Khảo sát sự ức chế phát triển mầm hạt giống cỏ lồng vực nước (echinochloa crus galli l ) của dịch chiết thô mô sẹo từ lá cây hoa lài (jasminum sambac l ) nghiên cứu khoa học

Cỏ dại tiết ra các chất hóa học ức chế sự sinh trưởng, phát triển của các loài thực vật khác allelopathy .... Thí nghiệm 2: Khảo sát sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng 2,4–D

NCKH SV2015 i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP

TRƯỜNG NĂM 2014 - 2015

KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ PHÁT TRIỂN MẦM HẠT

GIỐNG CỎ LỒNG VỰC NƯỚC (ECHINOCHLOA

CRUS-GALLI L.) CỦA DỊCH CHIẾT THÔ MÔ

SẸO TỪ LÁ CÂY HOA LÀI (JASMINUM SAMBAC

L.)

Mã số đề tài:

Thuộc nhóm ngành khoa học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – NÔNG NGHIỆP

Bình Dương, 03/2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP

TRƯỜNG NĂM 2014 - 2015

KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ PHÁT TRIỂN MẦM HẠT

GIỐNG CỎ LỒNG VỰC NƯỚC (ECHINOCHLOA

CRUS-GALLI L.) CỦA DỊCH CHIẾT THÔ MÔ

SẸO TỪ LÁ CÂY HOA LÀI (JASMINUM SAMBAC

L.)

Mã số đề tài:

Thuộc nhóm ngành khoa học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – NÔNG NGHIỆP

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Thảo, Nữ

NCKH SV2015 i

THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Thảo Nữ

Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: DH11SH01 Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo: 4 Ngành học: Công nghệ sinh học

Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: DH11SH03 Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo: 4 Ngành học: Công nghệ sinh học

Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: DH12SH02 Năm thứ: 3 /Số năm đào tạo: 4 Ngành học: Công nghệ sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Khảo sát sự ức chế phát triển mầm hạt giống cỏ lồng vực

nước (Echinochloa crus-galli L.) từ dịch chiết thô mô sẹo từ lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.)

- Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Thảo

- Lớp: DH11SH01 Khoa: Công nghệ sinh học

Năm thứ: 04 Số năm đào tạo: 04

- Người hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

2 Mục tiêu đề tài:

− Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.)

− Nhân sinh khối mô sẹo tạo nguyên liệu cho chiết thô

− Thử hoạt tính ức chế sự nảy mầm bằng chiết thô trên cỏ lồng vực

nước (Echinochloa crus-galli L.)

3 Tính mới và sáng tạo:

Hiện nay việc sử dụng thuốc diệt cỏ hóa học quá nhiều không những ảnh hưởng đến nguồn dinh dưỡng trong đất mà còn gây ô nhiễm môi trường Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm thuốc diệt cỏ mới có nguồn gốc thực vật đã được nhóm sinh viên triển khai Thí nghiệm đã được chủ nhiệm và các thành viên tiến hành chiết xuất mô sẹo từ lá cây hoa lài và thử nghiệm khả năng ức chế sự nảy mầm cỏ lồng vực như là nguồn thuốc diệt cỏ sinh học

NCKH SV2015 iii

4 Kết quả nghiên cứu:

a Thí nghiệm tạo mô sẹo từ lá cây hoa lài và chiết xuất dịch mô sẹo

− Đối với mẫu lá của cây hoa lài thì việc khử trùng mẫu trong 30% Javel

trong thời gian 10 phút là tối ưu

− Trên MS bổ sung 1,5 mg/l chất kích thích sinh trưởng 2,4–D hay bổ sung 1 mg/l chất kích thích sinh trưởng NAA đều là môi trường thích hợp cho việc tạo sẹo từ mẫu lá cây hoa lài mô sẹo trên môi trường này có màu

trắng xanh

− Trên MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 2,4–D, mô sẹo tăng sinh mạnh hơn ở môi trường bổ sung NAA, nhưng mô sẹo ở môi trường bổ sung

NAA xanh, chắc hơn

− Môi trường nhân sinh khối thích hợp đối với mô sẹo từ lá cây lài là môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4–D, 0,5 mg/l BA kết hợp 4 mg/l kinetin ( tỉ lệ BA : kinetin là 1 : 8) và MS có bổ sung 1 mg/l 2,4–D, 2 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l kinetin ( tỉ lệ BA : kinetin là 4 : 1); môi trường MS có bổ sung 1

mg/l NAA, 0,5 mg/l BA kết hợp 4 mg/l kinetin ( tỉ lệ BA : kinetin là 1 : 8)

− Dịch chiết từ mô sẹo đều xuất hiện kết tủa sau khi thử với 3 loại thuốc thử Mayer, Dragendorff, Wagner cho thấy có thể có alkaloid trong mô sẹo từ

lá cây lài (Jasminum sambac L.)

b Thí nghiệm đánh giá hoạt lực diệt cỏ lồng vực từ dịch chiết mô sẹo lá hoa lài

Dịch chiết thô mô sẹo từ lá cây hoa lài có khả năng diệt mầm cỏ cây lồng vực nước, và tăng theo nồng độ dịch chiết Nồng độ dịch chiết thích hợp

là 50%, dung dịch pha loãng là nước cất

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

- Đề tài bước đầu đã xây dựng quy trình tạo mô sẹo và chiết xuất dịch chiết thô từ mô sẹo lá hoa lài, đánh giá được khả năng ức chế sự phát triển của cỏ lồng vực nước

- Đề tài góp phần nhận thức được tầm quan trọng của việc sử dụng thuốc trừ

cỏ sinh học, bảo vệ môi trường và con người

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi

rõ tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết

quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

NCKH SV2015 v

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh

viên thực hiện đề tài: Đề tài đã nghiên cứu quy trình nuôi cấy mô sẹo từ lá

hoa lài, từ đó làm nguồn nguyên liệu trong thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế hạt cỏ nảy mầm 1 ngày tuổi Nhóm nghiên cứu đã đánh giá được vai trò như thuốc diệt cỏ có nguồn gốc từ mô sẹo lá hoa lài Đây là nguồn nguyên liệu từ các hợp chất thứ cấp, có hoạt tính sinh học và thân thiện môi trường

Đề tài góp phần cho những nghiên cứu sâu hơn về việc ứng dụng dịch chiết

mô sẹo từ lá cây hoa lài như là thuốc diệt cỏ sinh học trong phòng trừ cỏ dại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Nguyễn Thị Thanh Thảo

Sinh ngày: 24 tháng 12 năm 1993

Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh

Lớp: DH11SH01 Khóa: 2011 – 2015

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 409/102, tổ 4, khu phố 2, phường Tân Chánh Hiệp,

quận 12, thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 01264655177 Email: ngtthao2412@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến

năm đang học):

* Năm thứ 1:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình

* Năm thứ 2:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình – khá

* Năm thứ 3:

Ngành học: Nông Nghiệp Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình – khá

Sơ lược thành tích : Đoạt giải Khuyến khích sinh viên nghiên cứu khoa học cấp trường năm 2014

* Năm thứ 4:

Ngành học: Nông Nghiệp Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình – khá

Ảnh 4x6

MỤC LỤC

MỤC LỤC viii

DANH MỤC CÁC BẢNG xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH xiv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xv

ĐẶT VẤN ĐỀ xvi

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1 Tổng quan về cỏ dại 1

1.1 Khái niệm cỏ dại 1

1.2 Tác hại của cỏ dại 2

1.2.1 Làm giảm năng suất cây trồng, gia tăng chi phí sản xuất 2

1.2.2 Cỏ dại tiết ra các chất hóa học ức chế sự sinh trưởng, phát triển của các loài thực vật khác (allelopathy) 2

1.2.3 Cỏ dại là kí chủ của sâu bệnh và chuột 3

1.2.4 Ảnh hưởng đến chất lượng nông sản 3

1.2.5 Giảm hiệu quả của quá trình thu hoạch 4

1.2.6 Ảnh hưởng đến sức khỏe gia súc 4

1.2.7 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người 4

1.2.8 Gây ô nhiễm và cản trở nguồn nước 5

1.3 Lợi ích của cỏ dại 5

2 Phương pháp quản lý cỏ dại 6

3 Thuốc diệt cỏ 7

3.1 Thuốc diệt cỏ hóa học 7

3.1.1 Ưu điểm 7

3.1.2 Nhược điểm 8

NCKH SV2015 ix

3.1.3 Tình trạng sử dụng thuốc diệt cỏ hóa học hiện nay 9

3.2 Thuốc diệt cỏ sinh học 9

3.2.1 Định nghĩa 9

3.2.2 Ưu điểm 10

4 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

4.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

4.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

4.3 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

4.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật 13

4.4.1 Nhóm auxin 13

4.4.2 Cytokinin 14

5 Giới thiệu về cây hoa lài 17

5.1 Phân loại 17

5.2 Đặc điểm chung của chi Lài (Jasminum) 17

5.3 Nguồn gốc và phân bố 18

5.4 Đặc điểm hình thái 18

5.6 Công dụng 19

5.7 Nhân giống cây lài bằng phương pháp giâm cành 20

6 Tổng quan cây cỏ lồng vực nước 21

6.1 Phân loại 21

6.2 Đặc điểm cỏ lồng vực nước 21

6.3 Đặc điểm ngủ nghỉ 22

6.4 Đặc điểm nảy mầm 22

7 Alkaloid 22

7.1 Giới thiệu chung 22

7.2 Tính lý hóa của các alkaloid 23

7.3 Hoạt tính sinh học của các alkaloid 23

Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2 Vật liệu 25

2.1 Vật liệu và điều kiện thí nghiệm 25

2.2 Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 25

2.3 Hóa chất 26

3 Nội dung nghiên cứu 28

3.1 Nội dung 1: Tạo mô sẹo và nhân sinh khối mô sẹo từ lá cây lài (Jasminum sambac L.) 28

3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu đến khả năng sống và sinh trưởng của mẫu lá cây hoa lài 28

3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng 2,4–D và NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự tạo sẹo từ mẫu lá cây hoa lài 30

3.1.3 Thí nghiệm 3: Nhân sinh khối mô sẹo 31

3.1.4 Thí nghiệm 4: Định tính alkaloid 32

3.1.4.1 Mục đích 32

3.1.4.2 Cách tiến hành 32

3.1.4.3 Cách đọc kết quả 32

3.2 Nội dung 2: Chiết thô mô sẹo bằng ethanol và thử hoạt tính diệt mầm của cỏ lồng vực bằng dịch chiết thô mô sẹo từ lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.) 32

3.2.1 Thí nghiệm 5: Chiết thô mô sẹo khô từ lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.) bằng ethanol 32

3.2.1.1 Mục đích 33

3.2.1.2 Cách tiến hành 33

NCKH SV2015 xi

3.2.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính diệt mầm cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.) của dịch chiết thô mô sẹo lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.) 34

3.2.2.1 Mục đích 34

3.2.2.2 Cách tiến hành 34

Phần III KẾT QUẢ 35

1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu đến khả năng sống và sinh trưởng của mẫu lá cây hoa lài 35

2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng 2,4–D và NAA ở các nồng độ khác nhau trong môi trường MS lên sự tạo sẹo từ mẫu lá cây hoa lài 36

2.1 Khảo sát sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng 2,4–D ở các nồng độ khác nhau trong môi trường MS lên sự tạo sẹo từ mẫu lá cây hoa lài 36

2.1.1 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 36

2.1.2 Đường kính mô sẹo 37

2.2 Khảo sát sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng NAA ở các nồng độ khác nhau trong môi trường MS lên sự tạo sẹo từ mẫu lá cây hoa lài 38

2.2.1 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 38

2.2.2 Đường kính mô sẹo 39

3 Thí nghiệm 3: Nhân sinh khối mô sẹo 40

4 Thí nghiệm 4: Định tính alkaloid 44

4.1 Kết quả 44

4.2 Biện luận kết quả 46

5 Thí nghiệm 5: Chiết thô mô sẹo từ lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.) bằng ethanol 46

5.1 Kết quả 46

5.2 Nhận xét 46

6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính diệt mầm cỏ lồng vực nước (Echinochloa

crus-galli L.) của dịch chiết thô mô sẹo lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.) 47

6.1 Kết quả 47

6.2 Nhận xét 47

Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

NCKH SV2015 xiii

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skook, 1962) 26

Bảng 3.1 Bảng mô tả thí nghiệm khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu 28

Bảng 3.2 Bảng mô tả thí nghiệm của các công thức môi trường có 2,4–D và NAA trong nuôi cấy mô sẹo từ lá cây hoa lài 30

Bảng 3.3 Bảng mô tả thí nghiệm sự ảnh hưởng của 2,4–D, NAA, kinetin và BA ở các tỉ lệ khác nhau lên sự phát triển của mô sẹo 31

Bảng 3.4 Bảng mô tả thí nghiệm chiết thô mô sẹo bằng ethanol 33

Bảng 3.5 Bảng mô tả thí nghiệm thử hoạt tính diệt mầm cỏ lồng vực nước của dịch chiết thô mô sẹo 34

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian ngâm mẫu trong quá trình khử trùng mẫu cấy 35

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của 2,4-D trong môi trường MS đến sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của mô sẹo từ mẫu lá cây lài sau 6 tuần nuôi cấy 36

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của NAA trong môi trường MS đến sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của mô sẹo từ mẫu lá cây lài sau 6 tuần nuôi cấy 38

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của 2,4–D, kinetin và BA ở các tỉ lệ khác nhau lên sự phát triển của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 40

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của 2,4–D, kinetin và BA ở các tỉ lệ khác nhau lên sự phát triển của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 42

Bảng 4.6 Kết quả định tính alkaloid trong mô sẹo bằng thuốc thử 44

Bảng 4.7 Hiệu suất chiết thô mô sẹo bằng ethanol 46

Bảng 4.8 Hoạt tính diệt mầm cỏ lồng vực nước của dịch chiết thô mô sẹo 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Biểu đồ thể hiện khối lượng thuốc diệt cỏ được sản xuất trên cả nước

qua các năm từ 2008 đến 2013 9

Hình 2 Cây hoa lài ở Nhị Bình, Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh 17

Hình 3 Cỏ lồng vực nước ở Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh 21

Hình 4 Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4–D ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 37

Hình 5 Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 39

Hình 6 Nhân sinh khối mô sẹo bằng 2,4–D, kinetin và BA sau 4 tuần nuôi cấy 41

Hình 7 Nhân sinh khối mô sẹo bằng NAA, kinetin và BA sau 4 tuần nuôi cấy 43

Hình 8 Dịch chiết mô sẹo sau khi thêm 1 giọt thuốc thử Mayer 44

Hình 9 Dịch chiết mô sẹo sau khi thêm 1 giọt thuốc thử Dragendorff 45

Hình 10 Dịch chiết mô sẹo sau khi thêm 1 giọt thuốc thử Wagner 45

Hình11: Nghiệm thứ G1 (đối chứng nước cất) 48

Hình12: Nghiệm thứ G1 sau 3 ngày 48

Hình13: Nghiệm thứ G2 (đối chứng ethanol) 48

Hình14: Nghiệm thứ G2 sau 3 ngày phun ethanol 48

Hình15: Nghiệm thứ G3 48

Hình16: Nghiệm thứ G3 sau 3 ngày phun dịch chiết 48

Hình17: Nghiệm thứ G4 49

Hình18: Nghiệm thứ G4 sau 3 ngày phun dịch chiết 49

Hình19: Nghiệm thứ G5 49

Hình20: Nghiệm thứ G5 sau 3 ngày phun dịch chiết 49

NCKH SV2015 xv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS : môi trường Murashige và Skook, 1962

2,4-D : 2,4–dichlorophenoxy acetic acid

BAP (BA) : 6–benzylaminopurine

IAA : indole –3–acetic acid

IBA : indole –3–butyric acid

Kinetin : 6–(2–furfuryl–7–amino purine)

NAA : 1- naphthaleneacetic acid

TDZ : 1–phenyl–3–(1, 2, 3–thiadiazol–5–yl)

Zeatin : 6–(4–hydroxy–3–metyl–but–2–enylamino) purine

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cỏ dại luôn là đối tượng gây hại cho cây trồng và ảnh hưởng xấu đến đất đai

Cỏ dại vừa hại đất, vừa cạnh tranh nguồn dinh dưỡng với cây trồng, kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và thậm chí còn làm cho cây còi cọc mất tiềm lực về năng suất, chất lượng sản phẩm Là môi trường cho sâu bệnh trú ngụ và phát sinh gây hại cây trồng Cỏ dại làm tốn thêm công và phương tiện máy móc, nhiên liệu, hóa chất

để trừ cỏ dẫn đến tăng chi phí, tăng giá thành trong sản xuất nông nghiệp Thời gian gần đây, các nhóm cỏ gây hại cho cây lúa rất đa dạng về chủng loại như nhóm cỏ lá rộng (rau mương, rau bợ, dừa nước, vảy ốc ), nhóm cỏ lá hẹp (cỏ lồng vực, chỉ nước, đuôi phụng ) và một số loại cỏ khác thuộc nhóm lác chác như cỏ cói, lác, năn… Các loại cỏ gây hại chủ yếu trong ruộng lúa như lồng vực, đuôi phụng, vảy ốc… Người nông dân sử dụng thuốc trừ cỏ sau vài vụ thấy mật độ cỏ lồng vực (còn gọi là cỏ gạo, cỏ kê) ngày một tăng lên trên ruộng lúa Ở nhiều địa phương, cỏ lồng vực đã trở thành đối tượng dịch hại nan giải mà nhiều loại thuốc trừ cỏ thông dụng không có khả năng diệt trừ (Lê Thanh, 2014) Hiện nay, trong sản xuất nông nghiệp, hầu hết nông dân đều sử dụng các loại thuốc trừ cỏ để hạn chế tối đa sự phát triển của cỏ dại trên đồng ruộng, giúp giảm cơ bản công làm cỏ và hạn chế sự cạnh tranh về dinh dưỡng trong đồng ruộng, giúp các loại cây trồng hấp thu tối đa lượng dinh dưỡng trong đất… Hầu hết các loại thuốc trừ cỏ trên thị trường hiện nay đều có nguồn gốc hóa học Hoạt chất trong thuốc trừ cỏ là loại cực độc song chỉ hấp thu qua cây trồng một tỉ lệ nhỏ, còn lại thấm vào đất, hòa vào nước Thuốc trừ

cỏ còn tiêu diệt vi sinh vật có ích, gây mất cân bằng sinh thái. Hầu hết người dân sử dụng thuốc, thực hiện không đầy đủ theo quy trình “4 đúng” (đúng thuốc, đúng lúc, đúng liều lượng, đúng cách) và việc lạm dụng thuốc trừ cỏ đang gây ra nhiều hệ lụy, làm ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng trực tiếp đến con người, tác động tiêu cực đến hệ sinh thái Hiện nay người ta đang hướng tới thay đổi phương pháp quản lý

cỏ dại để sản xuất nông nghiệp bền vững Gần đây chất đối kháng thực vật

“allelopathy” đã được giới thiệu như là một lựa chọn khả thi để kiểm soát cỏ dại, thực hiện sản xuất nông nghiệp bền vững, an toàn

NCKH SV2015 xvii

Cây hoa lài là loại cây lâu năm, dạng cây bụi nhỏ, hoa màu trắng và có hương thơm, thuộc họ Ô Liu, có nguồn gốc từ Nam và Đông Nam Á Ở Việt Nam, lài

được trồng nhiều tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ (chủ yếu là Jasmine

sambac L.) Ngoài tác dụng làm thuốc, hoa lài còn được sử dụng làm hương liệu

trong các nhà máy chế biến trà xuất khẩu, tinh dầu chiết xuất từ hoa lài được dùng làm nguyên liệu trong sản xuất mỹ phẩm [23] Trong nghiên cứu của Poonpaiboonpipat và cộng sự (2011) đã cho thấy trong lá của cây hoa lài có chất đối kháng thực vật, có khả năng ức chế sự nảy mầm của cỏ lồng vực và điền thanh hoa vàng Phần acid trong dịch chiết thô lá cây hoa lài bằng ethanol ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của cỏ điền thanh hoa vàng và ức chế một phần sự nảy mầm của

cỏ lồng vực Phần acid trong dịch chiết thô này ức chế sự nảy mầm của hai loại cỏ trên tốt hơn các phần còn lại trong dịch chiết thô, và nó được chọn để làm thuốc diệt cỏ tự nhiên dạng bột ướt

Hiện nay người ta trồng lài chủ yếu để lấy hoa, làm nguồn nguyên liệu cho chế biến trà, sản xuất mỹ phẩm, dược liệu , việc chiết thô lá cây hoa lài sẽ cần một

số lượng lớn nguồn nguyên liệu là lá cây, như vậy sẽ ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất ra hoa của cây, ảnh hưởng đến sức khỏe của cây dẫn tới nguồn nguyên liệu cho chiết thô sẽ không được ổn định

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên

lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal và Tsay, 2004) Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy

mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…

Theo nghiên cứu của Priya Joy và công sự (2008) đã cho thấy trong lá của

Jasminum sambac có chứa resin, salicylic acid và một alkaloid là jasmine, được

dùng điều trị bệnh ngoài da, ung nhọt và sốt Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết

thô từ mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy của Jasminum sambac có khả năng kháng lại 3 chủng khuẩn Proteius mirabilis, Staphylococcus albus và Salmonella typhii [24]

Vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự ức chế phát triển mầm hạt

giống cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.) của dịch chiết thô mô sẹo từ

lá cây hoa lài (Jasminum sambac L.)”

NCKH SV2015 1

1 Tổng quan về cỏ dại

1.1 Khái niệm cỏ dại

Hiện có rất nhiều định nghĩa khác nhau về cỏ dại tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể nơi cỏ dại xuất hiện và đối tượng cây trồng liên quan Một số định nghĩa

thông dụng về cỏ dại như sau: cỏ dại là “những thực vật gây phiền toái cho con

người” hay “những thực vật mọc ở nơi con người không mong muốn” hoặc là

“những thực vật ngoại lai xâm lấn”

Cỏ dại còn là cây mọc hoang và cây mọc lẫn

− Cây mọc hoang: là những thực vật mọc tự nhiên nhưng không xuất hiện trên đồng ruộng hay trên cơ quan thực vật có ích mà thường mọc trên những bãi đất hoang như sú, vẹt, dứa dại …

− Cây mọc lẫn: là những thực vật mọc ngoài ý muốn của con người, thường là hạt của cây trồng vụ trước mọc lẫn vào ruộng cây trồng vụ sau trên đồng ruộng, chẳng hạn như đậu mọc lẫn trong ruộng bắp hay rau muống mọc lẫn trong ruộng lúa

Khái niệm về mức độ không mong muốn đã ảnh hưởng đến nhận định của con người về cỏ dại và các đặc tính của nó

Crawley (1997) thừa nhận những khó khăn trong việc định nghĩa cỏ dại và đề nghị rằng thực vật chỉ được coi là cỏ dại khi mức độ phổ biến của chúng phải vượt

qua một ngưỡng nhất định và chúng phải là mối bận tâm, lo lắng của nhiều người

Định nghĩa này cũng thừa nhận rằng cỏ dại chỉ là cỏ dại trong những trường hợp nhất định và việc xếp một thực vật nào đó vào nhóm cỏ dại là tùy thuộc vào nhận định của con người

Định nghĩa cỏ dại thường được dùng phổ biến hiện nay như sau: “Cỏ dại là

những loài thực vật bản địa hay ngoại lai sinh trưởng, phát triển ngoài ý muốn của con người Sự hiện diện của chúng gây khó chịu và cản trở các hoạt động của con người hoặc ảnh hưởng bất lợi đến lợi ích của họ” [1]

1.2 Tác hại của cỏ dại

Cỏ dại xuất hiện ở mọi nơi, mọi lúc và là mối quan tâm của tất cả mọi người

Cỏ dại không chỉ gây cản trở hoạt động sản xuất nông nghiệp và làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng và gây khó khăn cho việc bảo trì các công trình xây dựng, nhà cửa, cảnh quan …

Thiệt hại do cỏ dại gây ra hàng năm trên thế giới có thể nuôi sống 100 triệu người mỗi năm Kết quả nghiên cứu của tổ chức môi trường "Land Care of New Zealand" cho thấy cỏ dại gây ra thiệt hại 95 tỷ đô la Mỹ mỗi năm do làm giảm sản lượng lương thực thực phẩm trên toàn cầu trong khi bệnh cây, côn trùng và các động vật có xương sống (không kể con người) gây tổn thất 85,46 và 2,4 tỷ đô la Mĩ Những sự thiệt hại về kinh tế có thể lớn hơn nữa nếu tính đến khía cạnh là hơn phân nửa thời gian mà nông dân lao động trên đồng ruộng là dành cho công việc nhổ cỏ [1]

1.2.1 Làm giảm năng suất cây trồng, gia tăng chi phí sản xuất

Cỏ dại tranh chấp các điều kiện sinh sống của cây trồng (ánh sáng, nước, dinh dưỡng) dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng Tuy nhiên, tùy theo những điều kiện khác nhau mà cỏ dại làm cho năng suất cây trồng giảm nhiều hay ít

Sự hiện diện của cỏ dại trên đồng ruộng còn làm tăng chi phí sản xuất, bao gồm: thuốc trừ cỏ, chi phí phun và rải thuốc trừ cỏ, chuẩn bị đất, trồng trọt và chăm sóc, dụng cụ trừ cỏ và thời gian làm cỏ …[1]

1.2.2 Cỏ dại tiết ra các chất hóa học ức chế sự sinh trưởng, phát triển của các loài thực vật khác (allelopathy)

Một vài loài cỏ dại có khả năng hạn chế sự cạnh tranh của các loài khác bằng cách tiết ra các hóa chất độc hại ức chế sự sinh trưởng, phát triển bình thường của các loài thực vật khác gọi là hiện tượng “allelopathy” (đối kháng thực vật),sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng giảm mạnh trong những trường hợp này [1]

Allelopathy là một hiện tượng sinh học của sinh vật (thực vật, vi khuẩn, tảo, nấm…) sản xuất một hoặc nhiều hợp ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, sống sót và sinh sản của các sinh vật khác Những chất này được phóng thích ra từ thực vật vào đất bằng cách tiết ra từ rể hoặc từ sự phân rả tế bào chết của chúng [8]

NCKH SV2015 3

Ví dụ: cỏ tranh, loài cỏ phổ biển trên đất thoát nước kém, cản trở khả năng tái

sinh của rừng, làm ức chế sự phát triển của đậu Stylosanthus guyanensis, kê đuôi chồn Setaria italica, cỏ ba lá Medicago polymorpha và thông Pinus roxburghii [13] Người ta cũng thấy rằng chiết xuất rễ của cỏ lồng vực và cỏ gấu Cyperus

rotundus ảnh hưởng tiêu cực làm giảm khả năng nảy mầm của hạt và khả năng tăng

trưởng của chồi mầm và rễ bắp [16]

1.2.3 Cỏ dại là kí chủ của sâu bệnh và chuột

Cỏ dại là nơi trú ẩn của sâu bệnh hại và là nơi trú ẩn của chuột Các loài cỏ dại cùng họ, bộ với cây trồng là kí chủ rất tốt của sâu bệnh hại trên những cây trồng tương ứng

Cỏ lồng vực Echinochloa crus-galli là kí chủ phụ của nấm Colletotrichum

graminicola gây bệnh thán thư, Cercospora fujimaculans gây bệnh đốm lá, Exserohilum monoceras gây rụi lá, Rhizoctonia solani gây bệnh héo cây con và Ustilago crus-galli gây bệnh than đen, rầy nâu hại lúa Nilaparvata lugens

Cỏ gà (cỏ chỉ) Cynodon dactylon là kí chủ của nấm Puccinia graminis gây bệnh gỉ sắt, Helminthosporium sp gây bệnh đốm lá, Bipolaris, Gaeumannomyces,

Leptosphaeria sp., Marasmius sp., Sporisorium, Sorosporium sp., Ustilago sp., Xanthomonas cynodontis, virus gây bệnh vàng lùn lúa mạch, bệnh virus sọc lá lúa

và bắp, các loài tuyến trùng, đặc biệt là tuyến trùng nốt sừng Meloidogyne spp., sâu đất Spodoptera spp., sâu kéo màng Herpetogramma licarsisalis…

Kí chủ phụ của bọ xít đen (Scotinophora sp.) là cỏ mồm Ischaemum rugosum,

cỏ bắc Leersia hexandra và cỏ đuôi chồn Setaria aurea …

Cải dại là kí chủ phụ của dòi đục rễ cải bắp [1]

Có một số loài cỏ dại nếu gia súc ăn phải sẽ làm giảm chất lượng sữa và thịt

(Parthenium, tỏi dại làm giảm chất lượng thịt và sữa và có thể làm cho sản phẩm

không tiêu thụ được)

Nuôi cừu lấy lông thả trên đồng ruộng có cây ké đầu ngựa, hạt cỏ dính vào lông cừu làm giảm chất lượng lông cừu thương phẩm

Hạt của cây cải dầu hoang (Brassica spp.) lẫn trong hạt lúa mì, bột mì xay ra

có mùi cải dầu hoang

Hạt cỏ lồng vực lẫn trong thóc gạo làm giảm giá trị thương phẩm của thóc gạo Hạt và đoạn gãy của thân cỏ có độ ẩm cao lẫn trong hạt cây trồng sau thu hoạch, tiếp tục hô hấp làm cho hạt nông sản nóng lên và có thể bị thối

Ở những ruộng cây trồng có lẫn cỏ dại, hàm lượng dinh dưỡng của sản phẩm

bị giảm sút [1]

Thời gian thu hoạch bị chậm lại để đợi cỏ chết khô

Làm chậm tốc độ của quá trình thu hoạch, đặc biệt thu hoạch bằng cơ giới

Gây tổn thất nông sản trong khi thu hoạch

Mật độ cỏ dại cao còn làm tăng chi phí đồ bảo hộ lao động trong khi thu hoạch [1]

Một số loài cỏ chứa hàm lượng rất cao các chất như alkaloid, tanins, glucosides, oxalates, nitrates …gây độc cho gia súc khi tiêu hóa chúng

Ví dụ:

− Hàm lượng amino acid, mimosine có trong cây mai dương Mimosa

pigra gây độc cho không chỉ gia súc mà còn cho cả cây trồng

− Các loài cỏ thuộc họ kinh giới Chenopodium, dền Amaranthus bình

thường thì không độc nhưng trong điều kiện môi trường bất lợi, các loài cỏ này tích lũy một lượng lớn chất nitrate (có thể lên tới 1000 ppm) Trong quá trình tiêu hóa

trong cơ thể động vật, nitrate biến thành nitrite gây độc cho gia súc

Gai nhọn, lá sắc của một số loài cỏ dại còn gây tổn thương cho gia súc (táo dại, cỏ tranh, dền gai, trinh nữ, mai dương …) Gai nhọn của cây mai dương làm tổn thương cá quanh hồ Trị An [1]

1.2.7 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Cỏ gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người như gây thương tích và dị

ứng Các loài cỏ phấn hương Ambrosia spp gây bệnh sốt cỏ khô do có chứa

NCKH SV2015 5

gây chết nếu ăn phải: dứa dại Datura stramonium, lu lu đực Solanum americanum

Một số loài cỏ có gai nhọn (táo dại, dền gai, trinh nữ, mai dương …), móc (cỏ may

…), lá sắc (các loài cỏ họ hòa thảo) dễ gây thương tích cho con người khi tiếp xúc

Cỏ còn là nơi trú ẩn, cung cấp thức ăn và nơi sinh sản của các vector truyền

bệnh, các loài gặm nhấm, rắn, rết, … Ví dụ: bệnh ngủ do ruồi Tse-Tse ở châu Phi

gây ra, chúng sống và sinh sản mạnh ở các bụi cỏ Bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và

một số bệnh khác do muỗi truyền Bèo Pistia lanceolata cung cấp chỗ đẻ tốt cho muỗi Lục bình Eichhornia spp cung cấp oxy qua rễ tạo điều kiện tốt cho lăng

quăng nảy nở và sinh trưởng [1]

1.2.8 Gây ô nhiễm và cản trở nguồn nước

Cỏ làm giảm chất lượng nước, cản trở dòng chảy và giao thông đường thủy,

gây khó khăn cho sản xuất thủy sản Ví dụ: Các cụm bèo cái Pistia stratoides cản

trở sự trao đổi khí trong mặt phân giới nước-không khí, điều này làm giảm lượng ôxy trong nước và giết chết nhiều loài cá, chúng cũng ngăn cản sự chiếu sáng và giết chết nhiều loài thực vật sống ngầm dưới nước, cũng như làm thay đổi cộng đồng thực vật sống nổi trên mặt nước bằng cách chèn ép chúng

Cỏ dại làm mất nước trong hồ một cách nhanh chóng Ví dụ: lục bình thoát nước qua lá rất lớn Tổng lượng nước bốc thoát trên mặt hồ có lục bình bằng 130 – 250% so với mặt hồ sạch cỏ

Cỏ cạnh tranh nguồn dinh dưỡng của các vi sinh vật trong nước (là nguồn thức

ăn của thủy sản), tiết ra các khí và các chất hữu cơ phân hủy, gây bất lợi cho sự sinh trưởng của các loại thủy sản Việc thu hoạch thủy sản sẽ gặp khó khăn và thất thoát lớn trên diện tích mặt nước có nhiều cỏ

Cản trở tầm nhìn trên bề mặt ao hồ

Chất hữu cơ phân hủy từ cỏ tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm không khí [1]

1.3 Lợi ích của cỏ dại

Những tác động tích cực của cỏ dại đối với sản xuất và con người ít được quan tâm, nghiên cứu hơn so với những tác động tiêu cực của chúng Những tác động tích cực này rất khó định lượng vì chúng diễn ra trong một khoảng thời gian dài Cỏ dại cũng có một số lợi ích nhất định sau:

− Làm tăng thêm chất hữu cơ và mùn cho đất Trong quá trình sinh sống, cỏ dại đã tích lũy vào tầng đất các chất dinh dưỡng như N, P, K, … (thường

có ở những tầng đất sâu và trong nước mưa) Trên đất mới khai phá, lượng bùn này

có ý nghĩa rất lớn

− Trong một số trường hợp, cỏ dại giúp cây trồng phát triển tốt Chẳng

hạn như tại một số vùng đất khô hạn ở Ấn Độ 3 loài cỏ Arnebia hispidissima, cỏ nút

áo Borreria articularis và Celosia argentea giúp cây kê sinh trưởng phát triển tốt

nhưng lại hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của cây mè (vừng)

− Giữ cho đất khỏi bị xói mòn, làm cho đất và dinh dưỡng khỏi bị trôi

đi; giữ cho các công trình thủy lợi, giao thông như đê điều khỏi bị hư hỏng

− Là nguồn thức ăn cho các loại gia súc như trâu, bò, ngựa, cừu và các

loại gia cầm như ngỗng, vịt, gà tây, và cá

− Các loại cỏ như cói, cỏ gừng, cỏ dày, cỏ tranh … còn được dùng làm

chất đốt, làm nguyên liệu để lợp nhà

− Nhiều loài cỏ còn được dùng làm dược liệu và các mục đích khác Ví dụ: bèo cái chữa chứng sốt phát ban, phù thủng, nhọt và trừ muỗi (phơi khô và đốt ở

những nơi có nhiều muỗi); rau sam (Portulaca oleracea) dùng làm thuốc sát trùng

trị những chứng lở loét ngoài da, làm tiêu nhọt độc và làm lợi tiểu trong chứng tiểu

buốt, tiểu rát, trị ho, lao phổi, giải độc rắn hoặc côn trùng cắn; cây trinh nữ (Mimosa

pudica) có tác dụng ức chế thần kinh, chấn kinh, giảm đau

− Trồng làm cảnh: ngũ sắc, xương rồng, mào gà, lẻ bạn, dâm bụt …

Như vậy, cỏ dại ảnh hưởng hai mặt đến nông nghiệp và đời sống của con người, vừa có hại vừa có lợi do đó tùy từng trường hợp cụ thể mà phòng trị triệt để chúng hay lợi dụng chúng làm những việc có ích khác [1]

2 Phương pháp quản lý cỏ dại

2.1 Phòng ngừa cỏ dại

− Sử dụng hạt giống sạch, không lẫn cỏ dại

− Sử dụng giống có khả năng hạn chế cỏ dại

− Ngăn ngừa cỏ dại xâm nhập nông cụ, máy móc, gia súc

NCKH SV2015 7

− Giữ sạch cỏ ở khu vực quanh đồng ruộng

− Luân canh, xen canh, tăng vụ

3.1 Thuốc diệt cỏ hóa học

Thuốc diệt cỏ là những thuốc phòng trừ các loại thực vật, rong, tảo mọc lẫn trong ruộng cây trồng, làm cản trở đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng Thuốc diệt cỏ thường ít độc hơn thuốc trừ sâu, nếu sử dụng thuốc trừ cỏ không đúng rất dễ

gây hại cho cây trồng [8]

3.1.1 Ưu điểm

− Hiệu quả cao và tương đối triệt để

− Áp dụng được vào nhiều thời điểm khác nhau

− Diệt sớm không để cỏ tấn công ngay từ giai đoạn đầu

− Diệt được cả cỏ có hình dạng như cây trồng, rất khó phân biệt bằng biện pháp nhổ tay

− Thời gian diệt cỏ đa niên kéo dài, do thuốc lưu dẫn đến tận rễ và diệt tận gốc

− Diệt tốt các loài cỏ không nhổ bằng tay được

− Hạn chế xói mòn do không phải làm đất, làm đất thái quá còn dẫn đến

sự thay đổi cơ cấu đất, giảm chất hữu cơ, làm cạn kiệt nước dự trữ trong đất

− Thuốc diệt cỏ ngay tại ruộng không cho phép chúng lan truyền

− Không cực nhọc vất vả như các biện pháp khác

− Có tính chuyên biệt nên ít ảnh hưởng đến cây trồng nếu dùng đúng

− Ít tốn công lao động, sử dụng nhanh chóng trên diện rộng đạt kết quả nhanh [8]

3.1.2 Nhược điểm

− Không có dấu hiệu nhắc nhở ngay nông dân khi áp dụng sai, chỉ phát hiện thiệt hại sau đó một thời gian khi cây đã thể hiện triệu chứng ngộ độc

− Có thể gây thiệt hại cho các cây trồng lân cận

− Đòi hỏi phải thành thạo trong việc sử dụng thuốc

− Cần phải có dụng cụ chuyên dùng

− Có thể tạo ra tính kháng thuốc ở cỏ dại

− Gây ô nhiễm môi trường

− Ảnh hưởng đến sức khỏe người và vật nuôi [8]

NCKH SV2015 9

3.1.3 Tình trạng sử dụng thuốc diệt cỏ hóa học hiện nay

Hình 1 Biểu đồ thể hiện khối lượng thuốc diệt cỏ được sản xuất trên cả nước

qua các năm từ 2008 đến 2013 Số liệu được lấy từ http://gso.gov.vn

Hiện nay lượng thuốc diệt cỏ được sản xuất trên cả nước ngày càng tăng mạnh qua các năm, cùng với nhiều người dân thiếu kiến thức và ý thức bảo vệ môi trường, lạm dụng thuốc diệt cỏ làm ảnh hưởng rất lớn đến môi trường, sức khỏe con người

và vật nuôi Thuốc diệt cỏ không những gây ô nhiễm môi trường, nguy hiểm cho người sử dụng mà còn làm cho các loại cỏ ngày càng kháng thuốc, khó trị hơn, làm cho đất đai xói mòn, bạc màu Thuốc diệt cỏ có hiệu quả nhanh, nhưng để lại rất nhiều hậu quả nếu không sử dụng hợp lý

3.2 Thuốc diệt cỏ sinh học

3.2.1 Định nghĩa

Thuốc diệt cỏ sinh học thường là vi sinh vật gây bệnh có trong tự nhiên được phân lập, nuôi cấy và nhân lên với số lượng lớn để áp dụng cho các loài cỏ mà con người định kiểm soát [8]

Hai ví dụ quan trọng về sự thành công này là nấm Phytopthora palmivora và

Colletotrichum gloesporioides cho việc kiểm soát cỏ Morrenia odorata trên vườn

cam và cỏ Aeschynomena virginica trên lúa và đậu nành Hai loại thuốc này đã

được sản xuất công nghiệp tại Mỹ Thuốc sinh học phải phun xịt hàng vụ do đó khuyến khích các nhà công nghiệp đầu tư vào sản xuất [8]

3.2.2 Ưu điểm

- Chỉ nhằm vào một loại cỏ dại và vô hại với môi trường xung quanh

- Tồi tại trong môi trường lâu, tới tận mùa vụ sau ở khu vực có nhiều cỏ dại lây lan

- Tốn ít chi phí hơn so với thuốc trừ cỏ tổng hợp

- Không có hại với môi trường

- Không ảnh hưởng tới các sinh vật không phải mục tiêu [8]

4 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

4.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Gout Haberlandt (1902), nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô thực vật Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào để mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể

đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Tuy nhiên những thí nghiệm của Haberlandt với các tế bào mô mềm, biểu bì đã bị thất bại, do chúng không thể phân chia được

Năm 1922, Kotte là học trò Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại các thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô) Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn trên môi trường lỏng có chứa đường glucozo, muối khoáng và thu được hệ rễ nhỏ

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi

White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua (Lycopersicon

esculentum) trong một thời gian dài, trên trường lỏng chứa đường, một số muối

khoáng và dịch chiết nấm men Theo hướng khác, Gautheret (Pháp) nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng các cây gỗ và đã tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp Cũng trong giai đoạn này, vai trò thúc đẩy sinh trưởng trong nuôi cấy của hàng loại vitamin nhóm B cũng được phát hiện như: thiamin (vitamin B1), pyridoxin (vitamin

NCKH SV2015 11

khi Went và Thimann tìm ra được chất kích thích sinh trưởng đầu tiên, sau đó xác định là axit indole axetic (IAA) và được Kogl tách chiết, tinh chế thành công Năm

1939, Gautheret và Nobercourrt đã duy trì được sự sinh trưởng của mô sẹo cà rốt

(Daucus carota) trong một thời gian dài

Van Overbeck (1941) đã chứng minh tác dụng tốt của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà Sau đó Steward và Miles (1952) cũng được xác nhận tầm quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt Trong thời gian này,

nhiều chất kích thích sinh trưởng thuốc nhóm auxin được nghiên cứu và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic (NAA), axit 2,4–dichlorophenoxy axetic (2,4–D)

… Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4–D đã giúp tạo

mô sẹo thành công trên nhiều đối tượng mà trước đây rất khó nuôi cấy

Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thủy phân của tinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trưởng rất rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá Năm 1957, Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đối của auxin/cytokinin và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong khoảng thời gian từ 1954 – 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện dần

Nickell (1956) đã duy trì được sự sinh trưởng liên tục huyền phù cây đậu trắng

(Phaseolus vulgaris)

Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm từ địa lan Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh

Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của

cây cà độc dược (Datura inoxia) Sau đó Bourgin và Nitsch (1967) cũng thành công

với cây thuốc lá

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật

Ngày nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loại thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào cây trồng

…[11]

4.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại

nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Bao gồm:

− Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành

− Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

− Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

− Nuôi cấy mô sẹo (callus)

− Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

− Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong của tế bào thực vật sau khi tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần [7]

4.3 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể hoàn chỉnh

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và

tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật so với phương pháp truyền thống:

NCKH SV2015 13

− Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa… mà ngoài tự nhiên không

làm được

− Có thể sản xuất được một số lượng lớn cây giống trong một thời gian

ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại

− Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền

− Tạo cây sạch virus thông qua xử lí nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh

− Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

− Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn

− Dễ dàng tạo giống bằng phương pháp chuyển gen [2]

4.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy mô là các chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào; ảnh hưởng đến quá trình hình thành cơ quan như chồi, thân lá, rễ; ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy: auxin, cytokinin [7]

Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính … (Epstein và cộng sự, 1989) Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:

− IAA (indole acetic acid)

− IBA (indole butyric acid)

− α–NAA (α–naphthalene acetic acid)

− 2,4–D (2,4–diclorophenoxy acetic acid)

− pCPA (P–chlorophenoxy acetic acid)

IAA ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, những trường hợp có

bổ sung IAA vào môi trường nghiên cứu thì phải dùng ở nồng độ khá cao: 1 – 30 mg/l

Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 – 2 mg/l Chúng có hiệu quả sinh

lý ở nồng độ thấp Tuy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy …

mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) [11]

Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro

(Miller, 1961) Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy bao gồm:

− Kineitn (6–(2–furfuryl–7–amino purine)

Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai, còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những

tổ hợp tỉ lệ khác nhau [11]

NCKH SV2015 15

4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của

tế bào trong nuôi cấy in vitro Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác

nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau

Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng

Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp [7]

Nhiệt độ trong khoảng 17 – 250C thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với một nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy nói chung là (25 ± 2)0C Nhiệt độ ban đêm hạ xuống một vài độ so với ban ngày có lợi cho sự hình thành cây và rễ [7]

Trị số độ pH của môi trường nuôi cấy thay đổi ảnh hưởng đến sự hấp thu nguyên tố dinh dưỡng của mô nuôi cấy, các hoạt động sinh lí khác ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự sinh trưởng mô sẹo và sự phát sinh tế bào phôi của mô sẹo đều yêu cầu một trị số pH tương đối thích hợp

Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,7 – 5,8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng [7]

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi lượng là điều cần thiết [7]

4.5.5 Nguồn Carbon

Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp, hoặc nếu có quang hợp thì cường độ cũng rất thấp do thiếu clorophin, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác… Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy [11]

Sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng Đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng mà có sử dụng mantose, galactose hay glucose Loại đường và hàm lượng đường ảnh hưởng đến hàm lượng các chất thu nhận được [7]

Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Vitamin sử dụng rộng rãi là inositol, vitamin B1, acid nicotinic và vitamin B6

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, chỉ cần có vitamin B1 và inositol là có thể duy trì được sự sinh trưởng của mô nuôi cấy không cần đến các loại vitamin khác

− Inositol: tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất, đặc biệt các chất cấu thành thành tế bào như hemixenlulose, pectin Inositol thúc đẩy sự phân chia tế bào mẫu nuôi cấy, sự sinh trưởng và phân hóa tế bào Trong các môi trường nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mô sẹo và môi trường phân hóa mô sẹo nhất thiết phải có

inositol

− Vitamin B1: cùng với các chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng tương

hỗ, duy trì sự sinh trưởng và phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy

− Vitamin C: đóng vai trò là chất chống oxy hóa

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: vitamin B1, vitamin

B6, acid nicotinic, inositol [7]

NCKH SV2015 17

Agar là một loại polysacharid của tảo: agar là chất keo đông thường được sử

dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharid

do đường saccharose và galactose cấu thành Nồng độ của agar dùng trong nuôi cấy

dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy Agar có tác

dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mô do

− Chi Nhài: Jasminum [21]

5.2 Đặc điểm chung của chi Lài (Jasminum)

Cây nhỡ có khi leo, cao 0,5 – 3 m, có nhiều cành mọc xòe ra Lá hình trái xoan

bầu dục, bóng cả hai mặt, có lông ở dưới, ở kẽ có những gân phụ Cụm hoa ở ngọn,

thưa hoa Lá bắc hình sợi Hoa màu trắng, thơm ngát Quả hình cầu, màu đen bao

bởi đài, có hai ngăn

Có khoảng 200 loài, một số loài phổ biến:

5.3 Nguồn gốc và phân bố

Nhài hay còn gọi là Lài (Jasminum sambac L.) có nguồn gốc từ Nam và Đông

Nam Á Ở Việt Nam, cây hoa lài phân bố rộng khắp cả nước, chủ yếu là lài

Jasminum sambac L

Ở miền Nam nước Pháp có hai loài là Jasminum officinale và Jasminum

grandiflorum Jasminum officinale là loài lài hoang dại thường sống trên các vùng

núi cao, còn Jasminum grandiflorum thường gọi là lài Tây Ban Nha, được trồng để chiết xuất tinh dầu tự nhiên Jasminum grandiflorum đã có mặt ở vùng Grasse của

Pháp khoảng 200 năm, chúng được trồng để phục vụ cho công nghệ sản xuất các loại nước hoa nổi tiếng trên thế giới

Jasminum officinale mọc ở chân núi Himalayas và vùng đồng bằng Ganges,

được trồng thương mại ở vùng có khí hậu ôn hòa của Ấn Độ Đây cũng là loài rất nổi tiếng và phổ biến nhất ở Anh Vì có hương thơm vô cùng quyến rũ, chúng được gọi là nữ hoàng của các loài hoa và được ưa chuộng nhất ở Châu Âu

Jasminum angustifolium và Jasminum humile được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Jasminum fruticans mọc tự nhiên ở phía Nam châu Âu và vùng Địa Trung Hải [20]

Trên thế giới cũng đã có một số công trình nghiên cứu về việc tái sinh các

giống lài như Nhân giống nhanh Jasmine officinale L bằng phương pháp nuôi cấy chồi nách và cảm ứng tạo mô sẹo cây hoa lài Jasminum sambac bằng 2,4–D [24]

5.4 Đặc điểm hình thái

Jasminum sambac L Ait: tiểu mộc có thể trườn, nhánh có cạnh, có lông thưa,

lá có viền xoan, dày, ít hay không có lông, cuống ngắn Phát hoa có 3 – 12 hoa, đài

có tai nhọn, rìa có lông, có khi không lông, vành thường đôi, hoa trắng, có hai tiểu nhụy [3]

Jasminum subtriplinerve C L Blume: là loại cây bụi nhỏ, đường kính thân

không quá 6mm Thân cứng, từng đốt vươn dài hàng chục mét, phân nhánh nhiều

Vỏ thân nhẵn màu xanh lục Lá mọc đối hơi hình mác, phía cuống tròn, mũi nhọn,

có ba gân chính nổi rõ ở mặt trên, mép nguyên, càng lên ngọn, cành lá càng nhỏ Hoa màu trắng mọc thành xim ở đầu cành, quả hình cầu [27]

NCKH SV2015 19

Jasminum grandiflorum là loại cây mọc lâu năm, có nhiều cành, cành phía

dưới cứng, dạng gỗ còn ở phía trên mọc vươn dài, yếu, dạng cỏ Cành lài có thể dài

từ 1,5 – 2m, lá hình bầu dục, nhọn ở phía cuối Jasminum grandiflorum là loài lài

cánh to, có giá trị về mặt hương liệu Hoa mọc ở cuối cành, có cuống hình chuông, thường 4 – 5 cánh màu trắng đục, phần dưới cánh hoa hơi hồng, nở từ tháng 6 đến tháng 10 [20]

5.5 Đặc điểm sinh thái

Cây hoa lài thích nghi khá tốt đối với điều kiện khí hậu, đất đai ở nước ta

Nhiệt độ thích hợp cho cây lài sinh trưởng là 20 – 330C, nhiệt độ thấp 8 – 100C cây sinh trưởng kém

Ánh sáng: lài là cây ưa sáng, do đó cần trồng nơi thoáng, rộng, không bị che bóng, cây mới cho năng suất cao và hoa mới thơm

Nước: lài cần nước để sinh trưởng và ra hoa liên tục nhưng không chịu úng do

đó cần trồng nơi cao ráo, tưới tiêu thuận lợi

Đất: lài sống được trên nhiều loại đất khác nhau từ đất đồng bằng trung tính (pH từ 6,5 – 7) đến đất đồi núi hơi chua (pH từ 3,5 – 4); từ đất thịt nặng đến đất thịt pha cát, đất đồi núi nghèo dinh dưỡng, đất bạc màu nếu được chăm sóc tốt, bón phân, tưới nước đầy đủ vẫn cho năng suất hoa cao [23]

5.6 Công dụng

Hương lài đã được ứng dụng trong việc gia hương trà: trà lài gói sản xuất thử nghiệm theo dự án Bộ Công Nghiệp nhẹ năm 1994 – 1996, trà lài túi lọc sản xuất tại

TP Hồ Chí Minh năm 1997 – 1998 Hoa lài ứng dụng trong sản xuất xà phòng lài

có mùi thơm dịu và bền tại nhà máy xà phòng Hà Nội năm 1994 Lá lài có vị cay tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, hoa lài có thể chữa cảm sốt, đầy bụng, rễ lài chữa mất ngủ và giảm đau Hoa lài 6 – 12 g phối hợp với lá dây chè, lá ngấy hương hay

lá ngấy tía (mỗi thứ 20 g) sắc uống lúc thuốc còn nóng để chữa đầy bụng [12]

Ở Trung Quốc Jasminum paniculatum được sử dụng cùng với Jasminum

sambac, 5 g Jasminum paniculatum với 15 g Jasminum sambac để tạo mùi hương

cho trà, 20 g hỗn hợp dùng cho 50 g trà Người Trung Quốc, Ai Cập và Ấn Độ đã

sử dụng hoa lài để làm thuốc chống suy nhược thần kinh và chất kích thích, những

người Hindu xâu hoa lài thành vòng để đeo vào cổ sử dụng trong nghi lễ tôn giáo Người Thổ Nhĩ Kỳ sử dụng thân cây lài để làm dây thừng Trà lài được người Trung Hoa rất ưa thích và ở Indonesia nó dùng để trang trí rất phổ biến Tinh dầu hoa lài được dùng để sản xuất các loại nước hoa nổi tiếng hoặc pha loãng để tắm, làm giảm căng thẳng thần kinh và trạng thái bồn chồn Tinh dầu hoa lài giúp cho sự sinh đẻ được dễ dàng, làm giảm co thắt dạ con và xoa dịu sự đau đớn Vì mùi thơm

tự nhiên dịu dàng và dễ chịu nên tinh dầu hoa lài được sử dụng để giải quyết các vấn đề như sự bất lực và bệnh lãnh cảm Tinh dầu hoa lài thích hợp với da khô, da nhờn, da bị kích thích và da nhạy cảm, làm gia tăng tính đàn hồi và thường được sử dụng để làm căng những vết lằn và thẹo Giải quyết các vấn đề về hô hấp như xoa dịu cơn ho, tình trạng khàn giọng và viêm thanh quản Làm giảm sự đau nhức cơ và

bong gân Jasminum angustifolium ở Ấn Độ có rễ đắng, được trộn lẫn với rễ của

Acorus calamu (cây thạch xương bồ), rất có giá trị trong việc chữa bệnh ecpet mảng

tròn [20]

Jasminum sambac được dung điều trị bệnh ngoài da, ung nhọt và sốt Dịch

chiết thô từ mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy của Jasminum sambac có khả năng kháng lại 3 chủng khuẩn Proteius mirabilis, Staphylococcus albus, và Salmonella typhii

[24]

5.7 Nhân giống cây lài bằng phương pháp giâm cành

Cây lài rất dễ trồng, nhân giống chủ yếu bằng cách giâm cành Khi giâm cành thì chọn những bụi lài phát triển tốt, không sâu bệnh Trên những dây “lươn” bò ngang hoặc đứng, khoảng cách giữa các mắt lá gần nhau, dùng dao sắc cắt xéo thành những hom dài 15 – 20 cm (3 đốt lá) Sau khi cắt khoảng 3 – 4 giờ, mặt cắt đã

se lại, lúc này đem giâm hom vào bầu (hoặc trên mặt luống) Bầu gồm có đất mùn tơi xốp, trộn với phân chuồng hoai mục và tro trấu theo tỷ lệ 2:1:1 Sau đó cần thường xuyên tưới đủ ẩm cho hom nhanh ra rễ Nên làm giàn che, chăm sóc khoảng

4 – 5 tháng, khi cây có chiều cao 15 – 20 cm, lá ổn định thì đem trồng ra ruộng [23]