Xây dựng quy trình dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện và theo dõi sự biểu hiện mrna của các gene e6 và e7 human papilloma virus

Mục tiêu: Xây dựng quy trình trên các kĩ thuật sinh học phân tử nhằm tiên liệu sự biéu hién MRNA của các gene E6 & E7 phục vụ cho mục đích chân đoán phát hiện và theo dõi tiễn trình gắn

x XÂY ĐỰNG QUY 1 TRÌNH H DỰA TREN | a0

CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ i

NHẰM PHÁT HIỆN VA THEO DOI : |

_SỰ BIEU HIỆN mRNA CỦA CÁC |

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HOC MO TP HO CHi MINH

BAO CAO TONG KET

ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CAP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH DỰA TRÊN

CÁC KĨ THUẬT SINH HOC PHAN TU

NHAM PHAT HIEN VA THEO DOI

SU BIEU HIEN mRNA CUA CAC

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA DE TAI &

ĐƠN VỊ PHÓI HỢP CHÍNH

Stt Ho va tén Don vi công tác

PHAN I TONG QUAN TAI LIEU

I BỆNH UNG THƯ CỎ TỬ CUNG -.-e «-c©5ee<=esseereeterrerre 3

II Định nghĩa Ă chinh he 3

I2 Nguyên nhân .- «sen thư 3

II HUMAN PAPILLOMA VIRUS _— ÔỎ 3

11.1 Phân loại HPV ~ Ô 3-

H2 Humam papilloma virus ở động vật - co nhhrrrrdrerrrrre 5

I3 Sự tiến hóa của HPV - ccctntHrtrrrrrrrrirrirrieririd 5

M.4 Cấu trúc vỏ capsid HPV 5

TLS Cấu trúc bộ gen HPV -ccscrrrererHHưe 5

H.6 Chức năng các gen của HPYV + cnénhhhHhHirrhHrrirrerrrriire 6

H.7 Chu trình sống của virus . cccccteeierrerrrrrrreirirrrre 8

II7.1 Tấn công — x4m nhiém vao bidu M6 oes essessseesseeesteesneesneeeeeennneen 8

11.7.2 Virus hoạt động trong tê bào chủ ‹ - che 9

H.7.3 Sự sinh sản virus trong tê bào chủ «em 9

IL7.4 Diễn tiến hình thành khối u ác tính . -+ccsecstererrerrrre 9

II TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỎ TỬ CUNG . -° 13 TIL Tình hình trên thế giới -:-5-55+vcterterrerttrrrrrrtrtrrrirrriririie 13

IV PHUONG PHAP CHAN ĐOÁN UNG THƯ CỎ TỬ CUNG 15

IV 1 Chẩn đoán lâm sàng . .¿ + 52ttrétthrrtettitrrrrrrrrrrrriirie 15

IV.2 Các phương pháp chân đoán ở phòng thì nghiệm . 15

IV.2 1 Xét nghiệm tế bào học -cccscttrrerrrrirrririirrrrrrrie 15 IV.2.2 Xét nghiệm tim HPV DNA ào 17

IV.2 3 HPV DNA Hybrid Capture (H2 test) . ‹ - sen ae 7

CHẮN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỎ TỬ CƯNG . -c-ssescseseerereee 17 V.1 Nguyên tắc phương pháp PCR . - " 17 V.2 Các thành phần trong phản ứng PCR 5:-55ccccserterrreriirrrrrree 18

V.3 Phương phap Reverse transcriptase — PCR .csecsesseserseeseetsterteteeneesenees 20

V.4 Phương pháp Real tìme PCR ¬ 20

V.4.1 Nguyên tc ìì cniienrirrririiriirerrirrrrrirrrrrdrrirrrrrrriniiirriiml 20

V.4.2 Các thuật ngữ trong phương pháp Realtime PCR . 21

V.4.3 Các loại mẫu dò (probe) trong phương pháp Realtime-PCR 21 V.5 Kỹ thuật Realtime PCR va RT- PCR trong chân đoán ung thư 26

PHẢN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

LL Vật liệu — hoá chất cscccctihertrretrirrtrriiirrrriiiiirrerrriee 27

1.1.2 Hod chat tach chiét RNA vccccccccsssessessessestecesesensenesssneatssssecsseseenseneess 27 11.3 Hoá chất trong một phản ứng PCR -ccccccccsexieriee 27

1.1.4 Hoá chất dùng cho điện di trên thạch agarose và thang DNA 28

II PHƯƠNG PHÁP sossnvsssscnssennnnnossecsesensnnanasesecs 29

II.1 Phương pháp thiết kế mồi -555222tretrtrrttrrrrttrrrtrirrrrrriee 29 II1.1 Các phần mềm sử dụng . :-55¿©cscsxerrrerrrrtrirerirrrrrrrie 29 11.1.2 Phương pháp tiến hành -ccxrrserrrrrriietrrtrrierrrriee 30 I2 Phương pháp tách chiết RNA -cccccsertrrtrrterrrrrtrrrrririe 30 IL2.1 Nguyên tắc eeceerrrerrerrrrree _ tr 30

iii

11.2.2 e0 ốc ng ảẶỪš⁄:: 3]

I.3 Phương pháp Real time RT-PCR - ccèhheHhrrrmrrrrre 32 II3.I Nguyên tắc " 32 11.3.2 Cách tiến hành phản ứng Real time RT - PCR - 32

PHAN III: KET QUA VA THAO LUAN | | I THIET KE HE HE PRIMER - PROBE CHO GEN E6 VÀ E7 33

Ll Thiét ké hé méi-mau do trén gen E6, E7 cho HPV type l6 - 33

[2 Đánh giá hệ mỗi-mẫu dò trên gen E6, E7 cho HPV type lồ_ 33

I3 Thiết kế hệ mỗi-mẫu dò trên gen E6, E7 cho HPV type I8 35

I4 Đánh giá hệ mỗi-mẫu dò trên gen E6, E7 cho HPV type l8 36

II KET QUA THIET KE CHUONG TRÌNH REALTIME RT PCR 37

II.1 Xây dựng quy trình Realtime RT-PCR -cccceetrrrrrrrer 38 IL1.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mỗi-mẫu dò của gen E6, E7 HPV type 16, fype l8 -eeerrerrrrrrrrrrrrrre 38 II.1.2 Kết quả tách chiết RNA -ccccsrrerrrrrtrrtrrritrrrrrrirrrrrrie 39 IL1.3 Khảo sát độ nhạy của hệ mỗồi-mẫu dò -c-ccccecsereertereerrrree 42 ' ILI.4 Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mỗồi-mẫu dò -ccsctserserrree 44 IIL2 Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm . - 47 PHẢN IV KẾT LUẬN & ĐÈ NGHỊ

I KẾT LUẬN e eeeeeseeesersersttrsttrrrtieerrrriierireirriie 50

PHAN V: SAN PHAM KHOA HOC VA DAO TAO .-eseeseeseseeee 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO -csc©cssseerxstetrteetrerreriirrriiriirriirn 52

iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang Hình 1 : Sự hình thành ung thir CỔ (Ữ' CHH cà cee<Ăseeeesesrsrsrsesesesrrrerereee ty 0n 109998568198 3

Hình 2: Virus HPV tppe l6 e es-eeeereeeetreertrtreriierriirtrrirrriiiirirrirriiiririirie 4

Hình 3: Cầu trúc bộ gen HPV tppe l6 - -«eeeeeereereereetrerrrr Seeee.Ổ

Hình 4: Chức năng các gen của HPỨ eeeeeeeseseseseesesetrtrtrsrsrinsrsrerrrse 7 Hình 5: Quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ và gây bệnh của HPV -.-.«-«« 10

Hình 6: Quá trình tiến triển hình thành khỗi u do protein E6 và E7 . «««eeee= Il

Hinh 7: Ban dé biéu dién phan bố tỷ lệ bị ung thư CTC trên thế giới .«-«eeses 14 Hình 8: Cỗ tử cung cĩ thương 7 PEEEEEE 11 16 Hinh 9: Phuong phap xét nghiệm tẾ bào CỔ fÍ' CHHẸ -.-c<c<esesesesssssseereestsesrrrrrrn 16 Hình 10: Sơ đồ tĩm tắt phương pháp Readltime PCR ` ào 21 Hình 11: Nguyên tắc hoạt động của Molecular DeqCOHH .«eee««eeeeeeeeeseeeeeeeeseetttrttrereree 22 Hình 12: Nguyên tắc hoạt động của SyBr GT€€H ««eseeeseiesirrerrresrrrrrrse ven 23 Hình 13: Nguyên tắc hoạt động của Hybridisation prole «.-««eeeeeeeeereeersererrterrrre 24 Hình 14: Nguyên tắc hoạt động của TaqimaH prÓ€ ‹.e«eeeceeeceseeneeeerseeeirtersrrrtrrerrere 25

""“ ẽ.ẽ na Ĩ, 28

Hình 16: Chương trình luân nhiệt của phân ting Rea time RT PCR «s<5=« 32

Hình 17: Kết quả đánh giá mỗi và mẫu dị trên gen HPV type I6 bằng Annhiyb 34 Hình 18: Kết quả đánh giá mỗi và mau do trén gen HPV type 18 bằng Annhyb 37

Hình 19: Chu trình luân nhiệt của phản ứng ĐĨ «e-eeeeeeseeseersrrtrrtrrrrnrrrree 37 Hình 20: Chu trình luân nhiệt của phản ứng Real time PC «« «=seeeeeeeeesee 38

Hinh 22: Két qua kiém tra quy trinh tach chiét RNA

trên 5 mẫu dương tính với HPV (ype ÏỐ -«««seeeeseeeeeererererrrrnrsrrrsresrrrrrrrinnrresee 40 Hình 23: Sơ đồ quy trình xử lý DNase — ố 4I

Hình 24: Kẵ quả Real - thue PCR trên mẫu bệnh phẩm C

sau khi xử lý với DINAS€ Ï .ececeseseeeeessseeineieniiiei1010010001101000100 Hình 25a Kết quả khảo sát độ nhạy của mỗi và mẫu dò

trên gen E6 và E7 của HP lố «.eeeeeesesseesesseseteeserersesiriierersnee

Hình 25b Kết quả khảo sát độ nhạy của môi và mẫu dò |

trên gen E6 và E7 của HPV l8 .- «-«esseseesersersersere sesssesecenenensaseeoes -

Hình 26: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ môi và mẫu dò

trên gen E6 HPV (ype ÏTỐ «-<eessesseseesessesissesersessee 99198818310100181010100104001080058

Hình 27: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi va mau do

trên gen E7 HPV {ype ÏỐ «-««-<==eeseseeeeeesrstsesirsrsessesieiriii100111011101011

Hình 28: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ mỗi và mẫu dò

trên gen E6 HPV type Ïổ «seeeseesseeseresetsessee H0000131100100100010000010000104

Hình 29: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ mỗi và mẫu dò

trên gen E7 HP (p€ TỔ o-«=°<ss se sShseEsteirsesissssiseriseeiei01010101510 Hình 30a Kết quả xác định kiểu gen |

bang PCR reverse dot blot trên mâu bệnh phẩm SỐ Ì «ce«eeeeesesenenseeeeesre Hình 30a Kết quả xác định kiểm gen

- bằng PCR reverse dot blot trên mâu bệnh phẩm số Õ .- —

vi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1 : Một số type HPV ở động vậi «-«eeeceeesseeeeerieirrrrririiiiiiiirste 5

Bang 2: Tỷ lệ nhiễm HPV ở những độ tuổi khúc nhau L9 980 00094 00 60015088000006009099998 13

Bảng 3: Trình tự của hệ mỗi và mẫu dò trên gen E6 của HPV type l6 33

Bảng 4: Trình tự của hệ môi và mẫu dò trên gen E7 của HPV type lố ««- 33

Bang 5: Trinh tw của hệ mồi và mẫu dò trên gen E6 của HPV type Tồ -« 36

Bảng 6: Trình tự của hệ môi và mẫu dò trên gen E7 của HPV type lồ 36

Bang 7: Kết quả chay Real - time PCR trén 5 mẫu dương tÍHÌ -«-«eeesesesssses 39 Bang 8: Kết quả xử lý mẫu C với ensyme DÌNase Ï - T01 01905896009 9 9805005560 41

Bảng 9 Kết quả khảo sát bằng các phương pháp tế bào học

và sinh học phân tử trên 10 mẫu bệnh phẩm điên Ninh sree 47 Bảng10: Kết quả khảo sát bằng các phương pháp

sinh học phân tử trên 28 mâu bệnh pHẨHH ««ceeeeeneeenreesrerrreiiiisesrsrere 46

vi

DANH MUC CHU VIET TAT

Antigen —presenting cell Basic Local Alignment Search Tool

base pair |

complementary DNA cervical intraepithelia neoplasia Cytomegalovirus

Cycle Ti hreshold

Cổ tử cung DNA Data Bank of Japan Diethylpyrocarbonate dimethylsulfoxide deoxyribonucleic acid deoxynucleotide triphosphates early

ethylenediaminetetraacetic acid European Molecular Biology Labolatories

-episome

The US Food and Drug Adminitration Fluorescent Resonance Energy Transfer Hepatitis B virus

Hybrid capture 2 Hepatitis C virus Human papilloma virus high risk

high squamous intraepithelial lession Human Telomerase Reverse Transcriptase International Agency for research on cancer late

Long control region viii

Open reading frame Pap’smear Papanicolaou smear

ix

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THONG TIN KET QUA NGHIEN CUU

1 Thong tin chung:

- Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH DỰA TRÊN CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHAN TU NHAM PHAT HIEN VA THEO DOI SU BIEU HIEN mRNA CUA CAC

GENE E6 & E7 HUMAN PAPILLOMA VIRUS

- Mã số:

- Chủ nhiệm: ThS.Trương Kim Phượng

- Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ Sinh học Trường ĐH Mở TP.HCM

- Thời gian thực hiện: 12 tháng

2 Mục tiêu:

Xây dựng quy trình trên các kĩ thuật sinh học phân tử nhằm tiên liệu sự biéu hién MRNA của các gene E6 & E7 phục vụ cho mục đích chân đoán phát hiện và theo dõi tiễn trình gắn chèn và biểu hiện của hai oncogene này ở các bệnh nhân nhiễm HPV và diễn tiến ung thư cổ tử cung

3 Tính mới và sáng tạo:

Đề tài là những bước đầu tạo cơ sở cho việc xây dựng bộ kít với mục đích tiên lượng và theo dõi sự tiến triển ung thư cổ tử cung dựa trên sự biểu hiện của các mRNA của các

gene E6, E7

4 Kết quả nghiên cứu:

Bước đầu chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện và định lượng

sự biểu hiện của mRNA E6, E7 có trong mẫu bệnh phẩm (đã có kết quả dương tính với Pap’smear) bằng ky thuat Realtime RT PCR Hé mỗi-mẫu dò đặc hiệu cho gen E6 và E7

type 16; 91 bp đối với gen E7 type 16; 150 bp đối với gen E6 type 18 và 105 bp đối với gen E7 type 18 Quy trình được thử nghiệm trên hai lô bệnh phẩm được xác định có nhiém HPV type 16 hoac type 18 Kết quả ghi nhận được có sự gan chén oncogene E6, E7 của HPV type 16, 18 trên bộ gen người Bên cạnh đó, số lượng bản sao mRNA E6 và E7 của hai type 16, 18 dao động trong khoảng từ 102-— 107, cho thấy khả năng bệnh nhân đang bị ung thư hoặc tế bào đang bị tốn thương ở mức độ cao là rất lớn

5 San phẩm:

Tai quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện của mRNA E6, E7 có trong mẫu bệnh

hâm của HPV type 16 va 18

Hiệu quả, phương thức chuyền giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Jới những kết quả đạt được ban đầu, chúng tôi thiết nghĩ hai quy trình Realtime PCR

ày cần được thử nghiệm với số lượng bệnh phẩm lớn hơn để có thê ứng dụng chúng vào hực tế trong việc phát hiện sớm nguy cơ bị ung thư cô tử cung -

‘6 thể chuyển giao các quy trình Realtime PCR này cho các công ty chuyên sản xuất, ảinh doanh các bộ kit sinh học phân tử (công thương mại, dịch vụ và sản xuất Việt A )

“ac b6 kit nay sé cung cấp cho các.phòng xét nghiệm của các bệnh viện, trung tâm y tế

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: ESTABLISHMENT ASSAY BASED ON MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN ORDER TO QUANTITATIVE DETECTION mRNA E6/E7 ONCOGENE HUMAN PAPILLOMA VIRUS

Code number: |

Coordinator: TRUONG KIM PHUONG

Implementing institution: Department Biology Technology- Open University, Ho Chi Minh City

Duration: from to

2 Objective(s):

We aimed to establishment the assay based on molecular biology techniques in order to foresee the expression of \mRNA E6 & E7 oncogene for diagnostic, detection and monitoring the process of inserting and expressing E6 & E7 oncogene for HPV- infected patients and and progression of cervical cancer

3 Creativeness and innovativeness:

The present study is the initial research base of developing cervical cancer test kit -

4, Research results:

We achieved inital success for developing the assay based on Real time —PCR techniques

on in order to quantitative dectection of expressing mRNA E6, E7 from Pap smear positive samples Single amplicons are 81bp from E6 gene of HPV type 16, 91 bp from E7 gene of HPV type 16; 150 bp from E6 gene of HPV type 18 and 105 bp from E6 gene

of HPV type 18 The assay was tested on two lot of Pap smear positive sample The result was recorded the insertion of E6, E7 oncogene HPV type 16, 18 into the human genome

In other hand, mRNA E6 & E7 oncogene copy number fluctuated between 102 and 107 which showed the high possibility of cervical cancer in these patients or cells were badly injured |

5 Products:

Two quantitative dectective protocols for expressing mRNA E6, E7 from Pap smear positive samples

6 Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:

In the present study, two Realtime — PCR protocols have to tested on a large quantity of clinical sample, we possible to use the assay for the purpose of early detection the risk of cervical cancer

xi

The Realtime PCR protocols may be assigned to companies such as Viet A commercial, | manufactoring and services company that supply the laboratory of hospitals, health

centers with molecular kits for diagnosing dangerous diseases such as cervical cancer

xHI

MO DAU

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư cổ tử cung là căn bệnh nguy hiểm,

có thể gây tử vong đứng hàng thứ hai đối với phụ nữ trên toàn thế giới Đây là dạng ung thư nếu được phát hiện sớm, kịp thời sẽ có thể được điều trị khỏi bệnh Ở Việt

Nam, tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh ung thư cổ tử cung là là 20.3 trên 100.000 phụ

nữ

Một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh ung thư cổ tử cung là Human papilloma virus (HPV) Virus HPV được phân thành hai nhóm chính là nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp Trong các type nguy cơ cao, HPV type l6 và l§ là các

type được đánh giá là nguy hiểm nhất, có sự liên quan chặt chẽ với các diễn tiến bệnh

ung thư cổ tử cung ở các bệnh nhân khi bị nhiễm HPV

Trong những trường hợp tốn thương thông thường, virus HPV ở dạng vòng và không gắn chèn vào bộ gen tế bào chủ Ngược lại, ở những trường hợp khối u ác tính,

có sự gắn chèn các đoạn gen virus HPV vào bộ gene người Các đoạn gen của HPV

luôn giữ lại vùng mã hóa và điều hòa các gen Eó, E7 Hai oncogene này mã hóa cho hai protein liên kết với các protein p53, pRb dẫn đến ảnh hưởng sự điều hòa chu trình phân bao apoptosis

Vì vậy, việc theo dõi tiến trình gắn chèn hai ‘oncogene E6 và E7 vào bộ gen

người được xem là một dạng công cụ hữu ích giúp tiên đoán khả năng tiễn triển ung

thư Điều này có ý nghĩa hỗ trợ cho các bác sĩ trong việc chẩn đoán sớm, kịp thời đi

và can thiệp, có các phương pháp trị liệu phù hợp giúp kéo dài đời sống, và tăng khả năng phục hồi hoàn toàn đối với những bệnh nhân bị bệnh ung thư cô tử cung Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài: “Xây dựng quy trình dựa trên các kỹ thuật

sinh học phân tử nhằm phát hiện và theo dõi sự biểu hiện mRNA của các gen E6

và E7 Human papilloma virus”

1 Mục tiêu nghiên cứu:

Mục tiêu đề tài nghiên cứu nhằm tập trung xây dựng quy trình Realtime RT -

PCR dé theo đõi sự biểu hiện hai oncogene E6, E7 ở mức mRNA đối với các bệnh

nhân nhiễm HPV va diễn tiến bệnh ung thư cô tử cung

2 Phạm vi nghiên cứu:

- Thiết kế hệ mỗi và mẫu dò cho hai oncogene E6, E7 của type HPV l6 và

type 18

- Khảo sát độ đặc hiệu và các thông số của các hệ mỗi và mẫu dò trên máy

tính: chiều đài, thành phần nucleotide, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp

- - Xây dựng quy trình Realtime RT- PCR

- - Thử nghiệm quy trình trên các mẫu bệnh phẩm

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử ~ Trường Đại học

Mở TP.HCM và Công ty Cổ phần Thương Mại Sản xuất và Dịch vụ Việt Á

PHAN I TONG QUAN TAI LIEU

I BENH UNG THU CO TU CUNG

I1 Định nghĩa

Cổ tử cung là vùng hẹp nằm bên dưới tử cung và bên trên âm đạo Bao gồm cổ

ngoài và cỗ trong Bệnh ung thư cô tử cung (CTC) là dạng bệnh hình thành khối u ác tính tại cổ tử cung, xuất phát từ các tế bào biểu mô lát tầng không hóa sừng (tế bao gai) ở vùng chuyển tiếp giữa biểu mô lát ở vùng cổ ngoài và biểu mô trụ tuyến ở cổ

i Sự hình thành tế bào bất thường tiên triển ung

thư cô tử cung

Hình 1 : Sự hình thành ung thi cô tử cung [32]

Ghi chú: Giai đoạn 1 -Giai đoạn sớm ; Giai đoạn 2 -Giai đoạn giữa ; Giai đoạn 3 — Giai đoạn muỘn

I2 Nguyên nhân

Đa số các trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung đều do Human papilloma virus (HPV) gây ra Đáng chú ý là thuốc là, rượu làm tăng tý lệ nhiễm HPV qua đường miệng Những nguyên nhân khác gây ra bệnh ung thư này chưa được xác định rõ.[ 23,

24, 32,36, 37]

Il HUMAN PAPILLOMA VIRUS

II.1 Phân loại HPV [2, 20, 30]

Human papilloma virus thuộc họ Papillomaviridae, gồm những Virus không có

vỏ bao, cấu trúc capsid đa diện HPV có bộ gene là chuỗi DNA xoắn kép, tồn tại ở

episome dang vòng [2, 9, 14, 20, 30]

Hinh 2: Virus HPV type 16 [3636]

Virus HPV được phân loại dựa vào khả năng gây ung thư, hiện nay có hơn 100 type HPV gồm những type không có triệu chứng bệnh ở người, những type gây ra những căn bệnh ung thư HPV được xếp vào các nhóm như sau:

- Nhóm type nguy cơ cao (high — risk typ€): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35,

39, 45, 50, 53, 55, 56, 59, 64, 66, 68, 73, 82 Cac type nay có khả năng gây ung thư

cao, thường liên quan đến loan san va ung thu CTC.[8, 10, 14, 30]

Nam 1976, Harald zur Hausen đã đưa ra giả thuyết virus HPV là tác nhân chủ yếu gây ra bệnh CTC Năm 1983 đến 1984, zur Hausen và các cộng sự đã tìm thấy HPV type 16 và 18 trong các bệnh nhân ung thư cô tử cung.[24]

: Nhóm type nguy cơ cao có thế dẫn đến sự loạn sản, hình thành khối u ở cỗ tử

cung (cervical intraepithelia neoplasia- CIN); khối u ở âm hộ (vulva intraepithelia

neoplasia- VIN) [24]

- Nhóm type nguy cơ thấp (low — risk type): gồm các type 6, 11, 26, 42, 44, 54,

70, 73, it có khả năng gây ung thư, chỉ gây ra các mụn cóc vùng sinh dục, hoặc các bat thường tế bào CTC, hoặc có thể không biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lâm

sàng [14, 24]

- Type nguy co trung gian (intermediate — risk): gồm các type 51, 52 thường là

các type ôn hòa hoặc gây ra các dạng tế bào bất thường, ít xảy ra ung thư [14, 24]

Trong các type nguy cơ cao, HPV type 16 va HPV type 18 1a hai type co lién

quan cao nhất đến các bệnh ung thư (khoảng 70% trường hợp mắc bệnh) [14]

Tuy nhiên, HPV type l6 được tìm thấy phổ biến nhất trong hơn 50% các trường hợp bị ung thư ở biểu mô, màng nhảy, cô tử cung HPV type 18 được tìm thay trong hơn 50% các trường hợp bị ung thư tuyến [14]

II2 Human papilloma virus ở động vật

Nhiều type HPV thích ứng cao đối với cơ thể các loài động vật như thỏ, chuột,

và bò [30]

- Bảng I : Một số type HPV ở động vật

I3 Sự tiến hóa của HPV: [3030]

Sự tiến hóa của papilloma virus chậm hơn so với các loại virus khác Nguyên

nhân có thể là do bộ gen của chúng là DNA mạch đôi được sao chép chính xác bằng

bộ máy sao chép thông tin di truyền của tế bào chủ Điều này cho thấy chúng có sự tương tác lâu đài trong nhiều năm với tế bào chủ Type HPV 16 có khả năng lan truyền nhiều vùng trên thế giới dựa vào sự xâm nhiễm lâu dài vào những người di cư

I4 Cấu trúc vô capsid HPV

Virus HPV là nhóm virus không có màng bao, có vỏ capsid đa diện với kích thước 60nm, bao gồm khoảng 72 capsomer hình ngôi sao được cầu tạo bởi protein L1 Giống với những nhóm virus không có màng bao khác, vỏ capsid của HPV ở

dạng hình khối đa diện, gồm 20 mặt cắt đối xứng [30]

Vỏ capsid có một loại protein khác chiếm tỷ lệ ít là protein L2 Hiện nay cơ chế gắn L2 vào câu trúc virus hoàn chỉnh (virion) chưa được rõ, tuy nhiên protein L2 có vai trò quan trọng như giúp đóng gói bộ gen vào vỏ capside và giúp virus tấn công, xâm nhiễm vào tế bào chủ mới Protein L2 là protein đích mở ra hướng nghiên cứu sản xuất vacxin HPV.[30]

H5 Cấu trúc bộ gene HPVY [14, 20, 30]

Bộ gen HPV thường ở dạng vòng mạch đôi, kích thước khoảng 8000 cặp base, được phân ra thành 3 vùng gen:

s* Vùng gen sớm (E): 6 gene E1 đến E7; mã hóa protein

* Vùng gen muộn (L): gene L1 và L2; mã hóa protein

Vung diéu hoa (upper regulatory region - URR) va (Long control region - LCR):

không có nhiệm vụ mã hóa thông tin di truyền, là những vị trí để các chất kích hoạt

hoặc ức chế gắn vào điều hòa sự phiên mã, đóng vai trò cho virus HPV type 41 xac

IL6 Chức năng các gen của HPV [14, 24, 30]

Mã hóa cho 1 loại protein đóng vai trò điều hòa sự phiên mã RNA của virus

Protein E2 gắn vào các promoter trong ving LCR, uc chế sự phiên mã vùng gen sớm

[14]

Đồng thời protein E2 giúp cho protein El gắn dễ dàng vào vùng khởi đầu sao

chép Protein E2 sử dụng protein Bromodomain -4 để chèn bộ gen virus vào bộ gen

tế bào chủ [14, 20, 30]

Trong những trường hợp bộ máy di truyền bị thay đổi như DNA virus chèn vào

bộ gen người, gen E2 bị bất hoạt dẫn đến biểu hiện hai oncogene E6, E7, kết quả là

hình thành khối u ác tính [14, 20, 30]

Gen này được biểu hiện ở mức rất thấp ở giai đoạn sớm; gen này biểu hiện chủ

yêu ở giai đoạn muộn khi virus được “đóng gói hoàn chỉnh” thành virion Protein E4 -

có nhiệm vụ quan trọng trọng giai đoạn trưởng thành -sinh sản của virus; gây ra sự phá vỡ mạng lưới vi ống trong tế bào chất trong các tế bào gai của con người — tương ứng với giai đoạn giải phóng virus ra khỏi tế bào bị nhiễm [14, 30]

“* Gen E5:

Nằm trong khung doc mé (open reading frame -ORF), nhung déi khi gen nay

bi mat di trong các tế bào ung thư cổ tử cung, do có thể nó không có vai trò trong quá

trình biến đổi tế bào bị nhiễm virus thành tế bào ác tính Gen E5 biểu hiện tương tác

với những protein vận chuyển màng như thụ quan của nhân tố sinh sản biêu bì, nhân

tố § — dẫn xuất của tiêu cầu, nhân tố kích thích sự phát triển khối tế bào Có công trình nghiên cứu nhận thấy ở virus HPV type 16 có protein E5 có khả năng yếu trong quá trình tạo khối u Protein E5 HPV type 16 và HPV type 2 có vai trò điều hòa làm giảm sự biểu hiện phức phức hợp protein MHC lớp I của tế bào chủ nhằm ngăn

cản tế bào T tiêu diệt tế bào bị nhiễm virus [14, 30]

% Gen E6 và E7 [9, 14, 24 ,30]

Các khung đọc mở của gen E6 và E7 có các vai trò mã hóa cho những

oncoprotein điều khiển sự sao chép của virus và dẫn đến tế bào bất thường, bắt tử và

ác tính

Protein E6 gồm khoảng 151 acid amin; đóng vai trò gắn kết và gián tiếp làm

bat hoat protein p53 Protein p53 cé vai tro we chế hình thành khối u của con người;

dẫn đến bệnh ung thư cô tử cung Sự biểu hiện gen E6 là đặc điểm để xác định kiểu

hình các bệnh ung thư liên quan đến HPV

Protein E7 có chức năng làm bất hoạt họ protein pRb

Hai protein E6 và E7 gắn vào p53 và pRb làm cho quá trình “tế bào chết — apoptosis” không xảy ra và thúc đây chu trình tế bào diễn ra để sao chép DNA virus

Protein E7 còn có khả năng làm bắt tử những tế bào chủ bị nhiễm virus bằng hoạt

tính xúc tác telomerase của tế bào chủ ~ Protein E6 và E7 cần cho sự sống của các dòng tế bảo ung thư Hela trong những khối u ác tính do HPV gây ra

s% Các gen LI và L2: [14, 30]

Mã hóa cho những protein cau tao capsid; hai gen nay y được phiên mã trong

giai đoạn muộn: giai đoạn lắp ráp

Gen L1 mã hóa cho protein LI hình thành các capsomer 5 cạnh được liên kết với nhau bằng cầu nối disulñde để hình thành capside Trình tự amino acid của

protein L1 có độ bảo tồn cao trong những loài virus HPV, do đó có xu hướng sử dụng

các kháng thể kháng HPV virus ở bò nhằm phát hiện các protein capside của HPV trong mô người

Protein L2 ở trạng thái oxi hóa trong cấu trúc virus hoàn chỉnh, bao gồm hai gốc bảo tồn cystein hình thành cầu nối disulfide Gen L2 có trình tự đa dạng hơn gen

L1; kháng thể kháng protein L2 được sử dụng làm nguồn kháng nguyên đặc hiệu để

dinh type HPV

II.7 Chu trinh song cia virus

11.7.1 Tấn công— xâm nhiễm vào biểu mô [24, 30]

Virus HPV xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô qua vết trầy xước, tôn thương trên da, niêm mạc Virus không có khả năng gắn bám vào tế bào sống, chúng xâm nhiễm vào bên trong tế bào thông qua những chỗ vi tổn thương trên bề mặt tế bào Quá trình xâm nhiễm xảy ra chậm, khoảng 12-24 giờ để khởi đầu sự phiên mã Do đó

các kháng thể có vai trò trung hòa virus khi virus van còn ở dạng hoàn chỉnh (virion)

trên bề mặt màng tế bảo

Sự tương tác giữa protein LI và đường sulfat trên bề mặt tế bào chủ giúp cho virus dễ dàng tấn công tế bào chủ Sau đó virus tương tác với thụ quan chuyên biệt (alpha-6-beta-integrin) và các endosome gắn trên màng tế bào chủ Protein L2 phá vỡ

màng tế bào tại các endosome, cho phép bộ gen được giải phóng và vận chuyển cùng

với L2 vào trong nhân tế bào chủ |

1.7.2 Virus hoạt động trong tế bào chủ [20]

Sau khi vào bên trong tế bào gai, virus biểu hiện protein E1 và E2 nhằm thực

hiện quá trình sao chép DNA và bảo tồn thông tin di truyền ở dang episome mach

8

vòng Hai gen này được sao chép khoảng 50-100 bản sao trong một tế bào Khi gen

E2 bị ức chế hoạc không hoạt động, các oncogene E6 và E7 được biểu hiện, dịch mã

thành protein E6 và E7 làm bất hoạt các protein ức chế khối u p53 và pRb Đó chính

là nguyên nhân hình thành khối u ác tính, các tế bào gai trong lớp đáy biểu mô có thé

- mang virus tồn tại qua nhiều năm -

11.7.3 Sự sinh sản virus trong tế bào chủ [20, 24, 30]

Sự biểu hiện các gen muộn L1 va L2 dẫn đến sự biệt hóa các tế bào gai ở lớp

ngoài cùng của biểu mô, niêm mạc Sự biểu hiện L1 và L2 tăng lên tỷ lệ thuận với sự gia tăng số lượng bản sao bộ gen virus Trong khoảng 21 ngày, HPV dẫn đến những

sự biệt hóa khác nhau của tế bào biểu mô, chúng có khoảng 10.000 bộ gen virus/1 tế bảo

Chính sự biểu hiện các gen muộn là nguyên nhân làm cho các tế bào gai có nhiễm virus ở lớp biểu mô không hóa sừng tránh sự tiêu diét bởi các tế bào thuộc hệ

miễn dịch Đến giai đoạn sinh sản, virus mới được tạo ra bên trong tế bào chủ Các

virus HPV có cơ chế giải phóng virion vào trong môi trường giống với các virus không có màng bao Chúng sử dụng chu trình tan để giết tế bào chủ, giải phóng các

tín hiệu cho các thành phần trong hệ miễn dịch tấn công virus Tuy nhiên, HPV co khả

năng tạo sự bóc vảy tế bào, không gây ra phản ứng viêm

Trong suốt thập niên qua, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu xác định

trước tới nay đã mô tả khá rõ quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ung thư CTC của HPV type nguy cơ cao

Việc nhiễm các type HPV nguy cơ cao không phải là nguyên nhân duy nhất

của các type HPV nguy cơ cao vao trong bộ gen người, dẫn đến rối loạn các chức

năng tế bào Nhiều nghiên cứu thống kê cho thấy hơn 90% các trường hợp ung thư

CTC đều có sự hiện điện của HPV nguy cơ cao.[9, 37]

Trước khi chuyên biến thành ung thư, từ giai đoạn nhiễm HPV type nguy cơ cao tế bào còn phải trải qua các giai đoạn tổn thương về phát triển mô học trong tế bào biểu mô CTC (CIN - dị sản) Theo tổ chức Y tế thế giới, tuỳ mức độ nặng nhẹ chia mức CN thành ba loại: CIN I -dị sản nhẹ, CIN II - dị sản trung bình và CIN HI- di

sản có thương tổn nặng nhất, ung thư tại chỗ Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng,

hiện tượng chèn gen của HPV chỉ xảy ra ở trường hợp bị CIN II, II và ung thư CTC,

còn CN I chỉ hiện diện DNA virus HPV dưới đạng episome [14, 30, 37, 28]

Những nghiên cứu trước đây các nhân tố môi trường và lỗi sống, nhiều bạn

tình, giảm cân, mang thai có ảnh hướng đến bệnh ung thư CTC Tuy nhiên, một số công trình nghiên cứu đã cho thấy có không mối liên hệ giữa các nhân tố nêu trên với

CINII, II ở đối tượng phụ nữ có tiền sử bệnh bị nhiễm HPV [14, 30, 37]

_"¬ (4)

Nhau Reviewed | bromunology

Hình 5: Quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ và gây bệnh của HPV [38]

Ghi chú: (1) Tế bào lát/hình vảy trưởng thành; (2) Giai đoạn virus xâm nhiễm tế bào chủ; (3): HPV hoàn chỉnh (virion); (4) Giai doan tế bào bình thường, virus tấn công qua da, qua vết thương tốn, trây xước; (3) Té bao trinh dién khdng nguyén- APC; (6)

Lớp tế bào lát trưởng thành; (7) Lớp tế bào lát; (8) Tế bào biểu mô lát tang khéng hóa sừng; (9) Màng đáy biểu mô; (10) Sự phân chia tế bào biểu mô; (11) Tế bào

mâm; (12) Gen E1 và E2 được biểu hiện; (13) Gen E6 và E7 chèn vào bộ gen người; (14) Gen E6 và E7 được biểu hiện; (15) Su phat triển các lớp tế bào biểu mô bị

nhiễm virus; (16) Các tế bào ở màng đáy hình thành ung thư CTC giai đoạn xâm lan

Biểu mô lát tang khong hóa sừng ở cổ tử cung có chức năng che chở, bảo vệ nên thường phát triển về bề mặt và sẽ được bong ra ngoài Virus HPV nguy cơ cao xâm nhiễm vào tế bào biểu mô CTC ở những lớp mang đáy, các tế bào này có khả năng

10

sinh sản cao Bộ gen virus sẽ được nhân bản thông qua hoạt động tăng sinh tế bào, dẫn

đến sự phát triển bất thường của 1 rồi nhiều lớp tÊ bào sau đó Các tế bào này sau đó được biệt hoá và di chuyển lên trên thay thé cho những tế bào già, chết, đồng thời các

virus cũng được phóng thích ra ngoài [37]

Copyright © 2009 Paarson Education, inc

Hinh 6: Qua trinh tiến triển hình thành khỗi u do protein E6 và E7 [25]

Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bảo biểu mô lát (dị sản

nặng ung thư tại chỗ), sẽ có khả năng phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cô tử cung giai đoạn xâm lẫn Tuy nhiên,

những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn không có tiếp xúc mạch máu,

HPV hẳu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình

đã nhiễm tự nhiên HPV Ngày nay, có một số ít bằng chứng cho thấy dường như cũng

có vai trò miễn dịch trong nhiễm HPV mặc dù yếu ớt: những người có suy giảm miễn dịch sẽ đễ bị nhiễm HPV và khi đã nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh và nặng nề; có gia

tăng nồng độ kháng thể với HPV sau khi bị nhiễm tự nhiên nhưng nồng độ kháng thé

không đủ để gây đáp ứng miễn dich.[37]

Ở trạng thái bình thường, bộ gen virus HPV tổn tại dưới dạng DNA plasmid,

l1

E6 và E7 Trong giai đoạn tiềm ân, gen E6 và E7 tồn tại trong bộ gen virus không ảnh

hưởng đến bộ gen tế bào chủ Gen E6 và E7 bị ức chế bởi protein mã hóa bởi gen E2

[14, 30]

Ở các lớp tế bào đáy bên dưới, nằm ngay vùng chuyên tiếp (transformation 'zone) của tế bào biêu mô trụ tuyến, ngoài hoạt động nhân bản bình thường, các virus HPV còn sản xuất ra các thành phần bổ sung (cofactor) giúp chúng tồn tại lâu đài trong tế bào Việc tế bào bị nhiễm lâu dài các type nguy cơ cao sẽ làm cấu trúc té bao CTC bị rối loạn và chu trình tế bào bị xáo trộn Đến một lúc nào đó, khi nhiễm sắc thể

người bị mất ôn định, một số vị trí dé gay trên nhiễm sắc thể sẽ trở nên lỏng lẻo và

yếu ớt, dưới một điều kiện thuận lợi nào đó, bộ gen virus HPV nguy cơ cao sẽ chèn vào các vị trí trên, gắn kết hai gen E6 và E7 vào bộ gene chủ Từ đó chúng được phiên

mã thành mRNA rồi thành protein theo hoạt động tăng sinh của tế bảo Oncoprotein

E6 và E7 không có trình diện trên bề mặt tế bào nên hệ thống miễn dịch không tan cong cac té bao bi nhiém.[ 7, 14, 15, 30]

Khi gắn vào bộ gen chủ, hai oncogene E6 va E7 sé không chịu sự kiêm soát của gen E2, hai oncogene này biểu hiện mã hoá cho hai protein làm ức chế hai hệ thống tiêu diệt và đàn ap khối u p53 và pRb Việc bất hoạt hệ thống p53 sẽ dẫn dén

hiện tượng bắt tử hóa tế bào (do kích hoạt enzyme telomerase — có vai trò kéo dài đầu

telomere của nhiễm sắc thể) và bất hoạt pRb sẽ làm cho tế bào tăng sinh liên tục, gây mất ổn định tế bào và chuyên thành ung thư CTC Khi các tế bào ung thư bắt đầu xâm lắn vào mô liên kết, có chiều hướng lan rộng dọc theo màng đáy sẽ được gọi là ung thư xâm lấn (invasive cancer) Ung thu CTC nếu tiến triển nặng có thê di căn sang

bụng, phổi và một số nơi khác [14, 30]

Một số trường hợp nhiễm kéo dài bởi type nguy cơ cao, sẽ gây ra các tổn

thương về phát triển mô học của cô tử cung (dị sản xếp theo thứ tự nhẹ, vừa, nặng)

Hơn phân nửa các trường hợp dị sản nhẹ có khả năng tự thoái lui; 10% các trường hợp

dị sản nặng hay vừa có khả năng tiến triển nặng hơn trong 2-4 năm; khoảng 50% dị sản nặng sẽ trở thành ung thư tại chễ cổ tử cung, đặc biệt khả năng này it gặp ở người

Việc phát hiện, tầm soát ung thư chủ yếu dựa vào các giai đoạn tiến triển ung thư Với các trị liệu thích hợp, tỷ lệ sống đối với trường hợp ung thư xâm lan CTC la 92%, 80 to 90% phụ nữ ở giai đoạn CIN I và 50 to 65% giai đoạn CIN II kéo đài tuổi

thọ hơn 5 năm sau ngày phát hiện Chỉ có bệnh nhân ở giai đoạn CIN III được kéo dài

tuổi thọ sau 5 năm vớ tỷ lệ thấp 25 to 35% [23]

II TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CÓ TỬ CUNG

IH.1 Tình hình trên thế giới

Bệnh ung thư cô tử cung là căn bệnh nguy hiểm thứ hai đối với phụ nữ trên thế giới Hàng năm có khoảng 400.000 ca bệnh mới/mỗi năm Hàng năm, bệnh ung thư CTC dẫn đến tử vong ít nhất 250 000 phụ nữ trên toàn thế giới, chủ yếu chiếm trên 80% ở các nước nghèo, đang phát trién [9, 14, 39]

Theo cac nghiên cứu của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) Tỷ lệ

nhiễm HPV tăng gấp 20 lần trên toàn thế giới, chúng ảnh hưởng ở nhiều độ tuổi khác

nhau Hiện nay, ở các nước phát triển, HPV có khả năng xâm nhiễm và được tìm thấy

ở những phụ nữ có độ tuổi trẻ đưới 25 hoặc 30 tuổi và tỷ lệ nhiễm HPV nhiều so với phụ nữ trung niên, già Điều này cho thấy cần có biện pháp thích hợp và hiệu quả dé phòng chống, phát hiện sớm tình trạng nhiễm HPV và diễn tiễn ung thư CTC ở phụ nữ

trường hợp nhiễm bệnh mới được chan đoán và có hơn 3870 trường hợp được dự báo

sẽ bị tử vong do bệnh ung thu CTC Điều này cho thấy tỷ lệ tử vong ở Hoa Kỳ là khá cao, đây là một quốc gia đã sử dụng phương pháp chân đoán ung thư CTC chủ yếu

bằng Pap smear [23]

Ở những nước Châu Âu, có khoảng 34.000 trường hợp mắc bệnh mới được

phát hiện hàng năm, có khoảng hơn 16.000 trường hợp bị tử vong do căn bệnh ung thư CTC vào năm 2004 [23]

13

Ở Canada vào năm 2008, ước tính có khoảng 1300 phụ nữ được chân đoán bị ung thư CTC và đã có 380 trường hợp tử vong do căn bệnh này [23]

Ở Úc, có khoảng 734 trường hợp bị ung thư CTC vào năm 2005 Đây là quốc

| gia có ty lệ mắc bệnh giảm do có đây mạnh phương pháp kiểm tra, tầm soát ung thư

nên đã cứu sống 1200 phụ nữ ÚC mỗi năm [23]

| Glee © Gl tea (1 < atom,

Hinh 7: Ban đề biểu diễn tỷ lệ bị ung thư CTC trên thể giới [35]

HI.2 Tình hình ở Việt Nam [21, 27]

Nhóm bác sĩ bệnh viện Ung bướu TPHCM và bệnh viện Từ Dũ cho biết, ghi

nhận toàn thế giới vào năm 2002 có 493.000 ca mắc UTCTC và đã có 275.000 ca tử

vong Tại Việt Nam cũng trong năm này, ước tính có 6.224 phụ nữ mắc mới và hơn 3.300 ca tử vong do ung thu Theo GS Nguyễn Chan Hùng, Chủ tịch Hội Ung thư TPHCM, qua khảo sát ung thư quản thể tại TPHCM trong năm 2003 cho thấy có bệnh

ung thư CTC chiếm tý lệ 16,5/100.000 dân Bác sĩ Hùng cho biết, riêng tại BV Ủng bướu TPHCM mỗi năm có hơn 1.000 trường hợp UTCTC mới nhập viện và điều trị, gần phân nửa trong số này đã vào giai đoạn cuối

Tại TPHCM có hơn 3 triệu phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ nhưng mỗi năm tại BV

Từ Dũ, Hùng Vương và các BV sản tư nhân khác chỉ làm sàng lọc cho khoảng

300.000 người Các chuyên gia về ung thư cho biết, thực tế một số phụ nữ có thê đã bị UTCTC rồi nhưng không hay biết, vì trong giai đoạn đầu bệnh này không có triệu chứng Đây là nguyên nhân khiến số bệnh nhân bị căn bệnh này tăng cao

Có khoảng 90% các trường hợp UTCTC đều xảy ra trước tuổi 35- 40 Thời

gian trung bình để cho ung thư tiến triển thành ung thư xâm lan kéo dai khoảng 10 —

20 năm, và chỉ có một tỷ lệ rất nhỏ UTCTC diễn tiến thành ung thư xâm lấn, nếu

không phát hiện và điều trị kịp thời

IV PHƯƠNG PHÁP CHẲN ĐOÁN UNG THƯ CÓ TỬ CUNG

IV.1 Chấn đoán lâm sàng

Ở giai đoạn sớm của bệnh ung thư cô tử cung, thường không có dấu hiệu bệnh

Ở vài trường hợp, những dạng tôn thương thông thường có sự xuất huyết âm đạo,

dịch âm đạo (khí hư) có thể là dấu hiệu bệnh [23, 27]

Bệnh ung thư cỗ tử cung ở giai đoạn muộn thường có biểu hiện : giảm cân,

chán ăn, mệt mỏi, đau xương chậu, đau lưng, đau chân, sưng một chân, gãy xương,

xuất huyết bất thường [23, 27]

IV.2 Các phương pháp chân đoán ở phòng thì nghiệm

IV.2 1 Xét nghiệm tế bào học

s* Pap?smear: [9, 19, 21, 26, 27, 28, 37]

Từ khi xuất hiện cách đây rất lâu từ những năm 50 của thế kỷ trước, phương pháp Papanicolaou smear (phết tế bào CTC - Pap smear) được sử dụng rộng rãi trên

toàn thế giới Năm 1228, George Nicolas Papanicolaou — một bác sĩ người Hi Lạp giới

thiệu những phát hiện mới của mình, về một phương pháp chẩn đoán ung thư mới:

phết tế bào âm đạo và sau này được cải tiến là phết mỏng tế bào cô tử cung Đây là

một xét nghiệm tầm soát, nhằm phát hiện sự thay đổi bất thường tế bào ở lớp biểu mô

trong vùng chuyển tiếp của CTC bằng cách kiểm tra các tế bào đã bị bong tróc trong

âm đạo hoặc CTC, để xác định tình trạng của những thương tôn tiền ung thư, phục vụ

cho mục đích điều trị hoặc nghiên cứu

Phương pháp này góp phần làm giảm tỉ lệ ung thư CTC và tỉ lệ tử vong giảm xuống 2/3 các trường hợp Tuy nhiên, nhược điểm của Pap’ smear là có thể có trường

hợp âm tính giả với tỉ lệ khá cao do chỉ kiểm tra trên tế bào đơn, độ nhạy thấp (37 —

84%) Vì vậy, phải thực hiện xét nghiệm Papˆsmear nhiều lần để giảm bớt các trường

hợp âm tính giả, khoảng thời gian giữa hai lần xét nghiệm càng ngắn càng tốt Thông

kê của IARC cho thấy nếu giữa hai lần xét nghiệm cách nhau 1 năm, tỉ lệ giảm ung

thư CTC đạt đến 93.5

15

Hình 9: Phương pháp xét nghiệm tế bào cỗ tử cung [28]

s* ThinPrepTM Pap Test:

Đây là phương pháp cải tiến từ Pap°smear nhằm mục đích làm giảm tỉ lệ mẫu

lấy không đạt yêu cầu, giảm bớt các trường hợp âm tính giả do nguyên nhân từ khâu

- lấy mẫu Các mẫu tế bào CTC mới lấy sẽ được trộn vào một dung dịch, sau đó lọc hỗn

hợp này dé loại bỏ các tạp chất, chất nhầy, nắm, mảnh vụn và nhiều thứ khác làm ảnh hưởng đến độ chính xác của xét nghiệm [40]

s* Phương pháp soi CTC:

Đây là phương pháp được áp dụng để phát hiện ung thư CTC khi bệnh nhân đã

có kết quả phết tế bào CTC bị bất thường Phương pháp soi bằng mắt thường hoặc bằng máy soi có độ phóng địa từ 10-30 lần, giúp xác định rõ vị trí và mức độ lan toả

của tổn thương, đồng thời hướng dẫn cho bệnh nhân sinh thiết CTC Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, nhưng chỉ phí cao, không giải quyết được bệnh một cách triệt dé [29]

«%* Phương pháp sinh thiét CTC:

16

Sinh thiết là phương tiện sau cùng của chân đoán bệnh ung thư CTC và cho kết

quả chính xác hơn cả, giúp chẩn đoán về mặt giải phẫu bệnh Sinh thiết CTC được

thực hiện dưới hướng dẫn của máy soi.[ 23,29]

IV.2 2 Xét nghiém tim HPV DNA [5, 10, 26]

Từ những mẫu phết CTC hay âm đạo, xét nghiệm HPV DNA có thể phát hiện

DNA của các type HPV nguy cơ cao Phương pháp này lấy mẫu tế bào từ cổ tử cung hoặc âm đạo bằng que tăm bông nhỏ, sau đó được đưa đến phòng xét nghiệm

Phương pháp này có độ nhạy cao hơn Pap”smear (97 — 100%), do đó, việc bỏ

sót trường hợp âm tính giả rất thấp Ngoài ra, xét nghiệm HPV DNA không mang tính

chủ quan như các xét nghiệm tầm soát tế bào Bên cạnh việc có thê phát hiện ra những

mẫu đã mắc bệnh, phương pháp này còn có giá trị trong việc nhận biết được những trường hợp viêm nhiễm HPV có nguy cơ tiến trién sang ung thu CTC

“* HPV DNA PCR:

Phương pháp này có thể phát hiện và định danh các type của HPV Ưu điểm

phương pháp này có thể thực hiện và cho kết quả chính xác trong điều kiện mẫu bệnh

phẩm chỉ có một.số lượng nhỏ virus, dựa trên nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR

[10]

IV.2 3 HPV DNA Hybrid Capture (HC2 test): [10, 26]

Phương pháp này do hãng Digene phát triển, được Cơ quan Lương thực và Dược phẩm Liên Ban Mỹ (FDA) cho phép xét nghiệm lâm sàng

Nguyên tắc dựa trên phương pháp lai sử dụng các mẫu dò DNA tổng hợp để phát hiện các bộ gen của các type HPV nguy cơ cao Ưu điểm của phương pháp này là

có độ nhạy cao hơn các phương pháp phát hiện bằng mắt thường và xét nghiệm tế bào học Nhược điểm là đòi hỏi điều kiện phòng thí nghiệm phải tốt, thiết bị đặc biệt và kỹ thuật viên phải được huấn luyện về trình độ và thao tác Phương pháp này xác định được bệnh nhân nhiễm type HPV nhóm nguy cơ cao hay nguy cơ thấp, nhưng chỉ có thể phát hiện được 13 type HPV Đề thực hiện HPV DNA Hybrid Capture thi mẫu cần phải có một số lượng virus nhiều hơn phương pháp HPV DNA PCR Thông thường có

thể biết kết quả xét nghiệm sau 6 — 8 tiếng

V PHUONG PHAP PCR VA UNG DUNG TRONG CHAN ĐOÁN BỆNH

UNG THU CO TU CUNG

V.1 Nguyên tắc phương phap PCR [1, 2, 6, 10]

Phuong pháp PCR (Polymerase chain reaction) do Kary B Mulis cùng các cộng sự phát minh vào năm 1985 Đây là phương pháp khuéch dai in vitro cé chon lọc, cho phép khuếch dai đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự

17

oligonucleotide đã biết trước Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi (forward primer) và mỗi ngược (reverse primer) Mỗi có khả năng bắt cặp bổ sụng với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase thực hiện nối dài mạch tạo thành

e© Bước 2- Lai: Các primer bắt cặp vào mạch khuôn, nhiệt độ tùy thuộc vào Tim của các primer sử dụng, dao động từ 40 — 700C

e Bước 3- Kéo dài: Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA

polymerase, 720C là nhiệt độ tối ưu cho Tag DNA polymerase hoạt động

V.2 Các thành phần trong phản ứng PCR [1,2, 6, 10]

DNA bản mẫu:

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tính sạch nhưng nhiều kỹ

thuật chân đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc các mẫu DNA không được bảo quản tốt, bị phân hủy từng phan: vết máu lâu ngày, hóa thạch, tóc

- Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao, thậm

chí chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng Thông thường nông độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng

b Méi va nhiét dé lai:

Mỗi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn (17 — 30 Nu) có khả năng bắt

cặp bổ sung đặc hiệu với DNA bản mẫu

Môi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng, chuyên biệt và có hiệu quả cao Việc chọn và thiết kế môi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Khong có sự bắt cặp bổ sung giữa mỗi “xuôi” và mỗi “ngược”, và cũng không

có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một

- Các mỗi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gene

_ Trinh ty nằm giữa hai mỗi xuôi và mỗi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ

ưu tiên trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb

Thông thường nồng độ mồi sử dụng nằm trong giới hạn từ 0,1 — 1,0 HM

Bén loai nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) thong duge str dụng ở nồng

độ 20 — 200 uM/mỗi loại nuceotide Bến loại nuclecotide thường được sử dụng ở

lỗi sao chép của DNA polymerase

d Dune dich dém cho phan ung PCR (PCR buffer):

phản ứng PCR bao gồm chứa 50 mM KCI, 10 mM Tris — HCI, pH 8,3 ở nhiệt độ

phong

e MgCl2:

Nồng độ Mg++ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thí

nghiệm Trong phản ứng PCR, MgCl2 đóng vai trò là một cofactor cho DNA

polymerase hoạt động Ngoài DNA polymerase, các thành phần khác cũng có thể kết

với MgCl2 như primer, DNA bản mẫu, dNTPs, EDTA; các thành phần này sẽ cạnh

tranh MgCl2 voi DNA polymerase Do đó nồng độ MgCl2 str dụng cần được tối ưu

cho từng hệ thống PCR cụ thể Nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại kí sinh, thông thường MgC12 được sử dụng ở nồng độ 0,5 mM - 5 mM

e Taq polymerase:

Enzyme được sử dụng là DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt, được tách

dụng với một liều lượng nằm trong giới hạn 0,5 — 2,5 đơn vị

{ Các chất ting cwong:

Trong phản ứng PCR ngoài những thành phần cơ bản, đôi khi người ta còn bồ sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn Các chất thường được sử dụng là betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), ‘glycerol Tuy nhién

cần thận trọng khi sử dụng những chất này bởi vì nếu sử dụng ở nồng độ không thích 'hợp thì những chất này sẽ gây ức chế phản ứng PCR

V.3 Phương pháp Reverse transcriptase - PCR [1, 6]

Nguyên lý hoạt động của RT - PCR cũng dựa trên nguyên tắc PCR bình

thường, chỉ khác ở vật liệu cần khuếch đại ban dau Trong RT — PCR, vat ligu ban dau

la RNA, ching sẽ được phiên mã ngược thành cDNA nho enzyme Reverse

transcriptase, sau dé cac CDNA nay tiếp tục được nhân bản qua các bước như trong

PCR

Thành phần cơ bản của phan ing RT- PCR gồm có: RNA bản mẫu, primer nguoc, dNTPs, dung dịch đệm cho phan tng RT- PCR, enzyme reverse transcriptase

Các điều kiện về nồng độ RNA ban đầu cũng tương tự như của DNA trong PCR

V.4.1 Nguyên tắc [6, 31, 33, 34,41]

Phương pháp Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm

thành nhiều bản sao dựa vào chu kỳ nhiệt, cho phép định lượng chính xác mức độ biểu hiện của gen thông qua kết quả khuếch đại DNA đích trong ống phản ứng được hiển thị ngay trên màn hình cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra (sau mỗi chu kỳ nhiệt

phản ứng), không cần thiết thực hiện bước điện di trên gel agarose như phương pháp

PCR cổ điển

Nguyên tắc chung của phương pháp Realtime PCR là sử dụng các chất nhuộm phat huynh quang (fluorescent dye), co sy kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản

phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật

(real time) của phản ứng Có thể sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi hoặc sử dụng các mẫu dò có đánh dấu chất phát huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu

Phương pháp Real time RT- PCR là phương pháp nhằm khuếch đại DNA bản mẫu thành các bản sao, DNA bản mẫu được phiên mã ngược từ mRNA Phương pháp

này nhằm định lượng số bản sao mRNA và khảo sát sự biêu hiện các gen thông qua

bước phiên mã thành mRNA

20

Hinh 10: So dé tém tat phwong phap Real-time PCR [31]

V.4.2 Các thuật ngữ trong phương pháp Realtime PCR [6, 7, 31, 33, 34] Amplification curve: cho biết tín hiệu huỳnh quang phát ra tại từng chu kỳ phản ứng PCR

Baseline :giá trị tín hiệu huỳnh quang tại các chu kỳ đầu của phản ứng PCR (được coi là giá trị nền-chưa co san pham PCR)

Reporter dye (danh dấu huỳnh quang) là phan tir fluorescent duge su dung dé

xác định lượng sản phẩm PCR tạo ra

Quencher là phân tử hấp phụ năng lượng từ reporter dye ở trạng thái bị kích

Threshold :là điểm bắt đầu phát hiện tín hiệu huỳnh quang, tại thời điểm này

ta có thê phân biệt sản phẩm PCR với tín hiệu nền

Ct (Threshold_cycle) - chu kỳ ngưỡng là số chu kỳ mà tại đó sản phẩm

khuếch đại có thể được phát hiện bởi sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang

Trong các chu kỳ đầu của phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang thay đổi lên xuống thực chất chỉ là "nhiễu" Ct và tín hiệu nền phải được đặt sao cho

máy Real time "bỏ qua” các tín hiệu nhiễu này

o_ Xác định giá tri Ct sao cho dung đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang

Melting curve: cho phép phân tích độ đặc hiệu của phản ứng khuếch đại dựa chỉ số nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR

V.4.3 Các loại mẫu đò (probe) trong phương pháp Real time-PCR (31,

33, 34]

“* Molecular beacon:

Đây là loại probe có cầu trúc dạng vòng va cuống, trong đó câu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu

Phần cấu trúc dạng cuống (stem) của phân tử probe được hình thành từ các liên

kết hydro giữa các base bắt cặp bỗ sung nằm ở hai đầu mút của probe Một chất hóa

học phát huỳnh quang (Reporter dye) được gắn vào một đầu của mẫu dò và một chất

hóa học khác (Quencher) có nhiệm vụ “dập tắt” được gắn ở đầu bên kia Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó

nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra

Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thái tự do sẽ có cầu trúc đạng vòng và cuống Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của mẫu dò ở gần với nhau trong không gian, lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang

PCR Product-Specific Nucleotides

Fluorescent Reporter Dye

“Ri

Quencher Dye

Hinh 11: Nguyén tic hoat déng cia Molecular beacon [34]

Khi probe bat cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ

lai của phản ứng thì mẫu dò mất cấu trúc dạng vòng và cuống trở thành dạng thang

Điểu này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thê tiếp

nhận và phân tích

Nếu beacon không bắt cặp bể sung hoàn toàn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon và trình tự DNA sẽ không xảy ra dẫn đến không có sự phát ánh sáng huỳnh quang

Khó khăn lớn nhất khi sử dụng probe dạng beacon chính là việc thiết kế probe

Trình tự nucleotide của cấu trúc dạng cuồng phải được thiết kế sao cho quencher và chất phát huỳnh quang tiếp xúc nhau Nếu không thì một phần ánh sáng huỳnh quang

sẽ được phóng thích một cách không đặc hiệu, làm gia tăng mức độ tín hiệu nền (background signal) của phản ứng dẫn đến việc sai lệch trong đánh giá kết quả định lượng Ngược lại, nếu các liên kết trong cầu trúc dạng cuống của phân tử quá mạnh thì beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu và tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng không phản ánh đúng hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng, Vì vậy, cần đảm bảo tính phù hợp giữa một cấu trúc ổn định và khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là điều quan trọng khi thiết kế một beacon

s* Chất nhuộm gan với DNA mach đôi:

Hình 12: Nguyên tắc hoạt động của SyBr Green [33]

Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào các phân tử DNA mạch đôi thì phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR Các chất nhuộm phát

huỳnh quang thường được sử dụng là SyBr Green I, Ethidium bromide

Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các mạch đôi DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính Tất cả DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả nặng bắt chất nhuộm và

23

phát huỳnh quang do đó nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác

Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng cần xây dựng một đường

cong “néng chay” (melting curve) bằng cách đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh

quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau để có thể phát hiện sự hiện diện

của các sản phẩm ký sinh và tiến hành các biện pháp khắc phục Các biện pháp khắc phục rất đa dạng: thiết kế primer đặc hiệu và cho hiệu quả phản ứng tối ưu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia phản ứng như 72g polymerase, MgCl2, dNTP dé cho phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu

«% Mẫu dò lai (hybridization probe): [ 31, 33, 34, 41] |

Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do sử dụng cùng lúc hai mẫu đò bắt

cặp với trình tự DNA mục tiêu

Mét probe mang 6 dau 3’ chat cho “fluorescein” (donor fluorescein) phat anh

sang mau xanh va mẫu dò thứ hai mang ở dau 5’ chat nhan “fluorescein” (acceptor

fluorescein acceptor)

Probe thứ hai này được chặn ở đầu 3’ sao cho Tag polymerase khong thể kéo

dài mạch từ đầu này Anh sang huỳnh quang từ chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiéu tmg FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer - sw chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có màu

dé (red fluorescent) Trong dung dich phan tng, khi hai chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần cuối của probe kia Khi đó, hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng

mà nó nhận được và sẽ phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản

ứng Ưu điểm đáng chú ý của phương pháp này là sự thiết kế mẫu dò tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon

Hình: Nguyên tắc "Hybridization probe"

Hình 13: Nguyên tắc hoạt động của Hybridication probe [33]

s* Afẫu dò thủy giải (hydrolysis probe): | 31, 33, 34]

Probe sur dung trong phuong pháp này còn có tên là Tagman (Taqman probe), dựa vào đặc tinh exonuclease 3’ — 5S’ cla Taq polymerase Mau do Taqman duge gan một chất phát huỳnh quang ở đầu 5° và một:chất “dap tat” (quencher) ở dau 3’ sao cho ánh sáng chất phát huỳnh quang bị hấp thụ bởi quencher |

Hình 14: Nguyên tắc hoạt động của Taqman probe [31, 33, 34]

Trong buoc bat cap va Keo dai mach cua mot chu Ky PUR, mau do nay sé bat

cặp với mạch bổ sung trên trình tự DNA mục tiêu Khi 7agman kéo dài mạch bé sung

tir ddu 3’ của primer đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính exonuclease 3'- 5' va loại bỏ một sé nucleotide & dau cua probe, thay bang nhiing nucleotide mdi Khi

đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi probe và quencher mất tác dụng

Tương tự như beacon, ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm

lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng 7agman probe chỉ bắt cặp với mạch khuôn

25