BÁO cáo THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN tử bài 4 ĐỊNH TÍNH BỆNH đốm TRẮNG và BỆNH còi TRÊN tôm BẰNG bộ KIT SHPT

Tổng quan:I.1 Bệnh đốm trắng WSSVWhite Spot Syndrome Virus: Virus đốm trắng WSSV là tác nhân gây bệnh đốm trắng ở tôm nước mặn và tôm nước ngọt.. Tôm bị bệnh đốm trắng WSSV thường có nhữ

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN TỬ

BÀI 4: ĐỊNH TÍNH BỆNH ĐỐM TRẮNG

VÀ BỆNH CÒI TRÊN TÔM BẰNG BỘ

KIT SHPT

Người hướng dẫn: TS PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG

Người thực hiện: NGUYỄN HƯƠNG TRÀ - 61503034

THÁI NHẬT ANH - 61800913

ĐỖ THỊ BÍCH NHIÊN - 61800979

VÕ KHÁNH ÂN - 61800912 HUỲNH THỊ MINH THƯ – 61800999

Nhóm : C7-N2

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

1.1 Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus): 1

1.2 Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus): 1

1.3 Phương pháp Mutiplex PCR 1

II Vật liệu, phương pháp: 2

2.1 Thiết bị 2

2.2 Hoá chất 2

2.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn: 2

2.2.2 Bộ Kit PCR 3

2.2.3 Bộ Kit điện di 3

2.3 Phương pháp: 3

2.3.1 Thu và bảo quản mẫu: 3

2.3.2 Tách chiết DNA 4

2.3.3 Thực hiện phản ứng PCR 4

2.3.4 Chạy điện di kết quả 5

III Kết quả biện luận: 7

3.1 Kết quả chạy điện di 7

3.2 Biện luận, kiến nghị 7

I Tổng quan:

I.1 Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus):

Virus đốm trắng (WSSV) là tác nhân gây bệnh đốm trắng ở tôm nước mặn và tôm nước ngọt

Tôm bị bệnh đốm trắng (WSSV) thường có những triệu chứng ban đầu như bơi trên mặt nước, tập trung thành từng đàn quanh bờ ao và sẽ chết hàng loạt trong vòng từ

5 -7 ngày sau đó với những dấu hiệu trên cơ thể như đốm trắng, rụng râu, thân có màu đỏ và trong ruột trống rỗng

I.2 Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus):

Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus

monodon, cấu trúc nhân (acid nucleoic) là ds ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que.

Khi tôm mới nhiễm virus MBV, dấu hiệu bệnh không biểu hiện rõ rμng Khi tômng Khi tôm nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có biểu hiện một số dấu hiệu sau:

- Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh trưởng chậm (chậm lớn)

- Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám (ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi)

- Gan tuỵ teo lại có mμng Khi tômu trắng hơi vùng, thối rất nhanh

- Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao

I.3 Phương pháp Mutiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm

II Vật liệu, phương pháp:

II.1Thiết bị

- Máy vortex

- Máy ly tâm eppendorf

- Máy PCR

- Máy điện di + đèn UV

- Bộ kit định tính bệnh trên Tôm

- Bể điều nhiệt

- Erlen 250ml (dùng để tăng sinh mẫu)

- Becher 100ml

- Micropipette 100-1000μng Khi tôml, 10-100μng Khi tôml, 0.5-10μng Khi tôml

- Eppendorf 1,5 ml – đã hấp khử trùng

- Eppendorf 0,2 ml – đã hấp khử trùng

- Đầu tip (trắng, vàng, xanh) – đã hấp khử trùng

II.2Hoá chất

II.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn:

 Solution 1: Dung dịch ly trích Alkaline I:

- 50 mM Glucose: duy trì độ thẩm thấu

- 25 mM Tris-HCl (pH 8): Làm thành tế bào vi khuẩn yếu đi

- 10 mM EDTA (pH 8): Ức chế DNAses

- 100 μng Khi tômg/ml RNase A: Phân hủy RNA

 Solution 2: Binding buffer : Gel solubilization buffer:

- 6 M Guanidine Thiocyante

- 50 mM Tris-HCl

- pH 7,5 20 mM

- EDTA pH 8,0

 Solution 3: Washing buffer

- 100 mM NaCl

- 1 mM EDTA pH 8,0

- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 50% Ethanol

- Rửa tạp chất trong quá trình tinh sạch DNA từ gel agarose

 Solution 4: Elution buffer: TE (pH 8)

- 10 mM Tris–HCl

- 1 mM EDTA

- Hòa tan và bảo vệ DNA hoặc RNA khỏi sự phân cắt

 Ethanol 70%

II.2.2 Bộ Kit PCR

- E.coli PCR mix

- Chứng dương E.coli

- Chứng âm

II.2.3 Bộ Kit điện di

- Thang DNA 100bp:

- 6X GelRed Loading Buffer

- Tae 50X

- Agarose:

II.3Phương pháp:

II.3.1 Thu và bảo quản mẫu:

- Đối với tôm thương phẩm: lấy mang, chân bơi, gan tuỵ, bao tử, đường ruột (lượng mẫu không quá 0.5g)

- Đối với tôm bố mẹ: lấy mẫu phân hoặc một phần gốc chân bơi (lượng mẫu không quá 0.5g)

- Mẫu phải được lấy khi tôm còn sống và được bảo quản ngay trong cồn 96% nếu chưa tách chiết ngay

Thế tichs cồn hơn 3 lần thể tích mẫu Sau khi cố định, mẫu giữ ở nhiêtj độ -20

II.3.2 Tách chiết DNA

- Cân một lượng mẫu không quá 0.5g cho vào tube 1.5mL Thêm vào 250 L

Solution 1 Nghiền mẫu thịt bằng chày nghiền mẫu

- Cho thêm 250L Solution 2 vào, tiếp tục nghiền đến khi mẫu đồng nhất hoàn

toàn

- Thêm 500L Solution 3( đã bổ sung Ethanol), vortex đều.

- Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút và chuyển 500L dịch nổi sang cột

silica đặt sẵn trong tube 2mL Ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Đặt lại cột vào tube 2mL cũ Rửa với 500L Solution 3 và ly tâm tốc độ

8000rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Chú ý: Rửa thêm 1 lần nữa để tăng độ tinh sạch.

- Làm khô cột bằng ly tâm 8000rpm trong 1 phút

- Chuyển cột sang tube 1.5mL Thêm 50L Solution 4 và ủ ở nhiệt độ phòng 2

phút Ly tâm ở tốc độ 8000rpm trong 2 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới

- Lưu trữ ở -20°C

II.3.3 Thực hiện phản ứng PCR

- Rã đông ống WSSV/MBV PCR Mix, trộn đều, sau đó spindown để toàn bộ chất lỏng đi xuống đáy

- Hút mẫu:

 Mẫu 1: Chứng dương PCR :

Hút 20L PCR mix + 5L chứng dương E.coli

 Mẫu 2: Chứng âm PCR:

Hút 20L PCR mix + 5L nước cất PCR

 Mẫu 3: Chứng âm tách chiết:

Hút 20L PCR mix + 5L chứng âm tách chiết

 Mẫu 4: PCR mẫu:

Hút 20L PCR mix +5L DNA mẫu

- Đóng nắp PCR và spindown để chất lỏng di chuyển xuống đáy trước khi đặt

vào máy

- Set chu trình nhiệt:

1 chu kỳ - 95 oC – 3 phút

45 chu kỳ - 95 oC – 10 phút

60 oC - 20 giây

72 oC - 40 giây

1 chu kỳ - 72 oC - 3 phút

-4 – vô cực

II.3.4 Chạy điện di kết quả

Bảng 1: Pha DNA ladder

Nồng độ mẹ Nồng độ con V hút DNA ladder 2L 2L 2L Gel Red loading

Nước cất To 6L 3L

Bảng 2: Pha mẫu chạy điện di

V hút Gel Red loading

dye Chứng âm PCR 10L 2L Chứng âm tách

chiết

10L 2L

PCR mẫu 10L 2L Chứng dương

PCR

10L 2L

 M(Marker): Ladder (5 µL) dài 1000 bp

 Lane 1:Chứng âm tách chiết ( 7µL)

 Lane 2:Chứng âm PCR (7 µL)

 Lane 3:Mẫu (7 µL)

 Lane 4:Chứng dương (1 µL)

III.2 Biện luận, kiến nghị

III.2.1Biện luận kết quả:

- Kết quả dự kiến:

+ Mẫu dương tính với WSSV: xuất hiện băng kích thước 526bp (giữa vạch 500bp và 600bp), nằm trên cùng

+ Mẫu dương tính với MBV: xuất hiện băng với kích thước 200bp (giữa vạch 100 và 200)

+ Chứng nội xuất hiện băng với kích thước 102bp

+ Vạch mờ phía dưới vạch 100bp là vạch mồi còn thừa lại sau phản ứng + Trong chứng dương bao gồm sẵn DNA tôm, MSSV và MBV

STT WSSV

(526bp)

MBV (200bp)

IC (102bp)

Kết luận

1 + + -/+ Mẫu dương tính cả WSSV/

MBV

2 + - + Mẫu dương tính WSSV

3 - + + Mẫu dương tính MBV

4 - - + Mẫu âm tính

5 - - - Không thể kết luận

- Kết quả dựa vào chạy điện di

+ Chứng âm PCR, chứng âm tách chiết, mẫu và chứng dương đều xuất hiện

vạch ở 102bp – có chứng nội

+ Mẫu không có vạch ở 526bp và 200bp

 Kết luận: mẫu âm tính với cả WSSV/ MBV

III.2.2Sự cố xảy ra và cách khắc phục

Sự cố Nguyên nhân Khắc phục

Không xuất hiện vạch

nào ở tất cả các giếng, kể

cả chứng dương

Cài đặt sai chương trình PCR

Thiết bị PCR gặp sự cố Hoá chất của kit không được bảo quản đúng chỉ định

Kiểm tra lại chương trình chạy PCR

Kiểm tra lại hoạt động của thiết bị PCR

Kiểm tra lại điều kiện bảo quản và hạn chế sử dụng của kit

Chứng dương bình

thường mẫu xét nghiệm

không cho vạch DNA, kể

cả vạch của chứng nội

Hàm lượng DNA thu được quá cao

Có chất ức chế trong mẫu

Pha loãng 10 lần dịch DNA và thực hiện lại phản ứng PCR

Bổ sung một lượng nhỏ chứng dương mục tiêu vào mẫu tách chiết Nếu kết quả vẫn âm tính thì kết luận có chất ức chế trong mẫu Tiến hành tách chiết lại hoặc xử lý như cách 1

Xuất hiện vạch DNA

trong chứng âm, chứng

âm tách chiết

Micropippet bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR

Vệ sinh hoặc thay Micropippet mới, sử dụng filter tip

Môi trường loàm việc bị nhiễm DNA

Sử dụng hoá chất PCR khác

Yêu cầu bộ phận kĩ thuật đến vệ sinh môi trường làm việc