BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨMBACTERIOCIN – CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ VI KHUẨNLACTIC

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặc lớn trong bảo quản thực phẩm.đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở nhiều nước phát triể

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

**************

BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM

BACTERIOCIN – CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ VI KHUẨN

LACTIC

GVHD: Vũ Thị Lâm An

Thành viên nhóm:

Nguyễn Thị Hồng Nhung Trần Hà Sơn

Huỳnh Duy Sơn

NỘI DUNG:

I BATERIOCIN

1 Giới thiệu bacteriocin

2 Các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh bacteriocin 2.1 Chủng latococus lactic

2.2 Các vi sinh vật khác sản sinh bateriocin

3 Phân loại

4 Cơ chế

II NISIN

1 Khái niệm

2 Cấu trúc

3 Đặc điểm

4 Cơ chế

III ỨNG DỤNG BACTERIOCIN

MỞ ĐẦU

Ngày nay,nhu cầu ăn uống của xã hội ngày càng được nâng cao Cũng từ đó, việc an toàn vệ sinh thực phẩm đang được chú trọng và đẩy mạn Bảo quản thực phẩm nói chung và phụ gia thực phẩm hay bao bì thực phẩm nói riêng đang là những vấn đề nóng bỏng của xã hội

Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học tác dụng phổ rộng với nhiều loại vi sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người thì những hướng nghiên cứu trển những chất chống vi sinh vật mới có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu với từng loài vi sinh vật gây hại đang được quan tâm

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặc lớn trong bảo quản thực phẩm.đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở nhiều nước phát triển Loài có khả năng sinh tổng hợp ra nó cũng không có gì xa lạ với chúng ta, đó là các vi khuẩn lactic, những vi khuẩn mà con người sử dụng trong thực phẩm cả ngàn năm nay

Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau sẽ có khả năng sinh tổng hợp những loại bacteriocin khác nhau.với số lượng khác nhau Vì vậy mà việc tìm ra các nguồn tự nhiên có thể phân lập ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hàm lượng chất chống vi sinh vật cao là cần thiết

Từ những thự tiễn đó,việc tìm ra các chủng lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và sản xuất được các loại bacteyiocin sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm an toàn là cần thiết và có ý nghĩa rất quan trọng

I BACTERIOCIN

1 Sơ lược về bacteriocin

Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chế vi sinh vật Chính vì lý do này nên thời kỳ đầu người ra chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, còn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâm đúng mức Theo thời gian sử dụng chất kháng sinh hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên trầm trọng đã gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra hiệu ứng trên của chúng rất thấp Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các bacteriocin đã được hồi phục và phát triển Các chế phẩm bacteriocin điền hình là nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin 850, monocin (từ Lactococus), pediocin A, pediocin PA – 1, pediocin ACH (từ Pediocucus), lactocidin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin

27, helveticin J (từ Lactobaccillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrigrad (từ Leuconostoc), propiocin PLG – 1, jenserin G (từ Propionicbacterium)

Bacteriocin được tìm thấy lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, được sản xuất bởi một chủng E.coli để chống lại các chủng khác trong dịch nuôi cấy Thuật ngữ “colocine” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), còn bacteriocin được sử dụng bởi Jacob et al (1953) như là thuật ngữ chung cho các protein có đặc tính kháng khuẩn cao Thuật ngữ colocine ngày nay là để chỉ các protein có tính kháng khuẩn được sản xuất bởi nhiều loài E.coli và các loài thuộc họ Enterobacteriaceae

Bacteriocin từ LAB

Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhóm vi khuẩn lactic vì từ xa xưa người ta đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm

và ngăn ngừa sự nhiễm các vi khuẩn gây bệnh Bởi vì LAB và chất chuyển hóa của chúng đã được tiêu thụ với số lượng cao qua nhiều thế hệ người tiêu thụ các thực phẩm truyền thống mà không có ảnh hưởng có hại nào LAB tiếp tục như là nguồn sản xuất bacteriocin sử dụng trong thực phẩm, kể cả dạng hợp chất tinh khiết hay dịch chiết từ môi trường phát triển Có thể thu được bằng bacteriocin thô bằng cách

nuôi chủng LAB sản xuất bacteriocin trên một phức hợp cơ chất Dịch lên men thô

có chứa các chất khác bên cạnh bacteriocin LAB là vi khuẩn nuôi cấy được sử dụng đầu tiên trong nghành sản xuất thực phẩm lên men, chúng hiển nhiên được sử dụng nhiều nhất cho sự biến đổi gen để tạo các chủng công nghiệp bị thiếu gen điều hòa sinh tổng hợp nên bacteriocin mong muốn

Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhằm lẫn như

là “các chất kháng sinh” Năm 1965, Reeves và cộng sự đã tìm ra sự khác biệt của bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất

là protein Chính sự khác biệt này đã tạo nên đặc tính ưu việt của bacteriocin trong ứng dụng bảo quản thực phẩm Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh

Bacteriocin khác biệt với kháng sinh:

+ Được tổng hợp bởi ribosom

+ Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh

+ Tế bào chủ miễn dịch với chúng

+ Phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh

+ Có thể sử dụng trong bảo quản thực phẩm

2 Các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh bacteriocin

Đặc điểm chung vi khuẩn lactis

Vi khuẩn lactis là các vi khuẩn gram dương , chịu acid, không hình thành bào

tử, hình que hoặc hình cầu, phát triển tối ưu ở pH từ 5,5- 5,8

Những vi khuẩn này sản xuất acid lactis như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men cacbohydrate Đặc điểm này gắn liền vi khuẩn lactis với thực phẩm lên men để acid hóa ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng

Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng vi khuẩn lactis, có vai trò ngăn cản vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh

Các giống của vi khuẩn lactis chủ yếu là: Lactobacillus, lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus…

Trong các giống của vi khuẩn lactis thì chủng lactococcus có vai trò quan trọng, nó có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

2.1 Chủng latococus lactic.

a Giới thiệu

Chủng lactococcus lactic (lc.lactic) là các vi sinh vật quan trọng nhất trong

sản xuất thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, fomat Chúng sản xuất nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng

Dựa vào đặc tính sinh hóa, lc Lactic được phân thành : Lc, lactic subsp.

Lactic; Lc Lactic subsp.cremoris và lc Lactic subsp.cremoris.lactic có khả năng

phát triển ở nhiệt độ 400C, sống được ở nồng độ muối ăn lên đến 4.0% và sản xuất

được ammoniac từ arginine trong khi Lc Lactic subsp.cremoris không có tính chất

này

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong nghành công nghiệp của

chủng Lc.lactic là plasmid được mã hóa, có nghĩa là plasmid mang gen có các đặc

tính như biến dưỡng lactose và sản xuất proteinase cũng như tính kháng bactriophage Các plasmid biến dưỡng quan trọng khác và chức năng của chúng ở

Lactococcus cũng đã mô tả Do đó, hiện nay chúng ta có những hiểu biết về gen

plasmid, kiểm soát biến dưỡng đường sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose,

sử dụng xitrat, … Thêm vào đó, lactococcus chứa nhiều plasmid, kích thước từ

1-100kbp Plasmid mã hóa cho bacteriocin thường lớn và kích thước của chúng thường

từ 81-133kbp Chủng Lc.lactic thường có từ 2-11plasmid DNA, trong khi số lượng

phổ biến thường là từ 4-7

b Tính chất.

- Biến dưỡng protein

Giống như tất cả các vi khuẩn Lactis khác, Lactococus có nhu cầu dinh dưỡng

phức tạp Chúng đòi hỏi các protein, peptide, các amino acid, nucleic acid, các vitamine, … Trong sữa, nồng độ isoleucine, leucine, valine, … cần thiết cho

Lactococus thấp hơn 1mg/l Nó bao gồm các amino acid tự do, cung cấp nguồn nitơ

cho khoảng 2% mật độ tế bào Trong sữa chiếm khoảng 80% là casein, trở thành nguồn nitơ sơ cấp khi dùng hết nitơ từ các nguồn không phải protein

- Biến dưỡng lactose

Biến dưỡng lactose của chủng Lc.lactis khác với các vi khuẩn lactis khác là ở

sự dị hóa cùng lúc glucose và galactose Vai trò của việc dị hóa cùng lúc là để sinh năng lượng và acid lactic (sản phẩm phụ)

- Biến dưỡng citrate

Trong nhóm Lactococus thì Lc.lactis subsp.lactis biovar diacerylactis là có

khả năng biến dưỡng citrate trong sữa Sản phẩm cuối cùng của quá trình biến dưỡng

là diacetyl, acetoin, acid acetic, carbondioxide, … Chúng tạo nên hương vị cho các loại thực phẩm

Citrate được vận chuyển vào tế bào mà không cần có sự biến đổi Phản ứng này được xúc tác bởi enzyme citrate permease

- Sinh tổng hợp bacteriocin

Các chủng thuộc loài Lc.lactis có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất có

hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cả bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối cùng của quá trình biến dưỡng

Bacteriocin từ Lactococus là các protein nhỏ, bền nhiệt, chống lại các vi

khuẩn lân cận Nisin là bacteriocin được biết đến nhiều nhất, có 34 amino acid, thuộc nhóm lantibiotic

Nisin là bacteriocin từ vi khuẩn lactis duy nhất được cho phép làm chất phụ

gia thực phẩm

2.2 Một số vi sinh vật khác sản sinh bacteriocin.

Laticin 3714 Lc Lactis 2847

Bền nhiệt ở 1000C trong 10 phút ở pH 5 hay 900C ở pH 7 trong 10 phút Nhạy cảm với trypsin, chymotrypsin, proteinase K và pronase E, kháng pepsin

Plantaricin C LactobacillusPlantarum 3500-4000

Ổn định ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút hay 1210C trong 10 phút Hầu hết ổn định ở pH acid hoặc trung tính Nhạy cảm với pronase, trypsin và alpha-chymotrypsin, kháng lại pepsin, proteinase K, alpha-amylase và lipase

Bavaricin A LactobacillusBavaricus 3500-4000

Bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút Ổn định ở pH bằng 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, kháng lại với catalase

Piscicolin

126

Carnobacterium piscicola JG126 4416

Ổn định ở pH bằng 2.0 sau khi lưu trữ 2 tháng tại 40C bền nhiệt tại 1000C trong

120 phút tại pH 2-3, trở nên ít ổn định hơn khi pH tăng Nhạy cảm với alpha-chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII

Variacin Micrpcoccusvarians 2658

Ổn định ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt

1150C trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E, proteinase K, ficin, kháng catalase

3 Phân loại bacteriocin

Hầu hết các bacteriocin từ LAB đều có tính cation, kị nước hay phân tử lưỡng cực, được hình thành từ khoảng 20 đến 60 gốc amino acid Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và trình tự chuỗi amino acid Các bacteriocin thường được chia thành 3 nhóm

Nhóm I: gồm các lantibiotic là các peptide nhỏ có trọng lượng phân tử

<5 kDa, chứa các amino acid không phổ biến như lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), dehydrodlanine, và dehydrobutyrine Các bacteriocin nhóm này hoạt động theo cấu trúc màng tế bào Nhóm I được chia thành 2 nhóm nhóm nhỏ tùy theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn

- Nhóm Ia: Lantibiotic type A là các peptide có hình dạng thon dài với mạng lưới tích điện dương, hoạt động thông qua việc hình thành các lỗ

trên màng tế bào vi khuẩn Một số nhóm như pep – 5 chứa 3 nối monosulfite, epidermin chứa 4 nối monosulfite, nisin A và Z, subtilin thì lại chứa 5 cầu nói monosulfite

- Nhóm Ib: Lantibiotic type B là các phân tử peptide hình cầu nhỏ hơn, có điện tích âm hoặc không tích điện, hoạt tính kháng khuần liên quan đến

sự ức chế các enzyme đặc biệt Một số các bacteriocin lớp phụ Ib như mersacidin, actagardin, cinnamycin và mutacin A

Nhóm II: Các peptide nhỏ có trọng lượng phân tử <10 kDa, bền nhiệt, không có các amino acid biến đổi sau dịch mã có chứa ít nhất một cầu nối disulfur cần thiết cho hoạt động của chúng Là nhóm bacteriocin lớn nhất trong

hệ thống phân lớp này, nhóm này được chia thành 3 nhóm phụ

- Nhóm IIa: Là lớp lớn nhất gồm những pepetide hoạt động chống Listeria Nhóm phụ này được quan tâm nhiều bởi vì hoạt tính kháng Listeria, chúng làm mất cân bằng điện tích và tạo lổ thủng làm rò rĩ các chất phân hữu cơ và gây chết tế bào đích

- Nhóm IIb: Gồm các bacteriocin được hình thành bởi phức hợp của 2 peptide khác nhau Đặc trưng cho nhóm này là: lactococcin G, lactococcin M/N, plantaricin EF, Plantaricin JK, enteriocin L50A và enteriocin L50B

- Nhóm IIc: Gồm các bacteriocin có phân tử lượng nhỏ, bền nhiệt Peptide

có nhóm thiol có hoạt tính

Nhóm III: nhóm này thể hiện vẫn chưa được mô tả kỹ Nhóm này bao gồm các protein lớn ( >30 kDa) không tan, dễ biến đổi bởi nhiệt độ Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng khuẩn Đại diện là Acidofilicin A, …

4 Cơ chế

CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP.

Bacteriocin được tổng hợp bởi ribosome, tích điện dương, lưỡng cực, có cấu trúc α- helical hay tấm β, hoặc cả hai và có thể chứa các thioether, các cầu disunful hoặc các nhóm thiol tự do Gen mã hóa cho sản xuất bacteriocin và miễn dịch nó được tổ chức thành một nhóm gen gọi là operon cluster Nhóm này được định vị trên nhiễm sắc thể, hoặc plasmid, hoặc transposon (nisin)

Quá trình tổng hợp Bacteriocin của các nhóm Bacteriocin khác nhau có sự khác nhau nhung điều có một điểm chung là được sinh tổng hợp giống như một tiền peptide

CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN

Các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại vi khuẩn Gram dương như

Bacillus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Các bacteriocin của

vi khuẩn lactic có thể không hiệu quả khi ức chế hoạt động của vi khuẩn Gram âm vì

màng ngoài của chúng gây cản trở cho hoạt động của bacteriocin Nhiều Bacteriocin

có tính diệt khuẩn chống lại một số loài và chủng họ hàng, nhưng một số loại lại có hiệu quả chống lại nhiều chủng từ các loài hoặc các chi khác Tuy nhiên, có một vài nghiên cứu đã công bố hoạt động của bacteriocin chống lại các vi khuẩn nhóm này

VD: Plantaricin 35d sản xuất bởi Lactobacillus plantarium chống lại

Aeromomas hydrophila, thermophylin sản xuất bởi Streptococcus thermophilus hoạt

động chống lại E.Coli và Yersinia entercolittica.

Mặc dù các tế bào vi khuẩn G- thường đề kháng với các Bacteriocin của vi

khuẩn lactic nhưng nếu dùng Bacteriocin với các chất khác hoặc kết hợp với các tác

nhân vật lí, để làm suy giảm chức năng màng, thì vẫn có khả năng ức chế chúng

Các cơ chế hoạt động khác nhau được đề ra cho các Bacteriocin khác nhau: ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông qua

sự hình thành các lỗ Tuy có thể các Bacteriocin có cơ chế hoạt động khác nhau nhưng màng tế bào thường là mục tiêu nhắm đến Sự tương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và peptide của Bacteriocin được cho là động lực cho các chuyển biến tiếp theo Sự có mặt của một cấu trúc α-helical lưỡng cực với các mặt phân cực đối diện nhau dọc theo một trục dài sẽ cho phép các Bacteriocin phản ứng với cả pha nước và pha lipit khi được liên kết với một bề mặt của tế bào vi khuẩn mẩn cảm, từ

đó dẫn đến sự làm yếu chức năng của màng và sự chết tế bào