Ghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học tuyến trùng meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu của một số chủng vi khuẩn, vi nấm và thực vật tiềm năng nghiên cứu khoa học

GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, VI NẤM VÀ THỰC VẬT TIỀM NĂNG Mã số 31 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thương Toàn Khoa: Công nghệ sinh học Các thành viên: Ngô Lập Vinh Lê Hu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, VI NẤM VÀ

THỰC VẬT TIỀM NĂNG

Mã số 31

Bình Dương, tháng 4 năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, VI NẤM VÀ

THỰC VẬT TIỀM NĂNG

Mã số 31 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thương Toàn

Khoa: Công nghệ sinh học

Các thành viên: Ngô Lập Vinh

Lê Huỳnh Nhật Giao Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh

Bình Dương, tháng 4 năm 2018

MỤC LỤC

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1 Tổng quan về cây hồ tiêu 2

Đặc điểm và công dụng 2

Giá trị kinh tế 2

Một số bệnh thường gặp trên cây tiêu 2

2 Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật 4

Tuyến trùng ký sinh thực vật 4

Tác nhân Meloidogyne spp gây bệnh sần rễ cây hồ tiêu 5

Đặc trưng sinh học 7

Triệu chứng bệnh 10

3 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng 10

Phòng ngừa 10

Luân canh 11

Biện pháp canh tác 11

Các biện pháp vật lý 13

Biện pháp sinh học 13

Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

Tình hình nghiên cứu trong nước 15

PHẦN IIlý do chọn đề tài 17

PHẦN IIIVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2 Vật liệu ……… 22

3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 22

Thiết bị 22

Dụng cụ 22

Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm 23

4 Phương pháp nghiên cứu chính 24

Tái phân lập, phân lập các chủng vi sinh vật 24

Thu nhận trứng tuyến trùng từ rễ cây bệnh, tạo nguồn tuyến trùng 24

4.2.1 Nguyên tắc 24

4.2.2 Cách tiến hành 24

Tạo nguồn tuyến trùng 25

Sàng lọc chủng vi khuẩn, dịch chiết thực vật có khả năng đối kháng tuyến trùng 25

4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng dịch chiết thực vật 25

4.4.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát sự nở của trứng 25

4.4.3 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 26

Đánh giá khả năng đối kháng tuyến trùng của các chủng vi khuẩn, vi nấm dịch chiết thực vật 26

4.5.1 Đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng 26

4.5.2 Đánh giá ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 27

Thí nghiệm thử khả năng tương thích giữa các chủng được lựa chọn 28

4.6.1 Nguyên tắc 28

4.6.2 Cách tiến hành 28

Đánh giá hiệu quả kiểm soát tuyến trùng chủng vi sinh vật tiềm năng và dịch chiết thực vật trên cây hồ tiêu ở quy mô nhà lưới 29

5 Công thức tính tỉ lệ trứng nở, ấu trùng chết, đọc kết quả Nghiệm thức đối chứng, Abamectin 30

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

1 Kết quả tái phân lập các chủng vi khuẩn 33

2 Kết quả tái phân lập vi nấm 37

3 Kết quả phân lập vi nấm 40

4 Kết quả thu nhận, tạo nguồn tuyến trùng 42

5 Kết quả sàng lọc chủng vi khuẩn, vi nấm có khả năng đối kháng tuyến trùng 46

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm

soát sự nở của trứng 46

Bảng kết quả tác động của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát sự nở của trứng 46

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 49

5.3.1 Kết quả đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng 52

5.3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 56

Kết quả thử khả năng tương thích giữa các chủng được lựa chọn 59

PHẦN IV: 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận 65

2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

A Tài liệu Tiếng Việt: 67

B Tài liệu Tiếng Anh: 69

DANH MỤC BẢNG

đặc điểm đại thể vi khuẩn 33

đặc điểm vi thể vi khuẩn 35

Quan sát đặc điểm đại thể, vi nấm chủng nấm NTI 37

Quan sát đặc điểm đại thể, vi nấm chủng nấm chủng TC 39

Quan sát điểm đại thể, vi nấm chủng nấm NTR 41

Bảng kết quả tác động của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm soát sự nở của trứng 46

Bảng kết quả tác động của các chủng vi sinh vật có khả năng kiểm quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 49

Bảng kết quả kí sinh của các chủng vi nấm lên trứng tuyến trùng 52

Bảng kết quả tác động của dịch chiết thực vật kiểm soát sự nở của trứng 55 Bảng kết quả tác động của các chủng vi sinh vật kiểm soát quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 56

Bảng kết quả tác động của dịch chiết thực vật kiểm soát quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 58

Bảng kết quả đếm mật độ khả năng sống sót của chủng vi khuẩn trong dịch chiết thực vật 61

DANH MỤC BIỂU ĐỒ phần trăm ức chế sự nở của trứng của các chủng vi khuẩn 48

phần trăm kiểm soát đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 51

tỷ lệ phần trăm ký sinh trứng tuyến trùng của các chủng vi nấm 53

Phần trăm ức chế sự nở của trứng của dịch chiết thực vật 55

Phần trăm đánh giá kiểm soát quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 của các chủng vi sinh vật 57

Phần trăm đánh giá kiểm soát quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2 của dịch chiết thực vật 59

DANH MỤC HÌNH Rễ hồ tiêu bị tuyến trùng ký sinh 6

Tuyến trùng Meloidogyne sp và khối trứng 7

Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp ……… ……….7

Diễn biến sau 72 giờ của ba tế bào khổng lồ sau khi Meloidogyne sp xâm nhiễm (Jones và Pay, 1978; Perry và Moens, 2006) 9

kết quả quan sát đại thể của một số vi khuẩn (A) chủng S29, (B) chủng TĐ13 35 kết quả quan sát vi thể một số chủng vi khuẩn (A) Chủng V18, (B) TĐ13 37 kết quả quan sát đại thể vi nấm chủng NTI 38

kết quả qua sát vi thể vi nấm chủng NTI 39

kết quả quan sát đại thể, vi thể vi nấm chủng 40

kết quả quan sát đại thể vi nấm chủng NTR 41

kết quả quan sát vi thể vi nấm chủng NTR 42

cây Hồ tiêu có triệu chứng bệnh (A) lá vàng từ dưới lên trên, (B) vàng lá, (C) rễ bị nốt sần 43

(A) Tuyến trùng cái và khối trứng, (B) Tuyến trùng cái 44

Trứng tuyến trùng được tách ra khỏi rễ bệnh 44

hồ tiêu trước và sau khi gây bệnh (A) cây khỏe mạnh, (B) cây gây bệnh

45

rễ hồ tiêu bị nốt sần 46 trứng tuyến trùng bị nấm ký sinh (A) chủng TC, (B) chủng NTI, (C) chủng NTR 54

Kết quả thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn 60 Thử khả năng tương thích giữa chủng nấm TC và 5 vi khuẩn tuyển chọn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học tuyến trùng meloidogyne

sp gây hại rễ hồ tiêu của một số chủng vi khuẩn, vi nấm và thực vật tiềm năng

- Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thương Toàn

- Lớp: DH14VS01 Khoa:Công nghệ sinh học Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh

2 Mục tiêu đề tài: Tuyển chọn, đánh giá những chủng vi khuẩn, vi nấm, thực vật có khả năng đối kháng tuyến trùng gây nốt sần ở rễ gây hại trên cây hồ tiêu

3 Tính mới và sáng tạo: Kết hợp các chủng vi khuẩn, nấm, thực vật trong kiểm soát tuyến trùng

4 Kết quả nghiên cứu:

Chúng tôi đã thu nhận vào tạo nguồn tuyến trùng thành công bằng cách gây bệnh nhân tạo trực tiếp trên cây tiêu non trong mô hình nhà lưới

Từ 20 chủng vi khuẩn, chúng tôi đã thực hiện được 20 chủng kết quả thu đươc

20 chủng đều có khả năng kiểm soát được tuyến trùng ở cả 2 giai đoạn trứng và ấu trùng Trong đó 6 chủng P20, TV6, Q16, SP1.1, CN1, KT2 có phần trăm ức chế sự

nở trứng cao nhất, cụ thể P20 74,55 ± 3,59%, TV6 69,43 ± 7,62%, Q16 68,43 ± 7.74%, SP1.1 68,21 ± 7,61%, CN1 67,68 ± 4,16%, KT2 67,23 ± 3,42 Hầu hết các chủng vi khuẩn thừ nghiệm đều gây chết ấu trùng (90,52 ± 13,5% đến 99,99 ± 0%)

và khác biệt so với đối chứng (7,75 ± 7,29%) và lớn hơn (82,77% đến 92,24%)

3 chủng vi nấm thử nghiệm đều có khả năng ký sinh trứng tuyến trùng, trong đó

2 chủng ký sinh trung bình chủng NTI 67,90 ± 15,93%, chủng TC 68,31 ± 5,01%, 1 chủng ký sinh yếu NTR 43,64%

Dịch chiết thử nghiệm ở nồng độ 5%, 10% ở 4 loại cây đều có khả năng ức chế khả năng nở của trứng tuyến trùng cao nhất ở nghiệm thức CH10% đạt 95,17 ± 8,35%

có khác biệt so với đối chứng 25,95 ± 2,25%

6 chủng vi khuẩn P20, Q16, SP1.1, CN1, KT2 gây chết 100% ấu trùng 99,99 ± 0% trong vòng 3h thử nghiệm khác biệt so với đối chứng 3,4 ± 5,87% và sau 6h, 12h kết quả không thay đổi

Nghiệm thức SD5% và CH5% gây chết 100% ấu trùng hiệu quả trong thời gian ngắn 3h bằng với nghiệm thức sử dụng thuốc hóa học Abamectin 20g/L 1%

Khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn P20, TV6, Q16, SP1.1, CN1, KT2 bằng phương pháp cấy vạch vuông góc làm cơ sở kết hợp các chủng vi khuẩn nhằm tăng hiệu quả kiểm soát sinh học, nhận thấy chỉ có chủng TV6 đối kháng với các chủng còn lại

Tất cả các chủng vi khuẩn có khả năng sống sót và có thể phát triển trong dịch chiết thực vật SĐ10%, CH10% kết quả cho thấy sau 24h, 48h

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Về kinh tế:

- Về lâu dài giảm chi phí, giảm nhân công cho các quá trình bón phân nhiều lần, phun thuốc bảo vệ thực vật

- Giúp ổn định năng suất cây trồng

- Hướng tới nông sản đạt chất lượng xuất khẩu ở các thị trường khó tính

- Khả năng áp dụng cao

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu:

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài (ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Ngày tháng năm Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu) Người hướng dẫn (ký, họ và tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Nguyễn Thương Toàn

Sinh ngày: 01/08/1995

Nơi sinh: ĐăkLăk

Lớp: DH14VS01 Khóa: 2014

Khoa: Công nghệ sinh học

Địa chỉ liên hệ: khối 7, Thị trấn Eađrăng, Huyện Eahleo, Tỉnh ĐăkLăk

Điện thoại: 0166721220 Email: Thuongtoan.nguyen@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang học):

Sơ lược thành tích:

Ngày tháng năm Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu) Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY HỒ TIÊU

Đặc điểm và công dụng

Hồ tiêu có tên khoa học là Piper nigrum L., thuộc họ Hồ tiêu Piperaceace Cây

hồ tiêu có nguồn gốc ở Tây Nam Ấn Độ, được người Ấn Độ phát hiện và đưa vào sự dụng đầu tiên Hồ tiêu là một loại cây dây leo, thân dài, nhẵn không mang lông, bám vào các cây khác bằng rễ bám Khi gỡ cây hồ tiêu khỏi trụ phần nhiều cây sẽ bị chết Hạt tiêu là một loại gia vị vô cùng phổ biến ở trên thế giới, không chỉ làm gia vị mà còn là một vị thuốc trong y học, giàu vitamin c và carotenoids giúp hỗ trợ tăng cường

hệ thống miễn dịch, chống oxi hóa, kích thích tiêu hóa, phòng và chữa được nhiều bệnh (Calucci và cs., 2003, Đỗ Tất Lợi, 2004) Hồ tiêu được trồng nhiều ở nước ta như Châu Đốc, Hà Tiên, Phú Quốc, Bà Rịa – Vũng tàu, Vĩnh Linh, Quảng Trị, Bình Phước, Tây nguyên Tại các nước khác như Indonesia, Trung Quốc, Brazil, Malaysia

Giá trị kinh tế

Hạt tiêu còn là mặt hàng có giá trị kinh tế cao và được thị trường trong nước và quốc tế tiêu thụ khá mạnh Đến hết 2016, diện tích trồng hồ tiêu tại Việt Nam khoảng 124,5 nghìn ha, đã xuất khẩu một khối lượng tiêu kỷ lục nhất từ trước tới nay đạt 179.233 tấn hồ tiêu các loại, bao gồm 159.171 tấn tiêu đen và 20.062 tấn tiêu trắng Kim ngạch xuất khẩu đạt 1 tỷ 439,87 triệu USD, trong đó tiêu đen đạt 1 tỷ 215,36 triệu USD, tiêu trắng đạt 224,51 triệu USD (Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2017) Trong tháng 10/2017, Việt Nam xuất khẩu được 11.029 tấn Hồ tiêu, bao gồm 9.447 tấn tiêu đen và 1.582 tấn tiêu trắng Kim ngạch xuất khẩu trong tháng đạt 50,90 triệu USD, tiêu đen đạt 40,90 triệu USD, tiêu trắng đạt 10,00 triệu USD So với tháng trước, lượng xuất khẩu chỉ giảm 592 tấn nhưng giá trị xuất khẩu lại giảm tới 14,03 triệu USD (Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2017)

Một số bệnh thường gặp trên cây tiêu

Theo đánh giá của Cục Bảo vệ Thực vật, trên cây tiêu có 17 loại bệnh gây hại, trong đó bệnh: thán thư, cháy đen lá, mốc hồng, tuyến trùng, virus, chết nhanh, chết chậm gây hại nặng và khá phổ biến ở nhiều vùng Các bệnh khác như nấm mạng

nhện, tảo đỏ, rụng gié, chết thân, thối rễ do vi khuẩn, khô vằn là những bệnh tuy có xuất hiện nhưng tác hại không lớn (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007)

Một trong những vi sinh vật quan trọng sống trong đất gây hại cho cây tiêu đó

là nấm Phytophthora spp Nấm gây hiện tượng chết nhanh và phân bố rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, Châu Á, Úc Ngòai ra còn có các loài nấm khác gây chết cây như Fusarium spp., Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani (Barbara, 2001) Và nấm gây bệnh có thể tồn tại 20 tuần trong đất ở độ thủy dung 100% Bệnh thối rễ chết nhanh do Phytophthora capsici gây thất thoát sản lượng từ 5–10 % hàng năm ở Mã Lai Hiện tượng vàng lá của cây có thể do sự cộng hợp của các tác nhân Fusarium sp., Rhyzoctonia sp., và tuyến trùng Meloidogyne sp., rệp sáp hại rễ và do cây thiếu dinh dưỡng Hiện chưa có biện pháp phòng trị hữu hiệu cho cây bị nhiễm Fusarium (Wong, 2002)

Ở Ấn Độ, thành phần sâu hại trên cây hồ tiêu vào khoảng 56 loài tấn công trên nhiều bộ phận như rễ, thân, lá, phác hoa và hạt Côn trùng hiện diện trong đất gây hại trên rễ cây hồ tiêu gồm có sùng đất Holotrichia fissa, mối Coptotermes curvignathus Holgmt Sùng đất chỉ thỉnh thoảng xuất hiện gây hại rễ cây tiêu còn non, và thường gây hại nặng trong các vườn tiêu có trồng xen với một số cây trồng khác, vì vậy hai loại côn trùng này được xem là loài gây hại thứ yếu (Devassahayam, 2000) Hai loại bệnh virus phát triển gây hại trên cây tiêu, dòng virus gây khảm cây dưa leo (cucumber mosaic virus, CMV-Pn) và virus mốc vàng (pepper yellow mottle virus, PYMV) Hai loại virus này làm cho cây sinh trưởng chậm và cho năng suất kém Bệnh có thể truyền qua dịch cây, các động tác cắt ghép, dụng cụ và qua côn trùng vectơ như rầy mềm (Aphis gossypii) đối với virus CMV-Pn, rệp sáp Planococcus citri

và Ferrisia virgata đối với virus PYMV (Govindan và cs., 2003)

Hồ tiêu hiện là cây trồng bị rất nhiều loài tuyến trùng kí sinh gây hại Tại Tân Lâm (Quảng Trị), cây tiêu bị nhiễm đến 49 loài tuyến trùng, trong đó có 4 loài được đánh giá quan trọng gây nguy hiểm cho cây gồm Meloidogyne incognita gây bệnh nốt sần, Rotylenchulus gây đen rễ, Xiphinema americanum truyền virus gây bệnh vàng lá, Paratrichodorus namus truyền virus gây bệnh xoắn lá (Nguyễn Ngọc Châu, 1993) Theo Nguyễn Bá Khương (1983), ở Nam Việt Nam, trên cây hồ tiêu có khoảng

15 chủng tuyến trùng gây hại: Criconemoides, Dilichodorus, Helicotylenchus,

Meloidodera, Meloidogyne, Pratylenchus, Scutellonema, Trichodorus, Trophonema, Tylenchorhynchus, Xiphinema Khoảng 10 giống tuyến trùng được phát hiện ở vùng miền Đông Nam Bộ, chủng Meloidogyne rất phổ biến ở các vùng trồng tiêu, gây hiện tượng bướu rễ tiêu (Phạm Văn Biên, 1989)

Tuyến trùng là đối tượng dịch hại khá phổ biến và gây thiệt hại rất lớn đối với các quốc gia trồng tiêu trên thế giới, chỉ tính riêng tuyến trùng Meloidogyne spp đã gây thiệt hại đến 16% ở các nước Đông Nam Châu Á (Sasser, 1979) Có đến 36 loài tuyến trùng kí sinh gây hại đã được báo cáo, trong đó có hai đối tượng quan trọng nhất là: Radopholus similis và Meloidogyne spp (Koshy and Geetha, 1992) Theo Mai (1985), bệnh vàng lá tiêu là do phối hợp giữa loài tuyến trùng này và nấm bệnh gây ra, bệnh này đã giết chết ngành công nghiệp tiêu đen ở nhiều nơi của Indonesia Trên cây tiêu ở Sumatra của Indonesia mức độ quần thể 2 con/100g đất và 25 con/10g

rễ được ghi nhận gây bệnh vàng lá (Koshy, 1992)

2 TỔNG QUAN VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH THỰC VẬT

Tuyến trùng ký sinh thực vật

Tuyến trùng ký sinh thực vật là nhóm sinh vật có kích thước bé (0,25 mm-7 mm), chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với hệ thực vật Đây là nhóm tuyến trùng có quá trình tiến hoá cao và thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật Tuyến trùng thực vật đa số sống ở rễ và vùng đất quanh rễ của cây trồng, cây hoang dại và có khả năng ký sinh ở tất cả các phần trên, dưới mặt đất của thực vật, bao gồm

rễ, thân, lá và hoa Chúng có những tập tính dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên bề mặt những mô ngoài của thực vật, một số khác thâm nhập vào bên trong các mô để ký sinh và một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng phù hợp tại nơi chúng ký sinh Trong quá trình sống ký sinh và sinh sản trên hoặc trong cơ thể thực vật, tuyến trùng có thể gây ra nhiều biến đổi theo chiều hướng bất lợi đối với cây chủ: biến đổi cơ học như phá huỷ mô thực vật, tạo các vết thương, biến đổi sinh lý như làm gián đoạn hoặc phá huỷ các quá trình trao

đổi chất khoáng, các muối hoà tan trong đất, quá trình hút và vận chuyển chất dinh dưỡng của rễ, thân và sự quang hợp của lá, các biến đổi sinh hóa do tuyến trùng tiết

ra các enzym tiêu hóa làm thay đổi các quá trình sinh hóa bình thường của cây Ngoài tác hại trực tiếp như trên, tuyến trùng ký sinh thực vật còn có mối quan hệ với các tác nhân gây bệnh khác gây hại cho thực vật Tuyến trùng thường tạo ra các vết thương trên cây chủ, mở đường cho nấm, vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh khác xâm nhập tiếp theo Một số tuyến trùng còn có thể làm giảm khả năng miễn dịch của cây trước

sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh vật gây bệnh Một số nhóm tuyến trùng khác còn có khả năng mang truyền virus gây bệnh cho thực vật Dựa trên cơ sở của 20 loại cây trồng chính ở các vùng khác nhau trên thế giới đã xác định mức thiệt hại trung bình hàng năm do tuyến trùng ký sinh gây ra là 12,5%, tương đương khoảng 77 tỷ USD năm 1984 Nếu tính cho cả các cây trồng khác thì chắc chắn con số thiệt hại vượt quá 100 tỷ USD Đặc biệt ở các nước đang phát triển do trình độ Canh tác thấp, mức độ đầu tư có hạm và công tác phòng trừ sâu bệnh còn chưa được quan tâm đúng mức thì thiệt hại do tuyến trùng ký sinh thường cao hơn 14,5% so với ở các nước phát triển là 8% (Luc và cs 1990)

Trong số các nhóm loài tuyến trùng ký sinh thực vật có 10 giống tuyến trùng được coi là quan trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới là: Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Ditylenchus, Globodera, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus và Helicotylenchus (Sasser & Freckman, 1987)

Tác nhân Meloidogyne spp gây bệnh sần rễ cây hồ tiêu

Tuyến trùng Meloidogyne spp Đặc điểm phân loại theo Göldi (1887) phân loại như sau:

Tuyến trùng Meloidogyne spp đây là nhóm phân bố rộng khắp thế giới và phổ biến tại Việt Nam chúng ký sinh ở rễ thực vật bậc cao gây hại chính trên nhiều loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau như hồ tiêu, cà phê, cà chua, cà rốt… Gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế cho cây hồ tiêu (El-Borai và cs., 2005, Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Ngoài khả năng gây hại trực tiếp làm cho cây còi cọc kém phát triển, chúng còn là tác nhân gián tiếp tạo ra những vết thương trên rễ làm cho nấm, vi khuẩn bệnh trong đất xâm nhập và gây hại (Perry & Moens, 2006) Tuyến trùng gây ảnh hưởng đến giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm của cây trồng Cho đến nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loài ký sinh quan trọng nhất là: M incongnita, M Javancica, M arenaria, M Hapla Đây là các loài phân bố khắp ở các vùng nông nghiệp trên toàn thế giới Ngoài ra một

số loài khác mặc dù cũng rất quan trọng nhưng chúng chỉ giới hạn về mặt phân bố, một số loài khác là ký sinh chuyên hóa cao hơn nên chỉ gây hại ở 1-2 cây trồng và phân bố hẹp Thông thường chúng sinh sản và lấy dinh dưỡng từ mô rễ gây ra khối u lớn hoặc nhỏ, Trứng tuyến trùng con cái đẻ ra được bao bọc bởi gelatin tạo thành khối thường nằm trên bề mặt rễ đôi khi bên trong rễ (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Rễ hồ tiêu bị tuyến trùng ký sinh

Tuyến trùng Meloidogyne sp và khối trứng.

Đặc trưng sinh học

Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp (Roland N

Perry, Maurice Moens, 2013)

Sau giai đoạn phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 (infective juvenile = IJ1) ngay bên trong trứng Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 (infective juvenile = IJ2) dạng cảm nhiễm không cần sự kích thích của rễ thực vật Khi rời khỏi khối trứng IJ2 chúng xâm nhập vào rễ gần đó hay tới các gốc rễ mới Nếu chưa tìm thấy được cây chủ thích hợp IJ2 có thể tồn tại trong đất thời gian dài ở trạng thái tĩnh bằng việc tiêu thụ thực phẩm dự trữ trước đó trong ruột Như vậy các IJ2 của tuyến trùng có thể tìm thấy dạng tự do trong đất (Curtis và cs.,2009) IJ2 có thể nhận thấy

sự kích thích và tấn công thực vật bằng các chất do vật chủ tiết ra IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo nên điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương Có sự khác nhau về tính chất dẫn dụ giữa các thực vật mẫn càm và kháng chịu với tuyến trùng, nếu cả 2 loại cây trên cùng hiện diện thì rễ cây mẫn cảm hơn bao giờ cũng hấp dẫn hơn cho sự xâm nhập của IJ2 Tuy nhiên bản chất dẫn dụ do các chất tiết ra từ rễ cây kích thích sự xâm nhập này chưa được làm rõ Nhiều chất hữu cơ, vô cơ được rễ tiết ra tạo thế chệnh lệch giữa bề mặt rễ và đất có thể ảnh hưởng đến tuyến trùng CO2 được tiết ra

từ rễ là chất có vai trò quan trọng nhất cho sự tấn công của tuyến trùng Khi IJ2 tiếp xúc với bề mặt rễ cứng, chúng thường dùng kết hợp kim hút, châm và hệ enzyme cellulytic và pectolyctic khiến rễ hư hỏng và xâm nhập vào ngay trong rễ Việc xâm nhập với số lượng lớn vào một nơi có thể khiến rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trong một thời gian ngắn (Perry và Moens, 2006)

Sau khi xâm nhập vào trong rễ tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của

vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng Khi đó tuyến trùng tiếp cận vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi

và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng

lồ (tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô phloem, nơi đầu rễ Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào, chúng được tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập Kích thước của nốt sần

liên quan đến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh (Perry và Moens, 2006)

Diễn biến sau 72 giờ của ba tế bào khổng lồ sau khi Meloidogyne

sp xâm nhiễm (Jones và Pay, 1978; Perry và Moens, 2006)

Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầu một cách nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần được phát triển Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh Tuyến trùng Meloidogyne spp sinh sản bằng 2 cách: một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần con đực Đối với các loài hữu tính thì con đực cặp đôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây chủ, nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm Có thể phân biệt 2 nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt

độ là nhóm ưa nóng (các loài điển hình như M incognita, M javanica, M exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như M hapla, M chitwooodi và có thể cả M naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid của tuyến trùng xảy ra ở 10 °C Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây trồng thường có liên quan đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi (stress) cho thực vật (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Triệu chứng bệnh

Hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng xuất hiện các nốt sần ở rễ (Ramana và Eapen 2000) Sự xâm nhiễm làm xuất hiện các nốt sần ở rễ chính hay các rễ bên của cây Bên trong rễ có một vài con cái trưởng thành và khối trứng của nó Kèm theo lá cây

bị vàng, cây thiếu sức sống như mô tả trong nghiên cứu của (Koshy và cs., 2005) đối với cây tiêu đen bị nhiễm Meloidogyne spp

3 CƠ SỞ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG

Mục tiêu phòng trừ: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu và giảm số cây trồng bị nhiễm tuyến trùng nhằm tăng sản lượng và chất lượng cây trồng

Sự giảm mật độ tuyến trùng có thể đạt được bằng các biện pháp:

 Loại trừ tuyến trùng bằng làm mất nguồn dinh dưỡng

 Loại trừ trực tiếp tuyến trùng bằng hóa chất hoặc bất kỳ một kỹ thuật khác được áp dụng trước khi gieo trồng

 Sử dụng các hóa chất một cách hợp lý để chống lại tuyến trùng trên đồng ruộng có cây trồng (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Phòng ngừa

Các loài Meloidogyne thường không tìm thấy trong hạt nhưng có thể có mặt trong củ hay rễ thực vật Số lượng tuyến trùng sần rễ được giảm bớt bằng nhiệt hay hóa chất Tuy nhiên tốt hơn là loại bỏ vật liệu bị nhiễm bệnh Chỉ nên sử dụng những giống cây từ những vườn ươm đáng tin cậy không có nguồn bệnh Nguồn bệnh có thể đến từ máy móc, dụng cụ làm nông nghiệp Cần vệ sinh máy móc, dụng cụ trước và sau khi sử dụng

Hệ thống thoát nước hay tưới tiêu cũng là con đường lan truyền tuyến trùng Vì vậy làm lắng đọng tuyến trùng trong thùng, bể nước làm giảm sự hiện diện của tuyến trùng trong nước để hạn chế sự lây lan (Perry và Moens, 2013)

để quản lý các cây trồng mẫn cảm với một loài tuyến trùng đã được trồng luân canh với các cây kháng hoặc miễn nhiễm tuyến trùng Thường các cây trồng kinh tế là các cây mẫn cảm với tuyến trùng và các cây trồng luân canh là các cây kém kinh tế hơn

Sự luân canh cần phải trồng như thế nào để mật độ quần thể tuyến trùng ở mức thấp nhất khi trồng cây trồng chính Các cây luân canh là cây miễn nhiễm hay có khả năng chống chịu cao với một hoặc một số loại tuyến trùng nào đó Khả năng miễn nhiễm của chúng có thể là miễn nhiễm tự nhiên Ví dụ như các loài cây lạc có thể miễn nhiễm với hầu hết các chủng của M incognita, M javanica và chủng 2 của M arenaria, nhưng lại mẫn cảm đối với M hapla và chủng 1 của M arenaria

Trồng cây không phải là vật chủ của tuyến trùng đôi khi gây cho mật độ tuyến trùng giảm một cách nhanh chóng hơn là biện pháp bỏ hoang Tuy nhiên ký thuật luân canh cần được kiểm tra trước sẽ là một nguy cơ lơn nếu sự luân canh lại làm tăng khả năng sinh sản và phát triển của quần thể tuyến trùng hại hơn là mức độ chúng

đã gây ra đối với cây trồng chính Ngoài ra các cây trồng bẫy tuyến trùng có thể làm tiêu tán các quần thể tuyến trùng bằng khả năng dẫn dụ, thu hút tuyến trùng ở giai đoạn cảm nhiễm và trước khi vòng đời hoàn thành đồng ruộng thường được cày xới

và nhiều tuyến trùng bị chết (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

các trang trại có thể gieo trồng ở thời kì lạnh, khi đó cây có thể phát triển trước khi tuyến trùng hoạt động Tuy nhiên việc trồng sớm liên tục cũng có thể tạo ra các chủng sinh thái của tuyến trùng ký sinh thích nghi với nhiệt độ thấp

Bón phân hữu cơ: sự phân huỷ chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh Đặc biệt, sự phân giải các chất phế thải thực vật sẽ giải phóng các acid hữu cơ như: acid acetic, propionic, butyric Nồng độ các chất này có thể lưu giữ một vài tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng ký sinh, nhưng không độc đến các nhóm tuyến trùng sống tự do trong đất Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải thành phố, rơm rạ và các phế thải sau khi thu hoạch đều có thể sử dụng làm chất bổ sung vào đất để tăng hàm lượng chất hữu cơ Các thí nghiệm

ở Nigeria bón các phế thải từ chế biến nông sản như vỏ khô của quả ca cao và vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây sần rễ đã mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với việc sử dụng thuốc hóa học hoặc bón liều lượng cao tổ hơn ba loại phân hóa học NPK (Đạm – Lân – Kali) Thí nghiệm dùng phân chuồng ủ hoai mục bón cho hồ tiêu với lượng 20kg/ gốc tiêu tại xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita so với đối chứng (Nguyễn Ngọc Châu, 1993)

Một số cây trồng và cây hoang dại cũng đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn Độ, hạt cây củ đậu, rễ cây ruốc cá, hạt

và lá cây sầu đâu rừng ở Việt Nam do chúng chứa các hợp chất như phenolic, glucid hoặc các alkaloid… có tác dụng gây độc tuyến trùng và một số sâu hại khác Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng 40-60g HBJ hoặc LBJ (chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng)/m2 diệt 75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu

và cs 1993) Chất thải công nghiệp chế biến hải sản như vỏ tôm cua cũng được xử lý

và bón vào đất do chúng chứa chất chitin cũng có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của nấm, hay đặc biệt là một sô loài Actinomycestes là vật hại đối với tuyến trùng trong đất Trong quá trình phân giải các chất hữu cơ bởi vi sinh vật đất một số độc tố được giải phóng có khả năng giết chết tuyến trùng thực vật Ngoài ra còn kích thích các loài nấm có enzyme phân giải phất chitin, có khả năng tấn công lớp vỏ trứng bằng chitin của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Các biện pháp vật lý

Cũng như tất cả các cơ thể sống khác, tuyến trùng có sức chống chịu hạn chế đối với các ứng suất (stress) vật lý vượt quá sức chịu đựng của chúng Phương pháp phòng trừ vật lý áp dụng theo nguyên tắc này Tuy nhiên khi ở trong mô thực vật tuyến trùng thường chống chịu tốt hơn với các ứng suất vật lý hay các thay đổi môi trường khác Một hạn chế nữa là khả năng chống chịu nhiệt giữa mô thực vật và tuyến trùng chỉ sai khác nhỏ

Lợi ích lớn của biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng là không để lại dư lượng, độc tố như thuốc hóa học Bản chất của các biện pháp vật lý là phòng trừ tuyến trùng bằng xử lý nhiệt Tuyến trùng nhìn chung rất mẫn cảm với nhiệt Hầu hết tuyến trùng chết ở nhiệt độ cao trên 60°C Phương pháp vật lý được áp dụng rộng rãi bằng nhiều biện pháp khác nhau như: xử lý khói, dùng hơi nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng bằng nhiệt điện, bằng nhiệt vi sóng, đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt, chiếu xạ… (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Biện pháp sinh học

Tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn, nấm, Rickettsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng

Phòng trừ sinh học nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa

ra đồng ruộng và phòng trừ sinh học tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn

có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng Hiện tại, biện pháp phòng trừ sinh học chưa thay thế thuốc hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất Tuy nhiên, PTSH rất phù hợp trong hệ thống quản lý tổng hợp tuyến trùng (Perry và Moens, 2013)

Một số tác nhân sinh học sử dụng trong phòng trừ sinh học:

Vi khuẩn:

Hầu hết các vi khuẩn gây trở ngại cho hoạt động sống tuyến trùng từ nguồn dinh dưỡng hoặc sinh sản gián tiếp bằng cách sản xuất kháng sinh, enzym hoặc chất độc Nhiều sản phẩm, chẳng hạn như axit béo dễ bay hơi và các chất đạm, được hình thành bởi vi khuẩn trong quá trình phân hủy các chất hữu cơ và có thể ảnh hưởng đến tuyến trùng tuyến trùng trong đất và vùng cận rễ Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ thông qua việc nuôi cấy thu nhận chất chuyển hóa của chúng nhằm phát hiện ra vi khuẩn có đặc tính đối kháng mạnh như Burkholderia spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp và Agrobacterium radiobacter có thể làm giảm sự xâm nhập của tuyến trùng vào rễ gây thông qua việc tác động đến sự nở và di chuyển tuyến trùng hoặc có thể tạo ra sự đề kháng của thực vật Một số vi khuẩn này cũng là vi khuẩn tăng trưởng thực vật (Perry

và Moens, 2013)

Vi khuẩn Pasteuria penetrans: có khả năng ký sinh bắt buộc lên ấu trùng tuyến trùng khi tiếp xúc các bào tử của chúng dính vào lớp biểu bì và khi nở chúng đâm thủng vách biểu bì của tuyến trùng, giải phóng các khuẩn lạc dinh dưỡng, các khuẩn lạc này tiếp tục vỡ ra, sinh sôi nảy nở và chiếm ưu thế trong khoang cơ thể tuyến trùng làm cản trở sự sinh sản của chúng, từ đó làm giảm mật độ tuyến trùng trong đất (Chen và Dickson, 1998)

Vi nấm:

Một số nấm là ký sinh bắt buộc cần tuyến trùng để tồn tại, một số khác là ký sinh không bắt buộc Nấm Nematophagous có thể dễ dàng phân chia thành những có tăng trưởng nấm lớn bên ngoài vật chủ, chẳng hạn như bẫy tuyến trùng

Purpureocillium lilacinus (Paecilomyces) và Pochonia chlamydospora được nghiêm cứu nhiều nhất về khả năng phòng trừ tuyến trùng của chúng Chúng có tính chất kí sinh lên trứng, tuyến trùng cái bất động như Meloidogyne spp Nấm tồn tại trong đất như một tác nhân điều hòa mất độ quần thể, kiểm soát sinh học trong chiến dịch quản lý dịch hại

Nấm bẫy: làm bất động tuyến trùng bằng cách sử dụng các bẫy không dính hoặc cấu trúc dính thường được tạo ra trên sợi nấm trước đó Ví dụ, Arthrobotrys dactyloides sử dụng vòng thuôn, Dactylella candida làm cho các vòng không co và các nút kẹp, Monacrosporium cionopagum hình thành nên các nhánh keo và một

mạng lưới keo hai chiều, trong khi M ellipsosporum bẫy tuyến trùng với nút hoặc keo dính có thể tạo thành các vòng lặp bắt tuyến trùng (Perry và Moens, 2013)

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Đã có nhiều hướng nghiên cứu phòng trừ tuyến trùng như Loewenberg J R và

cs (1960) cho thấy rằng ảnh hưởng của chất khoáng và pH, ở pH = 6,5 sự nở trứng được kích thích và tăng sự sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita Trong nghiên cứu của Nitao và cs (1999), tác động dịch lọc nuôi cấy 3-7 ngày tuổi từ nấm Fusarium giảm được sự nở trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita còn 5,6% Khan

và cs (2010) sử dụng dịch lọc nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis với nồng độ 50% gây chết 100% ấu trùng sau 1 ngày thử nghệm trong mô hình phòng thí nghiệm Tác nhân nấm Verticilium chlamydosporizkrn kiểm soát sinh học Meloidogyne arenaria của Frans và cs hiệu quả làm giảm hơn 80% tuyến trùng ở thế

hệ đầu tiên nhưng không kiểm soát được ở thế hệ tiếp theo Sử dụng Oxalic Acid từ Aspergillus niger F22 nhằm kiểm soát sinh học Meloidogyne incognita của Jang J

Y và cs (2016) với nồng độ 2 mmol/L oxalic acid kết quả làm chết 100% ấu trùng sau 1 ngày và ức chế nở trứng 95,6% sau 7 ngày Ngoài ra còn nhiều các nghiên cứu khác như thử nghiệm hoạt dịch lọc từ nấm Beauveria bassiana làm thuốc trị tuyến trùng của Zhao D và cs (2013) Hay các nghiên cứu hướng phân lập chủng Paecilomyces lilacinus bản địa có hoạt tính kháng Meloidogyne incognita của Pau C

G và cs (2012)

Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nước cũng đã có các hướng nghiên cứu về thành phần tuyến trùng gây hại trên cây hồ tiêu tại Quảng trị của Trần Thị Thu Hà và cs (2012) xác định được

12 giống tuyến trùng trong đó Meloidogyne sp rất phổ biến, tuyến trùng Pratylenchus

sp và Tylenchus sp phổ biến, còn 9 giống tuyến trùng khác là ít phổ biến Hay những ảnh hưởng của tuyến trùng Pratylenchus coffeae đối với một số cây trồng của Nguyễn Thị Tiến Sỹ và cs (2015) cho thấy tuyến trùng không thể xâm nhập, ký sinh vào cây Đều (Anacardium occidentale L.), có khả năng ký sinh trên Sầu riêng (Durio zibethinus L.), Hồ tiêu (Piper nigrum L.) nhưng khả năng sinh sản rất thấp ít ảnh

hưởng đến cây, nhưng loài này lại ký sinh và phát triển trên cây Bơ (Persea americana Mill.), hay nghiên cứu phân lập dòng vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh tuyến trùng bứơu rễ Meloidogyne spp ở cây hồ tiêu của Vy Thị Mai Trâm và

cs (2015) kết quả thu được 30% tuyến trùng cái được xác định có sự hiện diện của bào tử vi khuẩn vi khuẩn Ngoài ra còn có các nghiên cứu sử dụng thực vật bánh dầu neem (Azadirachta indica A Juss) trong phòng trừ tuyến trùng của Dương Đức Hiếu

và cs (2014), Nguyễn Ngọc Châu và cs (1996) sử dụng thuốc thảo mộc HBJ, LBJ (chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng) trong phòng từ tuyến trùng gây bệnh sần rễ hồ tiêu (Meloidogyne incognita) Sàng lọc và đánh giá khả năng đối kháng của một số chủng vi nấm đối với tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây hồ tiêu của Đỗ Thị Kiều An và cs (2015)

PHẦN II

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) được biết đến như một cây trồng thu quả, quả của chúng sấy khô để làm gia vị Bên cạnh đó còn là một trong những cây thuốc, vị thuốc chữa bệnh có công dụng kích thích hệ tiêu hóa, giảm đau (Đỗ Tất Lợi, 2004) Hạt tiêu được coi là "Vua của gia vị" do việc thương mại của nó trên thị trường quốc tế (Srinivasan, 2007, Mathew và cs 2001) Tại Việt Nam, Hồ tiêu một trong những cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu lớn hàng đầu thế giới đem lại lợi ích lớn về kinh tế Theo Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam báo cáo cuối năm 2016 nước ta đã xuất khẩu một khối lượng tiêu kỷ lục nhất từ trước tới nay, kim ngạch xuất khẩu đạt 1 tỷ 439,87 triệu USD, trong đó tiêu đen đạt 1 tỷ 215,36 triệu USD, tiêu trắng đạt 224,51 triệu USD (Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2017)

Tuy nhiên, việc giữ được sản lượng chất lượng nông sản hằng năm ở mức ổn định còn gặp nhiều thách thức do thiên tai, khí hậu hay xuất hiện nhiều bệnh hại Trong đó đáng chú ý là bệnh sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne spp gây nên, ngoài tác nhân gây bệnh trực tiếp cho cây thì việc tuyến trùng xâm hại làm tổn thương mô thực vật tạo điều kiệu cho các loại nấm khác tấn công (Luc và cs., 1990) Phòng trừ tuyến trùng hiện nay người nông dân thường vẫn dùng biện pháp hóa học chủ yếu để

có hiệu quả, nhanh Tuy nhiên, hệ lụy của việc lạm dụng hóa học làm giảm đa dạng

hệ sinh thái nông nghiệp, dịch hại phát sinh tràn lan, ảnh hưởng đến sức khỏe con người Hơn hết việc tồn dư chất bảo vệ thực vật trong sản phẩm làm cho hồ tiêu không xuất khẩu được sang các thị trường khó tính là điều khó tránh khỏi Tiêu biểu năm

2015, tại Châu Âu có nhiều lô hàng xuất khẩu tiêu của doanh nghiệp Việt Nam bị đối tác trả lại, trong đó chủ yếu là tiêu thô (chiếm 85%) Nguyên nhân do không bảo đảm

an toàn vệ sinh thực phẩm – với nhiều gốc hóa chất nguy hại cho sức khỏe, đặc biệt tồn dư hoạt chất carbendazim (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, 2016) Nhằm khắc phục vấn đề trên các sản phẩm nguồn gốc từ những cây trồng hoang dại đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc trong phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn độ (Melia azedarach), cây Thầu dầu (ricinus communis), rễ cây ruốc cá, hạt và lá cây Sầu đâu rừng ở Việt Nam (Brucea javanica) do chúng có chứa các hợp chất như phenolic, glucid, alkaloid… có tác dụng gây độc diệt tuyến trùng hay một

số sâu bênh gây hại khác (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Và có các nghiên cứu về việc

đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ các loại hạt hay lá cây Neem, cây họ đậu, họ cúc… lên tuyến trùng gây hại trên cây cà chua như của Taye và cs (2012) hiệu quả

sử dụng hạt neem nồng độ 3% làm giảm 38% mật độ tuyến trùng, El-Nagdi và cs (2013) đã sử dụng dịch củ tỏi nảy mầm và hạt thầu dầu hiệu quả giảm khoảng 70% nốt sần trên rễ và giảm cao nhất 55% tuyến trùng trong đất

Bên cạnh việc sử dụng thực vật, hiện nay trong và ngoài nước đã có nhiều hướng nghiên cứu về phân lập, đánh giá khả năng đối kháng sinh học tuyến trùng Meloidogyne spp từ các chủng vi khuẩn như trong nghiên cứu trên mô hình phòng thí nghiệm và nhà lưới trên cây đậu xanh của Khan và cs (2010) sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis gây chết 100% ấu trùng sau 1 ngày thử nghệm, giảm 51% nốt sần rễ so với đối chứng ở mô hình nhà lưới , Ni Xiang và cs (2017) sử dụng những

vi khuẩn vùng rễ cho thấy hiệu quả tỷ lệ tử vong của Meloidogyne incognita J2 dao động từ 0% đến 100%, trung bình 39% Hay hiệu quả từ vi nấm Paecilomyces spp trong nghiên cứu của Pau và cs (2012) kết quả 66-78,8% trứng bị nấm ký sinh, ức chế trứng nở 88-89% so với đối chứng 26%, Trong số 21 chủng nấm Trichoderma thử nghiệm, 66,7% chủng có khả năng ký sinh tuyến trùng (Đỗ Thị Kiều An và cs , 2015) … Cho thấy việc sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học trong nông nghiệp hiện nay đang rất được quan tâm

Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu của một số chủng vi khuẩn,

vi nấm và thực vật tiềm năng” nhằm xây dựng một bộ sưu tập các chủng vi sinh vật tiềm năng cho sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng trên cây tiêu, hướng đến nền nông nghiệp hữu cơ và là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn Mục tiêu:

Tuyển chọn, đánh giá những chủng vi khuẩn, vi nấm, thực vật có khả năng đối kháng tuyến trùng gây nốt sần ở rễ gây hại trên cây hồ tiêu

Các mục tiêu cụ thể như sau:

 Tái phân lập 20 chủng vi khuẩn, 2 chủng vi nấm tiềm năng từ bộ sưu tập phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM

 Phân lập các chủng vi nấm tiềm năng đối kháng tuyến trùng

 Thu nhận, tạo nguồn tuyến trùng Meloidogyne sp

 Sàng lọc các chủng vi khuẩn, vi nấm tiềm năng đối kháng tuyến trùng có khả năng kiểm soát sự nở của trứng, kiểm soát đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2

 Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn, vi nấm, dịch chiết thực vật đến

sự nở trứng tuyến trùng và quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2

 Khảo sát khả năng kết hợp giữa các chủng vi khuẩn, vi nấm và dịch chiết thực vật trong phòng trừ tuyến trùng

 Đánh giá hiệu quả kiểm soát tuyến trùng hại rễ trên cây hồ tiêu ở quy mô nhà lưới

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 15/10/2017 đến 09/01/2018 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

Mẫu rễ bệnh tuyến trùng thu thập tại xã Đắk R'Tih, Huyện Tuy Đức, Đắk Nông

3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG

 Becher

 Erlen

 Ống đong

 Phễu

 Đũa thủy tinh

 Que cấy, que cấy trang

 Đèn cồn

 Eppendorf

 Bình serum

Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm

Môi trường: PDA, NA

Thuốc nhuộm: thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), safranin O, lugol, lactophenol,

Hóa chất: NaCl, cồn 96º, cồn 70º, NaOH 2M, HCl,

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHÍNH

Tái phân lập, phân lập các chủng vi sinh vật

Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM chúng tôi tiến hành tái phân lập trên đĩa môi trường NA đối với

vi khuẩn, PDA đối với vi nấm để kiểm tra hình thái đại thể và nhuộm Gram, làm tiêu bản nấm kiểm tra hình thái vi thể

Phân lập vi nấm từ sâu nhiễm bệnh bằng phương pháp pha loãng mẫu với nước cất vô trùng hay nước muối sinh lý 0,85% sau đó cấy trang lần lượt lên môi trường PDA

Đối với vi nấm khi khóm nấm đồng nhất, chúng tôi tiến hành nhuộm nấm bằng lactophenol, định danh sơ bộ, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc và quan sát dưới kính hiển vi quang học Quan sát đại thể, vi thể theo phương pháp của Nguyễn Đức Lượng và cs (2003), làm tiêu bản nấm mốc theo phương pháp của Nguyễn Đức Lượng và cs (2011)

Thu nhận trứng tuyến trùng từ rễ cây bệnh, tạo nguồn tuyến trùng 4.2.1 Nguyên tắc

Natri hypochlorite được sử dụng để khử trùng mẫu thực vật và tách riêng lẻ trứng tuyến trùng ra khỏi bọc gelatin hay bọc trứng (Sankaralingam và cs., 1994, James K Nitao và cs., 1999, Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

- Bổ sung Natri hypochlorite 0.5% và lắc trong vòng 2 phút

- Để yên trong 30 giây để các mảnh vụn lắng xuống

- Dung dịch được lọc qua rây lọc đã hấp khử trùng kích thước lỗ 25 µm

- Rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng

- Thu lại trứng tuyến trùng trên rây vào ống nghiệm bằng nước cất vô trùng

- Sau 3-5 ngày trứng nở (Nitao và cs., 1999, Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Tạo nguồn tuyến trùng

Trứng và ấu trùng thu nhận từ phương pháp trên được gây nhiễm lại trên mẫu đất trồng hồ tiêu bằng cách đổ vào gốc để giữ mẫu cho thử nghiệm tiếp theo

Sàng lọc chủng vi khuẩn, dịch chiết thực vật có khả năng đối kháng tuyến trùng

4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng dịch chiết thực vật

Đối với dịch chiết thực vật thông qua việc thu thập dữ liệu từ các nghiên cứu cho thấy hiệu quả ức chế nở trứng, gây chết ấu trùng đến 98-100% sau 2 ngày phơi nhiễm dịch chiết từ thân và lá cây Cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) (Mohd Asif và

cs, 2017) hay dịch chiết lá cây Neem hiệu quả ức chế nở trứng 100% sau 6 ngày thử nghiệm (Muhammad Zameer Kayani và cs, 2001), dịch chiết từ hạt cây Thầu Dầu (Ricinus communis) hiệu quả tác động giảm 70,4% dấu hiệu nốt sần do tuyến trùng trên cây cà chua (El-Nagdi và cs, 2013), … Qua đó chúng tôi tiến hành đánh giá lại một số loài thực vật và không thực hiện thử nghiệm sàng lọc

4.4.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát

sự nở của trứng

Chuẩn bị dịch khuẩn: cấy dịch vi khuẩn thử nghiệm từ ống nghiệm đã nuôi cấy sang ống nước cất vô trùng hay môi trường NB, đồng nhất dịch đã pha và so với ống chuẩn 1 – 2.108 CFU/ mL, sau đó tiến hành pha loãng sao cho để được dịch khuẩn có nồng độ 1 – 2.106 CFU/ mL

Dùng pipetman hút 1mL dịch vi khuẩn thử nghiệm mật độ 1 – 2.106 CFU/ mL vào eppendorf chứa dịch 30-40 trứng (Mokbel và cs., 2014)

Tiến hành đọc kết quả sau 4-7 ngày

Cách đọc kết quả: trình bày ở phần 5

4.4.3 Thử nghiệm ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát đến quá trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 2

Chuẩn bị dịch khuẩn: mật độ 1 – 2.106 CFU/ mL thực hiện tương tự thí nghiệm Dùng pipetman hút 1mL dịch vi khuẩn thử nghiệm mật độ 1 – 2.106 CFU/ mL vào eppendorf chứa dịch 30-40 ấu trùng Tiến hành đọc kết quả sau 48h (Mokbel và

cs 2014)

Cách đọc kết quả: trình bày ở phần 5

Đánh giá khả năng đối kháng tuyến trùng của các chủng vi khuẩn, vi nấm dịch chiết thực vật

4.5.1 Đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng

Thử nghiệm ảnh hưởng của dịch lọc nuôi cấy từ các chủng vi khuẩn

Chuẩn bị dịch khuẩn: Những chủng vi khuẩn đã được sàng lọc ở thí nghiệm trước đó tiến hành nuôi lắc trên môi trường NB ở 37oC Sau 72h tiến hành ly tâm hai lần ở 3000g trong 20 phút, thu dịch qua màng lọc 0.2 μm

Cấy 1mL dịch lọc vào huyền trứng Đọc kết quả sau 24, 48, 72 và 96 giờ (Khan

và cs, 2010) phù chứa 30-40

Thử nghiệm đánh giá đặc điểm kí sinh của các chủng vi nấm

Vi nấm đã được làm thuần trên môi trường PDA, sau 3 – 9 ngày nuôi cấy, dùng que cấy có vòng 5 mm để cắt các thỏi thạch và đặt ngược vào đĩa petri chứa môi trường WA 1,5% tiến hành nuôi ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ 25oC

Nhỏ 0.03mL huyền phù chứa 80 – 100 trứng lên trên bề mặt các thỏi thạch Đọc

tỷ lệ kí sinh sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày xử lý (Nguyen, 2009) Mức độ ký sinh chia thành 4 cấp: (i) Ký sinh cao (+++): trên 80%, (ii) ký sinh trung bình (++): 50 – 80%, ký sinh yếu (+): dưới 50%, không ký sinh (-): 0% ( Đỗ Thị Kiều An và cs, 2015)

Thử nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết thực vật

Chuẩn bị dịch chiết: Ngâm 20g bột lá, hạt khô thử nghiệm với 100ml dung dịch nước cất trong bình tam giác 500ml Sau 24h ngâm, tiến hành thu dịch qua giấy lọc