Phân lập và tuyển chọn chủng aureobasidium pullulans từ một số loại quả sinh tổng hợp ß glucan tan ngoại bào để bổ sung trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP NGÔ THU THUỶ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP β- GLUCAN TAN NGOẠI BÀO

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGÔ THU THUỶ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP β-

GLUCAN TAN NGOẠI BÀO ĐỂ BỔ SUNG TRONG SẢN

XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HÀ NỘI, NĂM 2021

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGÔ THU THUỶ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP β-

GLUCAN TAN NGOẠI BÀO ĐỂ BỔ SUNG TRONG SẢN

XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 8540101

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Hồ Tuấn Anh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Vũ Văn Hạnh

HÀ NỘI, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn đều khách quan, trung thực, là kết quả từ quá trình lao động của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Hồ Tuấn Anh và PGS.TS Vũ Văn Hạnh

Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn trong phần Tài liệu tham khảo

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm theo quy định về nghiên cứu khoa học cũng như nội dung của luận văn này

Hà Nội, ngày 01 tha ́ ng 12 năm 2021

HỌC VIÊN

Ngô Thu Thuỷ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, các đồng nghiệp và những người thân yêu trong gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Hạnh, PGS.TS Hồ Tuấn Anh đã quan tâm, ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n về cơ sở vật chất trong phòng thí nghiệm và trực tiếp hướ ng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học của luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp đã cho tôi những tri thức quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các anh chị tại Phòng các chất chức năng sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn tập thể lớp cao học công nghệ thực phẩm khóa 2019-2021, các bạn đồng nghiệp, gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, ngày 01 tha ́ ng 12 năm 2021

HỌC VIÊN

Ngô Thu Thuỷ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về β-glucan tan 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Cấu trúc của β-glucan tan 5

1.1.3 Ứng dụng của β-glucan tan 5

1.2 Nấm Aureobasidium pullulans 6

1.3 Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.4 Cơ sở thực tiễn 14

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 17

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.1 Vật liệu 18

3.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị, hoá chất 18

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 19

3.3.1 Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật 19

3.3.2 Phương pháp sinh học phân tử để định danh chủng phân lập 25

3.3.3 Xác định điều kiện và thành phần môi trường lên men của chủng chọn lọc 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng Aureobasidium pullulans spp có khả năng

sinh tổng hợp β-glucan tan 28

4.2 Định danh đến loài chủng Aureobasidium pullulans spp được tuyển chọn 38

4.3 Nghiên cứu điều kiện và thành phần môi trường lên men của chủng tuyển chọn 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tư ̀ Viết Tắt Tư ̀ Tiếng Anh Nghi ̃a Tiếng Việt

EPS Exopolysaccharide Polysaccharide ngoại bào

GRAS Generally Regarded As Safe Được coi là an toàn

LAB Lactic Acid Bacteria Vi khuẩn lactic

NC Negative Control Đối chứng âm

PC Positive Coltrol Đối chứng dương

PDA Potato dextrose agar Môi trường PDA

YPD Yeast peptone dextrose Môi trường YPD

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 4.1 Khả năng sinh exopolysaccharide (EPS) ngoại bào của

các chủng nấm men phân lập ……… 28

2 Bảng 4.2 Khuẩn lạc và tế bào của các chủng giả nấm men điển

hình phân lập tiềm năng có nhiều đặc điểm giống Aureobasidium

pullulans ……….………… …… 30

3 Bảng 4.3 Các biến và các giá trị trong thiết kế Box-Behnken của

các thành phần môi trường lên men trong sản xuất β-glucan … 40

4 Bảng 4.4 Ma trận của thiết kế Box-Behnken và các giá trị thực

nghiệm của sản lượng β-glucan của chủng H8

5 Bảng 4.5 Phân tích phương sai của mô hình bậc hai bề mặt phản

ứng để sản xuất β-glucan của chủng H8 ………… ……… 42

DANH MỤC HÌNH

1 Hình 1.1 Cấu trúc EPS dạng β-(1,3;1,6) ……… 5

2 Hình 1.2: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh

phải) và hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và

5 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các chủng giả nấm men ……… 20

6 Hình 3.2 Sơ đồ tách chiết EPS từ dịch lên men ……… 22

7 Hình 3.3 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào của

chủng vi sinh vật ……… 24

8 Hình 3.4 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh

của chủng vi khuẩn được phân lập ……… 25

9 Hình 4.1 Dịch lên men các chủng nấm men phân lập ……… 32

10 Hình 4.2 Mật độ tế bào và sinh khối của các chủng phân lập

qua các ngày lên men trên môi trường PM, nuôi lắc 180 rpm

ở 28oC ……… 33

11 Hình 4.3 Khối lượng β-glucan sản xuất từ các chủng phân

lập sau các ngày lên men khác nhau (3, 4, 5 và 6 ngày sau lên

men) ……… 34

12 Hình 4.4 Khả năng kháng một số chủng vi nấm kiểm định ở

trên đĩa PDA, ủ 28°C, 7 ngày của các chủng giả nấm men

tiềm năng (H8, 58543, 58539 41291, 12017, 43382) ……… 35

13 Hình 4.5 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của

dịch lên men chủng nấm men đen (H8, 58543, 58539 41291,

12017, 43382), ở 37°C, 24 giờ ……… 36

14 Hình 4.6 Khả năng sinh tổng hợp các enzyme của các chủng

nấm men phân lập (H5, H8, H12, H26, HY5, HY10) ủ ở

37°C, 24 giờ ……… 37

15 Hình 4.7 Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm men đen

phân lập H8 ……… 38

16 Hình 4.8 Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến

khả năng sinh tổng hợp β-glucan của chủng A pullulans H8… 39

17 Hình 4.9 Biểu đồ đường bao (bên trái) và biểu đồ bề mặt

phản ứng tương ứng (bên phải) về tác động của ba biến độc

lập đến việc tạo ra β-glucan ……… 44

MỞ ĐẦU

Hoạt động sản xua ́t chăn nuôi tho ̀i gian qua tại Việt Nam đã đạt được những thành quả tích cực do có sự chung tay Chính phủ, các cơ quan bộ, ngành, của nhiều tập đoàn, doanh nghiệp lớn, xây dựng được các chuỗi liên kết khép

kín, sản xua ́t với chăn nuôi an toàn sinh học và các mô hình chăn nuôi có hiệu quả

Trong những năm gần đây ở nước ta việc sử dụng thiếu kiểm soát nhiều chế phẩm kích thích, chất tăng trọng, chất tạo nạc, các loại thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy hải sản đã không chỉ làm giảm chất lượng và giá trị của các sản phẩm chăn nuôi, mà còn gây ảnh hưởng không tốt lên sức khỏe người tiêu dùng và tạo ra rào cản đối với các mặt hàng thực phẩm chế biến quan trọng (thịt lợn, cá da trơn, tôm đông lạnh ) xuất khẩu ra thế giới

Khi bổ sung kháng sinh vào khẩu phần ăn thì khả năng kháng kháng sinh đối với mầm bệnh gia tăng [13] Trước thực tra ̣ng đó, các nước thuô ̣c khối Liên minh Châu Âu đã cấm hoàn toàn việc sử du ̣ng kháng sinh trong thức

ăn chăn nuôi [5]

Việc tìm kiếm các sản phẩm sinh học với các tính kháng sinh và tăng cường miễn dịch có nguồn gốc tự nhiên đang trở nên rất cần thiết Chăn nuôi theo hướng an toàn sinh học ngày càng được chú trọng để tránh tồn dư kháng sinh, hoocmon và giảm hiện tượng kháng thuốc

Công nghệ sinh học ứng dụng trong chăn nuôi an toàn được công nhận rộng rãi như một mục tiêu quan trọng để ngăn chặn dịch bệnh Trong bối cảnh dịch bệnh luôn thường trực, việc áp dụng các giải pháp sinh học là mấu chốt để đảm bảo an toàn trong chăn nuôi

Các nhà khoa học phát hiện và bắt đầu nghiên cứu β-glucan từ những năm

1960 Bắt đầu từ việc nghiên cứu Zymosan, một hỗn hợp các thành phần từ thành tế bào nấm men bao gồm protein, lipid, polysaccharide được sử dụng khắp châu Âu để kích thích miễn dịch Beta-1,3/1,6 D-glucan chính là loại

polysaccharide có tác dụng chính kích thích miễn dịch Chiết xuất từ lúa mạch

và các loại ngũ cốc là beta 1,3/1,4 D-glucan có hoạt tính kích hoạt miễn dịch kém hơn so với beta-1,3/1,6-D glucan Beta-glucan có công dụng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên, tăng cường sức khỏe hô hấp, giúp tăng cường hoạt động của các đại thực bào và kích thích tăng tiết nhiều cytokines (chất hoạt hóa tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhập từ bên ngoài, giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hóa, phòng các bệnh đường ruột, bệnh do vi khuẩn,

vi rút [1]

Hiện nay, các nghiên cứu trong và ngoài nước nước đã được thực hiện chủ yếu từ β-glucan không tan, chủ yếu được tách từ thành tế bào nấm men bia, khối lượng phân tử (KLPT) cao, khó hòa tan, hiệu quả sử dụng chưa cao

Aureobasidium pullulans spp là vi sinh vật sinh tổng hợp được

exopolysaccharide ngoại bào (EPS) có cấu trúc dạng β-glucan tan

Một số vi khuẩn lactic cũng có thể sinh tổng hợp được EPS nhưng không

có cấu trúc β-glucan ngoại bào dạng tan Gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol trên người cũng được nghiên cứu Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường Từ khi Lactic Acid Bacteria (LAB) được "công nhận là vi sinh vật an toàn”, việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS ứng dụng trong thực phẩm Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat, Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp, giá thành sản xuất EPS tương đối cao [4]

Sàng lọc các chủng Aureobasidium pullulans có năng suất cao và tối ưu

hóa các điều kiện lên men của các chủng sẵn có để cải thiện sản xuất EPS là những phương pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề này

Xuất phát từ nhu cầu sản xuất chế phẩm sinh học β-glucan tan bổ sung vào sản phẩm thức ăn cho vật nuôi để hỗ trợ tăng cường sức khỏe miễn dịch, phòng chống bệnh, giảm sử dụng thuốc và đặc biệt là giảm thiểu sử dụng kháng

sinh trong chăn nuôi, đề tài của luận văn thạc sĩ này được xác định là “Phân lập

và tuyển chọn chủng Aureobasidium pullulans từ một số loại quả sinh tổng

hợp β-glucan tan ngoại bào để bổ sung trong sản xuất thức ăn chăn nuôi”

Trong đề tài này, chủng giả nấm men thuộc chi Aureobasidium được

nghiên cứu để lên men sản xuất β-glucan ngoại bào dạng tan có KLPT thấp, khác biệt với các sản phẩm đã được nghiên cứu β-glucan không tan (tách từ

thành tế bào men bia) có khối lượng phân tử cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về β-glucan tan

1.1.1 Khái niệm

Theo định nghĩa, β-glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D glucose), tạo nên bởi liên kết loại β-glycoside Vòng 6 D-glucose có thể gắn với phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D-glucose Phân tử β-glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D-glucose Hình thức phổ biến nhất của β-glucan đó là chứa các đơn nguyên D-glucose với các liên kết 1,3 và với chuỗi D-glucose gắn vào vị trí 1,6 Các loại này tạo thành β-glucan 1,3/1,6 Các nghiên cứu đã cho thấy dạng hợp chất (1,3/1,6) β-glucan có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3/1,4) β-glucan Một sự biến đổi khác đó là một vài hợp chất này tồn tại dưới dạng chuỗi sợi đơn, trong khi trục chính của những β(1,3)-glucan khác tồn tại ở dạng các chuỗi sợi đôi hoặc sợi ba Trong một vài trường hợp, các protein gắn vào trục β(1,3)-glucans cũng có thể tạo nên hoạt tính kháng thể β-glucan được biết đến như là chất bổ sung sinh học nhờ vào khả năng kích thích hệ thống kháng thể Các nhà nghiên cứu miễn dịch tại Đại học Louisville đã phát hiện ra rằng một cơ quan cảm quan trên bề mặt tế bào kháng thể bẩm sinh được gọi là

(D-cơ quan cảm quan bổ sung 3 (CR3 hoặc CD11b/CD18) giữ vai trò liên kết glucan, cho phép tế bào kháng thể nhận ra chúng

β-Exopolysaccharide (EPS) của chủng A pullulans, được cấu tạo bởi chuỗi

chính glucose liên kết (1,3) và mạch nhánh liên kết (1,6) có cấu trúc glucan tan với hoạt tính kích thích miễn dịch và được dùng ở nhiều quốc gia

β-Ngoài ra, dịch EPS ngoại bào của chủng A pullulans ức chế khối u, chống

nhiễm trùng trên chuột EPS là mucopolysacaride tan trong nước, có tính màng, cản khí tốt, xử lý dễ dàng, không độc hại vì sản phẩm được tạo ra từ: (i) lên men nguyên liệu thực vật; (ii) độ thấm oxy thấp, dễ bảo quản; (iii) không gây bệnh [36]

1.1.2 Cấu trúc của β-glucan tan

EPS dạng glucan tan do A pullulans tiết ra ngoại bào (khác biệt so với

β-glucan không tan từ nấm đảm, thành tế bào nấm men), được sử dụng làm thực phẩm chức năng mà không cần quá trình chiết xuất phức tạp Hình 1.1 trình bày cấu trúc dạng beta-1,3/1,6 D-glucan

Hình 1.1 Cấu trúc EPS dạng β-(1,3;1,6)

1.1.3 Ứng dụng của β-glucan tan

Exopolysaccharide dạng β-glucan tan được sản xuất bởi A pullulans có

một loạt các ứng dụng trong công nghiệp và thương mại trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăm sóc sức khỏe và y sinh EPS đã được sử dụng làm màng sinh học và chất kết dính trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

EPS dạng β-glucan có vai trò kích thích quá trình thực bào (phagocytosis) của tiểu thực bào (microphage) và đại thực bào (macrophage) Trong quá trình này, oxy được chuyển thành các anion oxy hóa mạnh như superoxide (O2-) và nitrogen oxide (NO) để diệt vi khuẩn và virus Đại thực bào được hoạt hóa bởi β-glucan gắn với thụ thể (receptor) kích hoạt miễn dịch của tế bào (Kumari and Sahoo, 2006)

Exo-polysaccharide (EPS) dạng β-glucan là sản phẩm có tác dụng tăng cường sức đề kháng, chống lại dịch bệnh gây ra bởi các nhóm vi khuẩn gây bệnh, ngăn chặn tác động của virus EPS có tác dụng giúp tăng cường bổ thể, interferon (IFN) và hoạt tính lysozyme tiêu diệt mầm bệnh khi xâm nhập

Việc sử dụng β-glucan bổ sung hàng bữa vào thức ăn chăn nuôi với lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích tiêu diệt các hại khuẩn và các virus gây bệnh, triệt tiêu các mầm bệnh và đồng thời tạo cơ hội cho lợi khuẩn trong đường ruột, bao gồm

cả các lợi khuẩn bổ sung vào đường tiêu hoá theo thức ăn và cả hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột phát triển mạnh hơn Điều trị bệnh bằng kháng sinh làm giảm nghiêm trọng hệ vi sinh vật bản địa trong đường ruột

Cơ chế hỗ trợ sức khoẻ vật nuôi của β-glucan được mô tả bao gồm: i/ Tạo

ra các bạch cầu để phá huỷ nguồn bệnh; ii/ Huy động tế bào tới vùng tổn thương; iii/ Tạo ra các trung gian, hoạt hoá oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ

Trong thuỷ sản, người ta dùng β-glucan thành công trong việc tăng cường miễn dịch với khuẩn gây bệnh thuộc nhóm Vibrio, thậm chí với virus đốm trắng trên một số loài tôm biển, tôm sú Penaeus môndon, tôm he Nhật bản

Marsupenaeusjaponicas, tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei, tôm he Ấn độ Fenneropenaeus chnensis, tôm thẻ chân vàng Farfantepenaeus californiensis và tôm SaoPaulo Farfantepennaeus paulensis Bổ sung 0,2% β-glucan trong khẩu phần có tác dụng tăng khả năng miễn dịch của tôm, tăng tỷ lệ sống với lóc bông, tăng tốc độ tăng trưởng và hệ số miễn dịch tăng Tăng tỷ lệ sống với cá hồi đại dương khi sử dụng hàng ngày chỉ với liều 1g/ kg thức ăn

Trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta dùng β-glucan bổ sung thức

ăn cho gà tỷ lệ 0,1% hạn chế được sự xâm nhập và phát triển Samonella trong gan và lá lách, thậm chí có khả năng hỗ trợ tăng trọng và hệ số chuyển hoá thức

ăn của gà β-glucan có tác động tích cực tới heo Cho heo cai sữa ăn 0,025% cải

thiện được tốc độ tăng trưởng và chống lại Steptococcus sui, E coli

Ngày nay việc bổ sung β-glucan vào thức ăn cho vật nuôi đã được phổ biến rộng rãi Chất lượng chế phẩm phụ thuộc nguồn gốc và phương pháp trích

ly

1.2 Nấm Aureobasidium pullulans

Chi Aureobasidium thuộc ngành Ascomycota, bộ Dothideales, họ

Dothideaceae Đến nay, Aureobasidium spp chứa bảy loài: A pullulans, A

leucospermi, A proteae, A thailandense, A melanogenum, A subglaciale và A nambiae Aureobasidium pullulans là một trong những loại nấm phổ biến nhất

trên trái đất Aureobasidium pullulans thuộc ngành nấm túi Ascomycota nhưng hình thái giống với nấm men, có màu đen và có thể được phân lập ở các vùng ôn đới, vùng nhiệt đới và vùng khô cằn, ở các môi trường khác nhau: nước, không khí, biển và các loại đất khác nhau Trong tự nhiên, chúng được biết là những loại nội ký sinh của nhiều cây thực vật (táo, nho, dưa chuột, đậu đỗ, bắp cải,…)

mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào của bệnh A pullulans có những thuộc

tính của nấm như sự sắp xếp bào tử đính, hình dạng, cấu tạo giống với

Ascomycotina

A pullulans là loại hiếu khí bắt buộc, ưa ấm, sinh bào tử, sinh sản hữu

tính bằng bào tử Thay đổi kiểu hình của loài này cũng rất đáng chú ý, hình thái khuẩn lạc có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn cacbon, tuổi của khuẩn lạc, nhiệt độ, ánh sáng và cơ chất với các khuẩn lạc thay đổi từ đồng nhất đến phân cụm Bên cạnh đó những hình thái của chúng cũng thích nghi với điều kiện môi trường khắc nghiệt như: khoảng pH rộng, độ muối cao, axit và kiềm, nhiệt độ thấp và nghèo dinh dưỡng, lượng tia UV cao Chúng được coi

là loài có khả năng chịu đa điều kiện khắc nghiệt [3] Chúng có khả năng sinh tổng hợp các enzyme và một số hợp chất pullulan ứng dụng trong y tế và phụ gia

thực phẩm, trong đó A pullulans là chủng phổ biến và có ứng dụng rộng rãi nhất

[17]

Các chủng A pullulans được phân lập từ các môi trường khác nhau có thể

sản xuất các enzyme quan trọng như amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase, mannose và transferase Chúng đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp vì khả năng sản xuất exopolysaccharide dưới dạng chất nhờn vô định

hình trên bề mặt tế bào vi sinh vật [31] Một số chủng A pullulans đối kháng với

nấm gây bệnh trên thực vật, chúng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới và ôn đới

A pullulans cũng sản xuất enzyme như amylase, protease, lipase, cellulase,

xylanase, β-1, 4- mannanase A.pullulans tạo protein đơn bào (single cell protein:

SCP) [29]

Hình 1.2: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình

ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái)

Hình thái của nấm Aureobasidium pullulans được miêu tả trong các thuật

ngữ đơn giản như là lưỡng bội, giả nấm men, hoặc nấm men đen, mặc dù trong thực tế nó có nhiều dạng và khả năng biểu diễn các dạng đó là vô số Bằng cách nuôi cấy giọt các đơn bào để nghiên cứu hình thái, người ta đã cho thấy có một vòng đời phức tạp

Hình 1.3: Vòng đời của A pullulans (Kocková-Kratochvílová et al., 1980)

1 Hình dạng thay đổi của các đơn bào

2 Phôi bào mầm nảy mầm, hình thành sợi nấm

3 Sợi nấm với bào tử trần nảy chồi (blastoconidia) phát triển bên cạnh nhưng blastoconidia cũng có thể được tạo ra trên các đầu cuối tận cùng của sợi nấm, trong sợi nấm, nội bào tử xảy ra trong các tế bào giữa các tế bào

4 Sợi nấm nối tiếp mỏng liên kết với nhau để tạo thành các sợi lông nối tiếp dày hơn, chúng đôi khi tạo thành gốc với các đầu rộng ra

5 Bào tử chlamydospore xen kẽ với sự sắp xếp giống như chuỗi hạt và có hắc tố trong thành tế bào; chúng hoạt động như bào tử vĩnh viễn, tồn tại trong điều kiện không thuận lợi, và melanin bảo vệ chúng khỏi tác hại của bức xạ UV

6 Bào tử chlamydospore tự do vách dày và có vách ngăn; vách của chúng với sắc tố melanin vỡ ra

7 Bào tử chlamydospore đen nảy chồi thành blastoconidia trong suốt

8 Bào tử chlamydospore không màu phân chia bởi vách ngăn, thành phần của chúng là dạng hạt, chúng cũng được thiết kế như là bào tử arthroconidia

9 Phôi bào tử nảy chồi làm phát sinh bào tử thứ cấp

Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên hình thái của chủng

Vòng đời đầu tiên được mô tả bằng chồi bào tử sinh ra các chồi bào tử khác thông qua vô số các chồi Vòng đời thứ hai là sự hình thành sợi nấm Khi

mà các chồi không còn đủ để tách ra từ tế bào mẹ

Nitrat cần thiết cho vòng đời này, sợi nấm quá dài làm cho khả năng phát triển và tồn tại độc lập của nó thấp đi Vòng đời thứ ba tế bào phồng lên với sự mọc chồi hoặc nảy chồi Giai đoạn này phụ thuộc vào nồng độ nuôi cấy và cần thiết bổ sung NH4+ làm nguồn nitơ và pH môi trường lớn hơn 4

Vòng đời thứ tư miêu tả sản phẩm của tế bào có vách ngăn mà sau đó mọc chồi, nảy chồi hoặc tạo thành chlamydospore Vòng đời này phụ thuộc vào nồng

độ canh trường và nồng độ nuôi cấy hoặc chỉ phụ thuộc vào nồng độ nuôi cấy Hai vòng đời cuối được miêu tả là sự nảy mầm của các chlamydospore Nhưng những nghiên cứu sau này trên môi trường rắn đã cho thấy sự tạo thành sản phẩm dạng sợi có thể trực tiếp thông qua sự nảy chồi của các chồi bào tử

Sự tạo thành các hình thái khác nhau của chủng phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng của môi trường và các yếu tố khác Việc điều chỉnh hình thái một phần nào đó của một vài chủng thông qua nguồn nitơ, cụ thể NH4+ làm tăng hỗn hợp đơn bào và dạng sợi, trong khi đó thì NO3- chỉ tạo sợi đơn bào Một vài nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ với các nồng độ khác nhau được thử thử nghiệm và cho thấy, rằng cystein và metionin có tác dụng tạo nên các khuẩn lạc dạng sợi, tuy nhiên chưa được xét tới ảnh hưởng của pH lên khả năng này của chủng

Theo nghiên cứu của Park, sử dụng môi trường rắn để nghiên cứu và không tìm thấy mối liên hệ nào giữa nguồn nitơ và đặc trưng hình thái của chủng này Tuy nhiên, ông cũng chỉ ra rằng NH4+ có khuynh hướng tạo khuẩn lạc dạng sợi nhiều hơn NO3- Nồng độ nitơ cũng ảnh hưởng đến việc hình thành cấu trúc

và việc chuyển từ dạng chồi bào tử sang dạng bào tử đòi hỏi nồng độ nhất định

về nồng độ nitơ [27]

Các chủng A pullulans được phân lập từ các môi trường khác nhau có thể

sản xuất các enzyme quan trọng như amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase, mannose và transferase Chúng đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp vì khả năng sản xuất pullulan [31]

1.3 Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

TS Nguyễn Văn Năm đã chủ nhiệm nhiệm vụ “Tách chiết β-glucan từ

thành tế bào nấm men bia và ứng dụng cho nuôi trồng thuỷ sản” dự án First,

2019, nhóm tác giả đã tách chiết thành công beta-1,3/1,6-D-glucan trên 80% từ nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng công nghệ enzyme Beta-glucan đã

được thử nghiệm tiền lâm sàng chứng minh tác dụng kích thích miễn dịch tại Đại học Y Hà Nội và Viện Công nghệ sinh học Kết quả tại Đại học Y Hà Nội cho thấy, beta-glucan có tác dụng làm tăng gấp đôi nồng độ kháng thể IgM chỉ sau 7 ngày sử dụng trên chuột bị suy giảm miễn dịch Đồng thời, thử nghiệm tại Viện Công nghệ Sinh học cũng chỉ ra sản phẩm có chứa 320mg beta-1,3/1,6 - D glucan có khả năng ức chế khoảng 17,7% sự phát triển của khối u ác tính trên chuột chỉ sau 1 tháng sử dụng Những bằng chứng này cho thấy beta-glucan của

Việt Nam có độ tinh khiết và chất lượng đạt chuẩn quốc tế.”; TS Lã Thị Huyền

đã hoàn thành đề tài “Tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men ứng dụng”

đề tài cấp thành phố Hà Nội năm 2015; TS Phạm Việt Cường đã thực hiện

nhiệm vụ “Tách chiết β-glucan và acid amin từ nấm men” đề tài cấp Bộ, 2007

Sản phẩm β-glucan từ các nhiệm vụ trên đều ở dạng không tan và có KLPT cao, khả năng kích thích miễn dịch, hiệu quả ứng dụng còn hạn chế do khả năng tiêu hóa hấp thu của cơ thể động vật đối với β- glucan không tan còn thấp

Các nghiên cứu khác ở trong và ngoài nước cho thấy, phân tử β-glucan từ thành tế bào nấm men có KLPT cao, khó hòa tan Beta-glucans từ thành tế bào nấm men có các nhánh β-(1,6) dài hơn với các mạch β-(1,3) bổ sung

Hạn chế của sản phẩm hiện hành dạng β-(1,3;1,6)-glucan từ một số loài

nấm khác như nấm men S cerevisiae và nấm đảm là không tan và có KLPT lớn

(~ 2.000 kDa) [7] Dạng β-glucan không tan cũng được tách chiết từ nhiều loài nấm thuộc chi Basidiomycetes có hoạt tính chống ung thư và chống dị ứng thông qua việc điều hòa IFN-γ Theo Akramienė cấu trúc đặc trưng này có thể gây ra những khó khăn trong việc chiết xuất Hoạt tính của phân tử β-glucan có KLPT lớn về kích hoạt bạch cầu, kích thích hoạt động thực bào, gây độc tế bào

và kháng khuẩn Dạng β-glucan không tan từ thành tế bào nấm men bia có KLPT cao (2000-5000 KDa) được tách bởi NaOH nồng độ cao (>5,0%), ở

>1000C, dùng ethanol và hóa chất kết tủa, lặp lại nhiều lần, độc hại với môi trường sản xuất Sản phẩm có độ sạch thấp (50-60%) Dạng β-glucan này có KLPT lớn, không tan trong dung dịch acid, bền ở dạ dày và ruột, tỷ lệ được hấp thụ rất thấp do thiếu enzyme tiêu hóa

Trong khi đó, dạng β-(1,3;1,6)-glucan tan từ A pullulans có KLPT nhỏ

(100 kDa) và tan tốt trong nước, hoạt tính kích thích miễn dịch cao hơn và có các đặc tính tương tự như dạng không tan như chống ung thư và dị ứng Glucan

có KLPT thấp có tác dụng tế bào ít hơn, glucan rất ngắn là không có hoạt tính

Sự khác biệt giữa liên kết trong phân tử β-glucan, cấu trúc và KLPT có liên quan đến độ hòa tan và hoạt tính sinh học

Các chủng A pullulans sinh tổng hợp một số hoạt chất sinh học như

β-glucan, pullulans, chất kháng khuẩn (aureobasidins), một số enzyme (amylase, cellulase, lipase, xylanase, protease, laccase, mannanase, β-glucosidase, petinolytic, chất kháng khuẩn liamocins, chất cạnh tranh và ức chế vi khuẩn gây bệnh siderophores, protein đơn bào (chứa >50% protein), kiểm soát sinh học,

chất thơm dễ bay hơi Chủng A pullulans sản xuất exopolysacarit ngoại bào như

pullulan và glucan tan chứa liên kết β-(1,3; 1, 6) là phụ gia thực phẩm và thực phẩm tăng cường sức khỏe

Polysaccharide ngoại bào của chủng nấm A pullulans có hai dạng sản

phẩm: polysaccharide dị hình và glucan trung hòa Glucan trung hòa được gọi là pullulan, chứa liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside Pullulan được xác định dựa trên cơ sở quay cực, thủy phân axit fomic, phổ hồng ngoại, phương pháp phân tích methyl hóa Người ta đã đưa ra tỷ lệ liên kết α-1,4 : α-1,6 glucoside trong phân tử pullulan là 3:2 dựa trên phương pháp methyl hóa và oxy hóa [12] Trong ứng dụng thực phẩm, nó có trạng thái GRAS (Generally Regarded As Safe) và có thể được sử dụng để sản xuất thực phẩm ít calo [42] Nó có thể đóng vai trò như một prebiotic [25], thay thế tinh bột trong thực phẩm lỏng cũng như rắn [19], chất độn có độ nhớt thấp trong đồ uống và nước sốt, vật liệu kết dính để kết dính các loại hạt với bánh quy, … [20] Pullulan được dùng để cải tiến chất lượng và hình dạng sản phẩm hoặc thêm 0,1 % pullulan vào các sản phẩm thịt nướng, thịt nhồi, xúc xích… để giữ hình dạng cho chúng Một số chất tạo màng sinh học được sản xuất từ vi sinh vật là cellulose, levan, pullulan, kefiran, xanthan, gellan, haloferax exopolysaccharides, polyhydroxyalkanoates, … [33]

Để giảm chi phí sản xuất, một số nguồn nitơ phức tạp như bã ngô, bánh hạt cải dầu đã loại bỏ dầu, cũng được sử dụng làm nguồn nitơ để sản xuất EPS Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguồn nitơ phức hợp này có lợi hơn cho việc cải thiện sản xuất EPS hơn là các nguồn nitơ vô cơ

Sự cạn kiệt nitơ được coi là tín hiệu cho sự hình thành exopolysaccharide

của quá trình lên men A pullulans [9] Các nguồn nitơ hoàn thiện khác như ure,

muối ammonium,… được sử dụng với thành công hạn chế cho sản xuất pullulan [39] Các nghiên cứu về sản xuất pullulan từ các nguồn cacbon và nitơ khác

nhau như chủng A pullulans NRM2 cho lượng pullulan là 25,1g/L sau 7 ngày trên môi trường chứa sucrose và peptone [28], chủng A pullulans phân lập từ

các mẫu hoa và lá cây có đặc tính chịu nhiệt cho khối lượng 37,1g/L pullulan sau

2 ngày trên môi trường chứa sucrose và ammonium sulphate (Singh et al 2012),

lên men trên nước mía cho 64g pullulan/L [17]

Sự tạo thành các hình thái khác nhau của chủng phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng của môi trường và các yếu tố khác Brown và cộng sự [8] đã công bố việc điều chỉnh hình thái một phần nào đó của một vài chủng thông qua nguồn nitơ, cụ thể NH4+ làm tăng hỗn hợp đơn bào và dạng sợi, trong khi đó thì NO3-chỉ tạo sợi đơn bào Nhưng mối liên hệ này không được khẳng định trong các nghiên cứu sau này Brown cũng đã thử nghiệm một vài nguồn nitơ hữu cơ và vô

cơ với các nồng độ khác nhau, ông nhận thấy cystein và metionin có tác dụng tạo nên các sợi, nhưng ông chưa xét tới ảnh hưởng của pH lên khả năng này của chủng

Theo nghiên cứu của Park [27] sử dụng môi trường rắn để nghiên cứu và không tìm thấy mối liên hệ nào giữa nguồn nitơ và đặc trưng hình thái của chủng này Tuy nhiên cũng chỉ ra rằng NH4+ có khuynh hướng tạo khuẩn lạc dạng sợi nhiều hơn NO3- Nồng độ nitơ cũng ảnh hưởng đến việc hình thành cấu trúc đòi hỏi nồng độ nhất định về nitơ

A pullulans có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau để tổng hợp

EPS Hầu hết các nghiên cứu cho thấy rằng sucrose là nguồn cacbon tối ưu để tổng hợp EPS, trong khi xylose và lactose không có lợi cho quá trình tổng hợp

EPS Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng A pullulans có thể sử dụng hiệu quả

glucose để tổng hợp EPS Nguồn cacbon là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất EPS, ngoài ra nguồn nitơ cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS Ion (NH4)+, đóng vai trò đáng kể trong sản xuất pullulan

Trong hầu hết các nghiên cứu, sự kết hợp của cao nấm men và (NH4)2SO4 được

sử dụng làm nguồn nitơ để sản xuất EPS [15, 30]

Thiết kế tổng hợp trung tâm được áp dụng để đánh giá điều kiện tối ưu của các biến đã chọn theo các nghiên cứu trên khoai lang như nguồn cacbon

chính cho chủng A pullulans MTCC 2195, sản lượng EPS tối ưu đạt 9,3 g/L

[26], trên bột đậu nành thủy phân và fructose của chủng NCP2016 đạt 59,8g/L [41]

1.4 Cơ sở thực tiễn

Phòng thí nghiệm của Phòng các chất chức năng sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam có đầy đủ các thiết bị, dụng cụ, hoá chất đảm bảo cho đề tài nghiên cứu

Beta-glucan đã được khoa học công nhận là một chất kích thích của hệ thống miễn dịch, nó có khả năng liên kết và kích hoạt các tế bào chuyên biệt có liên quan đến hệ thống miễn dịch Bằng cách kích hoạt các phản ứng, β-glucan tăng các khả năng miễn dịch của cơ thể chống lại nhiễm trùng và kiểm soát dịch bệnh [2]

β-glucan là một polysaccharide được tạo thành từ các phân tử glucose liên kết với nhau thành chuỗi mà con người và động vật không dễ dàng tiêu hóa Glucan được sử dụng làm phụ gia cho thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa, cung cấp chất đóng cục phân, cung cấp nguồn axit béo chuỗi ngắn qua lên men vi khuẩn trong ruột già, cải thiện sự tiêu hóa, giúp ích cho các tế bào ruột [7]

Quy trình thu nhận β-glucan đơn giản, dịch lên men của chủng A

pullulans spp được thu nhận, loại tế bào, dịch nổi được kết tủa với ethanol, tủa

thu được chứa β- glucan có độ sạch đạt > 90% Quy trình sản xuất thân thiện với môi trường do không dùng NaOH, không dùng acid vô cơ, không tốn năng

lượng để tách chiết Sản phẩm β-glucan tan từ chủng Aureobasidium pullulans

spp có độ sạch cao, KLPT thấp, β-glucan tan trong nước, dễ tiêu hóa và hấp thụ,

khả năng kích thích sinh miễn dịch mạnh và hiệu quả sử dụng cao

Beta glucan có tác dụng tăng miễn dịch, tăng đề kháng, giải độc, tăng trọng nhanh, hấp thụ độc tố nấm mốc trong thức ăn, giúp vật nuôi tự đề kháng được các bệnh gây ra do virus và vi khuẩn trên gia súc, gia cầm Bên cạnh một

số chế phẩm chứa beta glucan hiện có trên thị trường, việc nghiên cứu tạo ra chế

phẩm beta glucan tan từ chủng Aureobasidium pullulans spp để bổ sung vào

thức ăn chăn nuôi là một bước đi mới với những ứng dụng của khoa học và công nghệ trong ngành chăn nuôi đem lại thực phẩm sạch phục vụ cộng đồng

Một số thí nghiệm khảo sát của nhóm nghiên cứu cho thấy, trên một số loại quả táo và nho tại Hà Nội và Hưng Yên có thể phân lập được chủng giả nấm

men A pullulans spp có khả năng sinh β-glucan tan Từ các chủng được sàng

lọc và tuyển chọn, các nghiên cứu về đặc điểm sinh lý (môi trường dinh dưỡng

và lên men), đặc điểm sinh hoá (khả năng sinh tổng hợp β-glucan tan) và một số đặc điểm khác của chủng được tiến hành để xác định điều kiện lên men nhằm thu được sản lượng β-glucan tan cao nhất (hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ quy trình sản xuất β-glucan tan từ chủng Aureobasidium

Thu tủa, sấy, nghiền

Kiểm tra hàm

lượng

β-glucan tan

Sản phẩm β-glucan tan

Thu dịch nổi, tủa bằng cồn

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

Mục tiêu chung: Chọn lọc được 01 chủng thuộc chi Aureobasidium có khả năng

sinh tổng hợp glucan tan ngoại bào cao từ một số loại quả sinh tổng hợp

β-glucan

Mục tiêu cụ thể:

- Phân lập, tuyển chọn được 01 chủng và định danh đến loài thuộc chi Aureobasidium

- Chọn được môi trường lên men và điều kiện lên men sản xuất β-glucan tan

ngoại bào cao

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu

- Các mẫu quả táo và nho được thu thập tại huyện Đan Phượng và huyện Gia

Lâm của TP Hà Nội, huyện Văn Giang - Hưng Yên

- Các chủng của các vi khuẩn kiểm định như: E.coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus và các chủng

của nấm sợi: Aspergillus niger, Trichoderma sp., Botrytis cinerea, Fusarium

oxysporum, Penicillium sp , Phytophthora capsici được lấy từ bộ sưu tập các

chủng của Phòng Các chất Chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện

Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị, hoá chất

- Kính hiển vi Nikon YS100, máy ly tâm Hittich MIKRO 185, tủ nuôi lắc Wise

Cube, nồi khử trùng Tomy ES 315, bốc cấy, cân điện tử, tủ ủ, buồng đếm và một

số dụng cụ khác

- pH mét (dụng cu đo pH)

- Tỷ trọng kế, tủ sấy, bình hút ẩm

- Ống đong, cốc đong, pipet, que cấy, đầu côn, ống ly tâm, ống falcon, duran, đĩa

petri, bình tam giác các loại

- NaOH, HCl, …

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường hoạt hóa (g/L): Potato Dextrose Agar (PDA) (dịch chiết khoai tây

200, glucose 20, agar 20)

- Môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) có thành phần tương tự môi trường

PDA nhưng không bổ sung agar

- Môi trường PSB là môi trường PDB thay thế glucose bằng sucrose 20 g/L

- Môi trường lên men (PM) (g/L): sucrose 30, (NH4)2SO4 5, KH2PO4 5, MgSO4 0,4, NaCl 1, cao nấm men 0,4

- Môi trường MM tương tự như môi trường PM chỉ thay thế sucrose bằng rỉ

đường 60 g/L

- Môi trường YPD (g/L): Glucose 20, peptone 10, cao nấm men 10, pH 7

- Môi trường CJ bao gồm nước mía: nước (1:1 v/v)

Tất cả các môi trường được khử trùng ở 121oC trong 20 phút và để nguội trước khi sử dụng

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng Aureobasidium pullulans spp có

khả năng sinh tổng hợp β-glucan tan;

Nội dung 2: Định danh đến loài 01 chủng Aureobasidium pullulans spp được

tuyển chọn;

Nội dung 3: Xác định điều kiện và thành phần môi trường lên men của chủng

Aureobasidium pullulans spp tuyển chọn để sinh tổng hợp β-glucan tan

3.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

3.3.1 Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật

Bề mặt mẫu (quả táo và nho) được làm sạch hai lần bằng nước muối sinh

lý, sau đó lấy 2g mẫu cho vào ống falcon có chứa 18ml nước cất khử trùng Mẫu được lắc ở 180 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành pha loãng đến nồng độ đến 10-4 rồi cấy gạt trên đĩa petri chứa môi trường PDA thạch có bổ sung kháng sinh streptomycine 25mg/L để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Đĩa sau cấy được ủ ở nhiệt độ phòng Sau 2-3 ngày quan sát các khuẩn lạc, cấy chuyển để tách các dòng nấm men thuần Khi các khuẩn lạc đã thuần sau nhiều lần cấy chuyển để sàng lọc tiến hành giữ giống và bảo quản giống ở -20oC trong glycerol 30%

Sơ đồ và quy trình phân lập, làm thuần các chủng vi sinh vật được thể hiện trên hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các chủng giả nấm men

Các bước tiến hành phân lập chủng:

Bước 1: Mẫu để phân lập, mẫu hoa quả được thu thập tại vườn hoặc các chợ

Phần quả bị nấm tấn công được tách nhẹ nhàng và cho vào dung dịch nước muối sinh lý

Bước 2: Mẫu được nghiền mịn, pha loãng mẫu, pha loãng đến 10-4 bằng nước muối sinh lý

Bước 3: Cấy trải mẫu trên đĩa PDA, hút 100 µl dịch nghiền đã pha loãng, cấy

trải trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh streptomycin 25 mg/lít (để diệt khuẩn tạp), các đĩa sau cấy được ủ ở 28oC trong 2 ngày

Bước 4: Kiểm tra đĩa, các đĩa sau ủ 2 ngày được kiểm tra và nhặt các khuẩn lạc

là giả nấm men

Bước 5: Nhặt các khuẩn lạc riêng rẽ, các khuẩn lạc riêng rẽ dạng giả nấm men

được nhặt và làm thuần Các khuẩn lạc thuần được lên men để đánh giá khả năng

sinh β-glucan

Các khuẩn lạc riêng rẽ được nhặt ra để lên men trong bình tam giác dung tích 250 ml có chứa 80ml môi trường PM, nuôi lắc 180 rpm, 4 ngày, ở 28oC