Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy túi phấn cây ớt capsicum annuum l nghiên cứu khoa học

Đối với ớt, nhiều nghiên cứu cũng được tiến hành bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn như: nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen và môi trường đến việc nuôi cấy túi phấn cây ớt Capsicum annuu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP NUÔI CÂY TÚI PHẤN CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L

Sinh viên thực hiện: Lương Thị Mơ

Hồ Hoàng Thuận Trần Thị Kim Phượng Phạm Thị Mỹ Hiền

Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Trần Đông Phương

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được học tập và rèn luyện trong môi trường tốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Trần Đông Phương đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức cùng với kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cám ơn các bạn thành viên trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào đã nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình Cám ơn tình cảm mà

ba mẹ và em đã dành cho con sự ủng hộ những lời động viên của gia đình giúp con có động lực vững bước trên con đường học tập và đường đời

Bình Dương, ngày 11 tháng 4 năm 2018

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 5

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L 8

1.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae 8

1.2 Sơ lược về cây ớt Capsicum annuum L 8

1.2.1 Vị trí phân loại 8

1.2.2 Nguồn gốc, phân bố 9

1.2.3 Đặc tính sinh học của cây ớt 10

1.2.4 Thành phần và công dụng của cây ớt 12

1.2.5 Giá trị kinh tế 12

2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO 13

2.1 Khái niệm và ứng dụng 13

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 13

2.2.1 Sự lựa chọn mẫu cấy 13

2.2.2 Khử trùng mẫu cấy 13

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 14

2.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 14

2.3.1 Ánh sáng 14

2.3.2 Nhiệt độ 14

2.3.3 pH 14

2.3.4 Sự thoáng khí 14

2.3.5 Muối khoáng 14

2.3.6 Nguồn carbon 15

2.3.7 Vitamin 15

2.3.8 Agar 15

2.5.3 Tạo cây đơn bội kép 19

2.5.4 Ứng dụng 20

3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TÚI PHẤN 21

3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cây túi phấn 21

3.1.1 Ảnh hưởng của cây cho túi phấn 21

3.1.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển túi phấn 22

3.1.3 Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy 22

3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần nuôi cấy 22

3.2 Những nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy túi phấn in vitro 23

1 VẬT LIỆU VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 25

1.1 Vật liệu 25

1.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 25

1.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25

1.1.3 Thiết bị và dụng cụ 25

1.1.4 Điều kiện nuôi cấy 25

1.1.5 Môi trường nuôi cấy 25

1.1.6 Hóa chất 25

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Quan sát hình thái hạt phấn trước khi cấy 26

2.2 Khảo sát nồng độ NAA ảnh hưởng đến sự cảm ứng túi phấn tạo phôi cây ớt Capsicum annuum L 27

2.3 Khảo sát nồng độ kinetin ảnh hưởng đến sự cảm ứng túi phấn tạo phôi cây ớt Capsicum annuum L 28

2.4 Khảo sát nồng độ BA ảnh hưởng đến sự cảm ứng tạo chồi từ phôi cây ớt Capsicum annuum L 29

2.5 Theo dõi cây ớt được tạo ra từ quá trình nuôi cấy túi phấn cây ớt 30

1 QUAN SÁT HÌNH THÁI HẠT PHẤN TRƯỚC KHI CẤY 32

2 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ NAA ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ CẢM ỨNG TÚI PHẤN TẠO PHÔI CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L 34

3 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KINETIN ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ CẢM ỨNG TÚI PHẤN TẠO PHÔI CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L 37

4 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BA ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ CẢM ỨNG TẠO CHỒI

TỪ PHÔI CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L 40

5 TẠO CÂY HOÀN CHỈNH TỪ CHỒI ĐÃ CẢM ỨNG 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

1 KẾT LUẬN 45

2 KIẾN NGHỊ 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng II.2.1 Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA ảnh hưởng đến sự cảm ứng túi phấn tạo phôi cây ớt Capsicum annuum L 27 Bảng II.2.2 Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ kinetin ảnh hưởng đến sự cảm ứng túi phấn tạo phôi cây ớt Capsicum annuum L 29 Bảng III.1 Số lượng túi phấn cảm ứng và trạng thái túi phấn trên môi trường MS bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy 35 Bảng III.2 Số lượng túi phấn cảm ứng và trạng thái túi phấn trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L và kinetin với các nồng độ khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy 38 Bảng III 3 Số lượng chồi cảm ứng và trạng thái chồi trên môi trường MS bổ sung BA với các nồng độ khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 40

GA3 Gibberillic acid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy túi phấn cây ớt Capsicum

annuum L

- Sinh viên thực hiện: Lương Thị Mơ

- Lớp: DH14NN01 Khoa: Công nghệ Sinh học Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Trần Đông Phương

2 Mục tiêu đề tài: Tìm ra môi trường thích hợp nuôi cấy túi phấn cây ớt

3 Tính mới và sáng tạo: Ứng dụng trên cây ớt cay, tạo dòng ớt thuần

4 Kết quả nghiên cứu: Tạo ra được cây ớt đơn bội

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng

và khả năng áp dụng của đề tài: Tạo nguồn nguyên liệu cho lai tạo giống ớt

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả

nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên

ghi):………

………

………

………

Ngày tháng năm

Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu)

Người hướng dẫn

(ký, họ và tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Lương Thị Mơ

Sinh ngày: 07 tháng: 09 năm: 1996

Nơi sinh: Hưng Yên

Lớp: DH14NN01 Khóa: 2014

Khoa: Công nghệ Sinh học

Địa chỉ liên hệ: 1011/25 Lê Hồng Phong, Phú Thọ, Thủ Dầu Một, Bình Dương

Điện thoại: 0995592215 Email: luongmo3414@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang học):

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ớt Capsicum annuum L là loại cây trồng phổ biến, được trồng lâu đời ở nhiều

nơi trên thế giới Ở nước ta, ngoài việc dùng để ăn tươi, ớt còn được chế biến thành nhiều mặt hàng đa dạng: tương ớt, ớt khô để xuất khẩu 80 % sang Trung Quốc, thị trường tiềm năng xuất khẩu ớt tươi còn rất cao (châu Âu, Mỹ và Nhật) nhưng do sản phẩm ớt chưa đạt tiêu chuẩn về dư lượng thuốc bảo vệ thực vật màu sắc và kích cỡ ớt

(Võ Thị Thanh Lộc và cs., 2015) Trong những năm qua, năng suất ớt ở nước ta ngày

càng tăng do hàng loạt các giống lai ưu tú được đưa vào sản xuất Tuy vậy, năng suất trung bình của nước ta vẫn còn thấp khoảng 330 tấn/ha (Trung tâm thống kê, tin học, 2013) so với thế giới trên 27 triệu tấn/ha (FAO, 2014) Ớt có chứa thành phần hóa học chủ yếu như: capsacin 0,01 - 0,1 %; vitamin C 0,8 - 1 % (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong 100

g ớt tươi có chứa các thành phần dinh dưỡng như: năng lượng 40 kCal; calcium 14 mg; phosphate 43 mg; iron 1,03 mg; vitamin C 143,7 mg; niacin 1,244 mg; vitamin E 0,69 mg; pantothenic acid 0,201 mg (Cơ sở dữ liệu Dinh dưỡng Quốc gia Mỹ USDA, 2015)

Để tạo được giống ớt lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì bố mẹ phải là các dòng có khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi, khả năng chống bệnh và đặc biệt phải ở dạng đồng hợp tử Tuy nhiên, việc tạo ra các dòng bố mẹ thuần chủng bằng phương pháp tự thụ phấn truyền thống mất rất nhiều

thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi đó, sử dụng kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro có thể rút ngắn việc tạo dòng thuần chỉ còn 2 đến 3 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs., 2005) Cây đơn bội đầu tiên đã được tạo ra nhờ kĩ thuật này từ cây cà độc dược lùn (Blakelsee et al., 1992) Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979), hành (Bohanec và

Jakse, 1999), …

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn là hai phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc tạo cây đơn bội phục vụ cho mục đích lai tạo và nghiên cứu di truyền (Thomas

là một bước ngoặt lớn đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống cây trồng (Trần Duy Qúy, 1999)

Trong họ cà, cây đơn bội được tạo ra với nhiều biện pháp khác nhau như: nuôi

cấy túi phấn cây cà tím Solanum melongena L (Basay et al., 2013), sự tạo callus trong nuôi cấy túi phấn cây ớt Capsicum annuum L với kiểu gen khác nhau, môi trường và nhiệt độ ủ (Roshany et al., 2013) Đối với ớt, nhiều nghiên cứu cũng được tiến hành

bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn như: nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen và môi

trường đến việc nuôi cấy túi phấn cây ớt Capsicum annuum L (Arjunappa et al., 2016; Irikova et al., 2011) Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của phương pháp

nuôi cấy túi phấn phụ thuộc và rất nhiều yếu tố như: kiểu gen của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn, môi trường nuôi cây, nhiệt độ, ánh sáng, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn (Dương Công Kiên, 2003) Dựa trên những lợi ích của việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và nhu cầu sản xuất từ thực tế chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP NUÔI CẤY TÚI PHẤN CÂY

ỚT Capsicum annuum L.” nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho sự tạo phôi từ túi

phấn cây ớt

Phần I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình I.1 Cây ớt (nguồn internet)

1 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CÂY ỚT CAPSICUM ANNUUM L

1.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae

Họ Cà Solanaceae bao gồm khoảng 90 chi và trên 2600 loài phân bố tập trung

ở các vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có khoảng 70 loài gồm các cây thân thảo hoặc cây

nhỏ Một số loài cây được trồng với mục đích nông nghiệp, làm cảnh, làm thuốc và đặc

biệt là cây trồng có ý nghĩa toàn cầu như khoai tây, cà chua và ớt

Cây thường là thân thảo, mặc dù có cây bụi và cây gỗ nhỏ Lá mọc cách, khác nhau về hình dạng và kích thước, thường không có lá kèm hay thay thế Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Quả mọng nước hoặc quả nang Một số loài có hợp chất alkaloid (atropine, nicotine, solanine, tomatine), trong một số trường hợp được sử dụng như thuốc chữa bệnh, nhưng có thể gây độc cho con người và động vật

1.2.2 Nguồn gốc, phân bố

Cây ớt có nguồn gốc từ rất cổ xưa Người ta đã tìm thấy quả ớt khô trong ngôi

mộ cổ của Peru hàng ngàn năm về trước Nhiều tác giả khẳng định rằng ớt có nguồn gốc

từ vùng nhiệt đới châu Mỹ và được trồng trọt lâu đời ở Peru, Mexico Trung tâm khởi nguồn của ớt có thể là Mexico, trung tâm thứ hai là Guatemala và trung tâm thứ ba là Amazon, Peru và Bolivia và phân bố phân bố rộng rãi ở châu Mỹ cả dạng hoang dại và dạng trồng trọt

Ớt là cây trồng được Cristoforo Colombo đưa đến Tây Ban Nha vào năm 1493 khi ông ghé nước này trên hành trình trở về sau chuyến đi vòng quanh thế giới Ớt vào châu Âu đầu thế kỷ thứ XVI, việc gieo trồng ớt phổ biến từ vùng Địa Trung Hải đến nước Anh vào năm 1548 và đến Trung Âu vào cuối thế kỷ thứ XVI Sau đó người Bồ Đào Nha mang ớt từ Brazil đến Ấn Độ vào năm 1885 Ớt vào châu Á đầu thế kỷ XV, được trồng ở Trung Quốc và lan rộng qua Nhật Bản, Bán đảo Triều Tiên

Ớt là cây "đặc sản" của vùng nhiệt đới, các giống ớt trồng ở vùng này thuộc nhóm cay hoặc hơi cay Tuy nhiên ngày nay ớt được trồng rộng rãi trên toàn thế giới từ 55°B - 55°N, đặc biệt nhiều nước ở châu Mỹ và một số nước châu Á như: Trung Quốc,

Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia Nước trồng ớt sớm nhất

ở Đông Nam Á là Indonesia, sớm hơn châu Âu

Nước trồng ớt nhiều nhất là Ấn Độ (70 - 80 nghìn tấn ớt/năm), Brazil (40 - 50 nghìn tấn/năm), Liên Xô (cũ), Trung Quốc (30 - 40 nghìn tấn/năm), Bulgaria, Hungari (20 - 25 nghìn tấn/năm) Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu đầy đủ về lịch sử trồng trọt

ớt cay, nhưng căn cứ vào sự đa dạng của các giống địa phương đã khẳng định ớt được trồng từ rất lâu đời Nhiều giống ớt cũng được người Pháp đưa sang trồng rất sớm, từ

đó ớt được trồng phổ biến ớ các vùng sinh thái khác nhau và chủ yếu trong vụ Xuân Hè Trong khu vực này có nhiều giống ớt địa phương được hình thành để phục vụ cho từng mục đích sử dụng khác nhau (Lê Thị Khánh, 2009)

1.2.3 Đặc tính sinh học của cây ớt

Ớt là cây loại cỏ mọc hàng năm tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Bộ rễ: thuộc loại rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh về bốn phía, có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm Bộ rễ ớt ăn nông hay sâu, mạnh hay yếu có liên quan đến mức độ phát triển các bộ phận trên mặt đất Phụ thuộc và phương pháp trồng, cấu tạo của đất, loại đất, độ ẩm và chế độ canh tác (Lê Thị Khánh, 2009)

Thân: thân thuộc loại thân gỗ, thân tròn, dễ gãy, một số giống còn non thân có lông mỏng Khi thân già, phần sát mặt đất có vỏ xù xì, hoá bần Thân chính cây ớt dài hay ngắn phụ thuộc vào giống, thường biến động 20 - 40 cm thì ngừng sinh trưởng, trong lúc đó các nhánh mọc ra từ thân chính phát triển mạnh nhánh cấp 1, 2, 3 Khi cây già thì khó phân biệt thân chính và các nhánh cấp Trên thân các cành phát triển mạnh

và mọc đối xứng hoặc so le tuỳ giống, chồi ngọn của thân được phân đôi thành hai đỉnh sinh trưởng, mỗi đỉnh sẽ phát triển thành một cành mới, các chồi cành lại tiếp tục phân đôi như vậy Trong sự phân cành này không có thân chính tạo thành trục chủ chốt của cây nên không đảm bảo độ vững chắc, cây rất dễ đổ khi gặp mưa, gió mạnh (đa số các giống ớt hiện nay, các cành cấp 1 mọc so le còn các cành xa cấp 1 mọc đối) Sự phân cành trên thân chính cao hay thấp, sớm hay muộn là phụ thuộc vào đặc tính của giống

và kỹ thuật canh tác (Lê Thị Khánh, 2009)

Lá: lá ớt ngoài nhiệm vụ quang hợp, thì còn là một đặc điểm rất quan trọng để phân biệt giữa các giống với nhau Lá có hai dạng chủ yếu: dạng elip (bầu dục), dạng lưỡi mác Phiến lá nhẵn không có răng cưa, đầu lá nhọn, gân lá dày nổi rõ, phân bố dày

và so le Cuống lá mập, khoẻ, dài, chiều dài cuống thường chiếm 1/3 so với tổng chiều dài lá (2,5 - 5 cm) tuỳ giống Lá ớt thường có màu xanh đậm, xanh nhạt, xanh vàng và màu tím Một số giống trên mặt lá non có phủ lông tơ Diện tích, hình dạng, màu sắc lá phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt Lá ớt nhiều hay ít có ảnh hưởng đến sản lượng quả sau này Lá ít không những ảnh hưởng đến quá trình quanh hợp của cây mà còn làm cho ớt ít quả vì ở mỗi nách lá nơi phân cành là vị trí ớt ra hoa ra quả (Lê Thị Khánh, 2009)

Hoa: ớt là cây hàng năm (cây 1 năm) Hoa lưỡng tính (tự thụ phấn) Đầu nhụy chia hai vòi dài, rất thuận tiện cho quá trình tự thụ phấn Hoa mẫu 5, đều, thường có hiện tượng rụng hoa, rụng nụ trên cây Hoa thường phân bổ đơn hoặc thành chùm (1 - 3

hoa/chùm nhưng rất ít) Nhị có túi phấn tách rời và hợp lại thành 2 - 3 bó Mỗi hoa đều

có cuống hoa, phát sinh từ nách lá và 2 cánh đối xứng nhau Cuống hoa màu xanh, đầu cuống hoa loe ra thành đế hoa Trên các đế hoa có các bộ phận chính như đài, tràng, nhị, nhụy hoa Khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho quá trình thụ phấn, thụ tinh và sinh trưởng dinh dưỡng, thì lớp tế bào riêng lẻ có cấu tạo đặc biệt, bằng nhu mô được hình thành nơi đính cuống hoa (với cành nách lá) Lớp tế bào này sẽ chết đi hình thành tầng rời và làm cho hoa bị rụng, sự mẫn cảm của lớp tế bào này đối với điều kiện ngoại cảnh

là phụ thuộc vào giống (Lê Thị Khánh, 2009)

Quả và hạt: quả ớt thuộc loại quả mọng, nhiều nước có 2 - 3 ô cách nhau bởi vách ngăn dọc theo trục quả (lõi quả) Cấu tạo quả chia làm 3 phần (từ ngoài vào trong): thịt quả, xơ thịt (lõi quả) và hạt nửa quả gần cuống to hơn và chứa nhiều hạt hơn nửa quả phần ngọn Hạt ớt nằm tập trung xung quanh lõi quả Phần lớn chất cay được tập trung phân giữa đến cuống quả Quả ớt chín có màu đỏ, vàng hoặc tím đen Dạng quả:

to hoặc nhỏ, dài hoặc nhọn cuối quả (chìa vôi), quả dài cong ở cuối quả (sừng bò), quả tròn dài Ớt ngọt quả to hơn Ớt cay, ớt ngọt có nhiều hình dạng: tròn dẹt như quả cà chua, tròn dài như quả cà tím, quả đào tròn bầu như quả lê, hoặc dạng sừng bò, chìa vôi phụ thuộc vào đặc tính của giống và kĩ thuật canh tác và độ lớn của quả, trọng lượng và

số lượng quả trên hạt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống, do đó tỉ lệ chất khô/tươi trên cây cũng phụ thuộc vào giống và biện pháp kĩ thuật, hàm lượng chất cay, dinh dưỡng thay đổi ngay trong một quả và phụ thuộc vào giống cũng như chế độ dinh dưỡng, nước Hạt

ớt nhẵn, dẹp có màu vàng Sức nảy mầm hạt giống khá cao, nếu bảo quản tốt có thể giữ được 2 - 3 năm (Lê Thị Khánh, 2009)

1.2.4 Thành phần và công dụng của cây ớt

Ớt chứa nhiều chất dinh dưỡng dễ tiêu hóa như đường, đạm, caroten, các sinh

tố khác như vitamin C, B1, B2 (Lê Thị Khánh, 2009) Trong 100 g ớt tươi có chứa các thành phần dinh dưỡng như: năng lượng 40 kCal; calcium 14 mg; phosphate 43 mg; iron 1,03 mg; vitamin C 143,7 mg; niacin 1,244 mg; vitamin E 0,69 mg; pantothenic acid 0,201 mg (Cơ sở dữ liệu Dinh dưỡng Quốc gia Mỹ USDA, 2015)

Ngoài công dụng làm gia vị, ớt có thể là một vị thuốc làm giúp sự tiêu hóa, ăn ngon chóng tiêu Dùng ngoài, ớt là một vị thuốc gây đỏ, kích thích tại chỗ, những trường hợp đau do phong thấp, đau lưng, đau khớp, chữa rắn rết cắn (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.5 Giá trị kinh tế

Ớt là cây gia vị quen thuộc với nhân dân Ớt cay xay thành bột là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị trong nhiều năm gần đây Nếu chế biến được tinh dầu ớt thì giá trị xuất khẩu lại càng tăng lên gấp bội

Từ năm 1986 - 1990 là thời kỳ trồng ớt xuất khẩu mạnh nhất, mỗi năm nước ta xuất khẩu trên 2000 tấn ớt bột khô sang thị trường Liên Xô (cũ) Một tấn ớt bột xuất khẩu loại một thu được 1400 - 1500 rupe tương đương 7 tấn đạm urê hoặc 17 - 18 tấn thóc, 1 tấn lạc nhân 450 - 500 rupe, một tấn gạo ngon 300 - 350 rupe (1987) Nó là mặt hàng xuất khẩu cao và ổn định về giá cả trong vòng 5 năm (1985 - 1990) nhưng khi thị trường các nước Đông Âu bị mất thì hiện nay ớt được xuất khẩu dưới dạng muối mặn (10 - 20 % muối) hoặc quả khô bằng con đường tiểu ngạch ra nước ngoài Xuất khẩu qua công ty rau quả mỗi năm khoảng 500 - 700 tấn ớt quả tươi Một sào trồng ớt thu lãi

1 - 1,6 triệu đồng trên vụ Ớt là nguyên liệu trong công nghiệp chế biến thực phẩm, làm gia vị Vì chất cay tan trong nước và không bị mất mùi vị do đun nấu hoặc bảo quản

Cây ớt rất dễ tính, kỹ thuật gieo trồng và đầu tư cho sản xuất ít tốn kém và phức tạp so với một số cây trồng khác Ớt được trồng trên nhiều chân đất khác nhau, nếu chăm sóc đúng kỹ thuật thì trên đất kém màu mỡ vẫn cho năng suất, hiệu quả kinh tế khá hơn một số cây màu, cây công nghiệp khác cũng trồng trên đất ấy Vì vậy đẩy mạnh trồng

ớt là điều kiện sử dụng có hiệu quả các loại đất, góp phần cải tạo đất trong một chế độ luân canh thích hợp đồng thời tận dụng được sức lao động ở địa phương để phát triển nông nghiệp toàn diện (Lê Thị Khánh, 2009)

2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

2.1 Khái niệm và ứng dụng

Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện

vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được sử dụng để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa học, di truyền học và cấu trúc thực vật (Dương Công Kiên, 2002)

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô

2.2.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

Việc lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nuôi cấy mô Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa cũng thường có kết quả tái sinh rất tốt Mẫu cấy thích hợp phải có khả năng biểu hiện tính toàn thế (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2 Khử trùng mẫu cấy

Phần quan trọng nhất trong kĩ thuật vô trùng và quá trình nuôi cấy là khử trùng mẫu cấy, môi trường, duy trì trạng thái khi đưa mẫu vào bình Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy mô thực vật Bào tử nấm có trọng lượng nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống của chúng ta Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy thì đây là điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và từ đó phát triển nguồn lây bệnh (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố quan trọng quyết định

sự thành công trong nuôi cấy mô Nhìn chung, môi trường nuôi cấy sẽ bao gồm các muối

vô cơ (các khoáng đa lượng và khoáng vi lượng), các chất hữu cơ như: chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, đường Ngoài ra, môi trường nuôi cấy còn có các amino acid, kháng sinh hoặc các phức hợp tự nhiên (Dương Công Kiên, 2002)

2.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

2.3.1 Ánh sáng

Đối với mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết, vì năng lượng được cung cấp dưới dạng glucid trong môi trường nuôi cấy Tuy vậy sự quang tổng hợp đường dường như không bị hủy bỏ mà chỉ giảm mạnh Ngoài ra, ánh sáng còn cần thiết để điều hòa vài quá trình về hình dạng cây (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro

Nhiệt độ phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ 22 đến 25 °C (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.3 pH

Ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.6 Nguồn carbon

Cây in vitro sống chủ yếu bằng phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng

nhân tạo cây có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy các nguồn carbon dưới dạng hữu cơ là bắt buộc, giúp cho

tế bào phân chia và tăng sinh khối Tùy mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đường khác nhau: sucrose, glucose, maltose, galactose, lactose ở nồng độ thường 20 - 40 g/L (Dương Công Kiên, 2002)

Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, thoái biến và hình thành melanoidin, một chất màu sẫm và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào

2.3.7 Vitamin

Việc sử dụng vitamin làm thuận lợi hơn cho sự phát triển của cây nuôi cấy in

vitro (Dương Công Kiên, 2002)

2.3.8 Agar

Agar là một polyoside có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mô do thiếu oxy (Dương Công Kiên, 2002)

2.4 Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng

2.4.1 Auxin

Auxin là những hợp chất được đặc tính hóa bởi khả năng gây ảnh hưởng đến sự kéo dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh và giống như indole-3-acetic acid (IAA) trong hoạt động sinh lý Auxin cũng có những ảnh hưởng khác bên cạnh sự kéo dài, nhưng sự kéo dài là quan trọng nhất Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bão hòa hoặc những dẫn xuất của chúng (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò rất

Auxin có thể được chia thành 6 nhóm sau:

Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA) Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram) Những naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β-NAA)

Những naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β-NOA) Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây như: kéo dài tế bào, quang hướng động, địa hướng động ưu thế chồi ngọn, sự tượng rễ, sự sinh sản ethylene, sự phát triển trái, sự trinh sản, sự rụng và sự thể hiện giới tính (Bùi Trang Việt, 2000)

Trong số các loại auxin được sử dụng, 2,4-D được xem là một auxin mạnh, có tác dụng giúp hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ quá cao auxin này

sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong cây được nuôi cấy

Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao Điều

này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động của enzyme IAA oxidase

và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định

2.4.2 Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa tăng trưởng khác giống như kinetin (6-furfuryl aminopurine) Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá bẹ được thanh trùng và được gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào trong mô lõi thuốc lá Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên

từ hạt bắp non và được gọi là zeatin (6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino) purine) Ngày nay, hầu hết cytokinin được tìm thấy trong cây là zeatin (Bùi Trang Việt, 2000)

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật Ở rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích tăng chiều rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của

diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi

Cytokinin có hai loại: tự nhiên như zeatin và 2-ip hoặc được tổng hợp như kinetin, BA, TDZ Kinetin là chất có khả năng phân chia tế bào mạnh mẽ và có ảnh hưởng đến sự nảy mầm TDZ là chất có tác động tích cực trong việc cảm ứng và hình thành phôi

Hiện nay, cytokinin được tổng hợp khá nhiều, thông dụng nhất là kinetin và BA Cytokinin đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh, vi khuẩn, tế bào động vật Hiện nay, có hơn 200 loại cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện (Bùi Trang Việt, 2000)

Cytokinin ảnh hưởng nhiều đến sinh lý trong cây như sự phân chia tế bào và sự tạo thành cơ quan, sự nảy mầm, sự mở rộng tế bào và cơ quan, sự tượng rễ và sự phát triển rễ, sự phát triển nụ và chồi, trì hoãn sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những hợp chất hữu cơ (Bùi Trang Việt, 2000)

Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm

sự kéo dài của chồi Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất

2.5 Cây đơn bội và đơn bội kép

Hầu hết các loại cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến

là nhị bội (2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều

bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp tử (bất kể là nhị bội hay tứ bội) thì sự biểu hiện tính trạng của mỗi gen hoàn toàn phụ thuộc vào tính trạng trội hay lặn của chúng quyết định, điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc nghiên cứu di truyền Vì vậy, mức bội thể lí tưởng để có thể thực hiện các nghiên cứu

di truyền là mức đơn bội (1n) Với mức bội thể đơn bội này chúng ta hoàn toàn có thể tác động hoặc cá thể đơn bội đó có thể tự nhân đôi để tạo thành cây đơn bội kép hoàn

toàn đồng hợp tử (Jain et al., 1996) Điều này giúp tăng cường hiệu quả chọn lựa các

tính trạng mong muốn

Cây đơn bội thường có nhiều tính trạng tương tự cây lưỡng bội Tuy nhiên, từ kích thước tế bào đến các bộ phận đều nhỏ hơn cây lưỡng bội do số lượng gen và nhiễm sắc thể đều bị giảm đi Chúng có sức sống yếu và có những nét đặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội đều được thể hiện ra kiểu hình Các cây đơn bội đều bị bất dục

vì các giao tử không phân chia và mang nhiễm sắc thể là n

Cây đơn bội khi được lưỡng bội hóa sẽ tạo thành cây có kiểu gen đồng hợp tử

ở tất cả các gen dẫn đến tình trạng thuần chủng Điều này mang lại ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn thời gian tạo dòng thuần góp phần hữu ích cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống

Nếu tác động đột biến vào cây đơn bội sẽ phát hiện được ngay đột biến, sau đó nếu lưỡng bội hóa sẽ được dạng đồng hợp tử về gen đột biến và dễ dàng duy trì thông qua sinh sản hữu tính

Trong quá trình nuôi cấy túi phấn, không phải hầu hết các cây thu được đều là đơn bội Mô giao tử có thể tự lưỡng bội hóa, mô sẹo và phôi lưỡng bội cũng có thể phát triển từ tế bào bao phấn nên cây tái sinh sẽ là cây lưỡng bội giống hệt cây mẹ Có thể xác định cây đơn bội bằng cách: đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, đo gián tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước

và khả năng tăng trưởng, phát triển (Phan Hữu Tôn, 2004)

2.5.2 Tạo cây đơn bội in vitro

Đối với công tác chọn lọc và lai tạo giống việc có được hai dòng bố mẹ thuần chủng là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, với phương pháp tự thụ phấn truyền thống sẽ

mất rất nhiều thời gian từ 6 - 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi đó nếu áp

dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro sẽ rút ngắn thời gian tạo dòng thuần thậm chí chỉ còn 2 - 3 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs, 2005)

Hai phương pháp cơ bản được áp dụng phổ biến nhất là:

 Nuôi cấy trực tiếp từ hạt phấn hay từ noãn chưa thụ tinh

Cấu trúc dạng phôi sẽ phát triển trực tiếp từ hạt phấn hoặc từ noãn chưa thụ tinh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

 Nuôi cấy gián tiếp thông qua mô sẹo

Cây hoàn chỉnh được phát triển từ khối mô sẹo (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại bào

tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho việc nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng

Cây đơn bội đầu tiên đã được tạo ra từ cây cà độc dược lùn bằng phương pháp

nuôi cấy bao phấn (Blakelsee et al., 1922) Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979), hành (Bohanec

và Jakse, 1999)

2.5.3 Tạo cây đơn bội kép

Cây đơn bội kép thường được tạo ra bởi hai phương pháp chính là xử lý bằng colchicine và tái sinh trực tiếp từ lá cây đơn bội

Hạt phấn hay

Noãn chưa thụ tinh

Một phương pháp khác là tái sinh trực tiếp từ lá cây đơn bội

(Niemirowicz-Szczytt et al., 1995) Tuy nhiên kết quả thu được không hiệu quả bằng phương pháp xử

lí bằng colchicine Khi tiến hành tái sinh từ lá thứ nhất và lá thứ hai của cây đơn bội, kết quả thu được có sự khác biệt rõ rệt Tất cả cây tái sinh từ lá thứ nhất đều là đơn bội kép

nhưng khi từ lá thứ hai thì tỷ lệ đạt được là 70,5 %, lá tiếp theo là 28,2 % (Faris et al.,

2000) Điều này cho thấy độ tuổi phát triển của mô được tái tạo góp một phần quan trọng trong việc làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể

Dù bằng phương pháp nào thì việc tạo ra cây đơn bội kép vẫn là một bước tiến quan trọng góp phần tạo ra dòng đơn bội hoàn toàn đồng hợp tử giúp ích rất nhiều cho việc nghiên cứu và chọn tạo giống mới

2.5.4 Ứng dụng

Từ rất lâu, người ta cũng đã biết đến giá trị của cây đơn bội tuy nhiên tần suất xuất hiện của cây đơn bội trong tự nhiên là rất thấp do đó không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Các tác giả cho rằng bình quân các nhà nghiên cứu sẽ tiết kiệm được khoảng

5 năm khi sử dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro vào việc tạo ra giống mới

Việc đưa cây đơn bội vào chương trình tạo giống đã trở thành phổ biến trên thế giới (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

Tạo cây đơn bội kép từ cây đơn bội là một bước tiến hữu ích cho ngành lai tạo

và chọn giống Với kiểu gen hoàn toàn đồng hợp tử chúng ta có thể dễ dàng lựa chọn

những kiểu gen mong muốn Lofti và cs, 2003 đã sử dụng giống lai được lai tạo từ nhiều

giống có đặc tính kháng các bệnh khác nhau để làm vật liệu tạo ra cây đơn bội và đơn

bội kép phục vụ cho việc tạo ra giống dưa hấu (Cucumis melo L.) có thể kháng một số loại virus Nghiên cứu về việc chọn lọc các cây dưa hấu (Cucumis melo L.) mang gen kháng phấn trắng do nấm Sphaerotheca fuliginea gây ra ở mức độ đơn bội cũng đã được công bố (Kuzuya et al., 2003)

Ngoài các ứng dụng chuyển gen để tạo ra các giống mong muốn Cây đơn bội

và đơn bội kép còn được sử dụng để lập bản đồ di truyền (Forster và Thomas, 2005), nghiên cứu đột biến và nghiên cứu phân tử

3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TÚI PHẤN

Nuôi cấy túi phấn chứa các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội kép được sử dụng rộng rãi trong cải tiến giống cây trồng Thông qua phương pháp này, có thể rút ngắn thời gian chọn tạo, tăng tính biến dị cho

chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa Kỹ thuật nuôi cấy in vitro kích thích tiểu bào tử

phát triển thành cây trong môi trường nuôi cấy túi phấn và hạt phấn Cho phép nhân nhanh chóng và tạo ra hàng loạt cây đơn bội kép Đó là một bước ngoặt đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống cây trồng (Trần Duy Quý, 1999)

Sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong túi phấn trải qua các giai đoạn sau:

từ bào tử tế bào mẹ thông qua tính phân bào giảm nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội) Sau đó các tiểu bào tử hình thành các giao tử đực (hạt phấn cũng đơn bội) Nhưng khi nuôi túi phấn trong môi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi Dưới sự tác động của hàng loạt các yếu tố trong môi trường nhân tạo, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng, trong tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hóa, từ đó các bào tử sẽ phân chia thành mô sẹo, các mô sẹo này lúc đầu là đơn bội Sau đó tùy theo từng điều kiện nuôi cấy chúng có thể là đơn bội, đơn bội kép hay lưỡng bội hóa, khi chuyển vào trong môi trường tái sinh cây, sẽ thu được cây con tương ứng Khi cần thiết cây đơn bội thu được (Trần Duy Quý, 1999)

3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cây túi phấn

Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của phương pháp nuôi cấy túi phấn phụ thuộc và rất nhiều yếu tố như: kiểu gen của cây cho bao phấn, nhân tố thành túi phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, ánh sáng, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn (Dương Công Kiên, 2003)

3.1.1 Ảnh hưởng của cây cho túi phấn

Kiểu gen của cây cho túi phấn có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy, không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Túi phấn

3.1.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển túi phấn

Các giai đoạn phát triển của túi phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Túi phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp đồng thời tỷ lệ bạch tạng càng cao Tuy nhiên, không phải tất cả các loại cây đều có giai đoạn tối ưu như nhau Theo Nizeki và Oono, 1968 thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho cây lúa, còn theo Clapham, 1971 cho rằng cây đại mạch có hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm Vì vậy, để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy túi phấn, giai đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa rất quan trọng

3.1.3 Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy

Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với túi phấn hoặc cây cho túi phấn trước khi nuôi cấy đều có tác động đối với sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống Điều kiện lạnh sẽ kích thích việc tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây cao Các giống khác nhau cũng như trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý Ying, 1983 đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh trước nuôi cấy lên hiệu quả nuôi cấy túi phấn, kết quả cho thấy: xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo ở nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược và lúa nước Tapia

và cs, 1990 cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hóa và làm tăng sự phân chia của

hạt phấn, giúp giải phóng những chất cần thiết cho sự sinh sản đơn tính đực Nghiên cứu của Sugimoto lại cho thấy 20 xử lý lạnh làm tăng lượng acid amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây từ mô sẹo (Trần Văn Lài, 2005)

3.1.4 Ảnh hưởng của thành phần nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của nuôi cấy túi phấn Nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White, môi trường MS, môi trường Gamborg, môi trường Nitsch… Tùy theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau mà những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp Tuy nhiên cũng có một số quy luật chung: các cây hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4-D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên, ở lúa mì cần lượng đường saccarose là 60 - 120 g/L trong khi các cây họ cà chỉ cần 20 - 40 g/L Dịch chiết khoai tây, nấm men, nước có tác dụng đối với nhiều môi trường nuôi cấy (Hồ Kì Quang Minh, 2009)

3.2 Những nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy túi phấn in vitro

và cs, 2013)

Ngoài nước

Năm 2016, Arjunappa H M và cs, nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen và môi

trường nuôi cấy trong việc hình thành phôi trực tiếp của cây ớt Nghiên cứu 10 kiểu gen (PH 8, PH 11, PH 17, PH 25, PH 43, PH 50, PH 53 và PH 57), sử dụng môi trường MS

và 5 tổ hợp chất điều hòa tăng trưởng Kết quả cho thấy kiểu gen cho tỉ lệ phôi cao nhất

là PH 53 trong môi trường MS với kinetin 0,1 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L (Arjunappa et

al., 2016)

Năm 2011, Irikova T và Grozeva S., nghiên cứu so sánh các kết quả trong nuôi cấy túi phấn cây ớt Tìm hiểu các vấn đề liên quan tới lĩnh vực này, và ảnh hưởng của các yếu tố quan trọng cho sự hình thành phôi thành công và phát triển cây con như điều kiện phát triển và tuổi của cây mẹ, kiểu gen của cây mẹ, giai đoạn phát triền của túi phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, chất điều hòa tăng trưởng Kết quả cho thấy môi trường thích hợp là môi trường bazơ (môi trường cảm ứng C và môi trường tái sinh R-

Dumas de Vaulx et al., 1981; MS-Murashige và Skoog 1962), chất điều hòa tăng trưởng

thực vật là kinetin và 2,4-D, giai đoạn phát triển của tế bào là vào kì cuối Shock nhiệt

trước khi cấy là 4 °C và sau khi cấy là 35 °C (Irikova et al., 2011)