Nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của các chủng vi sinh vật tiềm năng đối với nấm gây bệnh thán thư và bệnh sương mai trên cây nho (vitis vinifera l ) đề tài nghiên cứu khoa học

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC C

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ VÀ BỆNH

SƯƠNG MAI TRÊN CÂY NHO (Vitis vinifera L.)

006

Bình Dương, 3/2019

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ VÀ BỆNH

SƯƠNG MAI TRÊN CÂY NHO (Vitis vinifera L.)

006 Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thị Thùy Linh Khoa: Công nghệ sinh học

Các thành viên:

Lê Diễm Trang Nguyễn Thị Lan Phương Phạm Thị Phương Thảo Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Văn Minh

Bình Dương, 3/2019

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các triệu chứng của bệnh thán thư trên lá, quả, cành……… 13

Hình 1.2: Hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum……… 16

Hình 1.3: Hình thái bào tử nấm Colletotrichum……… 17

Hình 3.1: Hình thái đại thể mặt trước và sau đĩa của các chủng nấm……… 34

Hình 3.2: Hình ảnh quan sát vi thể của chủng NT1……… 36

Hình 3.3: Hình ảnh quan sát vi thể của chủng NT2……… …37

Hình 3.4: Hình ảnh quan sát vi thể của chủng NT3……… …………37

Hình 3.5 : Hình ảnh quan sát vi thể của chủng NT4……….38

Hình 3.6 : Hình ảnh quan sát vi thể của chủng T5……… ……… 38

Hình 3.7: Hình ảnh quan sát vi thể của chủng TN2……….……….………39

Hình 3.8: Kết quả gây nhiễm nhân tạo trên lá của các chủng nấm…….…… ……41

Hình 3.9: Kết quả quan sát đại thể của nấm NT1 sau khi tái phân lập từ lá nho bị gây nhiễm… ……… ……….42

Hình 3.10: Kết quả quan sát vi thể của chủng nấm NT1 sau khi tái phân lập từ lá nho bị gây nhiễm……… ……….………… ……… 43

Hình 3.11: Kết quả giải trình tự mẫu nấm NT1 … 44

Hình 3.12: Kết quả BLAST trình tự NT1 trên NCBI …… … 45

Hình 3.13: Kết quả dựng cây phả hệ bằng phương pháp Maximum likelihood ……… ……… 46

Hình 3.14: Kết quả quan sát đại thể các chủng vi khuẩn……… 48

Hình 3.15: Kết quả quan sát vi thể các chủng vi khuẩn………49

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

iv

Hình 3.16: Kết quả định tính khả năng đối kháng nấm bệnh của một số chủng vi

khuẩn……… 51

Hình 3.17: Kết quả thử nghiệm khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn… 52

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nho có trong 100g phần ăn được………7

Bảng 1.2: Bảng thống kê tình hình phân bố và trồng trọt nho một số khu vực trên thế giới năm 2016……… ……… 8

Bảng 1.3: Bảng thống kê sản lượng nho của các nước trên thế giới năm 2016……9

Bảng 1.4: Diện tích và sản lượng nho cả nước từ năm 2005 đến năm 2016….… 10

Bảng 3.1: Kết quả thu nhận mẫu và phân lập các chủng nấm……….11

Bảng 3.2: Kết quả quan sát đại thể của 6 chủng nấm……….….12

Bảng 3.3: Kết quả quan sát vi thể của 6 chủng nấm……… ……… 13

Bảng 3.4: Kết quả quan sát đại thể của các chủng vi khuẩn……… 54

Bảng 3.5: Kết quả quan sát vi thể của các chủng vi khuẩn………55

Bảng 3.6: Kết quả định tính khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn……… 57

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm……….19

Colletotrichum gloesporioides Elsinoe ampelina

Gloeosporium ampelophagum Colletotrichum acutatum

Colony Forming Unit Polymerase Chain Reaction

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

v

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU……… ……… 1

1 Lý do chọn đề tài……… ……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… ……….2

3 Đối tượng nghiên cứu……… …… 2

4 Mục tiêu nghiên cứu……… ……2

Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined.4 1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHO 5

1.1 Giới thiệu 5

1.2 Phân loại 6

1.3 Giá trị dinh dưỡng 7

2 TÌNH HÌNH PHÂN BỐ VÀ TRỒNG TRỌT NHO 8

2.1 Trên thế giới 8

2.2 Ở Việt Nam 9

3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY NHO 10

4 BỆNH THÁN THƯ GÂY HẠI TRÊN NHO 12

4.1 Tổng quan về bệnh thán thư 12

4.2 Tác nhân gây bệnh 14

5 PHƯƠNG PHÁP PCR……… ……….17

5.1 Định nghĩa PCR……… ……17

5.2 Nguyên tắc……… 18

Phần II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1 ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

vi

2 VẬT LIỆU 20

3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thiết bị và dụng cụ 20

3.2 Môi trường, hóa chất 221

4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 221

4.1 Bố trí thí nghiệm 221

4.2 Phân lập và định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 21

4.3 Tái phân lập các chủng vi khuẩn tiềm năng Error! Bookmark not defined 4.4 Sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năngError! Bookmark not defined Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 229

1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY NHO 30

1.1 Kết quả quan sát đại thể 30

1.2 Kết quả quan sát vi thể 35

1.3 Kết quả gây nhiễm nhân tạo trên lá nho……….…….40

1.4 Kết quả tái phân lập vi nấm gây bệnh trên lá nho……… ….42

1.5 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử….…44 2 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP VI KHUẨN……….…46

2.1 Kết quả quan sát đại thể……… 46

2.2 Kết quả quan sát vi thể……….48

3 KẾT QUẢ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH……….……….50

3.1 Kết quả định tính khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn 50

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

vii

3.2 Kết quả khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn tiềm

năng……… 51

Phần IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………53

1 KẾT LUẬN 54

2 KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC……… ………67

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TIỀM NĂNG ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH THÁN THƯ

VÀ BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY NHO (Vitis vinifera L.)

- Sinh viên thực hiện: Vũ Thị Thùy Linh

- Lớp: NN51 Khoa: CNSH Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Văn Minh

2 Mục tiêu đề tài: Phân lập và định danh vi nấm gây bệnh thán thư trên cây nho

Đồng thời sàng lọc các chủng vi khuẩn tiềm năng có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm gây bệnh

3 Tính mới và sáng tạo: Tại Việt Nam chưa có công bố khoa học nào về biện pháp

sinh học sử dụng vi khuẩn giúp phòng trừ bệnh thán thư trên nho

4 Kết quả nghiên cứu: Phân lập được vi nấm Colletotrichum gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên nho bằng phương pháp sinh học phân tử Sàng lọc được các chủng

vi khuẩn có khả năng kiểm soát nấm bệnh

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài: Ứng dụng nghiên cứu chế phẩm sinh học giúp phòng trừ

bệnh thán thư từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp

chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

ix

Ngày25 tháng 03 năm 2019

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

Vũ Thị Thùy Linh

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực

hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Vũ Thị Thùy Linh

Sinh ngày: 23 tháng 09 năm 1997

Nơi sinh: Nam Định

Lớp: NN51 Khóa: 2015

Khoa: Công nghệ sinh học

Địa chỉ liên hệ: 256/25/31A Phan Huy Ích phương 12 quận Gò Vấp TPHCM

Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình

Sơ lược thành tích: Điểm trung bình 6.74

* Năm thứ 2:

Ngành học: Công nghệ sinh học

Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình

Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình - Khá

Sơ lược thành tích: Điểm trung bình 7.75

* Năm thứ 4 (học kì I) :

Ngành học: Công nghệ sinh học

Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Điểm trung bình 10

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH

xii

PHẦN MỞ ĐẦU

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 1

1 Lý do chọn đề tài

Cây nho (Vitis vinifera L.) thuộc họ nho (Ampelidaeae) có nguồn gốc ở các

miền ôn đới Âu – Á và là một trong những cây có từ lâu đời nhất trên trái đất (90 - 95 triệu năm) Nho đem lại nguồn lợi lớn về dinh dưỡng và kinh tế Theo FAO, sản lượng nho trên thế giới năm 2016 đạt 93 triệu tấn với tổng diện tích trồng trên toàn thế giới khoảng 8 triệu ha(FAO, 2016) Ở nước ta, cây nho được xem là một loại cây chủ lực nên luôn được chú trọng phát triển ở những nơi có điều kiện thời tiết khí hậu khô ráo quanh năm, điều kiện thổ nhưỡng đặc thù thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nho như tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận Nhờ vậy, cây nho ở Ninh Thuận đã giúp người dân nơi đây thoát nghèo và không ít người vươn lên làm giàu do giá trị kinh tế cao hơn cây trồng khác (Anh Tùng, 2018) Theo thống kê của ngành Nông nghiệp cả nước năm

2005 diện tích nho là 1900 ha Đến năm 2017, diện tích trồng nho giảm xuống còn khoảng 1400 ha (Tổng cục thống kê, 2017) Một số nguyên nhân dẫn đến tình trạng diện tích trồng nho giảm như: giá cả, bất lợi thời tiết… đặc biệt là các loại bệnh do nấm bệnh, sâu hại và côn trùng Trong số các bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cây nho

thì bệnh thán thư (Anthracnose) hay còn gọi là bệnh ung thư ở nho, thẹo quả, bệnh đốm mắt chim do vi nấm Elsinoe ampeline, Colletotrichum gloeosprioider, Sphaceloma ampelium gây ra (Jamadar, 2007) Ngoài việc làm giảm năng suất, bệnh còn làm giảm

đáng kể chất lượng thương phẩm dẫn tới làm giảm giá trị hàng hóa, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế của bà con nông dân Hiện nay, để khắc phục tình trạng bệnh thán thư, đa số người dân sử dụng các loại thuốc hóa học gốc đồng như Kocie 61,4 DF, Champoin 77WP, (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011) Tuy nhiên, thuốc hóa học cần thời gian cách ly dài ngày sau khi phun, bón và có ảnh hưởng lớn đến môi trường sinh thái xung quanh cũng như sức khỏe người tiêu dùng Do đó các nhà khoa học đang tìm kiếm những phương pháp sinh học để đem lại những biện pháp tối ưu hơn cho người sử dụng

Nhằm phục vụ nhu cầu thiết yếu đó, đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước được thực hiện nhằm tìm ra các biện pháp phòng trừ và kiểm soát nấm bệnh có thể

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 2

kể đến như nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và cs năm 2017 về khả năng kháng nấm

Colletotrichum gloeosporioides của chế phẩm Oligochitosan – Nano Silica (SiO2),

nghiên cứu của Nithin B và cs năm 2018 về việc sử dụng dịch chiết thực vật để kiểm

soát bệnh thán thư trên cây nho nho (Vitis vinifera L.),…

Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu được công bố về các biện pháp sinh học tối ưu

để phòng trừ nấm gây bệnh thán thư trên nho Đứng trước tình hình đó, cần đưa ra các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại phù hợp, hiệu quả, ít tốn kém, không gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe người sử dụng Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của các chủng vi sinh vật tiềm năng đối với

nấm gây bệnh thán thư trên cây nho (Vitis vinifera L.)” với mục tiêu tìm ra các chủng vi

sinh tiềm năng có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm gây bệnh thán thư trên cây nho, hướng đến nền nông nghiệp hữu cơ an toàn cho người dân và là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Phân lập và định danh vi nấm gây bệnh thán thư trên nho bằng phương pháp sinh học phân tử

 Sàng lọc các chủng vi sinh vật tiềm năng có khả năng kiểm soát vi nấm gây bệnh thán thư trên nho

 Đánh giá khả năng kiểm soát nấm bệnh của các chủng vi khuẩn

 Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn được lựa chọn

 Đánh giá hiệu quả kiểm soát nấm bệnh của các chủng vi sinh vật tiềm năng trên cây nho ở quy mô nhà lưới

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm nấm gây bệnh thán thư trên cây nho Colletotrichum gloeosporioides và các chủng vi khuẩn của phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh 1 tại trường Đại học Mở TPHCM cơ sở III Bình Dương

4 Phạm vi nghiên cứu

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 3

Phạm vi nghiên cứu nằm trong lĩnh vực nông nghiệp

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 4

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 5

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHO

1.1 Giới thiệu

Cây nho (Vitis vinifera L) thuộc chi Vitis, họ Vitaceae có nguồn gốc ở các miền

ôn đới Âu – Á (Acmênia – Iran) và là một trong những cây có từ lâu đời nhất trên trái đất (90 - 95 triệu năm) Nho được trồng đầu tiên ở gần biển Caspian của Liên Xô cũ sau phát triển theo hướng phía tây của châu Âu và lục địa châu Mỹ và hướng về phía đông đối với Iran và Afghanistan (Jamadar, 2007)

Nho là cây dây leo thân gỗ, lá hình tim, quả tròn, nhỏ, mọc thành chùm từ 6 -

300 trái một chùm, có màu đen, vàng, đỏ tía, xanh lục Khi chín quả dùng để ăn tươi, làm nho khô, rượu vang nho hoặc các loại nước quả (Vũ Công Hậu, 2001) Nho là cây

ăn quả có giá trị, được trồng tập trung ở vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới Tuy được trồng ở phổ rộng về khí hậu nhưng đặc điểm đáng chú ý nhất của nho là yêu cầu

có một mùa khô đủ dài để tích lũy đường, đây cũng chính là yếu tố quan trọng nhất để tạo nên chất lượng nho Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng giúp cây nho phát triển sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực, nhiệt độ phù hợp cho cây nho phát triển từ 18 – 30oC, nhiệt độ thấp dưới 10oC hoặc cao trên 38oC đều gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nho Đồng thời nho cũng là cây ưa sáng, thiếu ánh sáng trong thời gian dài sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp hydrat carbon gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nho Nếu thiếu ánh sáng trong thời kỳ ra hoa và đậu quả sẽ dễ dẫn đến tình trạng rụng hoa và rụng quả non Ẩm độ không khí đóng vai trò quyết định lớn đến năng suất và phẩm chất nho, vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây nho, ẩm độ không khí phù hợp với nho từ

70 - 75%, ẩm độ không khí cao nho dễ bị nhiễm các loại nấm bệnh Lượng mưa phù hợp cho nho từ 700 - 850 mm/năm, lượng mưa cao trên 1.200 mm/năm dễ gây nên hiện tượng úng nước của bộ rễ, mưa lớn vào thời kỳ ra hoa đậu quả gây nên hiện tượng rụng hoa, rụng quả Nho thích hợp trên nhiều loại đất, từ cát thô, lẫn sỏi đá đến đất thịt nặng Các đất có thành phần cơ giới sét nặng, tầng canh tác nông, tiêu thoát nước kém không

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 6

phù hợp cho nho Khoảng giá trị pH phù hợp cho nho từ 5,5 - 7,5, nếu pH thấp dưới 4,5 hoặc cao trên 8,5 có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nho Yêu cầu đất trồng nho có độ phì cao, thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình, tầng đất dày, khả năng thoát nước tốt (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011)

Với diện tích trồng nho trên toàn thế giới năm 2017 là hơn 7,5 triệu ha và đem lại sản lượng nho hàng năm trên toàn thế giới đạt trên 90 triệu tấn, tập trung ở các nước như Mỹ, Brazil, Italy, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Thổ Nhĩ Kỳ và Ấn Độ… nho hiện đang là loại trái cây đem lại giá trị kinh tế khá lớn ở nhiều quốc gia (OIV, 2018) Năm 2000, nho chỉ được trồng chủ yếu ở các nước như Tây Ban Nha, Pháp, Ý, Thổ Nhĩ

Kì, Trung Quốc nhưng đến năm 2017, nho đã được trồng nhiều ở các nước khác như Ấn

Độ, Đức, Iran… Ở vùng nhiệt đới Châu Á, nho phát triển mạnh ở các nước như Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Trung Quốc chiếm 26% diện tích trồng và 34% sản lượng nho trên toàn thế giới (Jean-Marie Aurand, 2018)

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 7

vinifera Ngoài ra còn một số loài nho lai ghép, chủ yếu là lai ghép giữa V vinifera và một trong các thứ (biến chủng) của V labrusca, V riparia hay V aestivalis Các giống

lai ghép có xu hướng ít nhạy cảm với sương muối và dịch bệnh (Vũ Công Hậu, 2001)

Ở nước ta, giống nho đỏ Cardinal được trồng nhiều vì đây là giống nho quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở các nước khác như Thái Lan, Philippines,… vì

có nhiều ưu điểm như mẫu mã đẹp, dễ vận chuyển, sinh trưởng nhanh, chất lượng sản phẩm khá tốt Ngoài ra, còn một số giống nho khác được trồng ở Việt Nam như NH01-

48, NH01-93,… nhờ những đặc điểm vượt trội như bộ rễ khỏe mạnh, vỏ dày, độ đường cao, thích nghi với nhiều loại đất, có khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt của môi trường, khả năng nhân giống cao (Vũ Công Hậu, 2001)

1.3 Giá trị dinh dưỡng

Nho là một loại quả chứa nhiều đường, độ ngọt tương đương với các loại trái cây nhiệt đới như nhãn, vải, hồng Đường trong nho ngọt ở dạng dễ tiêu như Glucose, Fructose… Ngoài ra, trong nho còn chứa nhiều loại muối khoáng và vitamin khác nhau, đem lại những lợi ích về sức khỏe và sắc đẹp Không chỉ vậy, quả nho chứa một hàm lượng lớn polyphenol Đây là chất làm hạn chế quá trình đông của tiểu cầu, giảm bệnh nhồi máu cơ tim, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, chữa cao huyết áp, chống lão hóa… (Vũ Công Hậu, 2001) Bên cạnh đó một số lợi ích từ các sản phẩm làm từ nho có thể kể đến như như rượu vang nho có tác dụng chữa trị các bệnh liên quan đến tim mạch, tiểu đường, béo phì, cao huyết áp, hoặc làm tăng cholesterol tốt và giảm cholesterol xấu, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể (Lysa và cs., 2010) Đặc biệt, chiết xuất hạt nho đã được chứng minh có tác dụng dược lý và trị liệu như chống oxy hóa, chống viêm

và kháng khuẩn, cũng như có tác dụng bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh (Marjan và cs., 2016) Theo kết quả nghiên cứu của Bộ Y tế năm 2007 về thành phần các dưỡng chất có trong nho được thống kê qua bảng sau:

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nho có trong 100g phần ăn được

Đơn

vị

Thành phần dinh dưỡng

Hàm lượng

Theo thống kê của FAO năm 2017, diện tích trồng nho trên toàn thế giới khoảng

8 triệu ha, đem lại sản lượng lên đến 93 triệu tấn (FAO, 2017) Trong số đó, 2/3 sản lượng nho là để sản xuất rượu, khoảng 30 triệu tấn còn lại là để ăn tươi hoặc làm nho khô (OIV, 2018) Châu Âu là khu vực có diện tích trồng nho nhiều nhất trên thế giới, tập trung ở một số quốc gia như Tây Ban Nha, Italy, Pháp,… (FAO, 2017) Tình hình phân bố và trồng trọt nho ở một số châu lục và các nước trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.2 và 1.3 như sau:

Bảng 1.2: Bảng thống kê tình hình phân bố và trồng trọt nho một số khu vực trên

thế giới năm 2016 (Nguồn: FAO, 2017)

Stt Khu vực Diện tích (ha) Sản lượng (tấn)

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 9

Bảng 1.3: Bảng thống kê sản lượng nho của các nước trên thế giới năm 2016

2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây nho được xác định là cây trồng chủ lực nên được tập trung phát triển ở những khu vực không bị ngập úng, có điều kiện khí hậu thời tiết, đất đai phù hợp Diện tích trồng nho của cả nước năm 2016 khoảng 1400 ha, trong đó tỉnh Ninh Thuận chiếm khoảng 90% diện tích trồng và đạt 95 - 98% năng suất nho hàng năm, chủ yếu ở

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 10

các xã như Phước Hậu, Phước Sơn, Phước Nam, Phước Thuận và Phước Dân, Tân Giang, Bầu Zôn và Lanh Ra (huyện Ninh Phước), Thành Hải và Ðô Vinh (Phan Rang – Tháp Chàm) (Cục thống kê tỉnh Ninh Thuận, 2017) Diện tích và sản lượng nho cả nước qua các năm được thể hiện trong bảng 1.4 như sau:

Bảng 1.4: Diện tích và sản lượng nho cả nước từ năm 2005 đến năm 2016

(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017)

Năm Diện tích

(ha)

Sản lượng (tấn)

Năm Diện tích

(ha)

Sản lượng (tấn)

3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY NHO

Hiện nay, có rất nhiều bệnh gây hại cho nho trên thế giới Trong số đó có những bệnh khá phổ biến và gây ảnh hưởng khá lớn đến việc trồng trọt nho Một số bệnh

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 11

thường gặp trên cây nho và để lại hậu quả nghiêm trọng theo mô tả của Vũ Công Hậu

(2001) như sau:

Bệnh mốc sương (Downy mildew)

Bệnh xuất hiện vào thời kỳ nho sinh trưởng mạnh về thân lá ở những vùng có khí hậu ấm và ẩm Trong điều kiện thiếu mưa vào mùa xuân hoặc mùa hè ở những vùng nho ôn đới như Afganistan, California, Chilê bệnh ít phát triển Bệnh này do nấm

Plasmopara viticola gây ra Nấm chủ yếu tấn công trên lá non và lá bánh tẻ Triệu chứng

đầu tiên là xuất hiện các vết màu vàng với kích thước và hình dáng không đồng đều, sau

đó mọc lên các bào tử nấm màu trắng

Bệnh phấn trắng (Powdery mildew)

Bệnh nấm trắng được người trồng nho ở Ninh Thuận gọi là bệnh nấm xám hay

bột xám do nấm Uncinula necator gây ra Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ sau đó được

phát hiện ở Anh Ngày nay, người ta thấy bệnh nấm trắng gây hại trên tất cả các vùng nho trên thế giới, bao gồm cả các nước có khí hậu nhiệt đới

Bệnh rỉ sắt

Đây là bệnh nguy hiểm trên nho, chúng xuất hiện đầu tiên ở vùng nhiệt đới, sau

đó lan sang các vùng nho ôn đới của châu Á từ Srilanca, Ấn Độ và Bắc Java tới Triều Tiên và Nhật Bản Ở các nước châu Mỹ thì từ Colombia, Venezuela và Trung Mỹ tới miền Nam Florida và các bang khác của Mỹ Bệnh hại nặng đặc biệt ở vùng châu Á và Trung Mỹ, nếu không được phòng trừ thì cây nho bị tàn lụi Tác nhân gây bệnh do nhiều

loài nấm, nhưng ở Việt Nam tác nhân gây bệnh được xác định là nấm Kuehneola vitis

gây ra Nấm chủ yếu gây hại trên lá bánh tẻ và lá già, chính vì thế mà thường thấy nấm xuất hiện vào cuối vụ

Bệnh thán thư (Anthracnose)

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 12

Bệnh thán thư nói chung là bệnh gây hại nguy hiểm đối với tất cả các loài cây trồng, tập trung trên các cây: bông, bầu bí, cà chua, chuối, đậu, ngũ cốc, xoài, củ hành, cây tiêu Nấm gây hại ở tất cả các bộ phân của cây trên mặt đất (White và cs, 1990) Ở

Việt Nam, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp là bệnh hại rất phổ biến trên nhiều

cây ăn quả (xoài, chôm chôm, đu đủ ), cây công nghiệp dài ngày (cà phê, ca cao, điều…), cây công nghiệp ngắn ngày mức độ gây hại rất lớn, những cây bị bệnh gây hại nặng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của cây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm Đây cũng chính là bệnh gây hại đặc biệt nghiêm trọng trên cây nho và vẫn

chưa có phương pháp phòng trừ hiệu quả

4 BỆNH THÁN THƯ GÂY HẠI TRÊN NHO

4.1 Tổng quan về bệnh thán thư

Bệnh thán thư gây hại nho trên thế giới được Pliny phát hiện lần đầu tiên ở Italia vào năm 1886, bệnh lan truyền và phát triển rất mạnh ở Châu Âu trong nhiều thế kỷ qua Bệnh gây tổn thất rất lớn tại Nam Phi, Nam Mỹ và Chilê trong giai đoạn 1950 - 1951, 90% diện tích trồng nho bị bệnh thán thư gây hại, thiệt hại năng suất và sản lượng 83 - 100% (Jamadar, 2007) Ở Việt Nam, bệnh thán thư gây hại nho từ năm 1999 ở Ninh Thuận và sau đó lan sang các vùng trồng nho của cả nước Bệnh gây hại trên tất cả các

bộ phận của cây trên mặt đất, đặc biệt tập trung vào các chồi, quả non… Nghiêm trọng nhất quả bắt đầu bước vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch và làm giảm năng suất có thể tới 70 - 80% Ngoài việc làm giảm năng suất, bệnh còn làm giảm đáng kể chất lượng thương phẩm dẫn tới làm giảm giá trị hàng hóa (Sở NN & PTNT Ninh Thuận, 2011) Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về đối tượng nấm gây bệnh thán thư trên nho tại Việt Nam đến nay còn rất hạn chế, phần lớn mới chỉ nhận dạng loài dựa vào đặc điểm hình thái

Theo mô tả của Annemiek Schilder (2011), bệnh thán thư xuất hiện ở trên tất cả các bộ phận của cây nho Dấu hiệu bệnh dễ dàng nhìn thấy bởi mắt thường ở trên lá,

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 13

cành, chùm hoa, quả nho Bệnh được nhận dạng qua các đốm bệnh, được gọi là “đốm mắt chim” Triệu chứng bệnh thán thư như sau:

- Trên lá: xuất hiện các đốm hình tròn, màu nâu hoặc đỏ sậm (đường kính từ 1 -

5 mm) Dần dần, các đốm bệnh lan rộng ra, có thể kết hợp với nhau tạo thành đốm bệnh lớn, vết bệnh sau đó bị hổng thành lỗ Các tổn thương dọc theo gân lá có thể gây quăn

và biến dạng lá khi chúng nở ra

- Trên chồi: các đốm có hình bầu dục, màu nâu sẫm và tím tía với, trung tâm vết bệnh có màu xám và các cạnh được nâng lên Trên những chồi bị bệnh lâu ngày, các tổn thương có thể mở rộng vào sâu bên trong chồi và có các cạnh dày lên

- Trên quả: xuất hiện những đốm có đường kính từ 2 - 7 mm, màu nâu tía, hơi hõm sâu vào trong quả Khi bệnh nặng hơn, vết thương trên quả sẽ chuyển sang màu xám trắng bên trong, xung quanh có vòng tối hẹp Bệnh gây ra trên qủa có triệu chứng trông như mắt chim nên bệnh còn được gọi là “bệnh đốm mắt chim” (Annemiekr Schilder, 2011) Những vết thương trên quả có thể gây nứt vỏ, quả nhăn nhúm, thối rữa

và nho không thể bán được

- Trên ngọn: Vết bệnh ban đầu là những chấm nhỏ màu nâu xám sau phát triển bao quanh ngọn và lan dần xuống dưới làm đọt chết khô

- Trên thân, cành và cuống quả vết bệnh có dạng lõm xuống có gờ và xây thành xung quanh hình ô van, hoặc hơi dài nằm dọc theo thân cành hoặc cuống

Hình 1.1: Các triệu chứng của bệnh thán thư trên lá, quả, cành (Annemiekr

Schilder, 2011)

thành, lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1891 và đã được tìm thấy trong hầu hết các khu vực trồng nho, đặc biệt ở các khu vực ấm áp, ẩm như Đông Nam Hoa Kỳ

(Pearson,1988) Cả hai loài nấm C acutatum và C gloeosporioides đều gây bệnh thán thư (thối quả) trên cây nho (V rotundifolia) tại Hoa Kỳ (Daykin và cs.,1984) Theo Yamamoto, nấm C.acutatum gây bệnh thán thư (thối quả) đã được phát hiện ở Nhật Bản

và đồng thời 2 loài này gây thối quả trên loài nho (V vinifera) tại các khu vực cận nhiệt

đới của Úc như: Thung lũng Shoalhaven, Hunter, Hastings Valley và Kingaroy (Yamamoto J và cs.,1999) Bệnh thán thư xuất hiện ở các vườn nho đang thu hoạch ở

Úc trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho nấm bệnh phát triển như: ấm áp, ẩm ướt, bệnh phát triển gây thiệt hại lớn (Malksham và cs., 2002) Qua những nghiên cứu trên có thể

thấy chủng nấm Colletotrichum sp có mức độ gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất

trong 3 chủng nấm kể trên Đồng thời, đây cũng là chủng nấm gây bệnh thán thư đặc biệt nghiêm trọng ở các loài cây khác nhau nên cần có biện pháp sinh học xử lý sớm và

hiệu quả

4.2.2 Nấm Colletotrichum gây bệnh trên nho

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 15

Colletotrichum là một trong những nấm bệnh thực vật quan trọng nhất về kinh tế, chúng là nguyên nhân gây bệnh thán thư trên trái và lá của một loạt các cây

trồng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Hyde,

2009) Phân loại khoa học của nấm Colletotrichum theo khóa phân loại của Sutton

Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước được thực hiện nhằm mô tả hình

thái đại thể và vi thể của nấm Colletotrichum Theo khóa phân loại của Sutton (1980),

bổ sung đặc điểm màu sắc khuẩn lạc của Simmonds (1965) và CABI (2018), khuẩn

lạc của nấm Colletotrichum khá đa dạng về màu sắc như trắng, xám, xanh đen, hồng,

đỏ, cam, tím nhạt, vàng nhạt, vàng nghệ Một số loài nấm khuẩn lạc còn xuất hiện

các chấm xanh hoặc đen ở phía sau đĩa cấy Riêng loài C.gloeossorioides, khuẩn lạc

thường có màu trắng hoặc hơi xám, đặc trưng trên khuẩn lạc có dịch nhũ hồng hoặc màu cam đó là dịch bào tử Nghiên cứu của Ashokas (2005) cho thấy, trung bình

đường kính khuẩn lạc Colletotrichum gloeosprioides trên các môi trường sau 9 ngày

khá khác biệt Trên môi trường PDA đường kính khuẩn lạc phát triển đạt 90mm, trong khi đó môi trường CMA là 53 mm, Czapek là 67 mm, PCA là 62.83 mm Qua

đó có thể nhận thấy PDA là môi trường tốt để nấm Colletotrichum gloeosprioides

phát triển

Theo mô tả của Cao Ngọc Điệp (2014), nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty

thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và sợi nấm có vách ngăn Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 16

bào của hệ sợi nấm, khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại (Cao Ngọc Điệp, 2014)

Nấm Colletotrichum nội sinh trên cây chủ, chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử

đính Theo Agrios (2005) thì ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào, có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch

trong bên trong bào tử Riêng ở loài Colletotrichum gloeosporioides, bào tử đính có dạng thuôn dài, hình trụ, tròn 2 đầu Một số lượng nhỏ bào tử của Colletotrichum gloeosporioides có bào tử chỉ tròn 1 đầu, đầu còn lại hơi nhọn và thuôn dài (Pamela

và cs., 1992) Theo mô tả của Mai Văn Hào và cs (2005), kích thước bào tử chiều

dài/chiều rộng là 16,613 x 6,563 µm Theo Jamadar (2007) mô tả bào tử của

Colletotrichum gloeosporioides là bào tử trong suốt không có vách ngăn chiều

dài/chiều rộng 10,3 - 37,6 x 4,6 - 6,7 µm Còn theo Shanmughvelu và cs (1989), bào

tử Colletotrichum gloeosprioides có hình cầu hoặc hình trụ tròn 2 đầu, kích thước

trung bình là 14 - 18 x 4.5 - 6.5 µm Bào tử đính phát triển trên cuống mang bào tử

trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử

Hình 1.2: Hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum (Lê Hoàng Lệ Thủy và Phạm

Văn Kim, 2008)

40 - 65oC hoặc hơn và tổng hợp mạch mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) ở 70 - 72oC PCR có ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, phân tích

sự đa dạng sinh học, chọn giống và trong nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Hoàng Lộc

và cs., 2007)

5.2 Nguyên tắc

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong điều kiện

in vitro dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase PCR cho phép khuếch đại theo cấp

số nhân các đoạn DNA khuôn mẫu Đoạn DNA khuôn mẫu đã khuếch đại được nhận diện bằng cặp mồi đặc hiệu: mồi xuôi và mồi ngược có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu kì nhiệt lặp lại Mỗi chu kì

 Giai bắt cặp (annealing): Nhiệt độ được hạ xuống (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55oC - 70oC, tùy thuộc vào độ dài trình

tự mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết cho từng phản ứng PCR cụ thể

 Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ nâng lên khoảng 72oC, ở nhiệt độ này DNA polymerase hoạt động tốt nhất kéo dài các mạch DNA Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài khoảng 0 giây đến vài phút Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì trước là khuôn cho chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân

Nếu một phản ứng PCR được thực hiện trong 30 chu kì thì số bản sao tạo ra là

230 bản sao DNA

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 19

Phần II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 20

1 ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2018 đến tháng 12/2018 tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

2 VẬT LIỆU

Thu nhận 5 mẫu lá, quả nho bị bệnh thán thư được lấy trực tiếp từ vườn nho có cây bị bệnh ở ấp Phước Tân, xã Phan, huyện Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh và xã Phước Thuận, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Cây bệnh được xác định dựa trên các dấu hiệu ở phần II, mục 4 Mẫu bệnh sau khi thu thập phải được bảo quản ở môi trường khô ráo, tránh ẩm thấp Tiến hành phân lập nấm bệnh từ mẫu thu thập được trong vòng 8 giờ để tránh tình trạng mẫu bị héo, khô, gây ảnh hưởng đến quá trình phân lập

3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 21

3.2 Môi trường, hóa chất

- Môi trường: PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agrar), NB (Nutrient Broth),

- Hóa chất:

 Thuốc nhuộm: Lactophenol, Crysto Violet, Safarin O, Lugol

 Hóa chất: Ethanol 96o, NaCl, Tween 80

4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

4.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí ở sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm 4.2 Phân lập và định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

bệnh của vi khuẩn phân lập được

Nhuộm Gram, quan sát hình thái

Nhuộm lactophenol và quan sát

Khảo sát khả năng tương thích

giữa các chủng tiềm năng Tái phân lập vi nấm gây bệnh

Định danh bằng phương pháp

sinh học phân tử

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 22

Dựa vào các triệu chứng bệnh được mô tả ở phần I mục 4.1, thu nhận mẫu nho

và đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập mẫu Sử dụng túi giấy để lấy giữ mẫu bệnh Mẫu bệnh phải được bảo quản trong điều kiện mát mẻ, khô ráo và không bị tạp nhiễm Đóng gói mẫu cẩn thận để tránh va đập và hơi nước ngưng tụ (Roger và cs., 2005)

4.2.2 Phân lập nấm bệnh

Tiến hành phân lập nấm bệnh theo các bước sau:

1 Rửa sạch phần mẫu cây bệnh dưới vòi nước mạnh để trôi hết chất bẩn

2 Rửa mẫu bằng cồn ethanol 70%

3 Ngâm mẫu với NaOCl 1% trong 5-7 phút

4 Ngâm trong ethanol 70% trong 3-5 phút

5 Rửa mẫu với nước cất vô trùng 3 lần

6 Đặt trên giấy hấp vô trùng để thấm khô mẫu

7 Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe Đặt từ 3 - 4 miếng cấy lên môi trường PDA có chứa kháng sinh Chloramphenicol (100 µg/ml) Ủ tại nhiệt độ 25oC ± 2 Quan sát đĩa cấy hàng ngày Khi thấy xuất hiện sợi nấm, cấy chuyển ngay sang môi trường PDA mới, ủ tiếp tại nhiệt

Vi nấm được cấy trên đĩa PDA, ủ ở nhiệt độ phòng

Quan sát khóm nấm từ 3 – 10 ngày Đối với một số chủng phát triển chậm hoặc

có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát sẽ kéo dài hơn có thể đến 1 tháng Ghi nhận đặc điểm:

SVTT: VŨ THỊ THÙY LINH 23

Màu sắc và sự thay đổi màu sắc ở mặt phải và mặt trái của khóm nấm trên đĩa Petri

Hình dạng khóm nấm (sợi bông, nhung, sợi ướt, bột, trơn láng,…)

Tạo sắc tố ra môi trường

Tạo các giọt tiết trên bề mặt khóm nấm

Các đặc điểm khác (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Dựa vào mô tả hình thái đại thể của nấm theo khóa phân loại của Sutton (1980), Simmonds (1965) và CABI (2018) để so sánh, đối chiếu

Quan sát vi thể: tiến hành làm tiêu bản nấm mốc, rồi quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X

Cách làm tiêu bản nấm mốc như sau:

Lấy một lam kính sạch, trong đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (khoảng 10µL) lên lam kính vào giữa khung giấy

Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lame lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh)

Để trong 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát dưới kính hiển vi (Nguyễn Đức Lượng, 2011)

Dựa vào mô tả hình thái vi thể của nấm Cao Ngọc Điệp (2014), Agrios (2005), Mai văn Hào và cs (2005), Jamadar (2007), Shanmughvelu và cs (1989), Barnett và Hunter (1998), Pamela và cs (1992), Padman và Janardhna (2011) để so sánh và đối chiếu với các chủng nấm đã phân lập được

 Lưu ý:

- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm sinh vật khác làm sai lệch kết quả

- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở

121oC trong 20 phút