kHảo sát hợp chất kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) từ chủng bacillus sp rd26 được phân lập từ cây diệp hạ châu đắng (phyllathus amarus schum et thonn) nghiên cứu khoa học

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN KHẢO SÁT HỢP CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN MRSA TỪ CHỦNG BACILLUS SP.RD26 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ CH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT HỢP CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG

METHICILLIN (MRSA) TỪ CHỦNG BACILLUS SP.RD26 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLATHUS AMARUS SCHUM.ET

THONN)

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vương Hạ Quỳnh

Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh

TP Hồ Chí Minh, 2018

I

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG IV DANH MỤC BIỂU ĐỒ V DANH MỤC HÌNH ẢNH V DANH MỤC VIẾT TẮT VI

ĐẶTVẤNĐỀ 1

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.TỔNGQUANVỀVIKHUẨNSTAPHYLOCOCCUS AUREUSKHÁNG METHICILLIN(MRSA) 4

1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 4

1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococci 6

1.2.1 Đề kháng  - lactams 6

1.2.2 Đề kháng Penicillin 7

1.2.3 Đề kháng Methicillin 7

1.2.4 Đề kháng Vancomycin 8

1.3 Tình hình MRSA kháng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam 8

2.ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 11

2.1 Sơ lược về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn) 11

2.2.1 Đặc điểm thực vật học 11

2.1.2 Đặc điểm hình thái 12

2.1.3 Phân bố 12

2.1.4 Công dụng và các bài thuốc đặc trị bệnh từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum Et Thonn) 12

2.2 Vi khuẩn nội sinh 13

II

2.3 Vi khuẩn Bacillus 14

2.3.1 Phân loại 14

2.3.2 Hình dạng và kích thước 14

2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 15

2.3.4 Ứng dụng của Bacillus 15

3.PHƯƠNGPHÁPCHIẾT 16

3.1KHÁI NIỆM 16

3.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 17

4.XÁCĐỊNHTHÀNHPHẦNDỊCHCHIẾTBẰNGPHƯƠNGPHÁPGC–MS 18

4.1 Giới thiệu về sắc kí ghép khố phổ 18

4.2 Đặc điểm 18

4.3 Sắc ký khí 19

4.4 Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí 19

5.TÌNHHÌNHCÔNGTRÌNHNGHIÊNCỨUVIKHUẨNKHÁNGVIKHUẨN KHÁNGTHUỐC 20

5.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc thế giới 20

5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc ở Việt Nam 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

1.VẬTLIỆU 24

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

1.2 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 24

1.3 Môi trường – hóa chất 24

1.4 Thiết bị và dụng cụ 24

2 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.1 Tái kiểm tra 26

2.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp RD26 26

2.1.2 Lên men chủng Bacillus sp RD26 trên môi trường tối ưu 27

2.1.3 Chuẩn bị thí nghiệm 28

2.1.3.1 Chuẩn bị môi trường 28

III

2.1.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA 28

2.1.3.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm 28

2.1.4 Tái kiểm tra hoạt tính kháng MRSA của chủng Bacillus sp.RD26 28

2.1.4.1 Tiến hành thử nghiệm 28

2.1.4.1 Kết quả 29

2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền dịch lên men của chủng Bacillus sp.RD26 29

2 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền dịch lên men của chủng Bacillus sp.RD26 29

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch lên men của chủng Bacillus sp RD26 thử nghiệm 30

2.2.2.4 Tiến hành thử nghiệm 30

2.3 Tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận 31

2.4 Xác định thành phần hợp chất bằng phương pháp GC - MS 32

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.KẾTQUẢ 34

3.1 Tái kiểm tra chủng Bacillus sp RD26 34

3.1.1 Tái kiểm tra 34

3.1.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp RD26 34

34

34

3.1.2 Tái kiểm tra hoạt tính kháng bằng phương pháp khếch tán giếng thạch 34

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus sp RD26 36

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến dịch lên men kháng khuẩn thu nhận từ chủng Bacillus sp RD26 39

3.4 Kết quả tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận 41

3.5 Kết quả xác định thành phần hợp chất kháng khuẩn bằng phương pháp GC – MS 43

3.5.1 Thành phần hóa học trong dịch Methanol 43

3.5.1 Thành phần hóa học trong dịch Ethanol 44

IV

3.6 So sánh thời gian lưu của dịch mẫu có Ethanol và Methanol 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

4.1KẾT LUẬN 49

4.2ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT 1

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 3

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS 5

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập chủng Bacillus sp.RD26 trong môi trường tối ưu

……… 34

Bảng 3.2 Kết quả thử khả năng kháng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 35

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền của Bacillus sp.RD26 trong pH 37

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền của Bacillus sp.RD26 trong nhiệt độ 40

Bảng 3.6 Kết quả tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận 441

Bảng 3.7 Thành phần hóa học trong dịch Methanol 43

Bảng 3.8 Thành phần hóa học trong dịch Ethanol 44

Bảng 3.9 Thời gian lưu của mỗi peak 47

V

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Khả năng ảnh hưởng độ bền hoạt tính kháng khuấn của dịch lên men 31

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của dịch kháng khuẩn chủng Bacillus

sp RD26 38

Biểu đồ 3.4 Kết quả tách chiết hợp chất kháng khuẩn bằng các dung môi thử…… ……… ………42

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2 4 Hình vi thể của MRSA 4

Hình 1.2 Cơ chế kháng Penicillin và Methicillin của Staphylococcus aureus 6

Hình 1.2.4 Cơ chế Vancomycin của VISA Những chủng VISA này tổng hợp thêm lượng peptidoglycan đồng thời gia tăng D- Ala-D-Ala Những phần Ala nối với Vancomycin ngăn không cho tiến đến gần màng tế bào vi khuẩn 8

Hình 1.3 Tỷ lệ mà Staphylococcus aureus xâm kháng Methicillin (MRSA) ở 19 quốc gia và Kosovo (theo Nghị quyết 1244 (1999) của Liên hợp quốc tại CAESAR và 30 quốc gia trong EARS-Net; với các quốc gia thành viên của khu vực Châu Âu qua mạng lưới giám sát của Trung Á và Đông Âu về mạng lưới kháng kháng sinh năm 2016 9

Hình 2 1 Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn) 11

Hình 2.3 Hình vi thể của Bacillus 14

Hình 3 1 Sự phân bố của một chất tan trong hai pha lỏng 17

Hình 4.1 : Sơ đồ hệ thống GC 20

Hình 2.5 Kết quả kháng khuẩn của vi khuẩn thử nghiệm 29

Hình 3.2 Hình thái đại thể của Bacillus sp RD26 ở 24 giờ 34

Hình 3 3 Hình thái vi thể của Bacillus sp RD26 ở 24 giờ (100x) 34

VI

Hình 3.4 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng giếng khuếch tán chủng Bacilus

sp RD26 36 Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính kháng khuẩn 39 Hình 3.6 Kết quả tách chiết chất kháng khuẩn bằng dung môi Ethanol và Methanol42

Gram (-) Gram âm

Gram (+) Gram dương

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

“Staphylococcus aureus kháng Methicillin”

ICU Intensive care unit

“Đơn vị hồi sức cấp cứu, điều trị tích cực, chăm sóc đặc biệt”

CDDEP Center for disease dynamics, economics & policy

“Trung tâm động dịch bệnh, kinh tế và chính sách”

CLSI Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng

VII

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt

là nhiễm trùng ở các bệnh viện Hơn thế nữa, những tác nhân nhiễm trùng cơ hội này đã và

đang trở nên đề kháng với nhiều loại kháng sinh Staphylococcus aureus kháng Methicillin

(MRSA) là những chủng tụ cầu vàng kháng Methicillin và các kháng sinh thuộc nhóm 𝛽- lactam như Penicillin và Cephalosporin MRSA lần đầu tiên được báo cáo ở Châu Âu vào năm 1960 và số lượng các vi khuẩn kháng thuốc đã và đang gia tăng trong suốt những thập

kỷ qua Một nghiên cứu đa trung tâm được thực hiện trên 235 chủng Staphylococcus aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus cho thấy

tỉ lệ MRSA là 47% (Vân PH và cs, 2005) Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005 –

2007 ở các bệnh viện Hàn Quốc cho thấy vi khuẩn MRSA chiếm 64% Năm 2017, WHO

công bố danh sách mức độ quan trọng của kháng sinh bị kháng bao gồm Acinetobacter

baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobactericeae kháng Carbapenem đang nằm ở

mức độ quan trọng nhất Bên cạnh đó vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin

và vancomycin đang nằm ở mức cao (WHO, 2017)

Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới bước đầu nghiên cứu và tìm ra được một số hợp chất kháng khuẩn từ các vi sinh vật nội sinh Trong đó, vi khuẩn nội sinh được xem là một trong những nguồn tiềm năng có thể thay thế kháng sinh Các hợp chất sinh học tự nhiên0 được sản xuất bởi vi khuẩn nội sinh có nhiều ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và cả công nghệ sinh học Các hợp chất tự nhiên thu được

từ vi khuẩn nội sinh được tìm thấy có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm ví dụ như Ecomycins, Pseudomycins, Munumbicins và Xiamycins, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, đái tháo đường và ức chế miễn dịch (Christina và cs., 2013) Năm 2008,

Olffa Tabbene và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng Bacillus subtilis

B38 đối với vi khuẩn kháng thuốc MRSA Đến năm 2010, Olffa Tabbene và cộng sự đã xác định được hợp chất S07-2, đây là một hợp chất có khối lượng phân tử là 905,6Da được

thử nghiệm có thể kháng lại Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes và

Enterococcus feacalis (Olffa Tabbene và cs., 2010) Theo Sunkar và cộng sự, năm 2013 đã

2

phân lập và xác định vi khuẩn nội sinh Brassica oleracea khả năng sinh enzym amylase,

protease, cellulase tiềm năng trong sản xuất enzym đồng thời có kháng khuẩn đối với

Klebsiella Pneumoniae (20mm), Staphylococcus aureus (25mm) (Sunkar và cs., 2013)

Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nhiều về hợp chất kháng vi khuẩn kháng thuốc của vi khuẩn nội sinh

Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hợp chất kháng Staphylococcus

aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus sp RD26 được phân lập từ cây

Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn)”, đối với nghiên cứu này,

chúng tôi sử dụng chủng Bacillus sp RD26 được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng

Bacillus sp RD26 được thừa kế từ công trình nghiên cứu trước Chúng tôi nghiên cứu đánh

giá khả năng kháng MRSA cũng như tối ưu hóa môi trường để sinh ra hợp chất có nhiều kháng khuẩn cao

Mục tiêu đề tài:

Khảo sát hợp chất kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA)

từ chủng Bacillus sp RD26 được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus

schum Et thonn)

Nội dung đề tài:

- Tái kiểm tra chủng Bacillus sp RD26 trong môi trường tối ưu

- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của dịch lọc kháng khuẩn

- Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch lọc kháng khuẩn

- Khảo sát các dung môi phù hợp để thu nhận hợp chất dịch chiết

- Phân tích dự đoán các chất có trong dịch mẫu kháng MRSA

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG

METHICILLIN (MRSA)

1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin

MRSA được viết tắt với tên gọi Methicillin- resistant Staphylococcus aureus là

Staphylococcus aureus kháng Methicillin Staphylococcus aureus kháng Methicillin có

nghĩa là kháng được tất cả các 𝛽 − lactam, và có thể kháng được Aminoglycosides và Macrolides Methicilin được coi là kháng sinh mạnh nhất trong nhóm 𝛽 − lactam Hiện

nay, Staphylococcus aureus kháng Methicillin đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là

trong các trường hợp nhiễm trùng tại bệnh viện (Karpin và cs., 2015) Chính vì vậy phát

hiện kháng Methicillin trên Staphylococcus aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004) MRSA là các chủng Staphylococcus aureus biểu hiện cơ chế kháng qua mecA hoặc qua cơ

chế kháng Methicillin khác, ví dụ thay đổi ái lực của protein gắn Penicillin với Oxacillin (CLSI, 2011)

Phân loại khoa học

Giới: Eubacteria Ngành: Eubacteria Lớp : Bacilli

Bộ : Bacillales Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus

Loài: Staphylococcus aureus

MRSA thường gây nhiễm trùng bệnh viện nặng Được phân lập tại Châu Âu đầu tiên vào năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (tỷ lệ nhiễm MRSA 10 - 40%) Ở Canada phát hiện đầu tiên vào năm 1979

và trở thành dịch năm 1981 Tỷ lệ tăng từ 0,46/1000 ca năm 1995 lên 5,9/1000 ca năm

2004 Nghiên cứu năm 2006 ở 48 bệnh viện tại Canada cho thấy: 11.700/29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng (Nguyễn Thị Thu Ba và cs., 2011)

Staphylococcus aureus kháng Methicillin thường kéo theo sự đề kháng các kháng sinh

Hình 1.1 Hình vi thể của MRSA

5

khác là vì cơ chế đề kháng của Staphylococcus aureus đối với Methicillin là biến đổi

protein bám Penicillin (PBP) chỉ do một gen qui định (mecA) và kháng thuốc kiểu này là kháng thuốc một cấp, nghĩa là một khi đã đề kháng được Methicillin thì vi khuẩn đề kháng được tất cả các kháng sinh 𝛽-lactam và có thể kháng các kháng sinh khác nữa (Phạm

Hùng Vân, 2005) Đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus là vấn đề thời sự của

nghành y tế và là thách thức lớn cho điều trị Từ tháng 8/2012 – tháng 8/2013, một nghiên

cứu với 143 chủng Staphylococcus aureus về tỉ lệ đề kháng kháng sinh của

Staphylococcus aureus trong 4229 bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh

phẩm, khoa LAM Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy:

Staphylococcus aureus chiếm 23,6% (n=143 , đa số được phân lập từ bệnh phẩm mủ

(36,3%), dịch âm đạo (18,9% , nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%) (n=143) Qua kết quả

từ kháng sinh đồ, tỉ lệ đề kháng của Staphylococcus aureus với các kháng sinh là 93,7%

với Penicillin G, 65,0% với Erythromycin, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycin Tỉ lệ MRSA là 39,2% và MSSA là 60,8% Ngày càng xuất hiện nhiều chủng

đa kháng kháng sinh hơn Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp và một hệ thống giám sát quốc gia về kháng sinh của vi

khuẩn nói chung, của Staphylococcus aureus nói riêng là cần thiết, đặc biệt là đối với các

chủng MRSA hay MSSA tại Việt Nam (Nguyễn Hữu An và cs., 2013) Ngày nay, vi

khuẩn MRSA đã hiện diện từ 3-5% trên tất cả các chủng Staphylococcus aureus

(Hemamalini và cs., 2015) Trong những năm gần đây, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện toàn cầu đã chứng kiến một sự gia tăng đáng kể Tại Ấn Độ, tình trạng MRSA gia tăng đáng

kể từ 29 % - 47% trong năm 2014 (CDDEP, 2015)

MRSA được chia ra làm hai loại: MRSA bệnh viện và MRSA cộng đồng

MRSA bệnh viện (MRSA-N): do mắc phải gene gây biến đổi PBP-2a Protein này được mã hóa bởi gene mecA định vị trên yếu tố di truyền di động Chúng tác động giống như transpeptidase, liên kết với peptidoglycan chủ yếu ở cấu trúc màng tế bào vi khuẩn PBP-2a khác với PBP bình thường ở chỗ chúng có ái lực rất yếu với kháng sinh nhóm 𝛽- lactam, do vậy các kháng sinh nhóm Penicillin, Cephalosporin và các 𝛽- lactam khác không có tác dụng chống MRSA-N Gần đây, một số thuốcm ứoi đắt tiền và độc hơn đã xuất hiện để giúp chúng ta chống lại MRSA như: Linezolide, Tigecycline, Daptomycin,

6

Ceftobprole và Dalbavancine (Jettes L và cs, 2009)

MRSA cộng đồng (MRSSA-C): Từ sau thập niên 1990, đã xuất hiện các trường hợp nhiễm cộng đồng MRSA hoàn toàn không có yếu tố nhiễm khuẩn bệnh viện và ngày nay đang có nhiều nhận biết mới về chủng kháng thuốc cộng đồng này (Steafani S và cs, 2009), (Hidron AI và cs, 2009) Trái với MRSA-N, các chủng MRSA-C phát tán trong quần thể khỏe mạnh, nơi các cá thể tiếp xúc với nhau rất gần gũi như các vận động viên thể thảo, các em nhỏ ở nhà trẻ, các phạm nhân trong nhà tù, các quân dân và các người dân địa phương Trường hợp đầu tiên được phát hiện ở Mỹ năm 1982, với một chủng ít lan tràn, đề kháng với các kháng ính khác như: Doxycycline và clindamycine Kể từ đó

số ca mắc và độ nặng tăng dần lên (Rybak MJ và cs, 2005)

Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng đáng kể chi phí điều trị và tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân nằm viện Các chủng Staphyloccoci, đặc biệt vi khuẩn MRSA là một trong những chủng gây ra các nhiễm trùng khó điều trị và phổ biến ở bệnh viện Theo số liệu của CDC, tỉ lệ bệnh nhiễm trùng mà có sự đề kháng kháng sinh đang gia tăng Năm 1974, tỉ lệ bệnh nhiễm trùng mà có sự đề kháng kháng sinh đang gia tăng Năm 1995 con số này là 22%, năm 2004 lên đến 63% Một nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự tại 7 phòng thí nghiệm vi sinh của 7 phòng thí nghiệm vi sinh của 7 bệnh viện tham gia nghiên cứu: Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng, Bệnh viện Đa khoa Cần Thơ, Bệnh viện An Bình, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Bệnh viện Nhân Dân Gia ĐỊnh, Bệnh viện Nhi Đồng1 và Bệnh viên

chấn thương chỉnh hình Trần Hưng Đạo cho thấy: Trên 235 chủng Staphylococcus aureus

phân lập được, trong đó có 110 chủng kháng Methicillin (MRSA) và 125 chủng nhạy

Methicillin (MSSA) Như vậy tỷ lệ MRSA trong các chủng vi khuẩn Staphylococcus

aureus nghiên cứu là 47% (Vân PH Và cs, 2005)

1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococci

1.2.1 Đề kháng  - lactams

Staphylococci đề kháng với các kháng sinh  - lactams chủ yếu thông qua cơ chế tiết enzyme  - lactams (Penicilasa, Cephalosporinase, Carbapenase,…) Enzyme  - lactams tiết ra ở khoang quanh bào tương của tế bào vi khuẩn và làm mất hoạt tính của kháng sinh bằng cách xúc tác mở vòng  - lactams trước khi kháng sinh gắn vào đích PBP ở màng bào

7

tương Sự tiết  - lactams qua trung gian transpoison mecA (gen nhảy: là những gen có thể chuyển vị trí từ plasmid vào nhiễm sắc thể hay từ plasmid này qua plasmid khác) Wyeth Ayerst.,2002)

1.2.2 Đề kháng Penicillin

Đối với Penicillin thì: Gen blaZ mã hóa cho  - lactams tạo ra tính kháng penicillin của Stapylococus aureus Những enzyme ngoại bào này được tổng hợp khi Stapylococus aureus gặp kháng sinh  - lactams, thủy phân vòng  - lactams, làm bất hoạt  - lactams blaZ được điều hòa bởi gen hoạt hóa blả1 và gen ức chế blaI Con đường tổng hợp  - lactams đòi hỏi sự phân chia liên tục của protein điều hòa BlaR1 và BlaI Sau khi gặp  - lactams, BlaR1 tự tách ra, hoạt động như protease tách BlaI và cho phép blaZ tổng hợp enzyme (Ellen Jobaron., 1990)

1.2.3 Đề kháng Methicillin

Gen mecA tổng hợp protein PBP2a có ái lực với  - lactams thấp, giúp cho Staphylococcus aureus sống sót trong môi trường có nồng độ  - lactams cao Khác với những PBP khác, PBP2a chặn đứng liên kết của những  - lactams nhưng cho thực hiện phản ứng chuyển peptid (CDC., 1997)

Hình 1.2 Cơ chế kháng Penicillin và Methicillin của Staphylococcus aureus

8

1.2.4 Đề kháng Vancomycin

Hình 1.2.4 Cơ chế Vancomycin của VISA Những chủng VISA này tổng hợp thêm lượng peptidoglycan đồng thời gia tăng D- Ala-D-Ala Những phần Ala nối với Vancomycin ngăn không cho tiến đến gần màng tế bào vi khuẩn

Chủng VISA có MIC với Vancomycin 8 – 16 g/ ml Những chủng VISA tổng hợp nhiều lượng peptidoglycan dẫn đến vách tế bào dày lên và có hình dạnh bất thường Những chuỗi peptidoglycan bị giảm liên kết chêó làm bộc lộ nhiều phần đuôi D – Ala- D- Ala Kết quả là có nhiều phần đuôi D- Ala- D- Ala có thể kết hợp với Vancomycin Sự kết hợp này ngăn không cho Vancomycin tiến gần đến màng vi khuẩn (CDC., 1997)

1.3 Tình hình MRSA kháng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam

Ngày nay, hiện tượng kháng thuốc ở nhiều loại vi khuẩn không ngừng gia tăng, điều này làm cho một số loại thuốc kháng sinh mất tác dụng chữa trị và kho tàng thuốc kháng sinh trở nên hạn hẹp và khan hiếm Theo The Centers for Disease Control & Prevention (CDC) Hoa Kỳ cho biết, có thể nói là có trên 50% toa kháng sinh do bác sĩ kê cho bệnh nhân đều không cần thiết và không xác đáng vì được kê ra để chữa trị những bệnh do virus như ho hen hay cảm cúm Được biết là thuốc kháng sinh chỉ có công hiệu để chữa trị những bệnh cảm nhiễm do vi khuẩn gây ra Cơ quan y tế Canada cũng đưa ra một nhận định như trên

Staphylococcus aureus, giờ thì nó không còn hữu hiệu nữa

Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus là nguyên nhân gây nhiều loại nhiễm khuẩn trong

bệnh viện như: viêm phổi, nhiễm trùng xương, tim và nhiễm khuẩn huyết Hiện nay, tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) kháng giống nhau đối với tất cả các penicillin hiện hành

và các β – lactam khác Từ sau thập niên 1990 đã xuất hiện các trường hợp nhiễm MRSA tại cộng đồng (gọi là CA-MRSA: community-associated MRSA), những trường hợp này hoàn toàn không có yếu tố nguy cơ nhiễm khuẩn mắc phải tại bệnh viện Nhiễm trùng do

vi khuẩn này đang có khuynh hướng xảy ra phổ biến hơn ở người trẻ, khỏe mạnh và gây bệnh chủ yếu ở da và mô mềm Cũng có thể gặp viêm phổi hoại tử do vi khuẩn này Nhiễm khuẩn do MRSA khó điều trị hơn so với tụ cầu vàng nhạy cảm với methicillin, chỉ có một

số kháng sinh còn có hiệu quả tốt trong tình huống này Theo ICU, có đến 24% bệnh nhận

ở đây bị nhiễm khuẩn MRSA, và 20% trong bệnh nhân nhiễm khuẩn máu ở bệnh viện do MRSA Vancomycin là thuốc được đưa vào điều trị MRSA tại ICU Dữ liệu gần đây cho

10

thấy sự gia tăng kháng thuốc Vancomycin về lâm sàng khi dùng Vancomycin đã khiến cho vai trò của nó không còn nữa (Tervdek, 2016) Đứng trước tình hình Staphlylococcus

aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết được enzyme penicillinase phá

hủy được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định penicillin M để điều các nhiễm khuẩn

do Staphlylococcus aureus Tuy nhiênhiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân Staphlylococcus aureus kháng được penicillin M (MRSA) với tỷ lệ ngày

càng tăng Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực hiện năm 2005 trên 235 chủng

Staphlylococcus aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng nhiễm khuẩn do Staphlylococcus aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47% ( Hidron AI và cs, 2008) Tổng kết

tại bệnh viện Chợ Rẫy và Bạch Mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43% (Trần Thị Thanh Nga và cs, 2009) Tại bệnh viện Bạch Mai từ ngày 1/1/2013 – 31/1/2017 tại khoa vi sinh đã nghiên cứu tiến hành trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng

da và mô mềm dương tính với vi khuẩn Tỉ lệ vi khuẩn gram âm chiếm 55,7% Tỉ lệ phân

lập được đa tác nhân là 14,7% Tác nhân hàng đầu phân lập được là Staphylococcus aureus (34,2%) Tỉ lệ Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là 53,7% và tất cả các chủng Staphylococcus aureus còn nhạy vancomycin (Vũ Ngọc Hiếu và cs., 2017).

Tổng kết của GRAP-VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại Việt Nam vào năm 2008 là từ 30% đến 64% Bệnh viện Thống Nhất tại TP Hồ Chí Minh từ năm

2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 40% Staphlylococcus aureus phân lập từ nhiễm đường

tiết niệu kháng methicillin ( Bộ y tế và GRAP- VS, 2009) Chỉ định này đang phải đối điẹn với một thử thách mới, không phải do xuất hiện đề kháng Vancomycin mà là do MIC của

vancomycin đối với Staphlylococcus aureus bị tăng vượt quá 1.5 𝜇𝑔/𝑚𝑙 gây thất bại điều

trị vancomycin trên lâm sàng Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viên Chợ Rẫy với ghi nhận 46% cácc chủng MRSA có MIC của vancomycin

≥ 2 𝜇𝑔/𝑚𝑙 và 93% có MIC ≥ 1.5 𝜇𝑔/𝑚𝑙 Sự kháng thuốc đối với các loại thuốc đầu tiên

để điều trị các nhiễm trùng gây ra bởi Staphlylococcus aureus - một nguyên nhân phổ biến

gây nhiễm trùng nặng ở các cơ sở y tế và cộng đồng - rất phổ biến Những người bị nhiễm

MRSA (Staphylococcus aureus kháng Methicillin ) được ước tính là có khả năng chết hơn

64% so với những người có biểu hiện nhiễm trùng không kháng thuốc (WHO, 2017)

11

Tại một hội nghị của Bộ Y tế về kháng thuốc cuối tháng 9/2017, tình trạng kháng thuốc ngày càng trầm trọng và là mối nguy đe doạ sức khoẻ toàn cầu Tình trạng kháng thuốc kháng sinh gây tác động lớn đến nền kinh tế, sự phát triển chung của xã hội Không chỉ riêng đối với Việt Nam nó còn tác động đến tất cả các nước trên thế giới, đặc biệt là trong thời đại toàn cầu hoá hiện nay (Thùy Linh, 2017)

Tỉ lệ kháng kháng sinh của S aureus khác nhau giữa các bệnh viện: có tới 68,8% các

chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với Gentamicin Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế với 63,8% Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ

Rẫy năm 2008, có 8% số chủng S aureus phân lập được đề kháng với vancomycin Tuy nhiên, đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S aureus nào

đề kháng với vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện trực thuộc Sở y tế cho kết

quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng vancomycin của tụ cầu vàng, ví dụ như 60,9% S

aureus kháng vancomycin tại bệnh viện Uông Bí, 24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6%

tại bệnh viện Xanh Pôn (Tverdek và cs, 2008)

2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ lược về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn)

2.2.1 Đặc điểm thực vật học

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schunm.et thonn, thuộc họ: Thầu dầu

(Euphorbiaceae), tên thường gọi: chó đẻ thân xanh, chó đẻ răng cưa, cam kiềm, rút đất, kham ham

Loài: Amarus Schum.et Thonn

Hình 2.1 Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus

amarus Schunm.et thonn)

12

(Hemant Dhongade và cs, 1999)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây thảo, sống hằng năm hay sống dại, cao khoảng 20 – 30 cm, có rễ dẫn đến 60 – 70

cm Thân nhẵn, mọc thẳng đứng, lá mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy như một lá kép hình lông chim Phiến lá thuôn, dài 1 – 1,5 cm, rộng 3 – 4 mm, đầu lá nhọn hay hơi tù, mép có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu xanh lơ, cuống lá rất ngắn Hoa mọc ở kẽ lá,

có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc, hoa đực ở đầu cành có 6 lá dài, 3 nhị, chi nhị ngắn, hoa cái ở cuối cành, 6 lá dài, bầu hình trứng Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống dưới

lá, có khía mở và có gai, hạt hình 3 cạnh Mùa hoa: tháng 4 – 6, mùa quả: tháng 7 – 9 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

2.1.3 Phân bố

Cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus Schum Et Thonn ) là loài cây nhiệt

đới, có nguồn gốc xa xưa ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới cổ Ở Châu Á gồm các nước Ấn Độ, Malaysia, Phillippin, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi (Đỗ

Huy Bích và cs., 2004) Chi Phyllanthus L có nhiều loài, gồm những cây thảo đến các cây

bụi hay gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, chỉ có khoảng 40 loài Diệp hạ châu đắng là cây ưa ẩm và ưa sáng, thường mọc lẫn trong các bãi

cỏ, ở ruộng cao, nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi không chịu được ngập úng Cây sống được trên nhiều loại đất ( đất bazan, đất pha cát, đất phù sa,…) pH từ 5,0 đến 6,5 Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng là 25 - 30oC Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, vòng đời kéo dài 3 – 5 tháng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

2.1.4 Công dụng và các bài thuốc đặc trị bệnh từ cây Diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus Schum Et Thonn)

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, tất cả các bộ phận cây diệp

hạ châu Đắng được phơi khô, sắc uống chữa đau viêm họng, đính râu, mụn nhọt, viêm da,

lỡ ngứa… Người Ấn Độ sử dụng diệp hạ châu để trị ho, viêm phế quản,… Ngoài ra, Diệp

hạ châu đắng còn có khả năng làm hạ men gan, tăng cường chức năng gan và ức chế sự phát triển của virus viêm gan siêu vi B (Break Stone và cs., 1982)

13

2.2 Vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là các vi sinh vật sống trong mô của thực vậy ít nhất là một phần chu kỳ sống của chúng mà không gây ra bất kỳ biểu hiện bệnh đối với cây (Bacon và White., 2000) Các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất là nấm và vi khuẩn (bao gồm cả xạ khuẩn)

Vi sinh vật nội sinh được coi là loài cộng sinh Để đại diện cho các loài vi sinh vật này, De Bary (1866) đặt ra thuật ngữ endophyte Endophytes được tìm thấy ở nhiều loài thực vật quan trọng như thảo dược, cỏ dại, cây cành và cây ăn quả Cả vi khuẩn nội sinh và nấm nội sinh xâm nhập hoặc có thể di chuyển đến toàn bộ các cơ quan của cây chủ (Hallmann và cs., 1997) Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở cùng rễ,

rễ, thân, lá, quả của thực vật (Zinniel và cs., 2002) Vi khuẩn nội sinh khu trú ở trong nội tại mô, tế bào của cây mà không không gây dấu hiệu nhiễm trùng hoặc ảnh hưởng tiêu cực lên cây vật chủ (Schulz Boyle, 2006) Vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học trong việc làm giảm các hợp chất độc hại được tìm thấy trong tự nhiên (Guo và cs., 2008) Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học khác nhau mà có thể trực tiếp hoặc gián tiếp được sử dụng như tác nhân chống lại nhiều bệnh ở thực vật, động vật và cả ở người (Strobel và cs., 2004) Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu tìm kiếm phát hiện ra các hợp chất kháng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt được tìm thấy trong vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là một nguồn tiềm năng đang được nghiên cứu để thay thế các kháng sinh hiện nay Để ngăn chặn mầm bệnh, các vi khuẩn nội sinh tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp cất hữu cơ mới Việc nghiên cứu các cơ chế này có thể giúp phát triển các loại thuốc mới

để điều trị hiệu quả các bệnh trên người (Strobel và cs., 2004).Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan

và cs., 2008) Các hợp chất điều trị tự nhiên được sản xuất bởi vi khuẩn nội sinh có nhiều ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và cả công nghệ sinh học Một số sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn nội sinh được tìm thấy có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm ví dụ như ecomycins, pseudomycins, munumbicins và

Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

2.3.2 Hình dạng và kích thước

Bacillus hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các

tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi

Cohn khi nghiên cứu về B.subtilis và sau đo là Koch trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B.anthracis vào năm 1976 Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như

là một đặc tính căn bản để phân loại và xác định các thành viên của chi (Gibson và cs., 1975)

Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B thermoamylovorans,

B halodenitrificans, một số khác có gram âm hay gram dương yếu như B.horti, B.oleronius,… Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải trình DNA – ARN, dạng vi khuẩn

không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như B infernus Tế bào sinh

dưỡng Bacillus thường có đầu vòng hay vuông, kích thước từ 0,5 – 1,2 x 2,5- 10 𝜇𝑚, ở

dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ,

oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và bào tử phồng hoặc không phồng (Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009)

Hình 2.3 Hình vi thể của Bacillus

Hình 3.3 Hình vi thể của Bacillus sp

Hình 4.3 Hình vi thể của Bacillus sp

Hình 5.3 Hình vi thể của Bacillus sp

15

2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp

trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ) Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng hỗn hợp

tạo ra glycerol và butanediol Một số ít loài như B megaterium không đòi hỏi tác nhân tăng

trưởng hữu cơ, một số khác lại cần có amino acid, D-vitamin hay cả hai Phần lớn chúng là

ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 - 75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, khoảng pH rộng 2 - 11 Trong phòng thí nghiệm, với

điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus vào khoảng 25 phút (Phạm Văn Ty và cs.,

2006)

2.3.4 Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả năng

sinh các loại enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextrin

glucanotransferase, chitinase, glucanase, lipase, serine, protease,… Ngoài ra, Bacillus còn

có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid,

guanilic acid,… Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các

loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn (Hong và cs., 2005)

Một số chủng Bacillus như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus hiện nay đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate) Bacillus

pasteurii được đưa vào đất ướt đã tạo ra calcite – một chất xi măng liên kết đất, chuyển hóa

đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà và giúp chúng chịu được động đất

Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh

Bacillus thuringiensis sp làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng Do khả

năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi

sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E

coli, S aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp được sử dụng làm probiotic trong

chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi

họng ở người (Berkeley và cs., 2002)

16

Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin,

vitamin và polysaccharide Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng

không tiết protease vào môi trường nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác như nhân

tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1 –  của bò, antigen virus viêm gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009)

Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi

khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng

sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động

vật nguyên sinh và virus Các hợp chất này thường là enzym thủy phân hay là các peptid

có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng

Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng

khuẩn, vừa có tính diện hoạt mạnh (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009; Hong và cs., 2005)

Những loại peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi các chủng Bacillus spp bao gồm

nhiều lớp bacteriocin (Klaenhammer, 1993) Trong số những hoạt chất sinh học kháng khuẩn hoạt động bề mặt, lipopeptide chứa peptide từ 7 - 10 acid amin, được gắn kết theo chu kỳ thông qua một vòng lacton với một acid béo β-hydroxy cùng với độ dài chuỗi khác nhau

Việc sản xuất các peptide kháng khuẩn bởi các chủng Bacillus đã được tìm hiểu nhiều hơn trong thời gian và nhiều loại peptide được sản xuất bởi nhóm vi khuẩn Bacillus phù

hợp với nhiều ứng dụng hiện nay (Abriouel và cs., 2011)

3.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

3.1 Khái niệm

Chiết là quá trình chuyển chất tan từ một pha này sang pha khác dựa trên tính tan khác nhau của chất tan trong hai pha Lý do phổ biến để thực hiện quá trình chiết trong phân tích hóa học là để tách hay làm giàu chất phân tích, hay tách nó ra khỏi những chất là có thể gây

17

nhiễu trong phân tích Phổ biến nhất là quá trình chiết giữa dung môi nước và dung môi hữu cơ

Hình 3 1 Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng

Các dung môi hữu cơ là những hợp chất ít phân cực nên thường không tan trong nước, chất

có độ phân cực rất lớn

Dietyl ete, toluen, hexan là các dung môi có tỉ trọng nhỏ hơn nước, chúng nổi ở trên pha nước Clorofoc CHCl3, CH2Cl2, CCl4 là các dung môi phổ biến có tỉ trọng lớn hơn nước Trong hỗn hợp hai pha, một pha nước chiếm ưu thế, pha kia dung môi chiếm ưu thế Quá trình chiết thường xảy ra với vận tốc lớn nên có thể thực hiện chiết tách Sản phẩm chiết thường khá sạch (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

3.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan vào nước hoặc loại có thể hỗn hợp được vào nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: eter dầu hỏa và hexan, eter etyl, clorofom, etyl acetat, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

4.2 Đặc điểm

Thời gian phân tích rất ngắn : những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng

có thể phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp Nhờ

đó, có thể tiết kiệm được khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kĩ thuật đối với các kĩ thuật viên

GC – MS được sử dụng rất phổ biến Chúng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực

y tế, dược phẩm, môi trường và luật môi trường Tiến hành thực nghiệm trong phòng thí nghiệm để biết xem làm thế nào để các nhà hóa học môi trường có thể đánh giá các mẫu có chứa các chất ô nhiễm được gọi là PAHs

Một hệ thống GCMS gồm có ba phần chính đó là:

- Sắc kí khí (GC)

- Khối phổ (MS)

- Máy tính kết nối

Trong tất cả các phương pháp sắc ký, quá trình tách luôn xảy ra khi hỗn hợp mẫu được tiêm vào pha động Trong sắc ký lỏng (LC), pha động là dung môi Trong sắc ký khí (GC), pha động là một loại khí trơ như helium, nitơ, hidro

Riêng nói về sắc kí khi pha động mang hỗn hợp mẫu qua pha tĩnh Pha tĩnh sẽ tương tác với các thành phần trong hỗn hợp mẫu Pha tĩnh thường được chứa trong một ống được gọi là cột Cột có thể là thủy tinh hoặc thép hoặc có kích thước bằng nhau

4.4 Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí

Trong quá trình khi đem mẫu qua cột sắc ký, các hỗn hợp của các hợp chất trong pha động xảy ra sẽ tương tác với pha tĩnh Mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với pha tĩnh một lực tương tác khác nhau Những tương tác yếu nhất sẽ ra khỏi cột cuối cùng Bằng cách thay đổi các đặc điểm của pha động và pha tĩnh, sẽ tách ra được các hỗn hợp khác nhau của các chất hóa học Để cải tiến hơn quá trình phân tách này nhà phân tích có thể thực hiện thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc áp suất của pha động ( Nguyễn Kim Phi Phụng và cs, 2007)

20

Hình 4.1 : Sơ đồ hệ thống GC

5 TÌNH HÌNH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHÁNG VI KHUẨN KHÁNG THUỐC

5.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc thế giới

Kim và cộng sự đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực vật, nhóm nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô thực vật của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn Trong đó đã tìm ra được 10 chủng

có hoạt tính mạnh và có khả năng kháng nấm Candida albicans (Kim và cs., 2000) Năm

2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của xạ khuẩn nội sinh Streptomyces sp chủng NRRL 30562 được tách chiết từ cây Kennedianigricans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M.tuberculosis đa

kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác (Strobel và cs., 2000) Nghiên cứu của Phongpaichit (2006) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men vi nấm nội

sinh từ Garcinia spp., kết quả cho thấy từ 377 trong số 1979 vi nấm phân lập được có khả năng kháng S aureus, MRSA, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, (Phongpaichit, 2006)

Năm 2008, Olfa Tabbene và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng

Bacillus subtilis B38 đối với vi khuẩn kháng thuốc MRSA Đến năm 2010, Olfa Tabbene

21

và cộng sự đã nghiên cứu xác định được hợp chất S07 - 2, đây là một hợp chất kháng

khuẩn có khối lượng phân tử là 905,6 Da có thể kháng Pseudomonas aeruginosa,

Enterococcus faecalis và Listeria monocytogenes (Olfa Tabbene và cs., 2008)

Theo nghiên cứu của Arun và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm từ

Terminalia arjuna, Azadirachta indica và Catharanthus roseus, trong đó chủng vi khuẩn

NRL2 có hoạt tính kháng cao đối với chủng Staphylococcus aureus và dịch chiết thô từ

chủng vi khuẩn này cũng có khả năng kháng MRSA (Arun và cs., 2015) Năm 2016, các

nhà nghiên cứu tìm thấy một loài bọt biển ở Nam Cực, có tên gọi Dendrilla membranosa,

các xét nghiệm ban đầu cho thấy chất này có thể tiêu diệt 98,4% các tế bào MRSA

(McClintock và cs., 2016)

Các nhà khoa học trên thế giới đã bước đầu nghiên cứu và tìm ra được một số hợp

chất kháng khuẩn từ các vi sinh vật nội sinh kháng MRSA (Michael và cs., 2017)

Năm 2017, Michael và cộng sự đã phát triển được một giải pháp để đẩy lùi kháng

thuốc kháng sinh và ngăn chặn các bệnh nhiễm trùng như Staphylococcus aureus kháng

Methicillin (MRSA) Nhóm nghiên cứu đã thiết lập 45000 hợp chất, sử dụng cấu trúc ba chiều của ribosome ty thể Nhóm nghiên cứu đã xác định 800 phân tử nhỏ có thể ức chế

ty thể dựa trên đặc điểm cấu trúc của chúng và sau đó giảm bớt xuống còn 10 hợp chất nhờ sử dụng phương pháp sàng lọc thuốc theo kiểu hình truyền thống Kết quả của họ đã

ức chế một phổ rộng 4 loại vi khuẩn thông thường, bao gồm Streptococcus, Pseudomonas

(Michael và cs., 2017)

5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu trong nước hiện nay Năm 2009,

Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây Khổ Sâm (Croton

tonkinensis Gapnep) và Bùm Bụp (Mallotus apelta (Lour) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin

cho hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxy hóa và hoạt tính enzyme ngoại bào, sorbicillin

cókhả năng kháng S aureus với MIC = 25mg/ml (Trần Thị Như Hằng và cs., 2009) Năm

2015, một nghiên cứu phát hiện các hợp chất kháng lao và kháng sinh từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng Đông bắc Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã xác định có 5 hợp chất

22

mới (G016-1, G016-2, G057-1, G019-1 và G019-2) và 4 hợp chất mới lần đầu phân lập từ

tự nhiên (G057-2, G057-3, G115-1 và G115-2) Một nhóm nghiên cứu đã tiến hành đánh

giá sàng lọc và phát hiện 1 chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G006, phân lập từ mẫu

trầm tích tại Vịnh Hạ Long, có khả năng sản sinh hoạt chất chloramphenicol (G016-1) - một hoạt chất đang được sử dụng làm thuốc kháng sinh, là tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh chloramphenicol (Phạm Văn Cường, 2015) Năm 2016, Phan Thị Hoài Trinh và cộng sự đã sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của 50 chủng vi khuẩn phân lập từ 23 loài bọt biển thu thập từ vùng đảo Phú Quốc Chủng vi khuẩn 045 – 203 - 4 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với 6 chủng vi khuẩn gây bệnh cho người và sinh vật biển, đó là

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus và Streptococcus faecalis Nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn phân lập từ bọt biển tại vùng đảo

Phú Quốc có triển vọng là nguồn tiềm năng để nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học (Phan Thị Hoài Trinh và cs., 2016)

Hiện nay ở nước ta chưa có báo cáo nghiên cứu về các hợp chất kháng vi khuẩn kháng thuốc từ vi khuẩn nội sinh dược liệu

23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24

1 VẬT LIỆU

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 04 năm 2018 tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở – Tp Hồ Chí Minh

1.2 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng vi khuẩn nội sinh cây Diệp Hạ Châu Đắng ( Phyllanthus amarus schum Et

thonn) Bacillus sp RD26 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường

Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Chủng vi khuẩn MRSA được cung cấp bởi bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

MRSA: Staphylococcus aureus kháng Methicillin

1.3 Môi trường – hóa chất

- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA)

- Cồn 96o, 70o, NaCl, HCl, NaOH

- Nguồn dinh dưỡng: glucose, pepton

- Các muối khoáng: CaCO3, MgSO4

- Các dung môi : N- butanol, N- Hexan, Ethanol, Methanol

- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất

25

- Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng ( 100 - 1000 𝜇𝑙, 20 – 200 𝜇𝑙)

- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, qua cấy trang

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ nghiên cứu

Tái kiểm tra chủng Bacillus sp

RD26 trong môi trường tối ưu

Tái kiểm tra chủng Bacillus

sp.RD26 trong môi trường tối ưu

Tái kiểm tra chủng Bacillus

sp.RD26 trong môi trường tối ưu

Tái kiểm tra chủng Bacillus

sp.RD26 trong môi trường tối ưu

KHình 2 8 Diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus

Schunm.et thonn)hảo sát ảnh hưởng độ bền đến nhiệt

độ của dịch vi khuẩn thử nghiệm Khảo sát ảnh

Phân tích dự đoán các chất

có trong dịch mẫu kháng MRSA

Khảo sát dung môi phù hợp đến hợp chất kháng khuẩn

Lên men trên môi trường tối ưu

Lên men trên môi trường tối ưu

Lên men trên môi trường tối ưu

Lên men trên môi trường tối ưu

Khảo sát dung môi phù hợp đến hợp chất kháng khuẩn

Khảo sát thời gian bảo quản của dịch nuôi cấy Chủng Bacillus sp RD26 Chủng Bacillus sp.RD26

26

2.1 Tái kiểm tra

2.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp RD26

Tiến hành lấy sinh khối chủng Bacillus sp RD26 từ ống giữ chủng 20 glycerol được

cấy vào ống nghiệm chứ 5ml NB ủ 37oC/18h

Cấy ria chủng Bacillus sp RD26 trên môi trường NA, ủ 30oC/ 24 giờ để kiểm tra hình thái đại thể, thử catalase và nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi thể

Phương pháp kiểm tra hình thái vi thể

Nguyên tắc

Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (–) làm cho khả năng bắt màu màng

tế bào với thuốc nhuộm khác nhau Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm

vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003)

Thực hiện

Thao tác nhuộm Gram gồm các bước sau:

Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô

Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước

Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước

Tẩy cồn 96o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O

và để yên trong 1 phút Rửa với nước

Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100x

Phương pháp thử nghiệm catalase

Nguyên tắc

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều

có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzym này là một trong những enzym có

27

vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng với oxi là chất nhận điện tử cuối trong chuỗi truyền điện tử, tạo H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroside (H2O2) thành H2O và O2 ngăn chặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước, 2010)

2.1.2 Lên men chủng Bacillus sp RD26 trên môi trường tối ưu

Công thức môi trường tối ưu trong quá trình lên men chủng Bacillus sp RD26 đã

được nghiên cứu kế thừa từ nghiên cứu trước “Xác định các điều kiện ảnh hưởng và tối ưu

hóa khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được phân

lập từ cây diệp hạ châu đắng” đó

Hoạt hóa giống: chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được hoạt hóa bằng cách lấy một

ít sinh khối từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình erlen chứa 20mL môi trường

NB, nuôi lắc ở 35o C/ 36 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/ phút

Nhân giống: điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 108 tế

bào/mL Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp RD26 sau khi hoạt hóa vào 100ml môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng Bacillus sp RD26 ( pepton: 7,36g/L, glucose:

15g/L, CaCO3 :0,72g/L, MgSO4 :0,6g/L) trong bình erlen 100mL với tỷ lệ 1/20 theo thể tích dùng nuôi lắc ở 35oC/ 36h, tốc độ lắc 200vòng/ phút (Shrivastava và cs., 2013)

28

Lên men: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn ở 30o/ 36h, pH7

2.1.3 Chuẩn bị thí nghiệm

2.1.3.1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường tối ưu và môi trường MHA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121oC trong

20 phút

Môi trường MHA được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15mL

2.1.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA

Chủng vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24h ở 37oC

Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy vào nước muối NaCl 0,85% với thể tích 9,9ml; dùng máy vortex lắc đều ống

Đem dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 610 nm, điều chỉnh sao cho có mật độ tế bào tương đương khoảng 108 tế bào/mL, tương ứng với độ đục trong ống McFarland 0,5 Dịch vi khuẩn MRSA đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

2.1.3.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm

Sau quá trình lên men (mục 2.1.2) tiến hành ly tâm ở 10 000 vòng/ phút ở 4oC trong

10 phút thu dịch nổi Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Tiếp theo, lấy dịch nổi đã ly tâm đem lọc qua màng lọc 0.45𝜇𝑚 (Shrivastava

và cs., 2013)

2.1.4 Tái kiểm tra hoạt tính kháng MRSA của chủng Bacillus sp.RD26

Chúng tôi tiến hành tái kiểm tra hoạt tính kháng MRSA của chủng Bacillus sp.RD26

bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Kumar A Và cs., 2009)