Nghiên cứu môi trường thích hợp nuôi cấy bao phấn cây cà tím solanum melongena l nghiên cứu khoa học

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ khử mẫu với CaClO 2 ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L.. Mục tiêu đề tài: Xâ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP NUÔI CẤY BAO PHẤN CÂY CÀ TÍM SOLANUM

MELONGENA L

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Tuyết Nhi

Hồ Hoàng Thuận Trần Thị Kim Phượng Phạm Thị Mỹ Hiền

Người hướng dẫn: TS Lê Thị Kính

ThS Nguyễn Trần Đông Phương

MỤC LỤC

Phần I: MỞ ĐẦU 3

I ĐẶT VẤN ĐỀ 3

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2. GIỚI THIỆU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CÂY CÀ TÍM (Solanaum melongena L.) 4

2.1 Tổng quan về Họ Cà Solanaceae 4

2.2 Tổng quan về cây cà tím 5

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố 6

2.2.2 Đặc tính sinh học của cây cà tím 7

2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế 8

2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.1 Giới thiệu chung 9

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 9

2.3.3 Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô 11

2.5 Sự phát sinh cơ quan 13

2.6 Kĩ thuật nuôi cấy bao phấn 14

2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn 15

2.7.1 Ảnh hưởng kiểu gen của cây cho bao phấn 15

2.7.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển bao phấn 16

2.7.3 Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy 16

2.7.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy 16

2.8. Những nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro 17

2.8.1 Trên thế giới 17

2.8.2 Ở Việt Nam 17

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Vật liệu 18

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

3.1.3 Điều kiện nuôi cấy 19

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 19

3.1.5 Hóa chất 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Quan sát hình thái hạt phấn trước khi cấy 20

3.2.2 Khảo sát nồng độ khử mẫu với Ca(ClO) 2 ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L. 20

3.2.3 Khảo sát môi trường cảm ứng MS, CBM, C và Nitsch có bổ sung 2,4-D và kinetin đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L. 21

3.2.4 Khảo sát nồng độ kinetin trong muôi trường R đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melogena L. 22

3.2.5 Quan sát hình thái giải phẫu 23

3.2.6 Khảo sát nồng độ NAA và BA trong môi trường MS đến sự cảm ứng tạo chồi từ mô sẹo cây cà tím Solanum melongena L 24

Phần II: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

Chương 1: QUAN SÁT HÌNH THÁI HẠT PHẤN TRƯỚC KHI CẤY 26

Chương 2: KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHỬ MẪU VỚI CA(CLO) 2 ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO TỪ BAO PHẤN CÂY CÀ TÍM SOLANUM MELONGENA L 27

Chương 3: KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG MS, C VÀ NITSCH CÓ BỔ SUNG 2,4-D VÀ KINETIN ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO TỪ BAO PHẤN CÂY CÀ TÍM SOLANUM MELONGENA L 29

Chương 4: KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KINETIN TRONG MÔI TRƯỜNG R ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO TỪ BAO PHẤN CÂY CÀ TÍM SOLANUM MELOGENA L 32

Chương 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU 34

Chương 6: KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ NAA VÀ BA TRONG MÔI TRƯỜNG MS

ĐẾN SỰ CẢM ỨNG TẠO CHỒI TỪ MÔ SẸO CÂY CÀ TÍM SOLANUM

MELONGENA L 35

Phần III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

I Kết luận 40

II Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ khử mẫu với Ca(ClO) 2 ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L 21 Bảng 2: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát môi trường cảm ứng MS, C và Nitsch có bổ sung 2,4-D và kinetin đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L 22 Bảng 3: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ kinetin trong môi trường R đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L

23

Bảng 4: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA và BA trong môi trường MS đến

sự cảm ứng tạo chồi từ mô sẹo cây cà tím Solanum melongena L……… 24 Bảng 5: Số bao phấn thích ứng và trạng thái sau khi khử trùng trong dung dịch chứa Ca(ClO)2 với các nồng độ khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy 27 Bảng 6: Số bao phấn cảm ứng và trạng thái bao phấn cà tím trên các môi trường nuôi cấy khác nhau có bổ sung (2,4-D 5 mg/L, kinetin 5 mg/L) sau 4 tuần nuôi cấy 29 Bảng 7: Số bao phấn cảm ứng hình thành mô sẹo trên môi trường R chứa kinetin với

tỷ lệ nồng độ khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy 31 Bảng 8: Sự thay đổi kích thước mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung NAA và BA với

tỷ lệ nồng độ khác nhau sau 12 tuần nuôi cấy 36

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2-iP 6-y-y-dimethyl-aminopurine

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp bao phấn cây cà tím Solanum

melongena L

- Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Tuyết Nhi

- Lớp: DH14NN01 Khoa: Công nghệ sinh học

Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4 năm

- Người hướng dẫn: TS Lê Thị Kính

ThS Nguyễn Trần Đông Phương

2 Mục tiêu đề tài:

Xây dựng nên quy trình tạo ra cây cà tím đơn bội invitro từ kỹ thuật nuôi cấy

bao phấn: tìm ra được giai đoạn phát triển nào của nụ hoa là tốt nhất, nồng độ khử mẫu bao nhiêu là tốt nhất để bao phấn vô trùng, môi trường cảm ứng, nồng độ chất điều hòa tăng trưởng ảnh hưởng đến quá trình tạo mô sẹo (môi trường R có bổ sung nồng độ Kinetin khác nhau) và hình thành chồi từ mô sẹo (môi trường MS có bổ sung NAA :BA khác nhau) Tìm ra được thời gian, nhiệt độ, ánh sáng, kỹ thuật xử lý mẫu, môi trường cũng như nồng độ chất điề hòa tăng trưởng thực vật ảnh hưởng tích cực nhất đến quá trình hình thành cây đơn bội

3 Tính mới và sáng tạo:

Thay vì sử dựng phương pháp tự thụ phấn truyền thống tốn từ 6 – 8 thế hệ, thì

sử dựng kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro (kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn)

thì chỉ từ 2 – 3 thế hệ (rút ngắn thời gian) Có thể ứng dựng trên cây đơn tính và lưỡng

tính (bao phấn và noãn)

Xử lý sốc nhiệt ở nhiệt độ cao (35 oC) trong bóng tối, tăng khả năng cảm ứng

cho quá trình hình thành cây đơn bội invitro

4 Kết quả nghiên cứu: Tìm ra được nụ hoa được thu hái trước khi nở 2 ngày từ 1,7 –

2 cm, bao phấn có kích thước từ 0,4 cm đến 0,45 cm có màu xanh hơi chuyển sang vàng cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất

Cùng với nồng độ khử mẫu Ca(ClO)2 20 mg/L giúp bao phấn cà tím hạn chế sự lây nhiễm vi khuẩn và vi nấm tốt nhất và bao phấn phát triển tốt

Từ kết quả cho thấy môi trường nuôi cấy C bổ sung 2,4-D 5 mg/L, kinetin 5 mg/L là môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím

Với kinetin 0.3 mg/L được bổ sung vào môi trường nuôi cấy R cho kết quả cao nhất cho quá trình hình thành mô sẹo của bao phấn

Cuối cùng, với tỷ lệ NAA 0,6 mg/L và BA 2,5 mg/L được bổ sung vào môi trường MS cho kết quả về sự thay đổi kích thước mô sẹo vượt trội và hình thành mô sẹo màu xanh nhạt xốp mềm là tiền đề cho sự hình thành chồi từ mô sẹo cao nhất

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài: Tạo ra được những dòng bố mẹ thuần chủng với những

đặc điểm nổi trội, đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng Hạn chế được việc nhập khẩu hạt giống vào nước ta trong khi ta đã có thể tạo ra được hạt giống nhờ kỹ thuật

tạo ra cây đơn bội invitro

Tìm ra hướng đi mới cho phương pháp tạo giống thuần chủng, cũng như tạo động lực để phát triển những nghiên cứu tương tự đối với nhiều đối tượng thực vật khác nhau Làm đa dạng thêm thị trường giống của Việt Nam, góp phần vào kinh tế Tạo điều kiện để ngành Công nghệ tế bào thực vật cũng như ngành công nghệ sinh học phát triển

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp

chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực

hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Ngày 11 tháng 4 năm 2018

Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu)

Người hướng dẫn

(ký, họ và tên)

Nguyễn Trần Đông Phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

I SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Nguyễn Thị Tuyết Nhi

Sinh ngày: 04 tháng 09 năm 1996

Nơi sinh: Xã Eabar, Huyện Buôn Đôn, Tỉnh Đăk Lăk

Lớp: DH14NN01 Khóa: 2014 - 2018

Khoa: Công nghệ sinh học

Địa chỉ liên hệ: Số 68, Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành Phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương

Điện thoại: 01674485058 Email: nhinguyen.11041996@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung bình khá

Sơ lược thành tích: Học bổng khuyến khích học tập 2015 – 2016

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Học bổng khuyến khích học tập 2017 – 2018

Bảo vệ xuất sắc thực tập tốt nghiệp 2017 – 2018

Phần I: MỞ ĐẦU

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Cà tím (Solanum melongenla L.) có nguồn gốc từ Ấn Độ và ngày nay được

trồng ở khắp vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và vùng có khí hậu ấm Cà tím là một loài cây phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Tên tiếng Anh “eggplant” được bắt nguồn từ hình dạng quả của cây rau này trông giống như trứng gà Việt Nam những loài như cà tím, cà bát và cà pháo được sử dụng như một loại rau (Vũ Văn Liết

và Vũ Đình Hòa, 2005) Ngoài việc dùng để chế biến thành các món ăn, cà tím còn được chế biến thành nhiều mặt hàng đa dạng: đóng hộp, thái lát, muối mặn để xuất khẩu sang một số nước khác như: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapore (Lê Thị Khánh, 2008)

Những năm qua năng suất cà tím ở nước ta ngày càng tăng do hàng loạt các giống lai ưu tú được đưa vào sản xuất Tuy vậy, năng suất trung bình của nước ta vẫn còn thấp 18,3 tấn/ha (Tổng cục thống kê, 2009) so với thế giới 30,9 tấn/ha (FAO, 2009)

Để tạo được giống cà tím lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì bố mẹ phải là các dòng có khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi, khả năng chống bệnh và đặc biệt phải ở dạng đồng hợp tử Tuy nhiên, việc tạo ra các dòng bố mẹ thuần chủng bằng phương pháp tự thụ phấn truyền thống mất rất nhiều thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi đó, sử

dụng kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro (Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn) có thể rút ngắn việc tạo dòng thuần từ 2 đến 3 thế hệ (Lê Huy Hàm et al., 2005). Cây đơn bội đầu tiên

đã được tạo ra nhờ kĩ thuật này từ cây cà độc dược lùn (Blakelsee et al., 1922) Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc

lá (Burk et al., 1979), hành (Bohanec, Jakse, 1999)

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn là hai phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc tạo cây đơn bội phục vụ cho mục đích lai tạo và nghiên cứu di truyền

(Thomas et al., 2000; Bhat, Murthy, 2007) Nuôi cấy bao phấn chứa các tiểu bào tử

hoặc bao phấn chưa chín trong môi trường nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội kép thường được sử dụng rộng rãi trong cải tiến cây trồng Thông qua phương pháp này, có thể rút ngắn thời gian nhân tạo, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa Kỹ

thuật nuôi cấy in vitro kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong môi trường nuôi

cấy bao phấn và hạt phấn Cho phép nhân nhanh và tạo ra hàng loạt cây đơn bội kép

Đó là một bước ngoặc đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống cây trồng (Trần Duy Qúy, 1999)

Trong thực vật, cây đơn bội được tạo ra với nhiều biện pháp khác nhau như: nuôi cấy bao phấn Ngô bằng phương pháp lai lưỡng tính (Lê Huy Hàm, 2005) Ảnh

hưởng của các yếu tố kiểu gen đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ở cây ớt Capsicum

annuum L (Dumas et al., 1981) Đối với cà tím, nhiều nghiên cứu cũng được tiến

hành bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn: thu nhận các dòng dihalpoid bằng cách sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phần ở các giống cà tím khác nhau (Basay et al.,

2011) Ảnh hưởng của các yếu tố kiểu gen đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ở cây cà tím (Basay and Ellialtıoğlu, 2013) Nuôi cấy bao phấn là phương pháp được xem là

thành công nhất trong việc sản xuất cây đơn bội trong nhiều loài (Hansen et al., 1995; Alanet et al., 2003) nhưng lại bị kiểm soát bởi nhiều yếu tố: lựa chọn kiểu gen, giai đoạn phát triển của bao phấn, tiền xử lý, thành phần nuôi trường nuôi cấy, sự biến đổi

của phôi, điều kiện chiếu sáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Gémes-Juhász et

al., 2002, Jin-Feng Chen et al., 2010, Shalaby 2007)

Nuôi cấy bao phấn là phương pháp được xem là thành công nhất trong việc sản

xuất cây đơn bội trong nhiều loài (Alanet et al., 2003, Hansen et al., 1995) nhưng lại

bị kiểm soát bởi nhiều yếu tố: lựa chọn kiểu gen, giai đoạn phát triển của bao phấn, tiền xử lý, thành phần nuôi trường nuôi cấy, sự biến đổi của phôi, điều kiện chiếu sáng

và chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Gémes-Juhász et al., 2002, Jin-Feng Chen et al.,

2010, Shalaby 2007)

Dựa trên những lợi ích của việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nhu

cầu sản xuất từ thực tế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu môi trường

thích hợp nuôi cấy bao phấn cây cà tím Solanum melongena L.” nhằm tìm ra môi

trường thích hợp cho sự tạo chồi từ mô sẹo bao phấn cây cà tím

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2 GIỚI THIỆU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CÂY CÀ TÍM (Solanaum melongena L.)

2.1 Tổng quan về Họ Cà Solanaceae

Họ Cà có danh pháp khoa học là Solanaceae, là một họ thực vật bao gồm cà chua (Solanum lycopersicum L.), cà tím (Solanum melongena L.), ớt (Capsicum

annum L.), khoai tây (Solanum tuberosum L.) Họ Cà là một trong những họ quan

trọng trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới, mặc dù không quan trọng như họ

Hòa thảo (Poaceae), họ Đậu (Fabaceae) hay họ Bầu bí (Cucurbitaceae)

Họ Cà gồm khoảng 102 chi và trên 2600 loài phân bố tập trung ở các vùng nhiệt đới (APG II, 2003) Ở Việt Nam có khoảng 70 loài Một số loài cây được trồng với mục đích nông nghiệp, làm cảnh, làm thuốc

Cây thường là thân thảo, mặc dù có thân bụi, thân cứng và thân leo Lá mọc cách, khác nhau về hình dạng và kích thước, thường không có lá kèm hay thay thế Hoa mọc từ nách lá, đều, lưỡng tính, mẫu 5 Quả mọng nước hoặc quả nang Một số loài có hợp chất alkaloid (atropine, nicotine, solanine, tomatine), trong một số trường hợp được sử dụng như thuốc chữa bệnh, nhưng cũng có một số loài gây độc cho con người và động vật

Hình 1.1: Cây cà tím

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố

Cà tím Solanum melongena L có nguồn gốc từ Tiểu lục địa Ấn Độ, sau đó

được giới thiệu sang các nước thuộc vùng Nam Á, Đông Nam Á và Đông Á từ thời tiền sử Ở Trung Quốc cây cà tím xuất hiện trong sách nông nghiệp cổ đại vào năm

544 Ở Địa Trung Hải đã mô tả loài cây này khoảng thế kỷ thứ XX và ở nước Anh ghi nhận loài cây này khoảng giữa thế kỷ thứ XVI (Hồ Đình Hải, 2013) Cà được nhập vào Châu Âu từ thế kỷ XV, nay được trồng phổ biến ở các vùng nam Châu Âu, Châu

Á và Bắc Mỹ Ngày nay, có thể tìm thấy Solanum melongena L bán hoang dã ở vùng Myanmar - Vân Nam, nơi nó được thuần hoá từ tổ tiên hoang dã Solanum insanum

Bằng chứng về việc trồng trọt và sử dụng Solanum melongena L đã xuất hiện

trong văn học nông nghiệp của người Sanskrit và Trung Quốc từ 2.000 năm Sự mở rộng của Hồi giáo khoảng thế kỷ VIII - TCN đã gây ra sự lây lan của cà tím qua Châu Phi và Châu Âu (Phạm Hoàng Hổ, 2006) Ngày nay, cà tím được tìm thấy khắp mọi nơi trên hầu hết các lục địa, các khu vực sản xuất chính của cà tím là Châu Á và Địa Trung Hải, các khu vực tập trung nhiều như Australia và Châu Phi Nhìn chung, cà tím phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới

Nguồn internet

Cà tím là loại cây rau được trồng phổ biến tại Việt Nam Đặc biệt là các khu vực có khí hậu tương đối mát mẻ như Đà Lạt, Đăk Lăk, một số tỉnh khu vực Tây Bắc

và Nam Trung Bộ

2.2.2 Đặc tính sinh học của cây cà tím

Solanum melongena L là một loại cây thân thảo một năm (Phạm Hoàng Hổ,

2006) có nhánh, có chiều cao tới 1 m, ưa sáng và khí hậu ấm áp, sinh trưởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ từ 22 - 26 oC (Đỗ Tất Lợi, 2006)

 Hệ rễ

Rễ cái mọc mạnh, ăn sâu 0,5 - 1,0 m và thường bị đứt khi cây ra rễ phụ Hệ thống rễ phụ rất phát triển và phân bố rộng Bộ rễ ăn sâu hay nông, phát triển mạnh hay yếu đều liên quan đến mức độ phân cành và phát triển của các bộ phận trên mặt đất Trên thân cà tím ở bất cứ nơi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi đều có khả năng tạo

Quả là loại quả mọng nhiều thịt, quả có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ trái nhẵn, màu sắc và kích thước của trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết (Đỗ Tất Lợi, 2006)

 Hạt

Hạt cà màu trắng hình đĩa, hạt cà nhỏ, dẹp, màu vàng sáng hoặc hơi tối Trung bình có 150 - 550 hạt trong trái Trọng lượng 1000 hạt là 3,5 - 4,5 g (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Các giống hoang dại có thể có kích thước lớn hơn, cao tới 2,25 m (84 inch) và

lá to (dài tới trên 30 cm và rộng trên 15 cm) Tên gọi cà tím không phản ánh đúng loại quả này, do có nhiều loại cà khác cũng có màu tím hay quả cà tím có màu đôi khi không phải tím

Tuy nhiên, tên gọi cà dái dê cũng không phản ánh đúng hình dạng của quả, do quả của nhiều giống cà tím (cà dái dê) không phải ôvan thuôn dài như dái dê mà lại tròn, có đường kính từ 5 cm đến 8 cm

2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế

 Giá trị dinh dưỡng

Cà tím rất giàu dinh dưỡng, trong 100 g thịt quả cà tím có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng như: 92 % nước, 5,5 % glucid, 1, 3% protid, 0,2 % lipid Các khoáng chất (tính theo mg/100g) gồm: kali 220 mg, phospho 15 mg, magiê 12 mg, calcium 10 mg, lưu huỳnh 15 mg, clor 15 mg, sắt 0,5 mg, mangan 0,2 mg, kẽm 0,2

mg, đồng 0,1 mg, iod 0,002 mg Tuy nhiên, các vitamin B1, B12, PP rất ít, nhiều chất nhầy Vì lượng chất nhầy này mà cà tím còn có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh dạ dày Chính vì vậy mà người Hàn Quốc thường dùng cà tím phơi khô làm thuốc giảm đau, trị sưng khớp, loét dạ dày Còn người Nigeria thường dùng cà tím để chữa đau bụng do tiêu hóa Vì trong cà tím còn chứa nightshade soda một chất có tác dụng chống ung thư Theo các chuyên gia Nhật Bản thì trong nước ép cà tím có nhiều hoạt chất có khả năng ngăn ngừa ung thư dạ dày (Hồ Đình Hải, 2011)

 Giá trị kinh tế

Cà tím là cây rau ăn quả có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên thế giới

Cà tím có thể cho năng suất cao, sinh trưởng nhanh, bảo quản tương đối dài hơn so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển thuận lợi và đi xa (Dương Kim Thoa và Trần Khắc Thi, 2005) Vì vậy, trồng cà tím thật sự mang lại hiệu quả kinh tế cao

Những năm qua năng suất cà tím ở nước ta ngày càng tăng do hàng loạt các giống lai ưu tú được đưa vào sản xuất Tuy vậy, năng suất trung bình của nước ta vẫn còn thấp 18,3 tấn/ha (Tổng cục thống kê, 2009) so với thế giới 30,9 tấn/ha Sản xuất cà tím được tập trung cao độ, với 90% sản lượng đến từ năm quốc gia Trung Quốc là nhà sản xuất hàng đầu (58% sản lượng thế giới) và Ấn Độ là lần thứ hai (25%), tiếp theo là

Ai Cập, Iran và Thổ Nhĩ Kỳ Nhiều hơn 4.000.000 mẫu Anh (1.600.000 ha) được dành cho việc trồng cà tím trên thế giới (FAO, 2009)

Ở Việt Nam, chỉ mới trồng cà tím trong khoảng 100 năm trở lại đây nhưng trong những năm gần đây diện tích trồng cà tím ngày một tăng Điều kiện tự nhiên, khí hậu một số vùng ở nước ta rất thích hợp cho loại cây trồng này sinh trưởng và phát triển Đặc biệt như các tỉnh đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc và Lâm Đồng là những nơi sản xuất cà tím cho năng suất cao Tuy nhiên, chưa có vùng chuyên canh sản xuất lớn mà chỉ trồng rải rác ở nhiều nơi Đây cũng là khó khăn trong việc quy hoạch vùng sản xuất cà tím cho mục đích chế biến và xuất khẩu (Phạm Hữu Tôn, 2004)

2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thuật ngữ “Nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện

vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được sử dụng để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như: sinh lý học, di truyền học và cấu trúc thực vật

(Nguyễn Đức Lượng và cs., 2006)

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

Quá trình nuôi cấy mô phụ thuộc vào các yếu tố như môi trường nuôi cấy, mẫu cấy, lựa chọn khử trùng, ánh sáng, nhiệt độ, pH và cả sự thoáng khí Các yếu tố ảnh hưởng cụ thể như sau:

 Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố vô cùng quan trọng Một môi trường căn bản phải đảm bảo các yếu tố như:

Các nguyên tố đa lượng: N, P, K, S, Ca và Mg

Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo

Các vitamin: nicotinic acid, biotin, mà quan trọng nhất là thiamine (vitamin

B1)

Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin (2,4-D, NAA) và cytokinin

(BAP, kinetin) kích thích sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào và phát sinh hình thái Ngoài ra còn có GA và ABA

Agar: được sử dụng trong môi trường đặc có tác dụng như một giá đỡ giúp mẫu

cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mẫu do thiếu oxy (Dương Công Kiên, 2002)

 Lựa chọn mẫu cấy

Gần như tất cả các phần của cây tươi đều có thể dùng làm mẫu cấy như: rễ, thân, lá, nụ hoa, hạt phấn hoặc noãn Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn mẫu cấy cho phù hợp

Tuy nhiên, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non (các tế bào đang phân chia) như: chồi đỉnh, chồi nách Cây gốc phải có phẩm chất tốt, sạch bệnh Mẫu cấy phải được vô trùng trước khi được đưa vào môi trường nuôi cấy và phải thật cẩn trọng không được làm tổn thương nếu không sẽ làm giảm hiệu quả nuôi cấy

 Khử trùng mẫu cấy

Trong quá trình nuôi cấy khử trùng mẫu cấy là khâu quyết định sự thành công hay thất bại Đối với mỗi loại cây sẽ có nồng độ hóa chất, thời gian và cách khử trùng khác nhau Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm chủ yếu Khi vi khuẩn và bào

tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy sẽ nhanh chóng lây nhiễm làm mẫu cấy có thể bị chết

Các chất khử mẫu thường dùng: Javel, Ca(OCl)2, HgCl2

 Ánh sáng

Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy mô Mỗi loài thực vật khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau với từng loại ánh sáng Cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau

Cường độ ánh sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô

và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng

của chúng Cường độ chiếu sáng chủ yếu ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp

 Nhiệt độ

Nhiệt độ trong khoảng 17 - 25 oC thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo và tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với một nhiệt độ khác nhau Khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô)

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Mức pH phù hợp thường là 5,6 - 5,8, đây là mức để cây có thể hấp thụ muối khoáng

 Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí

CO2 trong không khí như một nguồn cung cấp carbon Trong nuôi cấy mô truyền thống, nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng Thông thoáng khí giúp cây hô hấp và quang hợp tốt hơn (Dương Tấn Nhựt, 2010)

2.3.3 Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô

Auxin và cytokinin là hai nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật quan trọng trong việc nuôi cấy mô

 Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò rất quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Auxin sẽ di chuyển xuống rễ và tích tụ ở đó (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin có sự tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000)

Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo rễ nhưng lại cản sự tăng trưởng của các

sơ khởi rễ (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs., 1980) Auxin được vận chuyển hướng gốc,

tích lũy ở phần gốc của các khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thianin

mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất là các hợp chất diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic)

orthor-Trong số các loại auxin được sử dụng, 2,4-D được xem là một auxin mạnh, có tác dụng giúp hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ quá cao auxin này

sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong cây được nuôi

cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao

Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định

 Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokynin tự do cho cả cơ thể thực vật Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng chiều rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi Trong

sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi

Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất

Cytokinin có hai loại: tự nhiên như zeatin và 2-ip hoặc được tổng hợp như kinetin, BA, TDZ Kinetin là chất có khả năng phân chia tế bào mạnh mẽ và có ảnh

hưởng đến sự nảy mầm TDZ là chất có tác động tích cực trong việc cảm ứng và hình thành phôi

Cytokinin có sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa

tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa quyết định trong quá

trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu

tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ kích thích tạo chồi Để tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi

2.4 Sự tạo mô sẹo

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân

chia mạnh, thường được tạo ra từ những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Do đó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ) dễ tạo mô sẹo trong

điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ

hay kết hợp với cytokinin Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo (Dương Công Kiên, 2002)

Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình:

- Sự phân hóa của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan)

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) Trong quá trình này được ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không có các tượng tầng điển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hóa (so với cây hai lá mầm) Để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tình trạng sinh lý của mô cấy, sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ auxin (Dương Công Kiên, 2002)

2.5 Sự phát sinh cơ quan

Sự phát sinh hình thái chồi bất định

Chồi bất định là chồi mọc ra từ các cơ quan, bộ phận khác của cây, không phải

là phôi Chồi bất định xuất hiện liên hệ với mô chóp và còn xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe - mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành

Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống nhau như

mô chóp và có mạch gắn liền với mạch thân (Dương Công Kiên, 2002)

Mô phân sinh ngọn có thể có nguồn gốc từ các tế bào biểu bì hay mô rào Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách loại bỏ hiệu ứng cản tương quan (bỏ ưu thế ngọn bằng cách cắt

bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa thích hợp Có hai giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hóa

Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lục lạp phân chia thành các bóng nhỏ) Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: mất dần tinh bột dự trữ trong các lạp hoặc tích lũy tinh bột dự trữ và một số chất khác, nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm tạo mô phân sinh Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan Có sự phân chia không bào thành những không bào nhỏ Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to

Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp Tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bước: bước một, tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất), chất dự trữ, các chất tiết (tinh dầu, tanin) được tổng hợp Sau đó, các tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự phân chia tế bào (Dương Công Kiên, 2002)

2.6 Kĩ thuật nuôi cấy bao phấn

Nuôi cấy bao phấn chứa các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội kép được sử dụng rộng rãi trong cải tiến giống cây trồng Thông qua phương pháp này, có thể rút ngắn thời gian chọn tạo, tăng tính

biến dị cho chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa Kỹ thuật nuôi cấy in vitro kích thích

tiểu bào tử phát triển thành cây trong môi trường nuôi cấy túi phấn và hạt phấn Cho

phép nhân nhanh chóng và tạo ra hàng loạt cây đơn bội kép Đó là một lối thoát kì diệu đối với ứng dụng ây đơn bội, di truyền giống cây trồng (Trần Duy Qúy,1999)

Sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn trải qua các giai đoạn sau:

từ bào tử tế bào mẹ thông qua tính phân bào giảm nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội) Sau đó các tiểu bào tử hình thành các giao tử đực (hạt phấn cũng đơn bội) Nhưng khi nuôi túi phấn trong môi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi Dưới sự tác động của hàng loạt các yếu tố trong môi trường nhân tạo, đặc biệt

là các chất kích thích sinh trưởng, trong tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hóa, từ

đó các bào tử sẽ phân chia thành mô sẹo, các mô sẹo này lúc đầu là đơn bội Sau đó tùy theo từng điều kiện nuôi cấy chúng có thể là đơn bội, đơn bội kép hay lưỡng bội hóa, khi chuyển vào trong môi trường tái sinh cây, sẽ thu được cây con tương ứng Khi cần thiết cây đơn bội thu được có thể xử lý bằng colchicine để lưỡng bội hóa dòng đơn bội thu được (Trần Duy Qúy, 1999)

2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của phương pháp nuôi cấy bao phấn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: điều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho phấn và

thành phần của môi trường dinh dưỡng (Mercy et al., 1986)

2.7.1 Ảnh hưởng kiểu gen của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy, không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy sẽ cho thấy khả năng di truyền (Mercy

et al., 1986)

Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôi cấy túi phấn nhận thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuôi cấy chỉ

có 53 giống tạo được mô sẹo từ túi phấn và chỉ có 15 giống có khả năng tái sinh cây

Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn

(Chaleff et al., 1982)

Ngoài ra, điều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho phấn cũng như mối tương quan giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài đều ảnh hưởng đến

phản ứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro Chaleft, 1982 cho rằng cây cho túi

phấn sống trong điều kiện nhiệt đồ thích hợp sẽ cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao, nếu cây sống

trong điều kiện có nhiệt độ cao thì sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây sẽ giảm và tỷ

lệ bạch tạng sẽ tăng (Trần Duy Qúy, 1999)

2.7.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn phát triển bao phấn

Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp đồng thời

tỷ lệ bạch tạng càng cao Tuy nhiên, không phải tất cả các loại cây đều có giai đoạn tối

ưu như nhau Theo Nizeki và Oono, 1968 thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho cây lúa, còn theo Claphm, 1971 cho rằng cây đại mạch có hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm

Vì vậy, để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn, giai đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa rất quan trọng

2.7.3 Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy

Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với túi phấn hoặc cây cho bao phấn trước khi nuôi cấy đều có tác động đối với sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống

Điều kiện lạnh sẽ kích thích việc tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây cao Các giống khác nhau cũng như trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý Ying, 1983 đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh trước nuôi cấy lên hiệu quả nuôi cấy túi phấn, kết quả cho thấy: xử lý lạnh làm tăng tỷ

lệ tạo mô sẹo ở nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược và lúa nước Tapia và cs., 1990 cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hóa và làm tăng sự phân chia của hạt phấn, giúp giải phóng những chất cần thiết cho sự sinh sản đơn tính đực Nghiên cứu của Sugimoto lại cho thấy xử lý lạnh làm tăng lượng acid amin tự do dẫn đến tăng tần số

tái sinh cây từ mô sẹo (Trần Văn Lài và cs., 2005)

2.7.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của nuôi cấy túi phấn Nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White, môi trường MS, môi trường Gamborg, môi trường Nitsch Tùy theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau mà những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp Tuy nhiên cũng có một số quy luật chung: các cây hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4-D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên, ở lúa mì cần lượng đường saccarose là 60 – 120 g/L trong khi các cây họ

Cà chỉ cần 20 – 40 g/L Dịch chiết Khoai tây, nấm men, nước có tác dụng đối với nhiều môi trường nuôi cấy (Hồ Kì Quang Minh, 2009)

Mặc dù trong các bao phấn rất giàu chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhưng số lượng và chất lượng của các hormone và sự cân bằng auxin – cytokinin được xem là rất quan trọng để tạo sự cảm ứng của bao phấn Thành phần auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngược lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con (Trần Duy Qúy, 1999)

2.8 Những nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro

2.8.1 Trên thế giới

Năm 2000, Liljana Koleva và cs đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố

kiểu gen đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ở cây ớt Thí nghiệm được tiến hành trên các kiểu gen: Slatko Luta, Vezena Luta Sivrija, Golden Medal, Kurtovska Kapija, Californian Wonder, Feherözön và Rotund Hoa được thu nhận bao phấn trước khi chuyển sang màu tím trước khi hoa nở 1 ngày và sau đó được cấy vào môi trường Cp

có bổ sung 2,4-D 0,01 mg/L và kinetin 0,01 mg/L Sau 12 ngày chuyển sang môi trường R1 có bổ sung kinetin 0,1 mg/L Kết quả kiểu gen Slatko Luta cho tần số cảm ứng cao nhất (30,8 %)

Năm 2015, Sirlei Aparecida và cs đã nghiên cứu khả năng tạo callus của mẫu

bao phấn cây cà chua Thí nghiệm được tiến hành trên các kiểu gen: Debora, Santa Clara, Alambra và Pizza Doro Với môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 0,04 g L-1cysteine, 1 mg L-1 6- (y, y-dimetylallylamino) purine (2Ip; Sigma) và 2 mg L-1 acid indolo-3-axetic (IAA; Sigma) sau 60 ngày Kết quả kiểu gen Santa Clara cho tần số cảm ứng cao nhất (42,3 %)

Năm 2013, Başay và cs đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố kiểu gen

đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ở cây cà tím Thí nghiệm được tiến hành trên 5 kiểu gen: Topa, Halep Karasi, Teorem F1, Vd và Vd-2 Hoa được thu nhận khi bao phấn chuyển sang màu xanh vàng và sau đó được cấy vào môi trường C có bổ sung 2,4-D 5 mg/L và kinetin 5 mg/L Từ kết quả thu được, chỉ ra rằng với nồng độ 2,4-D và kinetin, sau 12 ngày chuyển sang môi trường R có bổ sung kinetin 0,1 mg/L thì kiểu gen Halep Karası cho tần số cảm ứng cao nhất Tiếp tục với các năm tiếp theo vẫn cho kết quả tương tự là kiểu gen Halep Karası có tần số cảm ứng cao nhất (88,1 %)

2.8.2 Ở Việt Nam

Năm 2009, Đào Xuân Thanh đã nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở cây lúa Thí nghiệm được tiến hành với

20 kiểu gen khác nhau: TN49, TN50, TN53, TN57, TN64, TN65, TN68, TN70, TN71, TN72, TN73, TN76, TN81, TN83, TN84, TN85, TN87, TN91, TN93 và TN97 Với

các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi trường MS và N6 đến khả năng tạo callus của

mẫu cấy có bổ sung 2,4-D và NAA Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất Kinetin, BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Ảnh hưởng của chất NAA đến khả năng ra rễ từ chồi xanh và các loại môi trường thuần dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây Đã đạt được những kết quả: trong phòng thí nghiệm với 2,4-D 1,5 mg/L hoặc với BAP 1,5 mg/L cho tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo cao nhất Còn với kinetin 1,5 mg/L cho tỷ lệ mẫu hình thành chồi xanh là cao nhất và tỷ lệ hình thành chồi bạch tạng là thấp nhất

Và với NAA 0,1 mg/L thì kết quả ra rễ là tốt nhất

Năm 2002, Hồ Kỳ Quang Minh đã nghiên cứu sự tạo phôi từ hạt phấn nhờ kỹ

thuật nuôi cấy bao phấn thuốc lá Nicotianan Tabacum L Cho thấy được sự biến đổi

hình thái của hạt phấn bên trong các bao phấn nuôi cấy Tỷ lệ GA3 quyết định đến tỷ lệ phát sinh phôi Sự ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên bao phấn

thuốc lá N Tabacum vc K 326 đã cho thấy có thể thay thế quá trình xử lí lạnh bằng GA3

để làm tăng hàm lượng gibberellin để tăng khả năng sinh phôi của hạt phấn

Năm 2009, Đặng Thị Mai đã nghiên cứu kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội từ

nuôi cấy in vitro bao phấn trên 2 giống là Marinda và Valaspik Tìm ra được môi

trường MS là dinh dưỡng cơ bản thích hợp đẻ tạo mô sẹo với quá trình tiền xử lý là ở 4 o

C với 24 giờ Cùng với nồng độ của 2 chất điều hòa tăng trưởng là 1,5 ppm 2,4 D và 1,0 ppm kinetin thì cho khả năng tạo mô sẹo cao ở Marinda là 70,50 % và Valaspik là 69,17 % Với MS có bổ sung 0,03 ppm TDZ và 1,0 ppm BAP cho mẫu tái sinh cao và

từ mẫu tái sinh khi nuôi với môi trường MS có 2,4 D và kinetin thì cây tái sinh cao Sự

có mặt của cao nấm men vào môi trường nhân chồi (1,0 – 1,5 g/L) làm tăng chất lượng chồi

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

 Địa điểm

Phòng Công nghệ tế bào - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

Phòng cấy vô trùng: tủ cấy, máy điều hòa, dao cấy, kẹp, đèn cồn

Phòng nuôi mẫu: máy điều hòa, kệ sắt, nhiệt kế, đèn chiếu sáng

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Bao phấn được tách từ nụ hoa cà tím được thu hái tại nhà lưới của Trường đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bao phấn được khử trùng và cấy trong các môi trường MS, C và Nitsch có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật phù hợp để tiến hành các thí nghiệm

3.1.3 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ phòng nuôi: 24 ± 2 oC

Độ ẩm: 70 ± 5 %

Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux

Thời gian ủ tối: 24 giờ/ngày

pH môi trường nuôi cấy: 5,6 – 5,8

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường MS, C và Nitsch có bổ sung đường 120 g/L, agar 8 g/L và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật như: 2,4-D 5 mg/L, kinetin 5 mg/L

3.1.5 Hóa chất

Cồn 70 o, 90 o

Ca(ClO)2

Các hóa chất để pha môi trường MS, C, Nitsch

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

Kinetin (Kin)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quan sát hình thái hạt phấn trước khi cấy

Mục đích thí nghiệm: xác định và mô tả thời kỳ phát triển của hạt phấn trước

Mô tả thí nghiệm: bao phấn được tách ra và nhuộm trong thuốc nhuộm

acetocarmine theo quy trình như sơ đồ 2.1 và quan sát dưới kính hiển vi

Sơ đồ 3.1 Quy trình nhuộm bao phấn cà tím bằng thuốc nhuộm acetocarmine

3.2.2 Khảo sát nồng độ khử mẫu với Ca(ClO) 2 ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo

từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L

Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ khử trùng mẫu thích hợp ảnh hưởng đến tỷ

lệ sống của mẫu cấy

Bao phấn

Ngâm trong acid HCl 10% 15 phút

Ngâm trong acid HCl 10% trong 1 phút

Ngâm trong thuốc nhuộm acetocarmine 20 phút

Đặt mẫu trong acid acetic 45%

Quan sát dưới kính hiển vi

Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Rửa nước cất (3lần)

Rửa nước cất (3lần)

Vật liệu thí nghiệm: nụ hoa cà tím được thu hái từ 2 - 1 ngày trước khi nở Dung dịch khử mẫu: dung dịch Ca(ClO)2 thay đổi theo các nồng độ khử mẫu khác nhau như trong bảng 2.1

Mô tả thí nghiệm: nụ hoa cà tím sau khi thu hái sẽ được khử trùng với dung

dịch khử mẫu trên trong vòng 15 phút Sau đó, mẫu sẽ được rửa với 3 hoặc 4 lần bằng nước cất vô trùng Loại bỏ đài và cánh hoa cùng với nhụy, chỉ còn giữ lại bao phấn (nhị) Tiếp theo, mẫu được cấy vào các môi trường

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, 1 bình/lần, 10 mẫu/bình

Thời gian theo dõi: 2 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng mẫu thích ứng (không nhiễm vi khuẩn và vi nấm) (≥

1 mm) trên 1 bình

Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95 % của giá trị được thể hiện bởi các chữ cái kèm theo, phân hạng Duncan

Bảng 1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ khử mẫu với Ca(ClO)2 ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo từ bao phấn cây cà tím Solanum melongena L

Mục đích thí nghiệm: xác định được môi trường cảm ứng có bổ sung 2,4-D và

kinetin thích cho sự cảm ứng bao phấn cây cà tím Solanum melongena L

Vật liệu thí nghiệm: nụ hoa cà tím được thu hái một ngày trước khi nở

Môi trường nuôi cấy: môi trường MS, C và Nitsch như trong bảng 2.2