Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy noãn cây dưa lưới cucumis melo l nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP NUÔI CẤY NOÃN CÂY DƯA LƯỚI CUCUMIS MELO L.. Nuôi cấy b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP NUÔI CẤY NOÃN CÂY DƯA LƯỚI CUCUMIS MELO L

Sinh viên thực hiện: Hồ Hoàng Thuận

Người hướng dẫn: TS Lê Thị Kính

ThS Nguyễn Trần Đông Phương

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điền kiện cho em được học tập và rèn luyện tốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Lê Thị Kính và cô Nguyễn Trần Đông Phương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Công Nghệ

Tế Bào đã nhiệt tình giúp đỡ mình trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình Cảm ơn những tình cảm, những quan tâm lo lắng mà mọi người đã dành cho con, giúp con có thêm động lực

để bước tiếp trên con đường học vấn và đường đời

TP Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 04 năm 2018

Hồ Hoàng Thuận

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc tính sinh học của cây dưa lưới (Cucumis melo L.) 3

1.1.1 Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) 3

1.1.2 Đặc tính sinh học 4

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố 5

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng 6

1.2 Cấu tạo của noãn 7

1.2.1. Noãn 7

1.2.2. Sự hình thành và cấu tạo của túi phôi 7

1.3. Cây đơn bội và đơn bội kép 8

1.3.1 Giới thiệu chung 8

1.3.2 Ứng dụng 9

1.3.3 Tạo cây đơn bội in vitro 9

1.3.4 Tạo cây đơn bội kép 10

1.4 Nuôi cấy noãn 11

1.4.1 Giới thiệu chung 11

1.4.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy noãn 11

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn 12

1.5 Nuôi cấy mô 14

1.5.1 Giới thiệu chung 14

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 15

1.5.3 Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô 16

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 19

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 19

2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 19

2.1.5 Môi trường nuôi cấy 19

2.1.6 Hóa chất 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Khảo sát nồng độ AgNO 3 ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi

cây dưa lưới Cucumis melo L 20

2.2.2 Khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây dưa lưới Cucumis melo L 21

2.2.3 Quan sát hình thái giải phẫu 22

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Quan sát hình thái giải phẫu 23

3.3 Khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây dưa lưới Cucumis melo L 28

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2-iP 6-y-y-dimethyl-aminopurine ABA Abscisic acid

B5 Gamborg Medium

BA Benzyladenine BAP 6-benzylaminopurine CBM Cupressus Basal Medium

GA Gibberillic acid IAA Indole acetic acid IBA Indole butyric acid

MS Murashige & Skoog NAA Naphthalene acetic acid TDZ Thidiazuron

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây dưa lưới 4

Hình 1.2 quá trình hình thành của túi phôi 7

Hình 2.1 Sơ đồ nhuộm đỏ carmin, xanh iod 22

Hình 3.1 Hình thái giải phẫu noãn dưa lưới 1 ngày trước khi nở 24

Hình 3.2 Noãn dưa lưới sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CBM có bổ sung BA 1µM, IAA 2 µM và AgNO3 với các nồng độ khác nhau 27

Hình 3.3 Noãn dưa lưới sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CBM có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dưa lưới Cucumis melo L là cây ăn quả có thời gian sinh trưởng ngắn, trồng

được nhiều vụ trong năm với năng suất khá cao Trong 100 g thịt quả dưa lưới có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng như: năng lượng 34 Kcal; carbohydrates 8,6 g; protein 0,84 g; tổng acid béo 1,9 g; cholesterol 0 mg; chất xơ 0,9 g; vitamin B3 0,734 mg; vitamin B5 0,105 mg; vitamin B6 0,072 mg; vitamin B2 0,026 mg; vitamin B1 0,017 mg; vitamin A 3382 IU; vitamin C 36,7 mg; vitamin E 0,05 mg; vitamin K 2,5 mcg; natri 1 mg; kali 267 mg; canxi 9 mg; đồng 41 µg; sắt 0,21 mg; magie 12 mg; mangan 0,041 mg; kẽm 0,18 mg (USDA National Nutrient data base, 2015) Dưa lưới chứa nhiều chất xơ nên có tác dụng nhuận trường, chống táo bón Đây còn là nguồn cung cấp betacaroten, acid folic, kali và vitamin C, A Nguồn kali trong dưa lưới còn giúp bài tiết, thải muối vì vậy sử dụng dưa lưới có tác dụng giảm huyết áp cao(Lester, 1996) Dưa lưới hiện nay đang được trồng phổ biến rộng rãi tại nhiều nước trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc

Để tạo được giống dưa lưới lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì bố mẹ phải là các dòng có phổ di truyền rộng, khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi, khả năng chống bệnh và đặc biệt phải ở dạng đồng hợp tử Tuy nhiên, việc tạo ra các dòng bố mẹ thuần chủng bằng phương pháp

tự thụ phấn truy ền thống mất rất nhiều thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et

al., 2002) Do đó, các nhà nghiên cứu đã đưa ra kỹ thuật nuôi cấy thể đơn bội nhằm

rút ngắn thời gian tạo dòng thuần giúp công tác chọn tạo giống thuận lợi hơn Kỹ

thuật tạo cây đơn bội in vitro có thể rút ngắn việc tạo dòng thuần thậm chí chỉ còn

1-2 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs., 1-2005) Cây đơn bội đầu tiên được tạo ra từ cây cà độc dược lùn bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn (Blakelsee và cs., 1992) Nhiều nghiên

cứu sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá

(Burk et al., 1979), hành (Bohanec và Jakse, 1999)

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn là hai phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc tạo cây đơn bội phục vụ cho mục đích lai tạo và nghiên cứu di truyền Tuy nhiên, với phương pháp nuôi cấy bao phấn sẽ rất khó khăn trong việc sàng lọc cây đơn bội do giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều, cây tái sinh dễ bị

dục đực, loài có tỉ lệ cây tái sinh bị bạch tạng cao và các loài đơn tính khác gốc

(Thomas et al., 2000; Bhat, Murthy, 2007)

Trong họ Bầu bí, cây đơn bội được tạo ra với nhiều biện pháp khác nhau như:

nuôi cấy bầu noãn bí ngòi Cucurbita pepo L (Shalaby, 2007), cảm ứng phấn hoa chiếu xạ bí rợ Cucurbita maxima Duchesne ex Lam (Kurtar, Balkaya, 2010) Đối với

dưa lưới, nhiều nghiên cứu cũng được tiến hành bằng phương pháp nuôi cấy noãn như: Nghiên cứu tạo cây đơn bội và cây đơn bội kép ở cây dưa lưới để sử dụng trong

việc kháng lại nhiều virus (M Lotfi et al., 2003), khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

TDZ, BA, IAA, NAA, 2,4-D đến noãn chưa thụ tinh nhằm tạo nên cây đơn bội kép ở

cây dưa lưới (Sunita Premnath Koli et al., 2013) Nuôi cấy noãn là phương pháp

được xem là thành công nhất trong việc sản xuất cây đơn bội trong nhiều loài (Hansen

et al., 1995; Alanet et al., 2003) nhưng lại bị kiểm soát bởi nhiều yếu tố: lựa chọn

kiểu gen, giai đoạn phát triển của noãn, tiền xử lý, thành phần nuôi trường nuôi cấy,

sự biến đổi của phôi, điều kiện chiếu sáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật

(Gemes – Juhasz et al., 2002; Shalaby 2007, Jin-Feng Chen et al., 2010)

Dựa trên những lợi ích của việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và nhu cầu

sản xuất từ thực tế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu môi trường

thích hợp nuôi cấy noãn cây dưa lưới Cucumis melo L.” nhằm tìm ra môi trường

thích hợp cho sự tạo phôi từ noãn cây dưa lưới

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc tính sinh học của cây dưa lưới (Cucumis melo L.)

1.1.1 Họ Bầu bí (Cucurbitaceae)

Họ Bầu bí có danh pháp khoa học là Cucurbitaceae, là một họ thực vật bao gồm dưa hấu, dưa chuột, bí đao, bầu, bí ngô, mướp, mướp đắng… Họ Bầu bí là một trong những họ quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới, mặc dù không quan trọng như họ Hòa thảo (Poaceae), họ Đậu (Fabaceae) hay họ Cà (Solanaceae)

Họ Bầu bí gồm khoảng 120 chi và khoảng 1000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của 2 bán cầu (Hoàng Thị Sản, 2003) Ở nước ta có trên 20 chi và gần 50 loài, phần lớn là những loài cây trồng có quả ăn được hoặc làm rau ăn

Cây thân cỏ, sống một năm hoặc sống dai, leo nhờ tua cuốn hoặc bò trên mặt đất Lá mọc cách có cuốn dài, phiến lá thường chia thùy chân vịt, không có lá kèm Thân, lá thường phủ lông cứng, nhất là khi còn non

Trong họ có nhiều loại dưa cho quả như: dưa hấu (Citrullus lanatus Et Nakai), dưa lưới (Cucumis melo L var conomon Mak.), dưa leo (Cucumis sativus L.), dưa bở (Melo sinensis L.) Một số loài cho quả hoặc cả lá làm rau ăn như: Bí đao (Benincasa hispida Cogn.), bí ngô (Cucurbita pepo L.), bầu (Lagenaria sireraria Standl.), mướp ta (Lufa cylindrica (L.) Roem.), mướp khía (Luffa acutangular Roxb.), mướp đắng (Momordica charantia L.), gấc (Momordica cochinchinensis Spreng.), su su (Sechium edule Sw.) Ngoài ra, trong họ còn nhiều loại cây mọc dại như: mỡ lợn (Hodgsonia macrocarpa (Bl.) Cogn.)

Loài: Cucumis melo L

Hình 1.1 Cây dưa lưới

 Hệ rễ

Rễ phát triển yếu hơn so với các cây khác trong họ Bầu bí Tập trung phân

bố ở tầng đất từ 0 – 30 cm Hệ rễ ưa ẩm, không chịu khô hạn, cũng không chịu ngập úng

 Thân

Thân có màu xanh lục, thân tròn hay góc cạnh tùy thuộc vào giống, thường dài 1 – 2 m, có nhiều tua cuốn Thân có khả năng phân cành, quả ra chủ yếu trên thân chính Tua cuốn màu xanh lục nhạt, mảnh Cả thân và tua cuốn đều có lông cứng

 Lá

Lá đơn, to, mọc cách trên thân Phiến lá dài, rộng, không xẻ thùy, dạng hình tim Lá có nhiều gân chính từ đấy phiến lá và xòe đều trên tất cả bề mặt phiến lá Lá màu xanh đậm ở mặt trên, nhạt hơn ở mặt dưới, mép lá có răng cưa nhỏ, cuống lá dài

Cả cuống lá và mặt lá đều có lông cứng màu trắng

 Hoa

Hoa có màu vàng, đường kính từ 2 – 3 cm Tính đực cái biểu hiện rất phong phú Có cây dạng đơn tính cùng gốc (monoecious), có cây chỉ toàn hoa cái (gynoecious), hoặc đôi khi xuất hiện dạng đơn tính khác gốc (dioecious), trong quá trình phát triển còn xuất hiện dạng hoa cái và hoa lưỡng tính cùng gốc (gynomonoecious) (Tạ Thu Cúc, 2000) Tuy nhiên, dạng hoa đơn tính cùng gốc chiếm chủ yếu hơn cả Hoa cái mọc ở nách lá thành đôi hay riêng biệt, hoa đực mọc thành cụm từ 5 – 7 hoa

 Quả

Quả dưa lưới hình tròn hoặc hình bầu dục và có lớp vỏ cứng màu lục với những đường gân trắng đan nhau như lớp lưới rất độc đáo Quả dưa lưới có trọng lượng trung bình từ 1,5 kg đến 3,5 kg

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Dưa lưới có nguồn gốc từ châu Phi và Ấn Độ Người Ai Cập là người đầu tiên trồng giống cây này, sau đó là Hy Lạp, La Mã Hiện nay dưa lưới được trồng khắp nơi trên thế giới, chủ yếu bán tươi và được xem là loại thực phẩm có giá trị dinh

dưỡng cao

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g thịt quả dưa lưới

(USDA National Nutrient data base, 2015)

STT Thành phần Khối lượng Đơn vị

1.2 Cấu tạo của noãn

và đính với tâm gọi là hợp điểm

Túi phôi nằm trong phôi tâm gồm 1 nhân lưỡng bội ở giữa, 1 noãn cầu đơn bội với 2 nhân trợ bào ở 2 bên đều nằm ở 1 cực, 3 tế bào đối cực nằm ở cực đối diện

và 2 nhân cực nằm ở giữa

1.2.2 Sự hình thành và cấu tạo của túi phôi

Tế bào mẹ nguyên bào tử

phân chia giảm phân cho ra 4 tế bào

đơn bội (đại bào tử), nhưng chỉ có 1

bào tử được duy trì và phát triển

thành túi phôi bằng cách trải qua

nhiều lần phân chia Lần phân chia

đầu tạo ra 2 nhân con, chúng tách ra

và đi về 2 cực của túi phôi, mỗi nhân

con phân chia 2 lần nữa tạo thành 4

nhân Như vậy, trong túi phôi có 8

nhân hợp thành 2 nhóm Về sau, tại

mỗi cực có 1 nhân tách ra đi vào

trung tâm túi phôi và kết hợi với nhau

tạo thành nhân thứ cấp lưỡng bội

(2n) Ở đầu phía gần lỗ noãn, tế bào nằm giữa là noãn cầu, 2 tế bào hai bên là 2 trợ bào có kích thức nhỏ hơn noãn cầu Ba nhân còn lại ở cực đối diện được gọi là các tế bào đối cực, có chức năng dinh dưỡng

Hình 1.2 quá trình hình thành của túi phôi

2 nhân cực

2 nhân cực Noãn cầu

(3 đại bào tử bị thoái hóa)

1.3 Cây đơn bội và đơn bội kép

1.3.1 Giới thiệu chung

Hầu hết thực vật trong tự nhiên đều có bộ nhiễm sắc thể lớn hơn n, phổ biến

là nhị bội (2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều alen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp tử (bất

kể là nhị bội hay tứ bội) thì sự biểu hiện tính trạng của mỗi gen hoàn toàn phụ thuộc vào tính trạng trội hay lặn của chúng quyết định, điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc nghiên cứu di truyền Vì vậy, mức bội thể lí tưởng để có thể thực hiện các nghiên cứu di truyền là mức đơn bội (n) Thể đơn bội này có thể tác động hoặc tự

nhân đôi để tạo thành cây đơn bội kép hoàn toàn đồng hợp tử (Jain et al., 1996) Điều

này giúp tăng cường hiệu quả chọn lựa các tính trạng mong muốn

 Đặc điểm cây đơn bội

Cây đơn bội thường có nhiều tính trạng tương tự cây lưỡng bội Tuy nhiên,

từ kích thước tế bào đến các bộ phận đều nhỏ hơn cây lưỡng bội do số lượng gen và nhiễm sắc thể đều bị giảm đi Cây đơn bội có sức sống yếu và có những nét đặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội đều được thể hiện ra kiểu hình Các cây đơn bội đều bị bất dục vì các giao tử không phân chia và mang nhiễm sắc thể là n

Cây đơn bội khi được lưỡng bội hóa sẽ tạo thành cây có kiểu gen đồng hợp

tử ở tất cả các gen dẫn đến tình trạng thuần chủng Điều này mang lại ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn thời gian tạo dòng thuần góp phần hữu ích cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống

Nếu tác động đột biến vào cây đơn bội sẽ phát hiện được ngay đột biến, sau

đó nếu lưỡng bội hóa sẽ được dạng đồng hợp tử về gen đột biến và dễ dàng duy trì thông qua sinh sản hữu tính

 Chọn lọc đơn bội

Trong quá trình nuôi cấy túi phấn, không phải hầu hết các cây thu được đều

là đơn bội Mô giao tử có thể tự lưỡng bội hóa, mô sẹo và phôi lưỡng bội cũng có thể phát triển từ tế bào bao phấn nên cây tái sinh sẽ là cây lưỡng bội giống hệt cây mẹ

Có thể xác định cây đơn bội bằng cách: đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, đo gián tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng tăng trưởng, phát triển (Phan Hữu Tôn, 2004)

1.3.2 Ứng dụng

Từ rất lâu, người ta cũng đã biết đến giá trị của cây đơn bội tuy nhiên tần suất xuất hiện của cây đơn bội trong tự nhiên là rất thấp do đó không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Các tác giả cho rằng bình quân các nhà nghiên cứu sẽ tiết kiệm được khoảng 5 năm khi sử dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro vào việc tạo ra giống mới Việc đưa cây đơn bội vào chương trình tạo giống đã trở thành phổ biến trên thế giới (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

Tạo cây đơn bội kép từ cây đơn bội là một bước tiến hữu ích cho ngành lai tạo và chọn giống Với kiểu gen hoàn toàn đồng hợp tử chúng ta có thể dễ dàng lựa

chọn những kiểu gen mong muốn Lofti et al., 2003 đã sử dụng giống lai được lai tạo

từ nhiều giống có đặc tính kháng các bệnh khác nhau để làm vật liệu tạo ra cây đơn

bội và đơn bội kép phục vụ cho việc tạo ra giống dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.))

có thể kháng một số loại virus Nghiên cứu về việc chọn lọc các cây dưa hấu (Citrullus

lanatus (Thunb.)) mang gen kháng phấn trắng do nấm Sphaerotheca fuliginea gây ra

ở mức độ đơn bội cũng đã được công bố (Kuzuya et al., 2003)

Ngoài các ứng dụng chuyển gen để tạo ra các giống mong muốn Cây đơn bội và đơn bội kép còn được sử dụng để lập bản đồ di truyền (Forster, Thomas, 2005), nghiên cứu đột biến và nghiên cứu phân tử

1.3.3 Tạo cây đơn bội in vitro

Đối với công tác chọn lọc và lai tạo giống việc có được hai dòng bố mẹ thuần chủng là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, với phương pháp tự thụ phấn truyền thống

sẽ mất rất nhiều thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi

đó nếu áp dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro sẽ rút ngắn thời gian tạo dòng thuần thậm chí chỉ còn 1-2 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs., 2005)

Sự nuôi cấy hạt phấn non thành công vào khoảng năm 1965 đã dẫn tới sự hoàn chỉnh các phương pháp nuôi cấy để tạo các phôi và cây đơn bội (n) từ hạt phấn

và các tế bào túi phôi Trong thực tế, người ta dùng bao phấn, hạt phấn hay bầu noãn

để có cây tái sinh chứa thông tin di truyền của thể giao tử (Bùi Trang Việt, 2000)

Hai phương pháp cơ bản được áp dụng phổ biến nhất là:

 Nuôi cấy trực tiếp từ hạt phấn hay từ noãn chưa thụ tinh

Cấu trúc dạng phôi sẽ phát triển trực tiếp từ hạt phấn hoặc từ noãn chưa thụ tinh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

 Nuôi cấy gián tiếp thông qua mô sẹo

Cây hoàn chỉnh được phát triển từ khối mô sẹo (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại

bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho việc nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng

Cây đơn bội đầu tiên đã được tạo ra từ cây cà độc dược lùn bằng phương

pháp nuôi cấy bao phấn (Blakelsee và cs., 1922) Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979), hành (Bohanec và Jakse, 1999)

1.3.4 Tạo cây đơn bội kép

Phương pháp làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể chủ yếu được sử dụng là xử lý bằng colchicine (Caglar, Abak, 1997; Nikolova, Niemirowicz-Szczytt, 1996; Sari, Abak, 1996; Yetisir, Sari, 2003) Số lượng cây đơn bội kép thu được cao nhất là trên 60% khi ngâm các cây con trong dung dịch colchicine 0,5% trong 4 giờ (Caglar, Abak, 1997)

Một phương pháp khác là tái sinh trực tiếp từ lá cây đơn bội

(Niemirowicz-Szczytt et al., 1995) Tuy nhiên kết quả thu được không hiệu quả bằng phương pháp

xử lí bằng colchicine Khi tiến hành tái sinh từ lá thứ nhất và lá thứ hai của cây đơn bội, kết quả thu được có sự khác biệt rõ rệt Tất cả cây tái sinh từ lá thứ nhất đều là

Hạt phấn hay

Noãn chưa thụ tinh

Phôi Cây đơn bội

đơn bội kép nhưng khi từ lá thứ hai thì tỷ lệ đạt được là 70,5 %, lá tiếp theo là 28,2

% (Faris et al., 2000) Điều này cho thấy độ tuổi phát triển của mô được tái tạo góp

một phần quan trọng trong việc làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể

Dù bằng phương pháp nào thì việc tạo ra cây đơn bội kép vẫn là một bước tiến quan trọng góp phần tạo ra dòng đơn bội hoàn toàn đồng hợp tử giúp ích rất nhiều cho việc nghiên cứu và chọn tạo giống mới

1.4 Nuôi cấy noãn

1.4.1 Giới thiệu chung

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn được xem là hai phương pháp hiệu quả nhất để tạo ra cây đơn bội phục vụ cho nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống Tuy nhiên, với phương pháp nuôi cấy bao phấn sẽ rất khó khăn trong việc sàng lọc cây đơn bội do giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều, cây tái sinh dễ bị bạch tạng Trong khi đó, nuôi cấy noãn có thể khắc phục được những nhược điểm đó

Quá trình sản xuất cây đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy noãn được mô tả tương tự như quá trình trinh sinh cái Đây là hình thức noãn không qua thụ tinh nhưng vẫn có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh Bầu noãn chứa noãn với túi phôi đã trưởng thành được cô lập và đặt trên môi trường nhân tạo thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000) Sau một thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào từng loại cây, các phôi hay mô sẹo

sẽ nhú ra từ túi phôi Tiếp tục chuyển các phôi cũng như mô sẹo vừa hình thành sang môi trường tái sinh để thu được cây đơn bội

Phương pháp nuôi cấy noãn đã được chứng minh là sự lựa chọn tốt nhất để sản xuất cây đơn bội ở thực vật, đặc biệt là đối với những loài có hạt phản loạn hay những cây có tỉ lệ cây tái sinh bị bạch tạng cao, những loài bị bất dục đực hay những

loài đơn tính khác gốc (Thomas et al., 2000; Bhat, Murthy, 2007) Tuy nhiên, nuôi

cấy noãn vẫn gặp phải những khó khăn nhất định do đó vẫn còn bị hạn chế trong việc nghiên cứu Dù khó khăn và phức tạp nhưng nuôi cấy noãn vẫn là phương pháp hàng đầu được các nhà nghiên cứu lựa chọn để sản xuất cây đơn bội

1.4.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy noãn

Nhiều nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy noãn trên các đối tượng khác nhau đã được công bố như: hoa hướng dương (Gelebart, San, 1987), tỏi tây (Schum

Năm 2002, Gémes-Juhász et al đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của giai

đoạn phát triển giao tử cái và tiền xử lý đến việc nuôi cấy noãn cây dưa lưới Theo Gémes-Juhász bầu noãn được thu hái 6 giờ trước khi nở là giai đoạn tốt nhất cho cảm ứng đơn bội vì ở giai đoạn này các túi phôi thường đã có đủ 8 tế bào, tỷ lệ cây tái sinh thu được cao nhất 7,1 trên 100 noãn nuôi cấy

Năm 2013, Li và cs cũng đã báo cáo kết quả nghiên cứu của mình về khảo sát nồng độ TDZ và AgNO3 đến noãn chưa thụ tinh cây dưa lưới Nghiên cứu được tiến hành trên 2 giống dưa leo IL57 và IL69 của Trung Quốc và thu được nồng độ TDZ cảm ứng phôi cao nhất là 0,03 mg/L với giống IL69 và 0,07 mg/L với giống IL57 Điều này cho thấy rằng với mỗi giống khác nhau thì nồng độ ảnh hưởng của TDZ cũng như các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác cũng sẽ khác nhau Nồng

độ AgNO3 từ 5 - 10 mg/L sẽ kích thích nảy mầm phôi tốt nhất

Năm 2014, Plapung et al đã tiến hành nghiên cứu giống dưa lưới kháng virus

khảm bằng phương pháp nuôi cấy noãn Một lượng nhỏ kinetin sẽ làm kích thích sự tạo phôi trong quá trình nuôi cấy

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn

Nuôi cấy noãn là phương pháp được xem là thành công nhất trong việc sản

xuất cây đơn bội trong nhiều loài (Hansen et al., 1995; Alanet et al., 2003) Tuy nhiên,

nuôi cấy noãn lại bị kiểm soát bởi rất nhiều yếu tố như: lựa chọn kiểu gen, giai đoạn phát triển của noãn, tiền xử lý, thành phần môi trường nuôi cấy, sự biến đổi của phôi,

điều kiện chiếu sáng và chất điều hòa tăng trưởng thực vật (Gémes-Juhász et al., 2002; Shalaby 2007, Jin-Feng Chen et al 2010)

 Lựa chọn kiểu gen

Kiểu gen của các cá thể cho vật liệu nuôi cấy đóng một vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy noãn Các tế bào và hình thái phát sinh phôi soma được kiểm soát bởi một loạt các điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường và môi trường vật

lý) và sự ảnh hưởng của kiểu gen (Mart’nez et al., 2000) Trong hành tây, khả năng

cảm ứng đơn bội bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi kiểu gen của cây cho vật liệu nuôi cấy Dòng con lai F1 cho hiệu quả sản xuất phôi và tái sinh cây cao hơn các dòng giao

phấn (Gioffriau et al., 1997; Bohanec, Jakse, 1999) Các kiểu gen đã được chứng

minh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn bí đao Tỷ lệ noãn cảm ứng dao động từ 0 % đến 48,8 % tùy thuộc vào kiểu gen

 Giai đoạn phát triển noãn

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để tìm ra giai đoạn tối ưu nhất của noãn nhằm giúp cho quá trình nuôi cấy được diễn ra hiệu quả hơn Với các loài chẳng hạn như: củ cải đường, ngô, hướng dương, nhiều tác giả đã cho rằng nuôi cấy ở giai đoạn túi phôi gần trưởng thành là tối ưu nhất Các nghiên cứu mô học về sự phát triển của túi phôi dưa lưới đã chỉ ra rằng khả năng cảm ứng đơn bội ở giai đoạn đầu của túi phôi đã bị loại trừ Kết quả tốt nhất là vào giai đoạn túi phôi trưởng thành hoặc

hoàn toàn trưởng thành (Gémes-Juhász et al., 2002) Noãn nghệ tây phát triển ở các

giai đoạn khác nhau sẽ cho phản ứng khác nhau, khi noãn màu vàng là cảm ứng tốt nhất còn ở giai đoạn đã nở hoa thì không cảm ứng (Bhagyalakshmi, 1999)

 Tiền xử lý

Sốc nhiệt là phương pháp xử lý được áp dụng khá phổ biến và có tác động khá hiệu quả đến sự cảm ứng phôi Tiền xử lý cũng có thể áp dụng ở các mức độ khác nhau, chẳng hạn như xử lý khi hoa cái vẫn còn nguyên vẹn hay noãn đã bị cô lập Với những loại cây khác nhau, cách thức, cấp độ và thời gian xử lý cũng khác nhau (Jin-

Feng Chen et al., 2010)

Xử lý lạnh sẽ có hiệu quả đối với củ cải đường (Gurel et al., 2000), lúa mì (Sibi et al., 2001)

Noãn bí được ủ ở nhiệt độ 32 oC trong 4 ngày sau đó tiếp tục ủ ở 4 oC trong vòng 4 ngày nữa, kết quả thu được 22-28% noãn cảm ứng thành phôi (Shalaby, 2007)

Noãn thường được nuôi ngoài ánh sáng nhưng một vài trường hợp phải được

ủ tối ví dụ như nghệ tây (Bhagyalakshmi, 1999) và dưa leo (Gémes-Juhász et al.,

2002), việc này giúp giảm thiểu hình thành phôi soma và tăng cường cảm ứng Ngược

lại, thời gian chiếu sáng cao sẽ có lợi hơn đối với hành tây (Puddephat et al., 1999)

 Môi trường nuôi cấy

Việc cải thiện môi trường nuôi cấy cũng đã góp phần làm tăng hiệu quả quá trình nuôi cấy noãn Nguồn nitơ hữu cơ, carbonhydrate và chất điều hòa tăng trưởng thực vật là 3 yếu tố thường xuyên được thay đổi nhất Mỗi giai đoạn trong quá trình nuôi cấy có thể có những nhu cầu dinh dưỡng khác nhau và mỗi loại cây sẽ có những yêu cầu khác biệt cho riêng chúng (Mukhambetzhanow, 1997) Trong quá trình cảm ứng nhu cầu dinh dưỡng chỉ ở mức thấp, đến khi tái sinh thì cần mức độ cao hơn

Năm 1997, Giofriau và cs đã sử dụng môi trường B5 cho việc cảm ứng và

MS cho tái sinh cây CBM là môi trường được lựa chọn trong nuôi cấy noãn dưa leo

và cũng đem lại nhiều phản ứng tích cực (Gémes-Juhász et al., 2002) Các nghiên

cứu về môi trường nuôi cấy noãn chủ yếu xoay quanh những thay đổi về nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng, vitamin, acid amin

Thông thường đường được sử dụng với nồng độ 2-3% Đối với nuôi cấy noãn ngô sử dụng đến 12% (Truong-Andre, Demarly, 1984) Với nồng độ 6%, đường được chứng minh là có tác dụng thúc đẩy hình thành phôi và ức chế hình thành phôi soma trong nuôi cấy bao phấn lúa (Mukhambetzhanov, 1992)

Một số acid amin và vitamin cũng được ghi nhận là có tác dụng tích cực đến

quá trình cảm ứng noãn như ở dâu (Thomas et al., 1999) và dưa leo (Gémes-Juhász

et al., 2002)

Auxin và cytokinin là hai nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy noãn Trong dưa leo, TDZ đã đem lại nhiều hiệu quả tích cực trong việc cảm ứng và tái sinh cây Báo cáo về cảm ứng phôi cao nhất là 12,14% trên giống IL69 với TDZ 0,03 mg/L và IL57 là 11,11% với TDZ 0,07 mg/L

cũng đã được công bố (Li et al., 2013) NAA và BA phải được kết hợp với một tỷ lệ

cụ thể để có thể làm tăng khả năng phát triển chồi cả về chiều dài và số lá, NAA (0,54 mg/L): BA (2,22 mg/L) (Bhagyalakshmi, 1999)

1.5 Nuôi cấy mô

1.5.1 Giới thiệu chung

Thuật ngữ “Nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được sử dụng để nghiên cứu tất

cả các vấn đề liên quan đến thực vật như: sinh lý học, di truyền học và cấu trúc thực

vật (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2006)

Để nuôi cấy mô tế bào thực vật được hiệu quả cần thành thạo các kỹ thuật vô trùng, biết cách pha chế môi trường thích hợp và kèm theo là các dụng cụ, trang thiết

bị tương ứng

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

 Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố vô cùng quan trọng Một môi trường căn bản phải đảm bảo các yếu tố như:

 Các nguyên tố đa lượng: N, P, K, S, Ca và Mg

 Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo

 Các vitamin: nicotinic acid, biotin, B1

 Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose

 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin (2,4-D, IAA, IBA) và cytokinin (BAP, zeatin) kích thích sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào

và phát sinh hình thái Ngoài ra, còn có GA và ABA

 Agar: được sử dụng trong môi trường đặc có tác dụng như một giá đỡ giúp mẫu cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mẫu do thiếu oxy (Dương Công Kiên, 2002)

 Lựa chọn mẫu cấy

Gần như tất cả các phần của cây tươi đều có thể dùng làm mẫu cấy như: rễ, thân, lá, nụ hoa, noãn Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn mẫu cấy cho phù hợp

Tuy nhiên, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các

mô non (các tế bào đang phân chia) như: chồi đỉnh, chồi nách Cây gốc phải có phẩm chất tốt, sạch bệnh Mẫu cấy phải được vô trùng trước khi được đưa vào môi trường nuôi cấy và phải thật cẩn trọng không được làm tổn thương nếu không sẽ làm giảm hiệu quả nuôi cấy

 Khử trùng mẫu cấy

Trong quá trình nuôi cấy khử trùng mẫu cấy là khâu quyết định sự thành công hay thất bại Đối với mỗi loại cây sẽ có nồng độ hóa chất, thời gian và cách khử trùng khác nhau Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm chủ yếu Khi vi khuẩn và bào

tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy sẽ nhanh chóng lây nhiễm làm mẫu cấy có thể bị chết Các chất khử mẫu thường dùng: Javel, Ca(OCl)2, HgCl2

 Ánh sáng

Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của

Cường độ ánh sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng Cường độ chiếu sáng chủ yếu ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp

 Nhiệt độ

Nhiệt độ trong khoảng 17 - 25 oC thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo

mô sẹo và tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với một nhiệt độ khác nhau Khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô)

 pH

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Mức pH phù hợp thường là 5,6 - 5,8, đây là mức để cây có thể hấp thụ muối khoáng

 Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí

CO2 trong không khí như một nguồn cung cấp carbon Trong nuôi cấy mô truyền thống, nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng Thông thoáng khí giúp cây hô hấp và quang hợp tốt hơn (Dương Tấn Nhựt, 2010)

1.5.3 Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô

 Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò rất quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Auxin sẽ di chuyển xuống rễ và tích tụ ở đó (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin có sự tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ

và kích thích sự phân hóa mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000)

Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo rễ nhưng lại cản sự tăng trưởng của

các sơ khởi rễ (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs., 1980) Auxin được vận chuyển hướng

gốc, tích lũy ở phần gốc của các khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thianin