BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨMBACTERIOCIN – CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ VI KHUẨNLACTIC

 Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác 1 GIỚI THIỆU  Năm

I- BACTERIOCIN

 Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm

đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác

1) GIỚI THIỆU

 Năm 1925 Gratia là người đầu tiên nghiên cứu và phát hiện ra khả năng

kháng khuẩn của E.Coli

 1950 thuật ngữ bacteriocin xác định dựa trên đặc tính của colicin (chất kháng đầu tiên được

tìm thấy)

 1980 bắt đầu bùng nổ nghiên cứu bacteriocin.

 Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhóm vi khuẩn lactic (LAB).

 LAB và các chất chuyển hóa của chúng không tạo nên tác dụng phụ khi được sử dụng trong

thực phẩm lên men

 Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định

 Hiện nay đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về bacteriocin đã được báo cáo trong các tài liệu tham khảo, song trình tự các amino acide đối với hầu hết các bacteriocin còn chưa được xác định

 Đã biết được trình tự của 45 loại bacteriocin

 Các bacteriocin có hoạt chất kháng khuẩn cao

đã từng nhầm lẫn với kháng sinh

Bacteriocin khác biệt với kháng sinh:

+ được tổng hợp bởi ribosom

+ phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh + tế bào chủ miễn dịch với chúng

+ phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh

+ có thể sử dụng trong bảo quản thực phẩm

Bacteriocin có thể được tạo ra bởi vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, song tính chất kháng khuẩn của vi khuẩn Gram dương mạnh hơn

2) các vi sinh vật sản sinh bacteriocin

nhóm vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactis là các vi khuẩn

G+ , chịu acid, không hình

thành bào tử, hình que hoặc

hình cầu.

 Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men cacbohydrate Đặc điểm này được ứng dụng trong chế biến thực phẩm lên men nhằm ngăn chặn sự phát triển của các tác nhân gây hư hỏng.

Vi khuẩn lactis

 Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng vi khuẩn lactic, đây là một hàng rào ngăn cản vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh.

 Bacteriocin của vi khuẩn LAB kháng vi khuẩn với nồng độ thấp

vi khuẩn lactis

lactobacillus Lactococcus

Lactococcus lactis

 Lactococus có dạng hình

cầu hoặc hình trứng,

thường bắt cặp hoặc thành chuỗi

 Là vi khuẩn Gram dương, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất bơ và pho mát.

 Chúng sản xuất nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn bao gồm

3)CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

 Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống

 Bacteriocin được tổng hợp bởi ribosome tích điện dương, lưỡng cực, có cấu trúc helical hay tấm β hoặc cả hai và có thể chứa các thioether các cầu disulfua hoặc các nhóm thiol tự do

α- Gen mã hóa cho sản xuất bacteriocin và miễn dịch được tổ chức thành một nhóm gen gọi là operon cluster

Quá trình tổng hợp Bacteriocin ở các nhóm Bacteriocin khác nhau có sự khác

nhau nhưng điều có một điểm chung là được sinh tổng hợp giống như một tiền

peptide.

Bacteriocin Vi sinh vật MW Đặc tính

Laticin 3714 Lc Lactis 2847 Bền nhiệt ở 100oC trong 10 phút ở pH 5 hay 90oC ở pH 7 trong 10

phút Nhạy cảm với trypsin, alpha-chymotrypsin, proteinase K và

pronase E, kháng pepsin

Plantaricin C Lactobacillus

Plantarum

3500-4000 Ổn định ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 100oC trong

60 phút hay 120oC trong 10 phút Hầu hết ổn định ở pH acid hoặc trung tính Nhạy cảm với pronase, trypsin và alpha-chymotrypsin, kháng lại pepsin, proteinase K, alpha-amylase và lipase

Một số vi sinh vật khác sản sinh bacteriocin

Bavaricin A Lactobacillus Bavaricus 3500-4000 Bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút Ổn định ở pH

bằng 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, kháng

lại với catalase [30].

Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola

JG126

4416 Ổn định ở pH bằng 2.0 sau khi lưu trữ 2 tháng tại 40C

bền nhiệt tại 1000C trong 120 phút tại pH 2-3, trở nên ít

ổn định hơn khi pH tăng Nhạy cảm với chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII

alpha-Variacin Micrpcoccus varians 2658 Ổn định ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt

1150C trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E, proteinase K, ficin, kháng

catalase [14].

4) phân loại bacteriocin

 Hầu hết các bacteriocin đều có tính cation, kỵ nước hay phân tử lưỡng cực Các bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau:

+ Họ vi khuẩn.

+ Trọng lượng phân tử.

+ Trình tự sắp xếp của chuỗi amino acid.

Nhóm I: gồm các lantibiotic (<5 kDa) Các bacteriocin nhóm này hoạt động theo cấu trúc màng tế bào Nó được

chia thành 2 nhóm nhỏ.

Nhóm Ia: gồm các peptide có hình dạng thon dài, hoạt động thông qua việc hình thành các lỗ trên

màng tế bào vi khuẩn Đại diện: epidermin, nisin, …

Nisin

Nhóm Ib: gồm các phân tử peptide có điện tích âm hoặc không mang điện tích Có hoạt tính kháng khuẩn

liên quan tới sự ức chế các enzyme đặc biệt Đại diện: mersacidin, actagardin, cinnamycin và mutacin A

Nhóm II: Các peptide nhỏ có trọng lượng phân tử <10 kDa, bền nhiệt, có chứa ít nhất một cầu nối disulfur cần thiết

cho hoạt động của chúng Nhóm này được chia thành 3 nhóm phụ:

Nhóm IIa: được chú ý nhiều nhờ hoạt động chống Listeria Chúng làm mất cân bằng điện tích và tạo lổ thủng

làm rò rĩ các chất phân hữu cơ và gây chết tế bào đích Đại diện là: Leucocin A, …

Leucocin A

Nhóm IIb: Gồm các bacteriocin được hình thành bởi phức hợp của 2 peptide khác nhau Đặc trưng cho nhóm

này là: lactococcin G, lactococcin M/N, Plantaricin, …

Plantaricin

Nhóm IIc: Gồm các bacteriocin có phân tử lượng nhỏ, bền nhiệt Peptide có nhóm thiol có hoạt tính.

Nhóm III: Bao gồm các protein lớn ( >30 kDa) không tan, dễ biến đổi bởi nhiệt độ Nhóm này bao gồm các enzyme

ngoại bào kháng khuẩn Đại diện là Acidofilicin A, …

Ngoài ra còn có thể có nhóm IV, là các bacteriocin phức hợp chưa được nghiên cứu kĩ càng

5) CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN

 Các bacteriocin chống lại vi khuẩn Gram dương và có thể không hiệu quả khi ức chế hoạt động của vi khuẩn Gram âm (vẫn có một số ngoại lệ) vì màng ngoài của chúng gây cản trở cho hoạt động của bacteriocin

 Nhiều Bacteriocin có tính diệt khuẩn chống lại một số loài và chủng họ hàng, nhưng một số loại lại có hiệu quả chống lại nhiều chủng từ các loài hoặc các chi khác.

Các tác động kháng khuẩn

 Các tế bào vi khuẩn G- thường đề kháng với bacteriocin nhưng nếu dùng bacteriocin

với các chất khác hoặc kết hợp với các tác nhân vật lí, để làm suy giảm chức năng màng, thì vẫn có khả năng ức chế chúng

Hiệu quả diệt khuẩn

Chúng khác nhau nhiều về phổ kháng khuẩn

Một chủng mẫn cảm đề kháng với một bacteriocin có thể trở lại mẫn cảm với một loại bacteriocin thứ hai

Bào tử mẫn cảm đề kháng với một bacteriocin sẽ mẫn cảm trở lại khi nảy mần và tăng trưởng

Ảnh hưởng

Độ tinh khiết

Tình trang sinh lý

Điều kiện thi nghiệm

Lượng bacteriocin

Các bateriocin chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố

Các phân tử Bacteriocin lúc đầu được hấp thụ lên bề mặt màng tế bào vi khuẩn và tạo thành các lỗ tạm thời, dẫn đến sự mất lực chuyển dời proton cũng như gradient

pH giữa hai phía của màng Điều này làm thay đổi tính thấm của màng, tạo ra sự thất thoát các phân tử dinh dưỡng nhỏ, cũng như ảnh hưởng tới sự vận chuyển các chất và tổng hợp ATP… Những sự ảnh hưởng này sẽ làm ức chế tế bào vi khuẩn hoặc giết chết chúng.

Có khả năng lớp I và lớp II sử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau.

Phương thức hoạt động của các bacteriocin nhóm III không được biết đến

là một peptit kháng khuẩn đa vòng, được cấu tạo từ 34 gốc axit amin

là chất kháng khuẩn do vi khuẩn Streptococcus lactic sản sinh ra

là bacteriocin có chứa lantibiotic do Lc.lactic sản xuất

II.NISIN

 Một số giai đoạn lịch sử của Nisin:

 Nisin do Rogers phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928

 Năm 1959 mới được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm ở Anh.

 Năm 1969 FAO,WHO đã công nhận nisin là một phụ gia thực phẩm an toàn

và được phép sử dụng cho người ở 50 quốc gia trên thế giới bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi.

 Ở Mỹ, nisin cũng đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công nhận là an toàn, được coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và dùng như một phụ gia thực phẩm từ năm 1988 cho đến nay.

1) Cấu trúc của nisin

 Cấu tạo phân tử gần giống như protein

 Trong thành phần của nisin có chứa các axit amin như :Leucin, Valin, Alanin, Methionin, Glycin, Prolin, Histidin, Lyzin, acide Glutamic, acide Aspartic, Serin, Lanthionine (Lan), Methyllanthionin (MeLan), Didehydroalanine (DHA) và Acide didehydroaminobutyric (Dhb)

2.Đặc điểm

a.Tính chất vật lý

 Phân tử lượng của một phân tử nisin là 3,4 KDa

 Có tính phân cực với đầu N kị nước và đầu C ưa nước

 Tính tan của nisin phụ thuộc vào pH môi trường

 Nisin bị bất hoạt bởi α-chymotripsin,pancreatin và subtilopeptidase

 Bị phá hủy trong tiêu hóa thức ăn

 Nếu kết hợp dùng nisin và acid sorbic thì trong bảo quản diệt được vi khuẩn vừa ức chế được nấm men và nấm mốc

b.Tính chất hóa học

 Nisin có phổ kháng khuẩn tương đối rộng

 Nisin ức chế chủ yếu vi khuẩn Gram(+)

 Nisin ức chế tế bào sinh dưỡng và cả bào tử vi khuẩn

 Hoạt tính sinh học của nisin phụ thuộc vào pH của môi trường

 Đơn vị đo hoạt độ của nisin IU(International unit),được định nghĩa là hoạt tính có trong 1µg

Nisaplin-nisin thương mại

đến sự tổng hợp ATP

3.Cơ chế hoạt động

iii ứng dụng của bacteriocin

trong thực phẩm

 Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là

tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư hỏng thực phẩm

 Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung cấp

những thực phẩm mới

 Các bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như

những protein khác trong thức ăn

 Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ảnh hưởng không

đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đường ruột

 Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới ba

dạng chính:

-Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là LAB) để tạo bacteriocin in situ Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định.

-Sử dụng như chất bảo quản thực phẩm.

-Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm.

-Dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm.

Nisin là một loại bacteriocin được ứng dụng phổ biến nhất

Chế phẩm dạng bột

+ Nisaplin

+ Novasin

Ngoài ra, còn có một loại bacteriocin được

thương mại hóa nữa là ALTA 2431

Trong công nghiệp, nisin được thu bằng cách nuôi Lactococcus lactis trong sữa, hoặc trong dung dịch đường dextrose.

Với các sản phẩm đồ hộp, nisin được dùng để giảm khả năng bền nhiệt của vi khuẩn và ngăn chặn quá trình thối rữa của sản phẩm

Davies (1997) đã thử nghiệm sử dụng nisin để kiềm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn L.monocytogenes gây bệnh trong phomai

Một ứng dụng chính của nisin là sản xuất phômai

Tại Mỹ, nisin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tự nhiên của bào tử Clostridium botulinum và sự

hình thành độc tố vi khuẩn này trong quá trình lưu trữ phô mai tiệt trùng, các loại trái cây, rau, thịt ở mức

cho phép

Tại Mỹ, nisin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tự nhiên của bào tử Clostridium botulinum và sự

hình thành độc tố vi khuẩn này trong quá trình lưu trữ phô mai tiệt trùng, các loại trái cây, rau, thịt ở mức

cho phép

Nisin được sử dụng ở châu phi gồm Ai Cập, Mauritius, Tunisia và Nam Phi, mặc dù ở Nam Phi chỉ được phép dùng trong chế biến pho mát truyền thống, pho mát mềm và các sản phẩm làm từ pho mát Nisin được sử dụng ở châu phi gồm Ai Cập, Mauritius, Tunisia và Nam Phi, mặc dù ở Nam Phi chỉ được phép dùng trong chế biến pho mát truyền thống, pho mát mềm và các sản phẩm làm từ pho mát.

Tại Việt Nam

thời gian bảo quản kéo dài từ 1 ngày (không có nisin) lên 2 ngày (có bổ sung nisin

hạn chế nấm men, nấm

mốc 6.000 lần và kéo dài

thời gian bảo quản từ 45

ngày lên 60