TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH CÔNG cụ các PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH hàm LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin liệt kê các phương pháp xác địnhhàm lượng vitamin trong thực phẩm theo 2 nhóm vitamin tan trong nước và trong dầu.Dựa vào cấu trúc hóa học, trạng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ĐHQG TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/2013

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON2.COM

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

Vitamin được ghép bởi hai chữ: “vita” và “amine” “Vita” gốc Latinh có nghĩa là sựsống, “amine” là các acid amin Vitamin là những acid amine cần thiết cho sự sống

Cơ thể con người cần một lượng nhỏ Vitamin nhưng thiếu chúng cơ thể sẽ mắc bệnh.Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau,đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng Người

ta cũng tổng hợp một số lượng lớn vitamin bằng tổng hợp hoá học ở phòng thínghiệm

Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay người ta chia vitamin ra làm hainhóm

Vitamin tan trong nước chủ yếu tham gia và làm nhiệm vụ xúc tác trong quá trình sinhhọc gắn liền với sự giải phóng năng lượng ( các phản ứng oxi hoá - khử, sự phân giảicác hợp chất hữu cơ ) nghĩa là chúng hoàn thành chức năng năng lượng như nhómcác Vitamin B1 (tiamin), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (axit pantotenic),Vitamin B5 (nicotinamit), Vitamin B6 (piridoxin), Vitamin B7 (biotin), Vitamin B10(axit folic), các vitamin B12 (các cianocobalamin), vitamin B15 (axit pangaminic),vitamin C, vitamin P (citrin), vitamin U (S-metyl-metionin), Vitamin C,…

1.2 Các vitamin tan trong chất béo ( trong dầu và mỡ)

Vitamin hoà tan trong chất béo (trong dầu và mỡ) thì tham gia vào phản ứng tạo nêncác chất, tạo nên các cấu trúc, các cơ quan và các mô của cơ thể, nghĩa là chúng hoànthành chức năng tạo hình như nhóm các Vitamin A (A1, A2), D, K, E

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

Thực phẩm chứa nhiều loại vitamin, điển hình như

- Vitamin A có nhiều trong gan, cá, sữa

- Tiền tố vitamin A có nhiều trong cà rốt, rau xanh, quả mơ, dưa chột, quả đào có

màu vàng, ngô

- Vitamin D có nhiều trong cá, gan, lòng đỏ trứng, thịt lợn, chất béo của sữa

- Vitamin E có nhiều trong bột mì, quả hạnh nhân

- Vitamin C có nhiều trong cam, chanh, bưởi, rau xanh, cải bắp, cải xoong, xoài, củ

cải, hành tây, ớt ngọt, rau mùi, ổi

- Vitamin B1 có nhiều trong gạo, bột mì, bột đậu xanh, thịt gà, nấm

- Vitamin B6 có nhiều trong gan bê, ruốc thịt, thịt gà, ngô

- Vitamin B9 (hay còn gọi là axit pholic) có nhiều trong măng tây, rau xanh, đậu rau

xanh, gan, thịt gà, trứng

- Vitamin B12 có nhiều trong pho mát làm từ thịt dê và thịt cừu, cá, quả hạnh nhân,

cải xoong, dưa bắp cải, sữa tươi, sữa bột, sữa chua, sữa đậu nành, nước

khoáng

Vitamin B1 Vitamin B2

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

Vitamin B3 Vitamin B5

Vitamin B6 Vitamne B7

Vitamin B9 Vitamin B12

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

Vitamin C

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON6.COM

Các vitamin rất khác nhau về tính chất vật lý, tính chất hóa học Trong tự nhiên, các vitamin tồn tại ở dạng rắn hoặc dạng keo Ví dụ

- Vitamin B: nhóm các vitamin B đều tan tốt trong nước, thường ở dạng tinh thể

- Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, thường có mùi đặctrưng Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm (khoảng 4% nước)

- Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit acetic, nhưng

- khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen hay cloroform

và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng Vitamin B1 nóng chảy ở 2330C-2520C

- Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị phânhuỷ khi đun nóng

- Vitamin B2 ở dạng tinh thể màu vàng, có vị đắng, dễ bị phân hủy bởi ánh nắng mặttrời, nhiệt độ cao và không ổn định với tia cực tím Trong vùng UV Vitamin B2 hấp thu tại 2 bướcsóng 223,3 và 268,0nm Vitamin B2 hoà tan trong nước, ổn định trong môi trường axit, chịu nhiệt,phân huỷ nhanh trong môi trường kiềm Nó cũng bền vững khi đông lạnh, ở trạng thái khô Vitamin B2bền với nhiệt và axit

- Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và trongrượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ nóng chảy ở 1600C, pyridoxinhydrochloric nóng chảy ở 204-206 0C, bền vững khi đun nóng Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm,không bền trong môi trường có tính

oxy hóa Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng Chúng phân hủy nhanh khi chiếusáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì pyridoxin,pyridoxan và pyridoxamin bền hơn

- Vitamin C kết tinh không màu hoặc hơi vàng, rất dễ tan trong nước (300g/lít).Dung dịch nước 5% có pH=3 Có khi dùng dạng muối natri dễ tan trong nước hơn (900g/lít)

- Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON7.COM

· Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể

· Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến nhiềudưới tên bêta-caroten Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamin A để cơ thể có thể sửdụng

- Vitamin E: tồn tại trong tự nhiên với 8 dạng khác nhau, là chất dầu lỏng, khôngmàu, hòa tan rất tốt trong dầu thực vật, rượu etylic có thể kết tinh chậm trong rượu metylic nếu giữ ởnhiệt đọ thấp tới -35 oC Vitamin E khá bền với nhiệt, nhưng không bền với tia tử ngoại

Thông thường các vitamin trong cùng một nhóm có tác dụng bổ sung, hoàn thiện, làm tăng tác dụng của nhau Các nhóm đại diện cùng tác dụng như thế gồm có:

- Nhóm các vitamin làm tăng khả năng chống lại viêm nhiễm gồm có vitamin A, B1, B2, C, D, H, P

- Nhóm các vitamin bảo đảm cho hệ thần kinh hoạt động hoàn hảo gồm vitamin A, B1, B2, C

- Nhóm các vitamin khởi động việc tạo máu gồm có vitamin A, B2, B12, axit folic,

C, D

- Nhóm các vitamin chi phối tới việc tạo mô xương và răng gồm có vitamin A, B1,

C, D

- Nhóm các vitamin chi phối tới hoạt động sinh dục gồm có A, C, E

- Nhóm trợ giúp sự tăng trưởng: gồm tất cả các vitamin trừ vitamin H

- Vitamin phần lớn không tổng hợp được trong cơ thể mà phải có trong thức ănnguồn gốc động vật và thực vật Việc thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều rối loạn cho cơ thể

- Nhiều người cho rằng uống vitamin sẽ giúp tăng cường sức khỏe, nhưng khoa học

đã chỉ ra điều đó không hoàn toàn đúng, nhất là dùng quá liều

có thể gây ra những tác động bất lợi, làm suy giảm hệ miễn dịch của cơ thể Nhiều người tiêu dùng “thoảimái” sử dụng các loại vitamin hoặc các thực

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON8.COM

phẩm bổ sung vitamin vì nghĩ rằng “thừa còn hơn thiếu” mà không hề biết đến tác hại của việc sử dụng vitamin quá liều

- Các chuyên gia dinh dưỡng nói rằng cách tốt nhất để cơ thể hấp thụ các vitamin làthông qua một chế độ ăn uống lành mạnh với nhiều trái cây và rau Mọi người nên dùng vitamin bổsung chỉ khi họ không thể bổ sung đủ vitamin qua thực phẩm hoặc có nhu cầu thêm, và nên tham khảo

ý kiến bác sĩ hoặc chuyên gia dinh dưỡng uy tín về đúng liều để dùng

phẩm

Các vitamin đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu Đi kèm vớiviệc nghiên cứu các vitamin thì các phương pháp phân tich hóa lý, y sinh dùng để xácđịnh hàm lượng các vitamin từ các nguồn gốc khác nhau cũng đã phát triển khá đầy đủ

và chi tiết Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin liệt kê các phương pháp xác địnhhàm lượng vitamin trong thực phẩm theo 2 nhóm vitamin tan trong nước và trong dầu.Dựa vào cấu trúc hóa học, trạng thái tồn tại của các vitamin, hàm lượng các vitamin cótrong mẫu cần phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phòng thí nghiệm,các vitamin được xác định bằng rất nhiều cách khác nhau từ phương pháp phân tích cổđiển đến phương pháp phân tích hiện đại

Như đã nêu ở trên, các Vitamin thuộc nhóm này bao gồm các Vitamin B, VitaminC… Đặc điểm chung của nhóm này là có cấu trúc phân cực, tan nhiều trong nước Cácphương pháp xác định hàm lượng nhóm Vitamin này bao gồm:

Các Vitamin nhóm B và Vitamin C là những hợp chất phân cựcVitamin nhóm B như B1, B3, B6, B9, Vitamin C trong thực phẩm được phân tíchbằng phương phấp cực phổ trên thiết bị METROHM 797 VA COMPUTRACE củahãng METROHM (Thụy Sỹ)

Tiểu Luận Môn Học

- Đo mẫu: Hút 10ml đệm Acetate pH 6,5 + 0,5ml mẫu + 0,5ml Triton X-100 vào cell

đo và đem đi xác định trên thiết bị cực phổ METROHM 797 VA COMPUTRACE

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON10.COM

- Nền đệm axetat, pH=6,5

- Kết luận: Phương pháp cực phổ là một trong những phương pháp phân tích hữu cơnhanh và đạt được độ chính xác cao, ngoài ra chi phí cho máy móc thiết bị và hoá chất phù hợp vớiđiều kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

a) Nguyên tắc: được xây dựng trên nguyên tắc phản ứng oxy hóa khửIốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộn iốt với iođua và hình thành triiođua:

I2 + I- < > I3 Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:

-C6H8O6 + I3

+ H2O > C6H6O6 + 3I- + 2H+Vitamin C còn hiện diện trong dung dịch, thì triiotđua được chuyển thành ioniođua rất nhanh chóng

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON11.COM

Tuy nhiên, khi tất cả vitamin C đã bị oxy hóa, thì iốt và triiođua sẽ hiện diện trong dung dịch và phản ứng với tinh bột tạo nên một hỗn hợp màu xanh đen Màu xanh đen

là điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ

Quy trình chuẩn độ này thích hợp trong việc kiểm tra hàm lượng vitamin C trong viênthuốc vitamin C, nước ép quả, trái cây tươi, đông lạnh hoặc trái cây đóng gói vàrau quả Phương pháp chuẩn độ có thể thực hiện chỉ sử dụng dung dịch iốt vàkhông dùng iodate, nhưng dung dịch iodate ổn định hơn và cho kết quả chính xác hơn

· Dung dịch chỉ thị 1% tinh bột:

 Cho 0,5 g tinh bột hòa tan vào 50 ml nước cất nóng gần sôi

 Hòa tan hoàn toàn và để dung dịch nguội trước khi sử dụng

 Hòa tan 5 g KI và 0,268 g KIO3 trong 200 ml nước cất

 Thêm 30 ml acid sunfuric 3 M

 Cho dung dịch này vào ống đong 500 ml và pha loãng dung dịch bằng nước cất đếnvạch định mức 500 ml Hòa tan dung dịch hoàn toàn

 Cho dung dịch vào becher 600 ml

- Xử lý mẫu (kẹo vitamin C):

Tiểu Luận Môn Học WWW.DAYKEMQUYNHON12.COM

· Hòa tan 0,250 g kẹo vitamin C (acid ascorbic) trong 100 ml nước cất

· Dùng nước cất pha loãng thành dung dịch 250 ml bằng bình định mức

· Thêm 25,00 ml dung dịch mẫu xác định vitamin C vào bình erlen 125 ml

· Thêm 10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1 %

· Rửa sạch buret với một lượng nhỏ dung dịch iốt và sau đó cho dung dịch iốt và buret Ghi lại vạch thể tích dung dịch ban đầu trong buret

· Chuẩn độ dung dịch cho đến điểm dừng phản ứng, thấy dấu hiệu đầu tiên của màu xanh dương bền trong 20 giây khi lắc đều dung dịch

· Ghi nhận vạch thể tích dung dịch iốt trên buret Lượng iốt đã dùngcho ch uẩn độ chính là thể tích dung dịch iốt ban đầu trừ đi dung dịch sau chuẩn độ

· Làm lại thí nghiệm chuẩn độ ít nhất 2 lần Các kết quả chấp nhận sai khác 0,1 ml

Gọi Viot: thể tích dung dịch chuẩn Iot dùng chuẩn độ (mlk)

Niot: nồng độ đương lượng dung dịch Iot dùng chuẩn độ (N)

Vsample: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)

Nsample: nồng độ đương lượng Vitamin C trong mẫu đem chuẩn độ

Ta có:

Tiểu Luận Môn Học

Sự phát quang có thể được hiểu là năng lượng được tách ra khi các nguyên tử kích thích

bởi các chùm sáng có bước song tới hạn, tương tự như hiện tượng lân quang Tuy nhiên

sự khác nhau,giữa hai hiện tượng này là phát huỳnh quang giải phóng ngay lập tức năng

lượng ánh sáng hấp thụ từ một nguyên tử hay phân tử, còn lân quang giải phóng từ năng

lượng hấp thụ Cả hai đều là sự phát quang

Rất nhiều hợp chất giàu e, như hợp chấy chứa hai hoặc nhiều nối đôi liên hợp và do có

∏-electron nên phát huỳnh quang

Các e của một phân tử tồn tại trong điều kiện năng lượng thấp nhất (mức năng l ượng thấp

nhất của trạng thái cơ bản)vì các e này không ổn định trong bất cứ một bậc năng lượng

nào khác Trạng thái cơ bản này là trạng thái năng lượng bình thường của một phân tử

nếu như phân tử này bị chiếu bởi bức xạ tử ngoại và nó hấp thụ một số proton thì phân tử

này sẽ bị kích thíchđén một trạng thái năng lượng cao hơn Hiện tượng này cũng giống

như hiện tượng đã xảy ra khi một e hoặc các e thu năng lượng và nhảy từ trạng thái năng

lượng cơ bản đến mức năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đầu tiên

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

14

Theo lí thuyết lượng tử thì mức năng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một

số trạng thái xác định ,cho nên chỉ có ánh sáng với những tần số tương ứng với năng

lượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ

Bởi vì một trong rất nhiều trạng thái kích thích có thể được hình thành, nên các hợp chất

có thể hấp thụ ánh sáng với các tần ssó khác nhau

Quá trình hấp thụ xảy ra rất nhanh khoảng 10-15 giây Electron se duy trì ở trạng thái kích

thích từ 10-8 ddeens 10-4 giây Sau đó nó sẽ bắt đàu nhảyvề trạng thái cơ bản quá trình

này có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng tỏa ra dưới dạng nhiêựt hoặc e

rơi xuống mức dao động thấp nhất của trạng thái cơ bản ,đồng thời giải phóng một photon

năng lượng và phát huỳnh quang Do một lượng năng lượng dã bị mất trước khi e nhảy

xuống trạng thái năng lượng thấp hơn ,nên năng lượng giải phóng dưới dạng photon phải

có ít năng lượng hơn photon kích thích

Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát Nhiều hợp

chất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnh

quang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,N

hoặc S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên Tuy nhiên một số nhóm có

thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điều

trên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khác

nhau Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phát

quang tại cùng một bước sóng sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợp

chất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính Nếu có sự

nghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự

xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữ

liệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này

Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quá

trình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

15

không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụ

cùng một bước sóng kích thích khác Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hoặc

thay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó

Phép đo huỳnh quang cũng có thể được dùng trong phân tich dịnh lượng vì cường độ

huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của hợp chất phát quang Tuy nhiên mối liên quan

trực tiếp này chỉ đúng với dung dịch rất loãng vì ánh sáng phát ra từ những chất phát

quang đều phải di qua dung dịch trước khi đến máy đo quang vì thế một lượng ánh sáng

sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử khác trong dung dịch Nồng độ càng cao thì lượng ánh sáng

phát xạ bị hấp thụ càng lớn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tăng tiến tới bão hòa

và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lí do này mà đường chuẩn như

vậy thường được dùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang ) Do đó một giá trị của

cường độ huỳnh quang có thể sẽ tương ứng với hai giá trị nồng độ của chất phát quang

Chất tan có ảnh hưởng đến tính chất phát huỳnh quang của một hợp chất những chất tan

khác nhau có thể làm tăng hoặc giảm cường độ phát quang Cũng như vậy hằng số điện

môi thể hiện mức độ phát quang tự do của các điện tử л và do đó thể hiện sự thay đổi

bước sóng cực đại huỳnh quang Dung dịch đệm có xu hướng gây ảnh hưởng dập tắt bước

sóng của một số chất và ảnh hưởng này tăng khi dung dịch đệm tăng lên

Cường độ phát huỳnh quang của một hợp chất dễ bị ion hóa sẽ thay đổi theo trạng thái ion

hóa mà quá trình ion hóa này lại phụ thuộc độ PH Nhiều hợp chất sinh học có khả năng

phát huỳnh quang tự nhiên hoặc pháy huỳnh quang hóa học dễ bị ion hóa, cường độ phát

huỳnh quang của những chất này phụ thuộc vào PH Một số hợp chất bị ion hóa bởi ánh

sáng và do đó phát huỳnh quang

Cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng Nhiệt độ càng cao thì tốc độ

chuyển động của các phân tử trong dung dịch càng tăng Do đó năng lượng hấp thụ

chuyển thành nhiệt chứ không phải là huỳnh quang

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

16

Với một số chất không bền trong dung dịch ,tốc độ phân hủy quang phụ thuộc vào cường

độ ánh sáng Phần lớn các chất phát huỳnh quang phân hủy thành các chất không phát

huỳnh quang Tuy nhiên một số phân hủy thành chất có độ huỳnh quang thậm chí còn cao

hơn chất ban đầu

Phần lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mở được ở ghiữa nguồn sáng và mẫu

thí nghiệm, khe này được mở ngay trước khi đo để giảm tối thiểu sự phân hủy quang

Sự dập tắt xảy ra khi sự phat huỳnh quang của một chất bị giảm bởi một chất khác Có hai

loại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật ảnh hưởng màng lọc xảy ra khi

màng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hoặc ánh sáng phát xạ còn sự dập tắt thật thì xảy ra

khi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biến

thành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dập

tắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang Có

thể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trong

dung dịch Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi

Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và

độ nhạy tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so với

phương pháp quang phổ hấp thụ

Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bước

sóng của ánh sang kích thích Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứn

ánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,cho

nên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp trong

các kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác,

do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau

Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

17

· Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ

· Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ không phải

là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ

Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàm

lượng vitamin B2

Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B2) là chất có màu vàng-xanh lá

cây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang riboflavin có nhiều trong tế

bào động vật và thực vật nó bền trong muối khoáng và phần lớn các tác nhân oxi

hóa,nhưng lại không bền trong dung dịch kiềm.nó rất nhạy cảm với tia khả kiến và tia tử

ngoại nên các thao tác được thực hiện trong ánh sáng dịu hoặc trong các dụng cụ thí

nghiệm thủy tinh có độ quang hóa thấp

Trong các tế bào sống, riboflavin thường kết hợp với axit photphoric hoặc cả với axit

adenylic (FMN hoặc FAD) Cả 2 đều có thể kết hợp một số protein đặc thù để hình thành

các enzyme oxi hóa Trong một số sản phẩm ( sữa), riboflavin tồn tại dưới dạng tự do có

thể thẩm tách cũng như dạng coenzyme

Trong phần lớn các quy trình riboflavin, cần thiết phải xử lý các sản phẩm tự nhiên với

axit hoặc enzyme để thu được giá trị tối đa Bước xử lý này giải phóng riboflavin khỏi

phức chất protein và giúp cho việc tách chiết dễ dàng hơn

Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ quét tự vi Dùng

máy quang phổ huỳnh quang quét có điều khiển để điều chỉnh sự phát huỳnh quang của

riboflavin khi có mặt những chất gây cản trở, những chất này theo lý thuyết có ảnh hưởng

đến các chất chuẩn và mẫu thí nghiệm Do đó cường độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ với

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

18

nồng độ của riboflavin trong dung dịch loãng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênh

lệch độ huỳnh quang trước và sau sự khử Natritiosunfit (Na2S2O4 )

- Quy trình tách chiết

 Cân 6.0 g thực phẩm (dự tính là chứa 5 đến 10 microgam riboflavin), nghiền bằng cối

sứ

 Đổ vào bình nón 100 ml và them 50 ml dung dịch HCl 0.01M lức bình để tẩm ươt hết

ngũ cốc sau đó đậy nắp bình bằng giấy nhôm (tốt nhất là giấy bạc) để tránh riboflavin bị phân hủy bởi

ánh sáng Đặt trong nồi cách thủy đang đun sôi khoảng 1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần kiểm tra mức

nước mỗi lần lắc bình, không để nước cạn

 Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnh đến

6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)

Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin

 Ngay lập tức thêm HCl 1M để giảm PH đến 4.5.Li tâm bằng ống li tâm thủy tinh 100

ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút

 Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức

- Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết

 Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằng máy

trộn

Tiểu Luận Môn Học

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

19

 Lấy 2 ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩn

riboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều

 Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút

 Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO4 3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút

 Cho 0.5 ml H2O2 3% vào mỗi ống và trộn đều màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10 giây

- Đo độ huỳnh quang của dịch chiết

 Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thích phải

được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer)

 Xác định cực đại của bước sóng phát xạ và bước sóng kích thích của dung dịch chuẩn

riboflavin (nồng độ 1 microgam/ml riboflavin) giá trị cực đại cho kích thích nên có giá trị là 450 nm

Giá trị cực đại cho phát xạ là 530nm

F =2.303.Ф.p0.έ.b.cTrong đó: Ф –hiệu suất lượng tử

P0 –cường độ tối

έ – độ hấp thụ phân tử b –độ dài đường dẫn c – nồng độ

Phương trình này chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ thấp ở phương trình

trên,cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với cường độ tối p0 và nồng độ c độ huỳnh quang

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON