Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế enzyme α glucosidase của lá vẹt tách (bruguiera parviflora) nghiên cứu khoa học

Kết quả nghiên cứu khả năng thử hoạt tính ức chế enzyme α – glucosidase của cao chiết từ lá cây Vẹt tách .... Mục tiêu đề tài: - Cô lập các hợp chất tự nhiên của cao chiết từ lá Vẹt tác

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ VẸT TÁCH ( Bruguiera parviflora)

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE

CỦA LÁ VẸT TÁCH ( Bruguiera parviflora)

Mã số: 15

CNĐT: HUỲNH TẤN LỘC KHOA:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH VIÊN:

ĐỖ THỊ NGỌC MAI HUỲNH THỊ KIM TRINH TRƯƠNG THỊ THÙY ĐANG BÙI THANH TÙNG GVHD: ThS NGUYỄN THỊ LỆ THỦY

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2018

DANH MỤC BẢNG ii

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI VẸT (BRUGUIERA) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 3

1.1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.1.3 Phân bố 4

1.1.1.4 Giá trị kinh tế 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của chi Bruguiera 4

1.1.2.1 Cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica 4

1.1.2.2 Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) 6

1.1.2.3 Cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula) 10

1.1.2.4 Cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT 13

1.2.1 Nguyên tắc tách chiết [32] 13

1.2.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng [32] 13

1.2.2.1 Kỹ thuật ngấm kiệt 13

1.2.2.2 Kỹ thuật ngâm dầm 13

1.2.3 Kỹ thuật chiết pha rắn [32] 14

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu [32] 14

1.2.4.1 Lựa chọn dung môi để tách chiết 14

1.2.4.2 Nhiệt độ tách chiết 15

1.2.4.3 Thời gian tách chiết 15

1.2.4.4 Độ mịn của nguyên liệu 15

1.3 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 16

1.3.1 Khái niệm 16

1.3.2 Phân loại [32] 16

1.3.3 Phương pháp điều trị 16

1.3.3.1 Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 1: 16

1.3.3.2 Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2: 17

1.4.2 Chất ức chế enzyme [1] 18

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.3 Phương pháp cô lập các hợp chất [32] 22

2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 23

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

2.3.1 Quy trình điều chế cao tổng 24

3.1.1 Quy trình điều chế cao tổng từ lá cây Vẹt tách (Bruguiera parviflora ) 24

2.3.1.2 Thuyết minh quy trình 25

2.3.2 Quy trình điều chế cao phân đoạn 25

2.3.2.1 Quy trình điều chế cao phân đoạn 25

2.3.2.2 Thuyết minh quy trình 25

2.3.3 Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính của enzyme α - glucosidase từ cao chiết lá Vẹt Tách 27

2.3.3.1 Mục đích 27

2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm 27

2.4.4 Tiến hành thí nghiệm 28

PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết quả điều chế cao tổng từ lá cây Vẹt tách 30

3.2 Kết quả điều chế cao phân đoạn từ cao tổng 30

3.3 Kết quả nghiên cứu khả năng thử hoạt tính ức chế enzyme α – glucosidase của cao chiết từ lá cây Vẹt tách 30

3.4 Kết quả nghiên cứu cô lập hợp chất trong lá cây Vẹt tách 33

3.5 Kết quả phân tích những đặc điểm cơ bản và cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập từ lá cây Vẹt tách 38

3.5.1 Hợp chất BPE01 38

3.5.2 Hợp chất BPE02 40

3.5.3 Hợp chất BPE03 42

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 4.1 KẾT LUẬN 48 4.2 KIẾN NGHỊ 49

i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DMSO DiMethyl SulfOxide

EA Ethyl Acetate (EtOAc)

HR-ESI-MS High Resolution - ElectroSpray

Ionization - Mass Spectroscopy

Phổ khối lượng phân tử cao

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

ii

Bảng 1 1: Sơ đồ các kiểu ức chế enzyme thuận nghịch 20

Bảng 2 1: Bố trí thí nghiệm khả năng nghiên cứu chế enzyme α - glucosidase của cao chiết 27

Bảng 3 1: Kết quả phần trăm ức chế (I%) của cao chiết phân đoạn 31

Bảng 3 2: Đồ thị thể hiện khả năng ức chế enzyme α – glucosidase của các cao chiết từ lá Vẹt tách Error! Bookmark not defined. Bảng 3 3: So sánh dữ liệu phổ của BPE01 với lupeol 38

Bảng 3 4: So sánh dữ liệu phổ của BPE02 với β-sitosterol 40

Bảng 3 5: So sánh dữ liệu phổ của BPE03 với α-amyrin 413

Bảng 3 6: So sánh dữ liệu phổ của BPE04 với Myricitrin 44

Bảng 3 7: So sánh dữ liệu phổ của BPE05 với Myricetin 478

iii

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 1: Các loài thuộc chi Vẹt (Bruguiera) 3

Hình 1 2: Cấu trúc của các hợp chất cô lập từ câyVẹt Trụ( Bruguiera cylindrica) 5

Hình 1 3: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) 9 Hình 1 4: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula) 11 Hình 1 5: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora)12 Hình 2 1: Cây Vẹt tách (Bruguiera parviflora ) 21

Hình 2 2: Sự chuyển hóa chất nền khi bị enzyme α - glucosidase ức chế 23

Hình 2 3: Quy trình điều chế cao tổng từ lá cây Vẹt Tách (Bruguiera Parviflora) 24

Hình 2 4: Sơ đồ điều chế cao phân đoạn từ cao tổng lá Vẹt Tách 26

Hình 2 5: Sơ đồ nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α – glucosidase từ cao chiết 28

Hình 3 1: Đồ thị thể hiện khả năng ức chế enzyme α – glucosidase của các cao chiết từ lá Vẹt Tách 32

Hình 3 2: Sơ đồ điều chế cao phân đoạn từ cao EA 34

Hình 3 3: Sơ đồ cô lập các hợp chất từ phân đoạn cao EA1 35

Hình 3 4: Sơ đồ cô lập các hợp chất từ phân đoạn cao EA2 36

Hình 3 5: Sơ đồ cô lập các hợp chất từ phân đoạn cao EA3 37

Hình 3 6: Sắc ký lớp mỏng của các hợp chất cô lập 37

Hình 3 7: Cấu trúc hợp hóa học của hợp chất Lupeol 38

Hình 3 8: Cấu trúc hợp hóa học của hợp chất β-sitosterol 40

Hình 3 9: Cấu trúc hợp hóa học của hợp chất α-amyrin 42

Hình 3 10: Cấu trúc hợp hóa học của hợp chất Myricitrin 44

Hình 3 11: Cấu trúc hợp hóa học của hợp chất Myricetin 47

iv

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase của lá Vẹt Tách ( Bruguiera parviflora)

- Sinh viên thực hiện: Huỳnh Tấn Lộc

- Lớp: DH15SH01 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Lệ Thủy

2 Mục tiêu đề tài:

- Cô lập các hợp chất tự nhiên của cao chiết từ lá Vẹt tách ( Bruguiera parviflora)

- Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase của cao chiết lá Vẹt tách

( Bruguiera parviflora)

3 Tính mới và sáng tạo:

Đây là lần đầu tiên cây Vẹt tách được nghiên cứu một cách có hệ thống về mặt hóa học và hoạt tính chống đái tháo đường góp phần làm sáng tỏ kiến thức y học

về loài cây này

Kết quả của đề tài góp phần khoa học hóa, tiêu chuẩn hóa việc sử dụng cây Vẹt tách chữa trị đái tháo đường, làm giàu hơn danh mục các hợp chất thiên nhiên

4 Kết quả nghiên cứu:

Quy trình điều chế cao tổng và các cao phân đoạn từ lá Vẹt tách

Quy trình ức chế enzyme α –glucosidase của cao tổng và cao phân đoạn

Cô lập được 4 hợp chất từ phân đoạn cao ethyl acetate của lá Vẹt tách

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Sàng lọc, tách chiết và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật là tiền đề cho việc ứng dụng các hợp chất này vào việc tạo các chế phẩm ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả

nghiên cứu (nếu có):

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh

viên thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Đề tài nghiên cứu một cách khoa học về thành phần hóa học và khả năng ức chế

enzyme α –glucosidase Nghiên cứu là tiền đề cho việc ứng dụng các loài cây thực vật vào việc tạo ra chế phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Huỳnh Tấn Lộc

Sinh ngày: 04 tháng 09 năm 1997

Nơi sinh: Long An

Lớp: DH15SH01 Khóa: 2015

Khoa: CNSH

Địa chỉ liên hệ: 55/2/17 Huỳnh Văn Lũy , Phường Phú Lợi Tp Thủ Dầu

Một, Bình Dương

Điện thoại: 0869044214 Email: huynhtanloc9719@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, thế giới rất chú trọng đến việc bảo vệ sức khỏe cho con người

và lĩnh vực y dược cũng có những bước tiến vượt bậc trong những năm gần đây Nhiều nước trên thế giới, với xu hướng "trở về thiên nhiên" thì việc điều chế và sử dụng các thuốc từ dược liệu thiên nhiên ngày càng gia tăng vì những loại thuốc này phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể con người và rất ít những tác động có hại

Việt Nam nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa nóng ẩm của châu Á với những điều kiện khí hậu thuận lợi, ánh sáng nhiều, lượng mưa lớn, độ ẩm cao nên thực vật phát triển rất mạnh Thảm thực vật nước ta đa dạng và phong phú với hàng nghìn họ, hàng vạn loài, đó là một kho tàng qu giá về nguồn hợp chất tự nhiên và nguồn dược liệu cần được nghiên cứu và khai thác

Rừng ngập mặn cũng được coi là tài nguyên qu trên trái đất.Thực vật ngập mặn đã được nghiên cứu là có những hợp chất mới mang nhiều hoạt tính sinh học có giá trị cao như quả cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica) có hợp chất

các polysaccharide, cao chiết ethanol có khả năng kháng vi trùng gây bệnh sốt rét tại giá trị IC50 là 173,75 g/ml, hợp chất 3-feruloyltaraxerol từ cao chiết n-

hexane chứng minh khả năng gây độc tế bào kháng lại tế bào ung thư phổi , hợp

chất từ hoa của cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhizam) khả năng hoạt hóa

enzyme luciferase và làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

cyclooxygenase-2 , cây Giá (Excoecaria agallocha L.), cây Đước Đôi (Rhizophora apiculata Bl.),cây Đước Xanh (Rhizophora mucronata Poir in Lamk), cây Sam Biển (Sesuvium

portulacastrum L.) có hoạt tính kháng HIV; các hợp chất benzoxazolin mà dẫn xuất đường ribose của nó cho thấy có hoạt tính kháng ung thư và kháng virus

được cô lập từ cây Ô rô (Acanthus illicifolius L.)

Bên cạnh đó tình trạng bệnh đái tháo đường cũng đang trở thành căn bệnh phổ biến và đang gia tăng nhanh trên giới ở cả những nước phát triển và những nước đang phát triển.Chủ yếu là đái tháo đường tuyp 2 chiếm khoảng 90% và có tới 65% bệnh nhân mắc bệnh nhưng không được phát hiện Tuy nhiên bệnh đái tháo đường có thể được ngăn chặn nếu cải thiện được các yếu tố nguy cơ gây

mắc bệnh nhờ cơ chế ức chế enzyme α - glucosidase

Xuất phát từ cơ sở khoa học trên, nên đề tài : “Nghiên cứu thành phần hóa

học và khả năng ức chế enzyme α - glucosidase của lá Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) ” đã được đề xuất.Với tiêu chí đặt ra là công tác

nghiên cứu không làm ảnh hưởng tới hệ sinh thái thực vật của rừng ngập mặn

do đó sẽ thu hái lá trưởng thành của cây này để làm đối tượng nghiên cứu cũng như làm rõ hơn vai trò, tác dụng sinh học của cây Vẹt Tách góp phần

2

khuyến khích bảo tồn và nhân rộng loại cây thuộc hệ sinh thái rừng ngập

Mục tiêu đề tài:

- Cô lập các hợp chất tự nhiên của cao chiết từ lá Vẹt tách ( Bruguiera parviflora)

- Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase của cao chiết lá Vẹt tách

( Bruguiera parviflora)

3

PHẦN I : TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI VẸT (BRUGUIERA)

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Chi Vẹt (Bruguiera) là một chi thuộc họ Đước (Rhizophoraceae) sống ở rừng ngập mặn Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ[14], ở Việt Nam chi Vẹt (Bruguiera) gồm bốn loài

là là Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza), Vẹt Tách

(Bruguiera parviflora) và Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

Hình 1 1: Các loài thuộc chi Vẹt (Bruguiera)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Chi Bruguiera, họ Đước (Rhizophoracea) là đại mộc cao 20 m, tàn rậm; phế căn hình

đầu gối Lá có phiến non, gân phụ 7-10 cặp, khó nhận biết; cuống dài 2 cm, lá bẹ dài 5-7 cm Tụ tán từ 2-5 hoa; cọng 6-13 mm; đài có ống dài 7-9 mm, răng 8-10; cánh hoa vàng có 2 thùy, mỗi thùy có 3 lông tơ; tiểu nhụy từng cặp; noãn sào 2-4 buồng Trái cao 2-2,5 cm, trục hạ diệp dài 10-15 cm, to 4-5 mm, hợp tử là 2n=36

4

1.1.1.3 Phân bố

Cây phân bố ở rừng ngập mặn ven biển Việt Nam, Campuchia, Thái Lan, Mianma, ấn

Độ, Inđônêxia, Malaixia, Philippin, Bắc châu đại dương[21]

1.1.1.4 Giá trị kinh tế

Gỗ tốt, có thể nằm trong bùn và nước ngập mặn lâu năm mà không bị mục nên sử dụng làm cột, cừ hay người dân địa phương dùng làm công cụ lao động như cán cuốc, ngoài ra, nếu loài cây này được đem vào hầm than sẽ cho nhiệt cao và chưa ít NaCl hơn nên không làm hư máy móc Trong chiến tranh thế giới thứ 2, than của loài cây này được sử dụng để chạy máy tàu và xe ở Hậu Giang thay cho xăng

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của chi Bruguiera

1.1.2.1 Cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica)

 Trong nước:

Cho đến nay , chưa tìm thấy công trình nghiên cứu khoa học nào về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) được công bố trong

nước

 Ngoài nước:

Về thành phần hóa học

Năm 2004, Surat Laphookhieo và cộng sự[21] đã cô lập được sáu hợp chất mới thuộc

nhóm pentacyclic triterpenoid ester từ cao chiết n-hexane của quả cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) gọi tên là 3-E-feruloyltaraxerol (1), 3-Z-feruloyltaraxerol

(2), 3-E-feruloyltaraxerol (3), 3-Z-feruloyltaraxerol (4), 3-E-coumaroyltaraxerol

(5)và 3-Z-coumaroyltaraxerol (6) Trong đó hợp chất 3-Z-feruloyltaraxerol và 3

-Z-coumaroyltaraxerol có khả năng gây độc tế bào chống lại dòng tế bào NCI-H187

Năm 2005, Chatchanok Karalai và Surat Laphookhieo[20] đã cô lập được chín hợp chất

triterpenoid từ quả của cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) trong đó có ba hợp chất mới

thuộc nhóm khung sườn pentacyclic là 3-E-caffeoyltaraxerol (7), 3

-E-coumaroyllupeol (8), 3-Z-coumaroyllupeol (9) và bên cạnh sáu hợp chất đã biết

thuộc nhóm khung sườn lupane là 3-E-coumaroyllupeol (10), 3

-Z-coumaroyllupeol , 3-E-caffeoyllupeol (12), 3-lupeol (13), 3-lupeol , lupenone

(15),

Năm 2007, Suchada Chantrapromma và cộng sự[7,8] đã cô lập được một số hợp chất

ent-kaurane diterpene từ rễ của cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) bao gồm

ent-kaur-16-en-19-al (11) , ent-kaur-16-ene-13,19-diol (14)

Năm 2011, Sundaram Ravikumar và cộng sự[25] đã chứng minh cao chiết ethanol của lá

cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) có khả năng kháng vi trùng gây bệnh sốt rét tại giá

trị IC50 là 173,75 g/ml

Năm 2013, Suchada Chantrapromma và cộng sự[6] đã cô lập được hợp chất 3

-feruloyltaraxerol từ cao chiết n-hexane của quả cây Vẹt Trụ(Bruguiera cylindrica) và

chứng minh khả năng gây độc tế bào kháng lại tế bào ung thư phổi của hợp chất này

6

1.1.2.2 Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza)

nước

Cho đến nay , chưa tìm thấy công trình nghiên cứu khoa học nào về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) được công bố

trong nước

nước:

 Về thành phần hóa học

Năm 1999, Chitti Subrahmanyam và cộng sự[9] đã cô lập từ cao chiết n-hexane và

ethanol của vỏ rễ cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) hợp chất steviol (16) và năm hợp chất diterpene mới là ent-kaur-16-en-13-hydroxy-19-al (17); 15(S)-isopimar-7-en- 15,16-diol (18); ent-kaur-16-en-13,19-diol (19); methyl ent-kaur-9(11)-en-13,17-

epoxy-16-hydroxy-19-oate (20); 1,15(R)-ent-pimar-8(14)-en-1,15,16-triol (21)

Năm 2004, Han Li và cộng sự[14]

đã cô lập được bốn hợp chất diterpene mới từ cao

chiết của thân cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) đặt tên là acid 13,16

,17-trihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-oic (22); 16,17-dihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-al

(27); 17-chloro-13,16-dihydroxy-ent-kauran-19-al (28) và

(4R,5S,8R,9R,10S,13S)-ent-17-hydroxy-16-oxobeyeran-19-al (29)

Năm 2004, Sun Yan Qiu và Guo Yue-Wei[28] đã cô lập từ cây Vẹt Dù (Bruguiera

gymnorrhiza) được một hợp chất mới là gymnorrhizol (30)

Năm 2005, Han L và cộng sự[12] đã cô lập từ thân cây Vẹt Dù (Bruguiera

gymnorrhiza) năm hợp chất hương phương mới được gọi là bruguierol A–C (31-33),

1-(3-hydroxyphenyl) hexane-2,5-diol (34) và

3-(3-hydroxybutyl)-1,1-dimethylisochroman-6,8-diol (35)

Năm 2005, Han Li và cộng sự[15] đã cô lập được sáu hợp chất thuộc nhóm diterpenoid

từ thân cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) trong đó có 3 hợp chất mới là

ent-8(14)-pimarene-15R,16-diol (36), ent-8(14)-pimarene-1,15R,16-triol (37) và

(5R,9S,10R,13S,15S)-ent-8(14)-pimarene-1-oxo-15R,16-diol (38) cùng với ba hợp chất

là ent-8(14)-pimarene-1,15R,16-triol (39), isopimar-7-ene-15S,16-diol (40) và

isopimar-7-ene-1,15S,16-triol (41)

Năm 2006, Homhual S và cộng sự[16]

đã cô lập được ba hợp chất từ hoa của cây Vẹt

Dù (Bruguiera gymnorrhiza) trong đó có ba hợp chất đã biết là brugierol (42),

isobrugierol (43) và một hợp chất mới là bruguiesulfurol (44) Trong đó hai hợp chất

brugierol và isobrugierol có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme luciferase với giá

7

trị IC50 là 85,0 và 14,5 M Ngoài ra hợp chất brugierol còn có khả năng ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) với giá trị IC50 là 6,1 M

Năm 2006, Homhual Sudarat và cộng sự[14]

đã cô lập từ cao chiết ether dầu hỏa của

hoa của cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) ba hợp chất mới thuộc nhóm

dammarane triterpene gọi là bruguierin A–C (45-47), trong đó hợp chất bruguierin A

có khả năng hoạt hóa enzyme luciferase và làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cyclooxygenase-2

Năm 2007, Han L và cộng sự[13] đã cô lập được ba hợp chất từ nhánh cây Vẹt Dù

(Bruguiera gymnorrhiza) là brugunin A (48), bruguierol D (49) và

2,3-dimethoxy-5-propylphenol (50)

Năm 2008, Shang Suisheng và Long Shengjing [26] đã cô lập từ cây Vẹt Dù (Bruguiera

gymnorrhiza) một hợp chất mới là brugnanin (51)

Năm 2009, Huang Xiao-Ying và cộng sự[17] đã cô lập được bảy hợp chất từ cây Vẹt Dù

(Bruguiera gymnorrhiza) đó là các hợp chất tetrathiacyclodecane (52), cis-3,3’- dihydroxy-1,5,1’,5’-tetrathiacyclodecane (53),

trans-3,3’-dihydroxy-1,5,1’,5’-gymnorrhizol (30), neotrans-3,3’-dihydroxy-1,5,1’,5’-gymnorrhizol (54), bruguiesulfurol (44), brugierol (42) và isobrugierol (43)

Cấu trúc của các hợp chất cô lập từ cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) được trình

bày trong hình 1.2

H OH OH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14

15 16 17

18 19

20 10

O O

S S OH

O

S S OH

OH

OMe MeO

H HO H OH

COOH

(47)

S S

(52)

S S

(53) (30)

S S

5 7

9 10

OH O

O O

O

Hình 1 3: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây Vẹt Dù (Bruguiera

gymnorrhiza)

Về hoạt tính sinh học

Năm 2006, Homhual S và cộng sự[11] đã cô lập được ba hợp chất từ hoa của cây Vẹt

Dù (Bruguiera gymnorrhiza) hiza trong đó có ba hợp chất đã biết là brugierol ,

isobrugierol và một hợp chất mới là bruguiesulfurol Trong đó hai hợp chất brugierol

và isobrugierol có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme luciferase với giá trị IC50 là 85,0 và 14,5 M Ngoài ra hợp chất brugierol còn có khả năng ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) với giá trị IC50 là 6,1 M và khả năng hoạt hóa enzyme luciferase và làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cyclooxygenase-2

Năm 2011, Cai You-Sheng và cộng sự[5] đã cô lập được tám hợp chất mới từ cây Vẹt

Dù (Bruguiera gymnorrhiza) đó là các hợp chất palmarumycins BG1 – BG7 và hợp

chất preussomerin BG1, trong đó hợp chất palmarumycins BG5 được chứng minh là

có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL 60 và MCF-7

10

1.1.2.3 Cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

nước:

Cho đến nay , chưa tìm thấy công trình nghiên cứu khoa học nào về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula) được công bố trong

nước

nước:

Năm 2005, Shuyun Bao và cộng sự[3]

đã cô lập được chín hợp chất thuộc nhóm diterpene trong đó có ba hợp chất mới là 17-hydroxy-16-oxobeyer-9(11)-ene-19-al

(79); 16,17-dihydroxy-19-nor-ent-kaur-9(11)-ene-3-one (80) và

(16R)-13,17-epoxy-16-hydroxy-ent-kaur-9(11)-ene-19-al (81); bên cạnh sáu hợp chất đã biết là

17-hydroxy-16-oxobeyeran-19-al (82); 16,17-dihydroxy-ent-kaur-9(11)-ene-19-al (83);

methyl 16,17-dihydroxy-ent-kaur-9(11)-ene-19-oate (84); methyl

(16R)-13,17-epoxy-16-hydroxy-ent-kaur-9(11)-ene-19-oate (85); ceriopsin (86); (1,

15R)-ent-pimar-8(14)-ene-1,15,16-triol (87); bên cạnh đó nhóm tác giả còn cô lập được một hợp chất

mới thuộc nhóm dithiobenzoquinone là

(-)-3,4-dihydro-3-hydroxy-7-methoxy-2H-1,5-benzodithiepine-6,9-dione (88)

Năm 2007, Shuyun Bao và cộng sự[4] đã cô lập được sáu hợp chất phenol glycoside

mới gọi tên là rhyncoside A–F (89-94) từ nhánh cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula

var rhynchopetala)

Cấu trúc của các hợp chất cô lập từ cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula) được trình bày

trong hình 1.3

OHO

HO

OHO

HO

H3C

OOH

OHHO

O H2C

OO

R1

R2

OCH3OH

11

CHO

H

O OH

1

3

5

7 8 10

11 13 14 15 16 17

17

O OH

1 5 11

18 20

(81) R=CHO (85) R=MeO2C

1

11 14 15 17

18 20

(82)

CHO

O OH

H

OH OH

R

20

5

(83) R=CHO (84) R=MeO2C

1

11 14 15

18 20

(86)

COOMe

O OH

18 (87)

OH

H

OH OH

8 9

12

1.1.2.4 Cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora)

 Trong nước:

Cho đến nay , chưa tìm thấy công trình nghiên cứu khoa học nào về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) được công bố trong nước

 Ngoài nước:

 Về thành phần hóa học

Năm 2005, Parinuch Chumkaew và cộng sự[10] đã cô lập được một hợp chất

triterpenoid ester mới từ quả của cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) là caffeoyllupeol (95) và năm hợp chất đã biết là lupeol caffeate (96), 3-(Z)-

3-(Z)-coumaroyllupeol, dioslupecin A (97), lupeol và lupenone

Cấu trúc của các hợp chất cô lập từ cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) được

Hình 1 5: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây Vẹt Tách (Bruguiera

Có nhiều cách để chiết xuất các hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng Chiết tách là sử dụng một loại dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng hòa tan chất cần tách, tinh chế

và cô lập hợp chất mong muốn

1.2.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng[32]

1.2.2.1 Kỹ thuật ngấm kiệt

So với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn, vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết

1.2.2.2 Kỹ thuật ngâm dầm

Kỹ thuật ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngâm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn với các hợp chất đó có thể chứa trong cây

Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào các máy lắc để lắc nhẹ ( Chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần ngâm 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi

cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đạt đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Nhắc lại quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lượng ít dung môi

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

14

1.2.3 Kỹ thuật chiết pha rắn[32]

Chiết pha rắn có nguyên tắc cơ bản giống sắc ký cột, đó là sự tương tác giữa các chất tan trong một dung dịch lên trên chất hấp thu Kỹ thuật này cũng sử dụng các chất hấp thu giống như loại sử dụng trong sắc ký cột, gồm chất hấp thu pha thường, pha đảo, pha trao đổi ion

Kỹ thuật chiết pha rắn thường được áp dụng để đạt các mục đích khác nhau như:

Để xác định mức độ phân cực của một số hợp chất chưa biết

Để làm đậm đặc một số hợp chất đang ở trong một dung dịch rất loãng và lượng thể tích lớn

Để phân chia cao thô ban đầu ( có chứa tất cả các loại hợp chất từ không phân cực đến phân cực )thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên cần khảo sát ra khỏi cao thô ban đầu hoặc ở giai đoạn cuối muốn tinh chế mẫu hợp chất

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu[32]

1.2.4.1 Lựa chọn dung môi để tách chiết

Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử (polymer, cellulose, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật,…)tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hoạt chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất tự nhiên có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hay chiết một lần lấy tất cả các hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol ( có thể chiết hầu hết các hợp chất tự nhiên trong mẫu cây)

Nguyên tắc của sự tách chiết là dung môi không phân cực ( ví dụ: eter dầu hỏa, hexan, heptan, benzen, toluene,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực ( ví dụ: các alcol béo, ester béo,…), dung môi phân cực trung bình (ví dụ: dietyl eter, chloroform,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter –O-, aldehyde -CH=O, cetone –CO-, ester –COO-…) và dung môi phân cực mạnh ( ví dụ: metanol, ethanol,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, -COOH…)

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet,… Sau khi chiết, phần bã cây còn lại lọc bỏ, dung môi qua thu hồi bằng máy cô quay chân không

ở nhiệt độ thấp 30-40o

C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt

Đối với những hợp chất bền nhiệt khi nhiệt độ tăng cao sẽ gây biến đổi hoặc làm mất tính chất hóa học của chúng Ví dụ: alkaloid, vitamin, glycosid,…

Đối với tạp chất: Khi nhiệt độ tăng không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà độ tan của tạp chất cũng tăng theo làm cho dịch chiết thu được sẽ nhiều tạp chất như gôm, chất nhày… ngoài ra khi nhiệt độ tăng sẽ làm cho một số chất trong nguyên liệu bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết

Đối với dung môi dễ bay hơi nhiệt độ sôi thấp, khi tăng nhiệt độ thì dung môi

sễ bị hao hụt, có thể gây cháy nổ trong quá trình chiết nên thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lưu dung môi

1.2.4.3 Thời gian tách chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó đến các phân tử lớn hơn (thường là tạp chất như nhựa, keo,…) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong nguyên liệu cây, nhưng nếu thời gian chiết dài quá thì dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản

1.2.4.4 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu cây thô quá dung môi sẽ khó thấm ước nguyên liệu, hoạt chất khó chiết nguyên liệu, hoạt chất khó chiết vào dung môi nên thời gian

sẽ lâu hơn Khi nguyên liệu cây mịn quá thì bề mặt tiếp xúc giữ nguyên liệu và dung môi tăng lên, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng, do đó thời gian chiết sẽ ngắn hơn

Tuy nhiên nếu nguyên liệu quá mịn, khi ngấm vào dung môi bột nguyên liệu bị dính vào nhau nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết lẫn nhiều tạp

là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư,

1.3.2 Phân loại[32]

Có 2 loại tiểu đường đó là tiểu đường type 1 và type 2 ứng với hai thể bệnh chính: Bệnh tiểu đường loại 1 do tụy tạng không thể tiết insulin, và loại 2 do tiết giảm insulin và đề kháng insulin

 Loại 1 (Type 1)

Khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường thuộc loại, phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi (<20T).Các triệu chứng thường khởi phát đột ngột và tiến triển nhanh nếu không điều trị Giai đoạn toàn phát có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng đường huyết và nhiễm Ceton

Những triệu chứng điển hình của Bệnh tiểu đường loại 1 là: ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều (4 nhiều), mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng

 Loại 2 (Type 2)

Bệnh tiểu đường loại 2 chiếm khoảng 90-95% trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên Bệnh nhân thường ít có triệu chứng

và thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ hoặc khi có biến chứng như nhồi máu

cơ tim, tai biến mạch máu não; khi bị nhiễm trùng da kéo dài; bệnh nhân nữ hay bị ngứa vùng do nhiễm nấm âm hộ; bệnh nhân nam bị liệt dương

1.3.3 Phương pháp điều trị

1.3.3.1 Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 1:

Với những người mắc bệnh đái tháo đường loại 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hormon này.Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong hai dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dung ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrate sắp nhập vào, dạng tác dụng chậm thường được dung

1.3.3.2 Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2:

Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân, phương pháp điều trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dung thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết.Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin

Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:

- Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết ra them insulin như nhóm sulfonylurea: glyburide (Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucontrol, Glucontrol XL), glimepiride (Amaryl) và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin)

- Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hiệu quả hơn như nhóm biguanide: metformin (Glucophage, Glucophage XR, metformin XR, nhóm thiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avadia), pioglitazone (Actos)

- Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu đường khi ăn các chất ức chế enzyme α – glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sinh sản insulin …Như các phương pháp khác

1.4.2 Chất ức chế enzyme[1]

Chất ức chế enzyme là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Hoạt động của một enzyme có thể giết chết một mần bệnh hoặcđiều chỉnh lại sự không cân bằng trong chuyển hóa Có nhiều loại thuốc ức chế enzyme, chúng cũng được sự dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu, Không phải tất cả các phân tử liên kết với enzyme đều là chất ức chế enzyme, những chất hoạt hóa liên kết với các enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme mà chúng liên kết

Sự liên kết cuả một chất ức chế có thể ngăn chặn một cơ chất đi vào tâm hoạt động của enzyme và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzyme đó Chất ức chế có thể liên kết với enzyme thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Chất ức chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzyme và thay đổi nó về mặt hóa học Những chất ức chế đó làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết cho hoạt động của enzyme Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùy thuộc vào liên kết chất ức chế - enzyme, phức enzyme – cơ chất, hoặc cả hai

Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzyme bằng các tương tác không đồng hóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion Nhiều liên kết yếu giữa những chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt Ngược lại, đối với các cơ chất và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzyme và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách

Có 4 kiểu ức chế enzyme thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác động của sự thay đổi nồng độ cơ chất của enzyme trên chất ức chế

1.4.2.1 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Cơ chất và chất ức chế không liên kết với enzyme cùng một lúc Điều này có thể

là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động của một loại enzyme nên xảy ra sự cạnh tranh giữa cơ chất và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzyme Đây là

loại ức chế có thể được khắc phục

19

bằng nồng độ đủ cao của cơ chất bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền thật

1.4.2.2 Ức chế phi cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Chất ức chế chỉ kết hợp với phức enzyme- cơ chất mà không kết hợp với enzyme

tự do Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzyme làm giảm hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzyme – cơ chất Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế

1.4.2.3 Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition)

Chất ức chế hợp với enzyme ở vị trí khác khác với vị trí kết hợp của cơ chất tạo thành phức enzyme- cơ chất- chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp Như vậy, enzyme

có thể đồng thời kết hợp cả chất ức chế và cơ chất Cơ chất và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết hợp với enzyme và cũng không thể loại trừ tác dùng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ chất nền

1.4.2.4 Ức chế tổng hợp (mixed inhibition)

Chất ức chế không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzyme – cơ chất tạo tahnhf phức hợp enzyme – chất ức chế - cơ chất nên không tạo được sản phẩm Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ

ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế

21

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Sử dụng lá Vẹt tách (Bruguiera parviflora )[32] thuộc chi Bruguiera,

họ Rhizophoracea Lá có phiến non, gân phụ 7-10 cặp, khó nhận; cuống 2 cm, lá bẹ

5-7 cm ,lá có màu xanh lục đậm , không bị sâu

Lá Vẹt tách (Bruguiera parviflora ) sử dụng trong thí nghiệm được thu nhận ở rừng

ngập mặn Cần Giờ.Sau khi hái về , nguyên liệu rửa sạch ,loại bỏ tạp chất, phơi khô

và xay tạo thành bột cây chuẩn bị cho quá trinh nghiên cứu

Hình 2 1: Cây Vẹt tách (Bruguiera parviflora )

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa , Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 09/2017 đến tháng 04/2018

Các loại hóa chất trong chạy phổ: DMSO, CDCl3 (Mesk)

- Silica gel (India)

- Silica gel 200-400 Mesk

- Silica gel pha đảo ODS Mesk

- Sephadex LH20 Mesk

- 4-Nitrophenyl α –D-Glucopyranoside( Sigma)

- Enzyme α – glucosidase (Sigma)

22

- Acarbose(Sigma)

- NaOH (Việt Nam)

Hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết phân tích

 Thiết bị :

- Tủ sấy (Memmert ALM400)

- Cân phân tích điện tử ( AA -200)

- Cân kỹ thuật ( Sartorius TE 412)

- Máy cô quay ( Heidolph)

- Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6 LC

- Máy đo quang phổ BioTek

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu nghiên cứu được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ Tp.HCM Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS Phạm Văn Ngọt (trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM) Mẫu được rửa sạch phơi khô xay mịn và ngâm dầm với ethanol

2.2.2 Phương pháp ngâm dầm (Maceration) [32]

Ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy (Tránh sử dụng bình bằng nhựa) Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến khi sắp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày

để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hợp chất tự nhiên Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hối dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

2.2.3 Phương pháp cô lập các hợp chất[32]

Từ cao chiết tổng ban đầu tiến hành phân bố lại trong các dung môi hexan, ethylacetat và ethanol Dùng sắc ký cột để chia cao ethylacetate thành nhiều phân đoạn, từ các phân đoạn được đem đi phân lập chất tinh khiết Chất tinh khiết sẽ được phân lập dựa trên các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo, diaion HP20, sephadex LH20, HPLC điều chế kết hợp với sắc ký bản mỏng

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

23

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha

thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430

mesk), silica gel pha đảo ODS Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng chất nhồi cột là diaion

HP20 và sephadex LH20 để phân lập chất

 Sắc ký lỏng cao áp điều chế (HPLC)

Được thực hiện trên máy Agilent 1100 với cột XDB-C18

2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125

MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện hóa học, viện

Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α – glucosidase [1]

Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α - glucosidase theo phương pháp

Aposstolidis et al (2007) Để khảo sát khả năng ức chế hoạt tính enzyme α -

glucosidase trên cao chiết, ta sử dụng p-nitrophenyl- α -D- glucopyranosid (pNPG)

làm cơ chất Cơ chất p-nitrophenyl- α -D- glucopyranosid sẽ bị enzyme α - glucosidase

thủy phân chuyển hóa thành α -D-glucose và p-nitrophenol (pNP)

Hình 2 2: Sự chuyển hóa chất nền khi bị enzyme α - glucosidase ức chế

24

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Quy trình điều chế cao tổng

Lá cây Vẹt tách sử dụng cho nghiên cứu được thu hái từ rừng ngập mặn Cần Giờ tháng 09 năm 2017, sau đó được mang đi điều chế cao tổng

3.1.1 Quy trình điều chế cao tổng từ lá cây Vẹt tách (Bruguiera parviflora )

Hình 2 3: Quy trình điều chế cao tổng từ lá cây Vẹt tách (Bruguiera Parviflora)

25

2.3.1.2 Thuyết minh quy trình

Mẫu lá cây tươi Vẹt tách (Bruguiera parviflora) được thu hái lá trưởng thành

tại rừng ngập mặn Cần Giờ, mẫu được mang đi giám định tên khoa học bởi TS Phạm Văn Ngọt (trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM) loại bỏ những lá hư hỏng sâu bệnh, rửa sạch loại đất cát, phơi khô và xay nhuyễn Sau đó, dụng dung môi ethanol 960C được

sử dụng để trích ly các hợp chất trong lá cây bằng phương pháp ngâm dầm với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:12 g/ml Qúa trình trích ly được thực hiện với thời gian ngâm là 15 ngày, trong quá trình ngâm dung môi được thay sau mỗi 24 giờ cho đến khi chiết kiệt các hợp chất có trong bã cây Tiếp đó, hỗn hợp sau khi được trích ly được lọc thô rồi lọc tinh để loại bỏ bã, dịch sau khi lọc được loại dung môi bằng phương pháp cô quay chân không Cao tổng này được sử dụng để tiến hành điều chế cao phân đoạn ở các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Quy trình điều chế cao phân đoạn

2.3.2.1 Quy trình điều chế cao phân đoạn

Cao phân đoạn được tiến hành điều chế từ cao tổng bằng cách sử dụng các dung

môi có độ phân cực khác nhau như: n-hexan, n-hexan:ethyl acetate (1:1), ethyl acetate,

ethyl acetate: methanol (1:1), methanol Phương pháp chiết lỏng-lỏng được sử dụng

để điều chế cao phân đoạn Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong hình 2.3

2.3.2.2 Thuyết minh quy trình

Cao tổng từ lá cây Vẹt tách thu được theo sơ đồ hình 2.3, tiến hành quá trình điều chế cao phân đoạn theo sơ đồ hình 2.3 Cao phân đoạn được điều chế theo thứ tự tăng dần của độ phân cực tương ứng với dung môi như: hexan, hexan:ethyl acetate (1:1), ethyl acetate, ethyl acetate: methanol (1:1), methanol