Khảo sát quy trình chiết xuất và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình in vivo của curcuminoid trích từ thân rễ cây nghệ (curcuma longa l ) nghiên cứu khoa học

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦACURCUMINOID

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID

TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ

(CURCUMA LONGA L.)

Mã số:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Y DƯỢC

Sinh viên thực hiện: LÂM THIỆN VINH Nam, Nữ: Nam

DANH MỤC BẢNG – SƠ ĐỒ iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGHỆ 4

1.1.1 Đặc điểm hình thái 4

1.1.2 Thành phần hoá học 5

1.1.3 Tác dụng dược lý 6

1.2 SƠ LƯỢC VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID 7

1.2.1 Tính chất hoá lý và phân loại hợp chất 7

1.2.2 Hoạt tính sinh học 8

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ 11

1.3.1 Phương pháp chiết bằng hệ thống Soxhlet 11

1.3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 12

1.3.3. Phương pháp chiết bằng hợp chất lưỡng cực 12

1.3.4 Phương pháp kết tinh .13

1.4 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ PHẢN ỨNG VIÊM 16

1.4.1 Nguyên nhân gây viêm và phân lo ại 16

1.4.2 Những biến đổi chủ yếu trong viêm 17

1.4.3 Mối liên hệ giữa phản ứng viêm và cơ thể 20

1.4.4 Các thuốc kháng viêm hiện nay 20

1.5 SỬ DỤNG MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH 20

1.5.1 Ý nghĩa của việc sử dụng mô hình động vật trong nghiên cứu y sinh 20

1.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc chống viêm bằng

mô hình động vật 21

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG THÍ NGHIỆM 24

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 24

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Quy trình chiết xuất chung curcuminoid từ thân rễ nghệ 28

2.2.2 Khảo sát quá trình chiết curcuminoid bằng các hệ dung môi khác nhau 29

2.2.3 Khảo sát quá trình chiết curcuminoid theo thời gian chiết bằng các phương pháp khác nhau 30

2.2.4 Phân tích định tính và định lượng curcuminoid 31

2.2.5 Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân 32

2.2.6 Khảo sát tác dụng kháng viêm của cucurminoid 33

2.2.7 Thống kê và xử lý số liệu 36

Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT CURCUMINOID BẰNG CÁC LOẠI

DUNG MÔI KHÁC NHAU 38

3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT CURCUMINOID THEO THỜI GIAN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU 41

3.3 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOID 43

3.3.1 Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng .43

3.3.2 Định tính bằng phương pháp đo điểm nóng chảy 44

3.3.3 Định tính bằng phương pháp phổ hồng ngoại FT-IR 44

3.3.4 Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS 47

3.4 KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT BỊ VIÊM CHÂN 48

3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA CURCUMINOID50 3.5.1 Chỉ tiêu tỷ lệ phù chân chuột 50

3.5.2 Chỉ tiêu trọng lượng chuột 53

4.1 KẾT LUẬN 56

4.1.1 Khảo sát quá trình chiết curcuminoid bằng các lo ại dung môi khác nhau 56

4.1.2 Khảo sát quá trình chiết curcuminoid theo thời gian chiết bằng các phương pháp khác nhau 56

4.1.3 Phân tích định tính curcuminoid 56

4.1.4 Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân 57

4.1.5 Khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid 57

4.2 ĐỀ NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bảng 1.1 Khóa phân loại thực vật của nghệ và các cây chi Curcuma 4

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của nghệ Curcuma longa L 5

Bảng 1.3 Tính chất lý hóa của curcuminoid 7

Bảng 1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết soxhlet .12

Bảng 1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 12

Bảng 1.6 Hiệu suất các chất lưỡng cực dùng chiết xuất curcuminoid .13

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất chung curcuminoid từ thân rễ nghệ

Curcuma longa L .28

Sơ đồ 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết tối ưu .29

Sơ đồ 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp và thời gian chiết .30

Sơ đồ 2.4 Quy trình khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid 34

PHẦN 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.1 Khối lượng tinh thể curcuminoid chiết bằng các loại dung môi khác nhau.38 Bảng 3.2 Năng suất chiết trung bình và hiệu suất của từng lo ại dung môi .38

Bảng 3.3 Khối lượng tinh thể curcuminoid theo thời gian chiết bằng hai

phương pháp khác nhau 41

Bảng 3.4 Năng suất trung bình và hiệu suất chiết theo thời gian của hai

phương pháp chiết .41

Bảng 3.5 Kết quả xác định hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng 43

Bảng 3.6 Kết quả đo điểm nóng chảy 44

Bảng 3.7 Kết quả đo quang phổ hồng ngo ại IR .44

Bảng 3.8 Kết quả sắc ký lỏng ghép khối phổ curcuminoid .47

Bảng 3.9 Tỷ lệ phù chân chuột và hiệu suất tạo mô hình viêm 49

Bảng 3.10 Tỷ lệ phù chân chuột qua các ngày thí nghiệm 51

Bảng 3.11 Trọng lượng chuột qua các ngày thí nghiệm 53

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Curcuma longa L .5

Hình 1.2 Curcumin 8

Hình 1.3 Demethoxycurcumin 8

Hình 1.4 Bisdemethoxycurcumin 8

Hình 1.5 Hệ thống chiết Soxhlet 11

Hình 1.6 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ tan và nhiệt độ 14

Hình 1.7 Các bước kết tinh và thu tinh thể 15

Hình 1.8 Hiện tượng viêm da chân (A) và hiện tượng viêm da bàn tay (B) 16

Hình 1.9 Các biến đổi trong phản ứng viêm 19

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Nghệ tươi và bột nghệ Curcuma longa L 24

Hình 2.2 Chuột bạch Mus musculus var albino 24

Hình 2.3 Bếp khuấy từ VELP ARE và máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11 .26

Hình 2.4 Curcumin chuẩn, thuốc medexa và dầu olive 26

Hình 2.5 Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC .27

Hình 2.6 Máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55 .27

Hình 2.7 Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC – MS micrOTOF – Q .27

Hình 2.8 Sát trùng vùng chân (A) và tiêm formol gây viêm (B) .33

Hình 2.9 Curcuminoid hòa tan trong dầu olive 35

Hình 2.10 Lô chuột thí nghiệm 35

Hình 2.11 Thao tác giữ chuột (a) và đưa kim cho uống vào thực quản (b) 35

Hình 2.12 Các vị trí đo chu vi trên bắp chân chuột 36

Hình 3.1 Bản mỏng sắc ký curcuminoid chiết được 39

Hình 3.2 Tinh thể curcuminoid chiết được 39

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hàm lượng curcuminoid chiết bằng các dung môi

khác nhau 40

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn lượng curcuminoid qua các giờ chiết của hai

phương pháp chiết .42

Hình 3.5 Sắc ký bản mỏng định tính curcuminoid chiết được 43

Hình 3.6 Phổ IR curcuminoid chiết xuất 45

Hình 3.7 Phổ IR cucumin chuẩn 46

Hình 3.8 Chuột co chân (A) và chân chuột liệt tạm thời (B) sau khi gây viêm 48

Hình 3.9 Chân chuột trước và sau khi gây viêm 48

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ phù chân chuột sau khi gây viêm giữa các lô

thí nghiệm 49

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên tỷ lệ phù chân chuột 51

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên trọng lượng chuột 53

Bcl-2 B – cell lymphoma 2

c-Myc v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)

ĐC Đối chứng

HIV Human immunodecifiency virus

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drugs

ROS Reactive oxygen spices

TGF Tranforming growth factor

TNF Tumor necrosis factors

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung

- Tên đề tài: KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ (CURCUMA LONGA L.)

đào tạo

Lâm Thiện Vinh SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Nguyễn Vũ Thanh Tùng SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Nguyễn Thị Thanh Xuân SH09A2 Công nghệ sinh học 04/04

Mai Thị Thanh Huệ SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Trần Thanh Tùng SH10A1 Công nghệ sinh học 03/04

Người hướng dẫn: ThS NGUYỄN MINH HOÀNG

ThS LAO ĐỨC THUẬN

2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát loại dung môi chiết, thời gian chiết, phương pháp chiết xuất tối ưu và

tinh sạch hợp chất curcuminoid từ thân rễ cây nghệ Curcuma longa L

Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân bằng formol và khảo sát nồng độ formol gây viêm tối ưu

Khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid ở các liều lượng khác nhau

3 Tính mới và sáng tạo

Tận dụng nguồn dược liệu là cây nghệ Curcuma longa L phong phú tại địa

phương ứng dụng vào chiết xuất và thu nhận hợp chất curcuminoid có hoạt tính ở dạng tinh sạch, phù hợp với xu thế hiện nay

Sử dụng hợp chất curcuminoid chiết được ứng dụng vào thực tiễn với bước đầu

thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình in vivo

Hiệu quả tách chiết hợp chất curcuminoid tối ưu khi sử dụng dung môi chiết là acetone (H% = 5,06%) với thời gian chiết phù hợp là 10 tiếng bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Độ tinh sạch của curcuminoid chiết bằng các loại dung môi khác nhau là tương đương nhau (curcumin chiếm khoảng 70% hỗn hợp)

Hiệu quả tạo mô hình chuột bị viêm bằng phương pháp tiêm cơ đùi thành công với tỉ lệ phù chân đạt khoảng 70% khi sử dụng liều 0,05 ml formol 8%

Việc sử dụng curcuminoid ở liều 90 mg/kg có tác dụng kháng viêm đối với chuột bị gây viêm bằng formol và không làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý của chuột thí nghiệm

5 Đóng góp về mặt kinh tế – xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài

Về mặt kinh tế – xã hội, đề tài đã khảo sát và chiết xuất được hợp chất

curcuminoid từ nguồn dược liệu khá kinh tế là cây nghệ Curcuma longa L sẵn có tại

địa phương Hợp chất được tinh sạch và ứng dụng khảo sát khả năng kháng viêm trên

mô hình in vivo

Về mặt giáo dục và đào tạo, đề tài cung cấp những kiến thức cơ bản từ các bước khảo sát quy trình chiết xuất cũng như các thí nghiệm gây viêm và khảo sát khả năng

kháng viêm để đưa vào làm tài liệu tham khảo thực hành cho các môn Chiết xuất dược

liệu, Sinh học chức năng động vật và Công nghệ sinh học Động vật cho sinh viên

ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Bên cạnh đó, đề tài cũng góp phần giúp trau dồi kỹ năng làm việc nhóm hiệu quả, rèn luyện thêm các thao tác thực hành phòng thí nghiệm, có được kỹ năng xử lý các vấn đề mà thí nghiệm đặt

ra

Đề tài có khả năng ứng dụng cao, đây sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu các sản phẩm thuốc chứa curcuminoid có nguồn gốc từ tự nhiên trong việc điều trị các bệnh về viêm nhiễm

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả

nghiên cứu (nếu có)

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên

Nhóm tác giả đã đạt được những đóng góp khoa học sau:

Xây dựng được quy trình chiết tách curcuminoid (trong đó hàm lượng curcumin khá cao, đạt gần 70% theo kết quả sắc ký lỏng ghép khối phổ LC – MS) từ thân rễ cây

nghệ Curcuma longa L trồng tại địa phương

Thành công trong việc tạo mô hình chuột mang bệnh lý viêm chân bằng formol

và quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm của hợp chất tự nhiên Cụ thể, nhóm tác giả đã tạo được mô hình chuột bị viêm chân bằng formol 8% và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm của curcuminoid cô lập được ở các liều khác nhau, trong đó liều 90 mg/kg

có tác dụng kháng viêm hiệu quả và không làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý trên chuột thí nghiệm

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: LÂM THIỆN VINH

Sinh ngày: 22 tháng 09 năm 1991

Nơi sinh: TP.HCM

Lớp: SH09A1 Khóa: 2009 – 2013

Khoa: Công nghệ Sinh học

Địa chỉ liên hệ: 239B Tân Phước P.7, Q.11

Điện thoại: 01286054537 Email: lamthienvinh@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích c ủa sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang học):

* Năm thứ 1:

Ngành học: Công nghệ Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Giỏi

Ngành học: Công nghệ Dược phẩm Khoa: Công nghệ Sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Giỏi

Sơ lược thành tích: Tham gia Đề tài khoa học và công nghệ cấp trường: Nghiên cứu

các quy trình chiết xuất dược liệu của Thạc sĩ Nguyễn Minh Hoàng

Lớp phó lớp SH09DP

Ảnh 4x6

Ngành học: Công nghệ Dƣợc phẩm Khoa: Công nghệ Sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Giỏi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê tháng 2/2012 của Cục y tế dự phòng về tình hình một số bệnh truyền nhiễm gây dịch, hiện nay ở nước ta tình trạng viêm nhiễm do các tác nhân vi khuẩn, virus và kí sinh trùng đang diễn biến phức tạp và là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, trực tiếp gây ra các bệnh lý nguy hiểm như viêm đường hô hấp, viêm não virus [5]… Điều này làm giảm chất lượng cuộc sống và có thể dẫn tới những biến chứng nguy hiểm, thậm chí gây tử vong cho bệnh nhân Do đó, việc phát triển những loại thuốc mới để điều trị tình trạng viêm nhiễm là rất cần thiết, đây cũng là một trong những mối quan tâm hàng đầu của giới y khoa Ngày nay, với sự tiến bộ của y học, các sản phẩm thuốc kháng viêm được nghiên cứu ngày càng nhiều nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh cho con người Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc được dùng phổ biến trên thị trường hiện nay đều có nguồn gốc tổng hợp, những lo ại thuốc này thường có giá thành cao, bên c ạnh đó còn có nhiều tác dụng không mong muốn ảnh hưởng đến sức khỏe… Để giải quyết những vấn đề trên thì việc phát triển những loại thuốc có nguồn gốc thảo dược thiên nhiên đang là vấn đề được các nhà khoa học, dược sĩ quan tâm vì chúng mang lại nhiều ưu điểm như dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng có hại Chính

vì thế, những nghiên cứu gắn liền với các hợp chất tự nhiên ngày càng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

Cây nghệ Curcuma longa L từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong thực phẩm

và y học, không những với mục đích tạo màu vàng đẹp mà còn có tác dụng phòng, điều trị một số bệnh như: chống viêm loét dạ dày, giải độc gan và lọc máu, kháng viêm, chống oxy hóa và đặc biệt là có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư [15]

Nghệ chứa nhiều thành phần khác nhau [27], nhưng quan trọng nhất vẫn là curcuminoid, hợp chất chủ yếu tạo nên màu vàng đ ặc trưng và dược tính cho nghệ Curcuminoid được cấu thành từ ba hợp chất chính: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Nhóm hợp chất này được thu nhận bằng phương pháp chính

là trích ly trực tiếp từ thân rễ cây nghệ nhằm thu hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học để có được hợp chất curcuminoid có độ tinh khiết cao hơn

Mặc dù có thể sản xuất được curcumin với độ tinh khiết cao bằng phương pháp tổng hợp hoá học nhưng việc tổng hợp này lại rất tốn kém [31] Trong khi đó,

hàm lượng curcuminoid chứa trong thân rễ cây nghệ khá cao, khoảng 2 – 6% trọng lượng khô [25]

Với xu thế ngày càng ưa chuộng các s ản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên thì việc chiết xuất curcuminoid trực tiếp từ thân rễ cây nghệ tỏ ra hiệu quả và kinh tế hơn

Do đó, vấn đề cần đặt ra là phải xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất curcuminoid có hiệu suất và độ tinh sạch cao Vì vậy, cần khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách như dung môi, thời gian, các phương pháp chiết khác nhau để thu được hàm lượng cao nhất và tinh sạch Song song đó là tiến hành khảo sát hoạt tính kháng viêm c ủa curcuminoid trên mô hình chuột thí nghiệm được gây viêm chân bằng formol

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ (CURCUMA LONGA L.)” Đây sẽ là một tiền đề cho việc nghiên cứu

một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên với độ tinh sạch, hoạt tính cao trong việc phòng và chữa bệnh

Phần 1

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGHỆ

Nghệ có tên khoa học là Curcuma longa L hay Curcuma domestica Lour.,

thuộc họ Gừng – Zingiberaceae [11] [27]

Trong đông y, tùy theo từng bộ phận được sử dụng mà có từng tên gọi khác nhau [11] Nếu dùng thân rễ của cây thì gọi là Khương hoàng (Rhizoma Curcumae longae), nếu dùng rễ củ thì gọi là Uất kim (Radix Curcumae longae) Nghệ được thu hoạch sau từ 7 – 9 tháng trồng [27], thông thường là vào mùa thu [11]

Cây nghệ được trồng nhiều ở các vùng nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistan, Trung Quốc, Việt Nam… dùng để làm gia vị và làm thuốc [11]

Bảng 1.1 Khóa phân loại thực vật của nghệ và các cây chi Curcuma [27]

Khóa phân loại Giới Plantae

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Nghệ là một loại cây thân thảo cao từ 0,6 – 1 m Thân rễ chuyển hóa thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ ho ặc cắt ngang có màu vàng cam sẫm Lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn dài kho ảng 45 cm, rộng 18 cm Cuống lá có bẹ Cụm hoa mọc từ giữa các lá lên, thành hình nón thưa, lá bắc hữu thụ khum hình máng rộng, đ ầu tròn màu xanh lục nhạt, lá bắc bất thụ hẹp hơn, màu hơi tím nhạt Tràng có phiến, cánh hoa ngoài màu xanh l ục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy trên to hơn, phiến các hoa trong cũng chia ba thùy, hai thùy hai bên đứng và phẳng, thùy dưới lõm thành máng sâu Quả nang ba ngăn, mở bằng ba đường nứt Hạt có áo hạt [11]

Hình 1.1 Curcuma longa L

1.1.2 Thành phần hoá học

Thân rễ của cây nghệ Curcuma longa L chứa các sắc tố góp phần tạo nên màu

đặc trưng, cùng với tinh dầu, các chất định hương, flavonoid, carbohydrate, protein, chất khoáng và vitamin [27] Thành phần hóa học tính trên phần trăm khối lượng chất khô của nghệ được thể hiện ở bảng sau

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của nghệ Curcuma longa L [27]

Hai thành phần có hoạt tính chính của nghệ là curcuminoid và các chất dễ bay hơi (tinh dầu) Curcuminoid là hợp chất tạo nên màu vàng đặc trưng, chiếm 2 – 6%, là hỗn hợp của 3 loại, trong đó hàm lượng curcumin là cao nhất, sau đó là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Tinh dầu chiếm khoảng 5%, có thành phần chính là các sesquiterpene đ ặc trưng cho từng loài Trong đó, quan trọng nhất là

các chất định hương α–turmerone, β–turmerone và ar–turmerone tạo nên mùi đặc

trưng cho nghệ [25] [27]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Cây nghệ có tác dụng phòng ngừa và điều trị nhiều căn bệnh khác nhau Nghệ

có hoạt tính chố ng viêm cấp tính và viêm mãn tính trong các mô hình gây phù bàn chân và gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng, đồng thời cây cũng có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non Ngoài ra, nghệ có khả năng chống loét dạ dày và chống rối loạn tiêu hóa, kích thích s ản sinh chất nhầy ở thành dạ dày [2] Theo thực nghiệm, khi cho thỏ uống cao chiết từ nghệ làm giảm tiết dịch vị, tăng lượng chất nhầy trong dịch vị, bảo vệ niêm mạc dạ dày tá tràng, chống thương tổn loét gây bởi thắt môn vị [4] Bên cạnh đó, trong y học cổ truyền, nghệ được dùng để điều trị trong các trường hợp bị tổn thương ứ máu, viêm loét dạ dày, ung nhọt, ghẻ lở, phong thấp, tay chân đau nhức, vàng da [11]

Các nghiên cứu cũng chứng minh tinh dầu và một số thành phần hóa học của nghệ có tác dụng ức chế nhiều loài vi khuẩn và nấm gây bệnh trong đó có trực khuẩn lao, các trực khuẩn lỵ, phế cầu khuẩn, trực khuẩn thương hàn,

trực khuẩn E coli [10]

Một số bài thuốc sử dụng nghệ trong y học cổ truyền:

- Chữa viêm loét dạ dày tá tràng, đau vùng dạ dày, ợ hơi, ợ chua: Nghệ 10 g, trần bì 12 g, khổ sâm 12 g, hương phụ 10 g, bồ công anh 10 g, ngải cứu 8 g Dùng dạng thuốc bột Ngày uống 10 – 20 g, chia 2 lần [4]

- Chữa viêm gan, suy gan, vàng da: Nghệ 5 g, bồ bồ 10 g, dành dành 5 g, râu ngô 5 g Uống ngày một thang, bào chế thành dạng siro hoặc cốm [11]

1.2 SƠ LƯỢC VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID

1.2.1 Tính chất hoá lý và phân loại hợp chất

Curcuminoid thuộc nhóm các hợp chất phenol, một polyphenol kỵ nước [27] Curcuminoid chiếm từ 2 – 6% và là hợp chất tạo nên màu vàng đ ặc trưng cho nghệ Đây cũng là thành phần tạo nên hoạt tính sinh học chính, có tác dụng chống oxy hóa

và kháng viêm tốt Curcuminoid được phân lập lần đầu tiên vào năm 1815 bởi Vogel

[25] [27]

Bảng 1.3 Tính chất lý hóa của curcuminoid [25]

Tên thông thường Curcumin Demethoxy

curcumin

Bisdemethoxy curcumin Tên hóa học Di-cinnamoyl

methane

4-Hydroxy cinnamoyl methane

Hình phiến màu đỏ tím

Tỉ lệ

trong hỗn hợp

[9] [27]

Curcuminoid có các tính chất lý hóa chung sau: [3] [12]

Curcuminoid dạng tinh thể màu vàng cam, nhiệt độ nóng chảy từ 179 – 183oC Không tan trong nước nhưng tan được trong dầu thực vật, ethanol, kiềm, acetone, acid acetic và chloroform

Có màu vàng chanh (ánh xanh) trong dung môi có tính acid Khi tăng pH, ánh xanh trở nên kém dần Trong môi trường kiềm pH = 9, dung dịch curcumin có màu cam, pH càng tăng thì dung dịch sẽ chuyển sang màu đỏ Curcumin bền hơn ở miền acid so với base và nhanh chóng bị phân hủy tại pH trên trung tính

Màu vàng của curcuminoid bền với nhiệt độ, chịu được gia nhiệt lớn mà vẫn giữ màu vàng tươi đ ặc trưng, tuy nhiên hợp chất này rất mẫn cảm với ánh sáng,

dễ bị phân hủy khi gặp ánh sáng mặt trời

Curcuminoid có thể phản ứng với acid boric tạo nên hợp chất có màu đỏ cam nên được ứng dụng dùng để nhận biết muối của nguyên tố boron

Ngoài ra, curcuminoid còn có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh về tim mạch thông qua khả năng ngăn ngừa thiếu máu cục bộ, ức chế sự gia tăng của các tế bào máu ngo ại vi và các tế bào cơ trơn mạch máu, giảm mức nồng độ cholesterol trong huyết thanh, chống xơ vữa mạch máu bằng cách ức chế quá trình oxy hóa c ủa các lipoprotein mật độ thấp, hạ lipid máu…

1.2.2.1 Tác dụng kháng viêm

Nhiều nghiên cứu trên mô hình động vật cho thấy curcuminoid là một chất kháng viêm hiệu quả và không gây tác dụng có hại [25] Quá trình viêm xảy ra khi cơ thể giải phóng arachidonic acid, dưới tác dụng của enzyme cyclooxygenase, chất này

sẽ chuyển hóa thành prostaglandine và thromboxane Đây là những chất có khả năng làm giãn mạch gây trương phồng mô dẫn đến viêm [27] Curcuminoid ức chế enzyme lypooxygenase và cyclooxygenase, có tác dụng ngăn cản tiến trình phóng thích các chất gây viêm (prostaglandine, thromboxane…) Hiệu quả tác động tương đương với các chất như cortisone, phenybutazone… [16]

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa

Trong ho ạt động sống hằng ngày, cơ thể luôn sản sinh ra các gốc tự do Các gốc

tự do này có khả năng phản ứng rất cao với các hợp chất sinh học trong cơ thể dẫn đến tổn thương mô, quá trình lão hóa sớm Curcuminoid có khả năng chống oxy hóa mạnh, trung hòa cũng như ngăn cản sự tạo thành các gốc tự do như peroxide, hydroxyl Phân tích cấu trúc của curcuminoid thì nhóm –OH trên vòng benzene tại vị trí ortho và một enol của 1,3 – diketone [26] giữ vai trò quan trọng trong khả năng chống oxy hóa của curcuminoid, chúng sẽ ngăn cản sự peroxide hóa lipid trong cơ thể [32] Nhờ hoạt tính này mà curcuminoid có khả năng giúp phòng chống các bệnh tim mạch, chống lão hóa, tương tự như vitamin E, C, β – caroten [16] [27]

Theo nghiên cứu của Khopde cùng các cộng sự vào năm 1999, khả năng chống oxy hóa c ủa curcuminoid cao gấp 10 lần so với các chất khác, cao hơn hẳn vitamin E

[20]

Curcuminoid ức chế sự phát sinh các ROS (Reactive Oxygen Spices) như các superoxide anion, H2O2 và các gốc nitrite bằng cách kích hoạt các đại thực bào Hoạt động chống oxi hóa của curcuminoid trung gian thông qua các enzyme chống oxi hóa như superoxide dismutase, catalase, glutathione và thioredoxin [23]

1.2.2.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Curcuminoid kháng mạnh trên vi khuẩn gram dương như Staphylococcus

aureus và vi khuẩn gram âm như Samonella typhi tương tự như penicillin và

streptomycin Đối với nấm, curcuminoid ức chế các nấm như Trychophyton gypcum,

Candida albicans, nhất là Aspergillus parasiticus phóng thích aflatoxin, tác nhân gây

nhiễm độc gan thường xảy ra khi dùng thực phẩm đóng hộp [16] [27]

1.2.2.4 Tác dụng phòng chống ung thư

Curcuminoid có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách cảm ứng apoptosis, thông qua ức chế protein tyrosine kinase, protein kinase C, ức chế biểu hiện c-Myc và Bcl-2 Ngoài ra, curcuminoid hạn chế sự phát triển của khối u bằng cách ức chế sự hình thành mạch máu mới trong khối u, kìm hãm chu kỳ tế bào của các tế bào ung thư… Đặc biệt, theo nghiên cứu của Madhuri Kakarala cùng cộng sự vào năm 2009 thì curcuminoid cùng với piperine có khả năng can thiệp vào quá trình tự làm mới của tế bào gốc ung thư vú thông qua tín hiệu Wnt [21]

Tuy vậy, dược tính c ủa curcumin chiết từ Curcuma longa L khó có thể ứng

dụng rộng rãi do quá trình trao đổi chất của nó diễn ra nhanh chóng trong gan và thành ruột (tính sinh khả dụng kém) Curcumin không bền vững trong ruột và một lượng rất nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái biến Tuy nhiên, việc kết hợp với piperine sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu và giảm đào thải của curcumin trong máu lên rõ rệt Piperine là một chất có khả năng ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình chuyển hoá ở gan và quá trình glucoronidation ở ruột [27]

Nghiên cứu của Shoba G trên mô hình động vật và người đã chứng minh rằng, khi kết hợp một liều nhỏ (20 mg/kg thể trọng) piperine cùng với curcumin sẽ làm tăng tính sinh khả dụng của curcumin lên gấp nhiều lần, giúp tăng hiệu quả hấp thu curcumin trên động vật thí nghiệm (154%) và cả trên các tình nguyện viên được thử nghiệm (2000%) [33]

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ

Chiết xuất là sử dụng một loại dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng hoà tan chất c ần tách, tinh chế và cô lập hợp chất mong muốn Các dung môi sau đây có thể được sử dụng trong quá trình chiết và tinh chế curcumin hiệu quả: hexane, acetone, methanol, ethanol, dichloromethane, ethyl acetate, isopropanol và carbon dioxide siêu tới hạn (supercritical fluid method) cũng có thể được sử dụng trong quá trình chiết [35]

1.3.1 Phương pháp chiết bằng hệ thống Soxhlet

Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng, sử dụng một pha lỏng để lôi kéo hợp chất hữu cơ ra khỏi mô thực vật (pha rắn) bằng cách hòa tan nó [24]

Hình 1.5 Hệ thống chiết Soxhlet

Hệ thống ho ạt động dựa trên nguyên lý: dung môi trong tr ụ chiết luôn luôn được đổi mới để hòa tan tối đa hợp chất trong mô thực vật Dung môi được đun nóng

sẽ bay hơi lên theo nhánh thông bên trái, khi gặp ống sinh hàn, dung môi ngưng t ụ và rơi xuống trụ chiết trung tâm Tại đây, hợp chất cần chiết được hòa tan và lôi kéo ra ngoài Khi tr ụ đầy, ống siphon sẽ hoàn trả dung môi về bình c ầu Chu trình lặp lại cho đến khi chất cần chiết hòa tan hết [14] [24] [37]

Bảng 1.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết soxhlet

- Tiết kiệm dung môi, không tốn công lọc

và châm thêm dung môi

- Dung môi chiết nóng dễ hòa tan

- Chiết kiệt hợp chất do dung môi luôn đổi

mới

- Kích thước trụ làm giới hạn khối lượng chiết

- Chất chiết trong bình bị đun nóng lâu dễ phân hủy

- Thiết bị phức tạp khó sản xuất quy mô lớn

1.3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Ngâm chiết là một phương pháp chiết xuất đơn giản nhất, diễn ra nhờ vào sự khuếch tán của chất cần chiết vào lượng lớn dung môi Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Bên cạnh đó, ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây [14], [32]

Bảng 1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

- Phương pháp đơn giản, dễ thực

hiện

- Có sự khuấy trộn và gia nhiệt làm

tăng hiệu quả chiết

- Phù hợp cơ giới hóa, sản xuất quy

1.3.3 Phương pháp chiết bằng hợp chất lưỡng cực [18]

Hợp chất lưỡng cực hay các chất trợ tan là hợp chất được cấu thành từ những alkyl mạch ngắn tan được trong nước Đây là hợp chất có tính lưỡng tính, vừa chứa phân tử ưa nước và cả phân tử kỵ nước

Chất lưỡng cực thường dùng là các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ với các alkyl sulfonate, ví dụ như: Na – BMGS (Sodium butyl monoglycol sulfate), Na – CS (Sodium cumene sulfate), Na – S (Sodium salicylate), Na – PTSA (Sodium p-toluen sulfonate acid) Tính chất chiết chọn lọc của chất lưỡng cực đối với curcuminoid có thể là do cấu trúc phenolic Phương pháp chiết này vừa đơn giản, dễ thực hiện lại chiết chọn lọc, thu được hợp chất có độ tinh sạch cao Dung dịch chất lưỡng cực có thể tái

sử dụng

Bảng 1.6 Hiệu suất các chất lưỡng cực dùng chiết xuất curcuminoid

Hiệu suất (%) Tinh khiết (%)

Sodium monoglycol sulfate (Na – BMGS) 51,50 97,00

Sodium cumene sulfonate (Na – CS) 38,56 90,70

Sodium p-toluen sulfonate acid (Na – PTSA) 13,79 79,30

Bột nghệ được cho tiếp xúc trực tiếp với dung dịch chất lưỡng cực cùng với dung môi nước tạo nên một hỗn hợp dạng sệt, trong điều kiện khuấy trộn thường xuyên Sau thời gian khuấy, hỗn hợp được lọc thu lấy dịch Phần bã được rửa với nước, phần nước rửa được nhập chung với dịch lọc trước đó

Dịch sau lọc được đem đi pha loãng với nước cho tới khi nồng độ chất lưỡng cực đủ thấp để curcuminoid kết tủa từ dung dịch Tinh thể thu được sẽ được đem đi lọc hay ly tâm, rửa tinh thể này lại với nước và sấy khô

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp kết tinh là dùng một dung môi hữu cơ có

độ tan chọn lọc hợp chất quan tâm để tách, tinh chế và thu sản phẩm tinh khiết Dung môi thích hợp để lựa chọn thường là dung môi có độ hoà tan của chất rắn cần tinh chế thay đổi nhiều theo nhiệt độ Bằng cách tạo dung dịch bão hoà ở nhiệt độ cao (thường

là nhiệt độ sôi của dung môi) các tạp chất sẽ ở lại trong dung dịch Sau đó kết tinh lại một số lần trong cùng một dung môi, hoặc trong các dung môi khác nhau, ngư ời ta có thể thu được tinh thể chất cần tinh chế ở dạng khá tinh khiết Đồ thị sau thể hiện được mối quan hệ giữa nhiệt độ và tính tan, từ đó ta có thể chọn được dung môi phù hợp cho quá trình kết tinh

Hình 1.6 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ tan và nhiệt độ [24]

Bước 1: Hòa tan chất rắn

Chọn dung môi kết tinh phù hợp Hòa tan chất rắn trong lượng tối thiểu dung môi sôi đến khi bão hòa Thêm than hoạt tính để khử màu và tạp chất

Bước 2: Loại bỏ tạp chất không tan

Gạn lấy dịch trong hay lọc dung dịch nóng qua giấy lọc để loại bỏ các tạp chất

không hòa tan hoặc than hoạt tính thêm vào ở các bước trên

Bước 3: Kết tinh

Làm nguội dung dịch thật chậm cho tới khi bằng với nhiệt độ phòng Khi xuất hiện tinh thể, làm mát hỗn hợp trong tủ lạnh Nếu tinh thể không xuất hiện thì gây kết tinh bằng cách: cọ đầu đũa thủy tinh vào thành erlen, cho thêm chất rắn nguyên chất vào dung dịch để tạo mầm, làm bay hơi vượt quá mức bão hoà của dung môi rồi làm mát một lần nữa

Bước 4: Thu nhận và làm khô

Thu tinh thể bằng cách lọc áp suất kém qua phễu Büchner Rửa tinh thể bằng một lƣợng nhỏ dung môi lạnh Làm khô mẫu ngay trên phễu lọc chân không, để khô tự nhiên hay cho vào tủ sấy

Hình 1.7 Các bước kết tinh và thu tinh thể

1.4 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ PHẢN ỨNG VIÊM

Viêm là một phản ứng phức tạp của cơ thể khởi phát sau khi bị tổn thương gây chết hoặc không gây chết tế bào Bản chất của viêm là một quá trình bệnh lý, lấy phòng vệ là chủ yếu nhằm duy trì cân bằng nội môi Bốn tính chất của quá trình viêm

là sưng, nóng, đỏ, đau [10]

Hình 1.8 Hiện tượng viêm da chân (A) và hiện tượng viêm da bàn tay (B)

Nguyên nhân bên ngoài bao gồm các yếu tố như cơ học, vật lý, hóa học (chấn thương, tia bức xạ…) và thường gặp nhất là các tác nhân sinh học như vi khuẩn, virus,

ký sinh trùng Nguyên nhân bên trong như hoại tử mô, thiếu oxy tại chỗ, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng Ngoài ra, viêm có thể bị gây ra do sự đáp ứng miễn dịch – sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể như trong viêm cầu thận

Trong thực tế, hai loại nguyên nhân này thường kết hợp với nhau Cường độ, tính chất của viêm thay đổi theo đặc điểm của nhân tố bệnh lý, điều kiện phát sinh, tính phản ứng của cơ thể, do đó biểu hiện lâm sàng c ủa các trường hợp viêm có thể thay đổi khác nhau

Có nhiều cách phân loại viêm, tùy theo nguyên nhân, vị trí gây viêm cũng như diễn biến hay tính chất của quá trình viêm mà có nhiều cách phân loại khác nhau Hiện nay, phân lo ại viêm chủ yếu dựa vào diễn biến của quá trình viêm gồm viêm cấp tính

và viêm mãn tính Viêm cấp tính khi thời gian diễn biến ngắn từ vài phút đến vài ngày,

có đặc điểm tiết dịch chứa nhiều protein huyết tương và bạch cầu đa nhân trung tính Viêm mãn tính nếu thời gian diễn biến từ vài ngày kéo dài nhiều tháng và biểu hiện về

(A) (B)

mặt mô học là có sự xâm nhập của lympho bào và đại thực bào kèm theo đó là s ự tăng sinh của mạch máu, tạo thành sẹo tại ổ viêm

1.4.2 Những biến đổi chủ yếu trong viêm

1.4.2.1 Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm

Biến đổi này xảy ra ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể kèm với đó là bốn hiện tượng:

- Rối loạn vận mạch [10]

Ngay khi yếu tố gây viêm tác động, hiện tượng co mạch xảy ra sớm nhất Đây

là hiện tượng rất quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng dây chuyền tiếp theo Kế đó, hiện tượng sung huyết động mạch diễn ra, giải phóng các enzyme từ lysosome của tế bào chết, tạo điều kiện cho quá trình thực bào Khi quá trình thực bào bắt đ ầu yếu đi, quá trình sung huyết tĩnh mạch tiếp diễn giúp dọn sạch ổ viêm, chuẩn

bị cho giai đoạn sửa chữa và cô lập ổ viêm Cuối cùng, sự ứ máu làm yếu tố gây bệnh không thể lan rộng, đồng thời tăng cường quá trình sửa chữa sau viêm

- Hình thành dịch rỉ viêm [10]

Tùy theo nguyên nhân và giai đoạn mà màu sắc và thành phần của dịch rỉ viêm

có sự khác nhau Nhìn chung, dịch rỉ viêm gồm 2 thành phần chủ yếu là các thành phần bình thường từ máu thoát ra như nước, muối, protein huyết tương, hồng cầu, tiểu cầu, các loại bạch cầu và các chất mới được hình thành do rối loạn chuyển hóa, tổn thương mô

- Bạch cầu xuyên mạch [10] [13]

Khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch, máu chảy chậm, lúc đó bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngo ại vi tới bề mặt nội mô thành mạch Tại đây chúng di chuyển theo vách mạch, thay đổi hình thái, mọc chân giả theo hướng đi, bám dính và xuyên mạch Tùy thuộc vào bản chất hoặc giai đoạn viêm mà loại bạch cầu tới

vị trí viêm khác nhau

- Bạch cầu thực bào [10] [13]

Thực bào là hiện tượng bạch cầu bắt giữ và tiêu hóa đối tượng Các đối tượng thực bào chủ yếu tại ổ viêm là các vi sinh vật và các mảnh tế bào bị phân hủy

1.4.2.2 Rối loạn chuyển hóa

Tại ổ viêm quá trình oxy hóa tăng làm tăng nhu cầu oxy, nhưng sự sung huyết động mạch chưa đáp ứng kịp Do vậy, pH sẽ giảm nhanh khi bắt đầu chuyển sang sung huyết tĩnh mạch, từ đó kéo theo hàng loạt những rối loạn chuyển hóa glucid, lipid và protein [10]

Quá trình rối loạn glucid xảy ra sẽ tạo thành acid lactic tại chỗ viêm Ở giai đoạn sung huyết động mạch, sự chuyển hóa glucid chủ yếu là hiếu khí, tạo ra CO2được dòng máu mang đi Ở giai đoạn muộn hơn, bắt đầu có chuyển hóa yếm khí, tạo

ra acid lactic tích lại trong ổ viêm vì sự tương tác của ổ viêm với cơ thể đã bị hạn chế,

do vậy pH giảm dần từ ngoài vào trong Sự rối loạn chuyển hóa glucid kéo theo rối loạn chuyển hóa lipid, làm tăng tốc độ chuyển hóa lipid trong cơ thể Hậu quả là tại ổ viêm, lượng acid béo, lipid và thể cetonic đều tăng cao Bên cạnh đó, chuyển hóa protein tăng do ho ạt tính cao c ủa các enzyme protease và TNF, tuy nhiên quá trình này xảy ra không hoàn toàn Các chất chuyển hóa trung gian như polypeptide và acid amine tăng lên và tích lại tại ổ viêm [13]

1.4.2.3 Tổn thương mô [10]

Tại ổ viêm thường thấy có 2 lo ại tổn thương Tổn thương tiên phát do nguyên nhân gây viêm tạo ra, tùy cường độ của nguyên nhân viêm mà tổn thương có thể rất nhỏ hoặc rất lớn Tổn thương thứ phát do những rối loạn tại chỗ gây nên, rất quan trọng vì nó không những phụ thuộc vào cường độ của nguyên nhân mà còn phụ thuộc vào mức độ phản ứng của cơ thể

1.4.2.4 Tăng sinh tế bào – quá trình lành vết thương [10] [13]

Viêm bắt đầu bằng tổn thương tế bào và kết thúc bằng quá trình tái t ạo Ngay trong giai đoạn đầu đã có tăng sinh tế bào bao gồm bạch cầu đa nhân trung tính, tiếp theo là s ự tăng sinh của các tế bào bạch cầu đơn nhân và lympho bào Cuối cùng, sự tăng sinh vượt mức hoại tử khiến ổ viêm được sửa chữa Các tế bào nhu mô của cơ quan viêm có thể được tái sinh đầy đủ khiến cấu trúc và chức năng cơ quan được phục hồi, nếu không thì một phần nhu mô được thay thế bằng mô sẹo

Tạm thời hạn chế

cử động ở khớp

Đau Phồng

Rỉ dịch giàu protein vào khoảng trống các mô

Rỉ các protein gây đông

Quá trình ngăn chặn (các cục máu ngăn chặn để ngăn ngừa sự tổn thương lan sang các vùng lân cận)

Mảng fibrin tạm thời tạo giàn để phục hồi

Sự thực bào các mầm bệnh và các tế bào của

mô đã chết (do neutrophil trong thời gian ngắn và đại thực bào trong thời gian dài)

Mủ có thể hình thành

Vùng thương tổn được làm sạch khỏi các cặn bã

Chỗ tổn thương đang lành lại

Dòng máu chảy chậm

Bạch cầu di chuyển tới vùng bị thương tổn

Hiện tượng lát (bạch cầu bám vào nội mạc mao mạch)

Sự sung huyết tại

Sự xuyên mạch (bạch cầu xuyên qua thành mao mạch)

Nóng

Đỏ

Bạch cầu tăng (tăng số lượng bạch cầu trong dòng máu)

Các tiểu

động mạch

giãn

Tăng tính thấm mao mạch

Hấp dẫn neutrophil, monocyte và lymphocyte tới vùng bị thương tổn (hóa ứng động)

Mô bị tổn thương

Giải phóng các chất trung gian hóa học (histamin,

complement, kinin, prostaglandin)

Giải phóng yếu tố gây tăng bạch cầu

Hình 1.9 Các biến đổi trong phản ứng viêm [6]

1.4.3 Mối liên hệ giữa phản ứng viêm và cơ thể

Ảnh hưởng của cơ thể đến phản ứng viêm là rất quan trọng Trạng thái thần kinh ảnh hưởng đến quá trình phát sinh, phát triển của viêm cũng như quá trình tiết dịch rỉ viêm và hiện tượng thực bào Ngoài ra, các nội tiết tố có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng viêm, nhất là nội tiết của tuyến yên và tuyến thượng thận, tác động theo hai hướng: làm tăng hoặc giảm phản ứng viêm [10]

Phản ứng viêm cũng ảnh hưởng lớn tới cơ thể Các sản phẩm của ổ viêm giải phóng vào máu gây những biến đổi toàn thân: tăng bạch cầu, tăng miễn dịch, sốt và tăng lắng máu Viêm nặng và cấp tính gây đau đớn cho cơ thể [10]

1.4.4 Các thuốc kháng viêm hiện nay

Đối với thuốc kháng viêm glucocorticoid thì cơ chế kháng viêm chính của

nhóm này là ức chế enzyme phospholipase A2, ngăn tạo thành các yếu tố gây viêm như prostaglandin, leukotriene, thromboxane Một số thuốc thuộc nhóm glucocorticoid như cortisol, cortisone, prenidsone, betamethasone…[17]

Cơ chế tác động của nhóm NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drugs) là ức chế enzyme cyclooxygenase, ngăn c ản sự tạo thành prostaglandin Một số thuốc thuộc nhóm NSAID hiện nay như aspirin, phenylbutazone, piroxicam, ibuprofen,

Qua đó, các nhà nghiên cứu sẽ đưa ra những quy định trong việc sử dụng dược phẩm, sản phẩm đó sao cho có lợi với sức khỏe con người Việc sử dụng động vật nhằm kiểm tra dược tính, tính gây độc được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhất và được ứng dụng rộng rãi trong bảy lĩnh vực chính sau: [19]

Ứng dụng trong nghiên cứu sinh lý cơ bản

Phát triển các phương pháp mới trong điều trị

Tạo các sản phẩm từ động vật được sử dụng trong nghiên cứu và điều trị y tế Thử nghiệm sự an toàn của hóa chất và thuốc

Nghiên cứu sự rối loạn di truyền

Phát triển những phương pháp mới trong việc chẩn đoán bệnh

Giảng dạy trong lĩnh vực sinh học và y sinh học

1.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc chống viêm bằng

mô hình động vật

Trong các mô hình viêm gây ra bởi các tác nhân khác nhau sẽ phóng thích ra các chất viêm trung gian khác nhau Cơ chế gây viêm cũng sẽ khác nhau hoặc bằng cách tăng tính thấm thành mạch, giãn thành mạch hoặc sự thâm nhiễm của bạch cầu từ máu vào các mô hoặc sự hình thành bạch cầu đa nhân và sự sửa chữa mô

Trong số các phương pháp được sử dụng để sàng lọc các loại thuốc chống viêm, một phương pháp phổ biến nhất là gây phù chân chuột bằng cách tiêm các chất gây viêm như men bia, formol, dextran, albumin trứng, cao lanh, caragenin, xylene…

Mô hình phù chân chuột bằng formol: formol khi vào cơ thể sẽ thay thế phân tử hydro (H2) trong nhóm amin của các tế bào, các mô bằng nhóm =CH2, làm biến đổi các amino acid, gây tổn thương đến cấu trúc của mô, tế bào, dẫn đến quá trình viêm Tác dụng gây viêm của formol gồm hai giai đoạn, đầu tiên là xảy ra tại các mô thần kinh và theo sau đó là một phản ứng ở mô trung gian Trong giai đoạn đầu có sự hình thành của histamine, 5 – hydrotryptophan và kinin, và trong giai đoạn hai liên quan đến sự hình thành prostaglandin [19]

Mô hình phù chân chuột bằng car agenin: gồm hai giai đoạn, giai đoạn đầu liên quan đến sự hình thành histamine và serotonin, giai đoạn hai của phù nề do sự hình thành prostaglandin, protease và bào tương Tiêm car agenin dưới da bàn chân chuột sẽ

gây viêm do sự tràn huyết tương, sự gia tăng nước mô và protein huyết tương rỉ ra cùng với bạch cầu, tất cả do sự chuyển hóa của acid arachidonic Giai đoạn đầu tiên

bắt đầu ngay sau khi tiêm car agenin và giảm trong hai giờ, giai đoạn thứ hai bắt đầu

vào cuối giai đoạn đầu và kéo dài trong khoảng 2 – 3 giờ sau.[30]

Mô hình phù chân chuột bằng histamine: histamine gây phù chân chuột được cho là do tăng tính thấm thành mạch gây ra viêm Trong đó, hiện tượng sưng xảy ra chủ yếu do tác động của histamine Do histamine được phóng thích từ các tế bào bạch cầu đa nhân theo sau các chất trung gian viêm bao gồm chất P interleukin-1 (IL-1) Điều này dẫn đến việc giải phóng các neuropeptide cũng như prostaglandin, acid monohydroxy eicosatetranoic từ các tế bào nội mạc làm gia tăng thụ thể gây đau và các tác dụng tiền viêm khác [15]

Phần 2

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG THÍ NGHIỆM

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm

Nghệ tươi (Curcuma longa L.) được thu mua một lần tại số 28/147, khu phố 9,

đường Nguyễn Thị Minh Khai, phường Phú Hòa, thị xã Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Đây là nghệ vừa trưởng thành được thu hái sau 9 tháng trồng Sau khi lấy về nguyên liệu được chà sạch vỏ, rửa sạch từ 2 – 3 lần trong nước để loại bỏ bụi đ ất, cắt

bỏ những phần bị hư, úng Để nơi thoáng mát đến khi ráo nước

Hình 2.1 Nghệ tươi và bột nghệ Curcuma longa L

Chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) có trọng lượng trung bình 23 ± 2

gram thu nhận từ Viện Pasteur Tp.HCM và nuôi tại Phòng thí nghiệm Sinh lý động vật, trường ĐH Mở Tp.HCM Chuột được nuôi với chu kỳ sáng tối 12/12 ở nhiệt độ phòng với lượng thức ăn là 8 g/con/ngày

Hình 2.2 Chuột bạch Mus musculus var albino

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hoá – Môi trường và phòng thí nghiệm Sinh lý Động vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 11/2012 đến tháng 03/2013

- Bình xịt cồn, bông thấm, găng tay cao su, khẩu trang y tế

- Kim cho uống đầu tù 24G, kim tiêm 18G

- Dây và thước vạch 1 mm

2.1.2.2 Thiết bị

- Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7

- Cân kỹ thuật Vibra DJ – 300 TW, cân phân tích AA – 200

- Hệ thống Soxhlet (gồm bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn)

- Bếp khuấy từ có gia nhiệt VELP ARE + cá từ

- Hệ thống chưng cất trực tiếp (gồm bình cầu, ống sinh hàn nằm ngang, nhiệt kế, bình cầu thu hồi dung môi)

- Hệ thống lọc áp suất kém (gồm erlen có vòi, phễu Büchner, bình phòng bị, máy bơm hút áp suất)

- Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC

- Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11

- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT – IR BRUKER EQUINOX 55 (Đức)

- Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC–MS micrOTOF–Q (Bruker, Đức)

2.1.2.3 Hóa chất

- Ethanol 96% (VN Chemsol Co., Ltd)

- Acetone (VN Chemsol Co., Ltd)

- Chloroform (VN Chemsol Co., Ltd)

- Ethyl acetate (VN Chemsol Co., Ltd)

- Ether dầu hỏa (Guangdong Guanghua Sci.Tech Co., Ltd)

- Isopropanol (Guangdong Guanghua Sci.Tech Co., Ltd)

- Curcumin chuẩn (Merck)

- Bản nhôm tráng sẵn silica gel hiện huỳnh quang (TLC silica gel 60 F254 Merck)

- Dung môi sắc ký bản mỏng: ethanol, methanol, chloroform, acid acetic

- Dung dịch muối sinh lý 0,9% (NaCl 9 g pha trong 1000 ml nước cất)

- Formol

- Thuốc Medexa 4 mg (PT Dexa Medica)

- Dầu olive (Angel Camacho Alimentaction)

Hình 2.3 Bếp khuấy từ VELP ARE và máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11

Hình 2.4 Curcumin chuẩn, thuốc medexa và dầu olive