NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và HOẠT TÍNH SINH học của các hợp CHẤT TRITERPEN TRONG lá cây SUM điểm đỏ (adinandra rubropunctata)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN TRONG LÁ CÂY SUM ĐI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN

TRONG LÁ CÂY SUM ĐIỂM ĐỎ

(Adinandra rubropunctata)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRITERPEN

TRONG LÁ CÂY SUM ĐIỂM ĐỎ

(Adinandra rubropunctata)

Mã số : 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Nguyễn Quang Huy

2 TS Lê Nguyễn Thành

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cho luận văn, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của rất nhiều tập thể và các cá nhân

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Nguyễn Quang Huy – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự

nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS Lê Nguyễn Thành – Viện Hóa sinh biển,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao đề tài và quan tâm tạo mọiđiều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Nguyễn Thành, NCS Vũ Thị Kim Oanhcùng với các cán bộ Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển– Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, hết lòngchỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo trường Đại họcKhoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, manglại cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tạitrường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luônủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thànhluận văn Do những hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn khôngtránh được những thiếu sót nên rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô đểtôi có thể bổ sung, hoàn thiện kiến thức phục vụ cho các công việc sau này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Học viên

PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Phạm Thị Lan Phượng, học viên cao học khóa 26 Trường Đại họcKhoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinhhọc thực nghiệm, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫnkhoa học của PGS.TS Nguyễn Quang Huy và TS Lê Nguyễn Thành

2 Công trình này không trùng lập với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã đượccông bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Người viết cam đoan

PHẠM THỊ LAN PHƯỢNG

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 10

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Tổng quan về họ Pentaphylacaceae 12

1.2 Tổng quan về chi Adinandra 13

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Adinandra Error! Bookmark not defined. 1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Adinandra 13

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Adinandra 14

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Adinandra 19

1.3 Tổng quan về cây Sum điểm đỏ 22

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Sum điểm đỏ 22

1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Sum điểm đỏ 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương tiện nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 26

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào 27

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính α-glucosidase 29

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31

3.1 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập 31

3.1.1 Chiết xuất 31

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ dịch chiết ethyl acetat Error! Bookmark not defined. 3.1.3 Dữ liệu phổ các hợp chất thu được 33

3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 34

3.3 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập 493.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase các hợp chất phân lập.

Error! Bookmark not defined 3.5 Một số bàn luận chung về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Error!

Bookmark not defined.

3.5.1 Về thành phần hóa học Error! Bookmark not defined 3.5.2 Về tác dụng sinh học Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CÁC TỪ

1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic

13 C-NMR 13 Carbon Nuclear Magnetic

Nồng độ gây ra tác động sinhhọc cho 50% đối tượng thửnghiệm

Ionization - Mass Spectrometry

Phổ khối ion hóa phun

mù điện tử

High Performance Liquid

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhânqua một liên kết

bằng Hz

3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tác dụng chống ung thư trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 22

29

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 2 và tài liệu tham khảo 42

47Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người

của ba hợp chất phân lập Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của ba hợp chất

phân lập Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập được từ loài Adinandra nitida 16

Hình 1.2 Các hợp chất triterpen phân lập được từ loài Adinandra nitida 18

Hình 1.3 Một số hình ảnh về cây Sum điểm đỏ (ppm)Adinandra rubropunctata) 23

Hình 1.4 Các hợp chất phân lập từ loài Adinandra hainanensis tại Việt Nam 24

Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1 34

Hình 3.2 Phổ ESI-MS của hợp chất 1 35

Hình 3.3 Phổ 1H NMR của hợp chất 1 35

Hình 3.4 Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 1 36

Hình 3.5 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 28

Hình 3.6 Phổ DEPT của hợp chất 1 29

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất 2 39

Hình 3.8 Phổ ESI-MS của hợp chất 2 40

Hình 3.9 Phổ 1H NMR của hợp chất 2 40

Hình 3.10 Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 2 41

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 41

Hình 3.12 Phổ DEPT của hợp chất 2 42

Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất 3 44

Hình 3.14 Phổ ESI-MS của hợp chất 3 44

Hình 3.15 Phổ 1H NMR của hợp chất 3 45

Hình 3.16 Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 45

Hình 3.17 Phổ HSQC của hợp chất 3 46

Hình 4.1 Cấu trúc của các hợp chất triterpen phân lập từ lá cây Adinandra rubropunctata 49

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Sum điểm đỏ 31

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế giới thực vật đa dạng với hàng chục ngàn loài trên trái đất đã ban chocon người vô số các phương thuốc chữa bệnh Việc nghiên cứu và phát triển cácloại thuốc thông thường rất tốn kém và gặp nhiều khó khăn do tỷ lệ thành công thấp

đi cùng với nhu cầu đầu tư vốn rất lớn Vì vậy, trong vài thập kỷ qua, các nhànghiên cứu đã tập trung vào phát triển các loại thuốc từ thảo dược hoặc có nguồngốc thực vật Không chỉ các nước phương Đông với lịch sử sử dụng các sản phẩmthảo dược hàng ngàn năm, các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớndược liệu Theo thống kê ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư sốthuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc Xu hướng

đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ cácloài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâmcủa các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là ít tác dụng phụ, dễ hấp thu vàchuyển hoá trong cơ thể dễ dàng hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Việt Nam nằm trong vùng nội chí tuyến nên khí hậu mang tính chất nhiệt đớigió mùa Với đặc điểm này, Việt Nam là quốc gia có thảm thực vật giàu có vàphong phú, là một trong 16 quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới

Về thực vật, theo số liệu thống kê, Việt Nam có 11,373 loài thực vật, thuộc 2524chi, 278 họ, và 7 ngành thực vật chính [4] Nhưng trong đó, mới chỉ có 10.500 loài

đã được mô tả, và 3.200 loài được dùng trong các bài thuốc y học cổ truyền Trongnhững năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vậtViệt Nam đã được thực hiện nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học

Chi Sum hay Dương đồng (ppm)Adinandra) thuộc họ Ngũ liệt (ppm)Pentaphylacaceae)

phân bố tại rừng nhiệt đới các nước ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ,

Bangladesh, Cam-pu-chia, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nhật Bản, NewGuinea, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam; và vùng nhiệt đới Châu Phi[26] Ở Việt Nam đã tìm thấy khoảng 10 loài thuộc chi Sum phân bố ở các tỉnh

miền núi nước ta Nhiều loài thuộc chi Adinandra được sử dụng trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị bệnh Cây Sum millett (ppm)A millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày, cây Sum nguyên (A integerrima) được dùng để trị bong gân, rắn cắn.

Cây Sum điểm đỏ (A rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, loài sum A.nitida có nhiều hoạt

tính sinh học phong phú như chống oxy hóa, giảm huyết áp, chống ung thư, chốngbéo phì [15], [23], [38]

Cây Sum điểm đỏ có tên khoa học A rubropunctata Merr & Chun là một

loài đặc hữu của Việt Nam phân bố ở các tỉnh miền núi nước ta và vẫn chưa đượcnghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học Quá trình sàng lọccủa dự án Pháp Việt cho thấy dịch chiết tổng ethyl acetate của loài Sum điểm đỏ ởViệt Nam có hoạt tính chống ung thư rất tốt trên một số dòng tế bào ung thư khácnhau như ung thư phổi (ppm)A549), ung thư gan (ppm)Hep-G2), ung thư vú (ppm)MCF-7) Chính

vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các

hợp chất triterpen trong lá cây sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata)” được

thực hiện, với mục tiêu:

1 Phân lập 3 hợp chất từ ethyl acetate của lá cây Sum điểm đỏ và xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập được.

2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được.

3 Đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase trong điều trị tiểu đường của các hợp chất phân lập được.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về họ Pentaphylacaceae (Ngũ liệt).

Họ Pentaphylacaceae (ppm)họ Ngũ liệt hay Ngũ mạc) là một họ thực vật có hoa nằm trong bộ Ericales (ppm)bộ Đỗ quyên) Họ này gồm 11 chi và gần 500 loài phân bố ởkhắp các vùng nhiệt đới [6]

Về số lượng chi, loài của họ Ngũ liệt, trước đây Pentaphylacaceae (ppm)theonghĩa hẹp) chỉ có một chi: Pentaphylax [13] Hệ thống APG III (ppm)AngiospermPhylogeny Group III, 2009) đã thay đổi vị trí phân loại trong bộ Ericales (ppm)bộ Đỗquyên) bao gồm họ Pentaphylacaceae (ppm)họ Ngũ liệt) (ppm)bao gồm cả Ternstroemiaceae)

và họ Theaceae (ppm)họ Chè) [5] Theo phân loại mới nhất, APG IV (ppm)2016), họ này baogồm 3 nhóm, chứa khoảng 12 chi và 337 loài, bổ sung các chi, loài trước đây thuộccác họ khác nhau [6]:

Pentaphylaceae: bao gồm một chi Pentaphylax (ppm)ngũ liệt, ngũ linh, ngũ liệt

mộc), bao gồm một loài duy nhất (ppm)Pentaphylax euryoides) phân bố rải rác từ

Sumatra đến Trung Quốc Loài này cũng có tại Việt Nam

Ternstroemieae: bao gồm phân họ Ternstroemioideae, với hai chi và khoảng

103 loài, trong đó chi Ternstroemia chứa khoảng 100 loài Phân bố tại vùng nhiệt

đới, đặc biệt là Đông Nam Á, Trung Mỹ, và Nam Mỹ Chúng là cây bụi thườngxanh, lá quanh thân cây

Frezierieae bao gồm 9 chi và 233 loài Các chi đa dạng nhất

là Adinandra (ppm)80 loài), Eurya (ppm)75 loài), Freziera (ppm)57 loài) Phân bố tại Đông Nam Á tới Malesia, Hawaii, Trung tới Nam Mỹ, Đông Phi (ppm)chi Balthasaria) và Tây Phi (ppm)chi Adinandra), và Canaries (ppm)chi Visnea).

Về đặc điểm thực vật của họ Pentaphylacaceae: Hầu hết những loài thuộc họPentaphylacaceae là cây thân bụi hoặc thân gỗ nhỏ Vỏ cây có màu nâu hoặc đỏ Lámọc đơn lẻ, bóng như da, mọc so le, thường xếp thành 2 hàng, có cuống Mép lákhía, gợn sóng hay nguyên Thường không có lá kèm Họ này được đặc trưng bởinhững bông hoa đơn độc trong nách lá, hiếm thấy ở đầu cành hoặc ở bên Các hoađơn tính hay lưỡng tính, đối xứng xuyên tâm và chủ yếu là mẫu 5 với bao hoa kép

Nếu là hoa đơn tính thì thuộc loại đơn tính khác gốc hay có hoa đơn tính cùng hoađực trên cùng một cây Năm lá đài rời Năm cánh hoa rời thường có màu hơi xanh

hay hơi vàng, nhưng ở chi Balthasaria là màu đỏ cam Có từ 5 tới 30 nhị rời Chỉ

nhị ngắn và bao phấn dài Lá noãn ở tông Frezierieae là 3 còn các tông khác là 5

Bộ nhụy dạng quả tụ, chủ yếu với bầu nhụy thượng Quả thường là quả mọng hayquả hạch, đôi khi là quả nang với các hạt có cánh Phôi mầm cong hình chữ U [39]

1.2 Tổng quan về chi Adinandra (Sum hay Dương đồng)

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Adinandra

Chi Adinandra (ppm)chi Sum hay Dương Đồng) thuộc họ Ngũ liệt (ppm)Pentaphylacaceae), bộ Đỗ quyên (ppm)Ericales), lớp Mộc lan (ppm)Magnoliopsida), ngành Mộc lan (ppm)Magnoliophyta).

Theo khung phân loại ngành Mộc lan, vị trí phân loại của chi Adinandra

được thể hiện như sau [6]:

Giới thực vật: Plantae

Ngành Mộc lan: Magnoliophyta Lớp Mộc lan: Magnoliopsida

Bộ Đỗ quyên: Ericales

Họ Ngũ liệt: Pentaphylacaceae

Chi Sum: Adinandra

1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Adinandra (Sum hay Dương

đồng).

Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả và xếp chi Adinandra vào họ Chè

(ppm)Theaceae) với 85 loài và 22 dưới loài trong đó có 17 loài là đặc hữu của TrungQuốc [26]

Căn cứ vào hệ thống phân loại mới nhất APG IV (ppm)2016) trên cơ sở những

dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Adrinandra được xếp vào họ Ngũ liệt

Pentaphylacaceae với tổng số 75 loài [6]

Ở Việt Nam chi Adinandra được Phạm Hoàng Hộ (ppm)2000), Nguyễn Tiến Bân

(ppm)2003) thống kê và mô tả 10 loài, bao gồm:

Adinandra annamensis Gagn (ppm)Sum đỏ)

Adinandra caudata Gagn., (ppm)Sum đuôi, Sa-lô)

Adinandra donnaiensis Gagn., (ppm)Sa-lô, Sum Đồng Nai)

Adinandra glischoroma Hand-Maz Var hirta (ppm)Gagn.) Kob., (ppm)Sum lông) Adinandra rubropunctata Merr & Chun (ppm)Sum điểm đỏ) hay Adinandra hainanensis Hay., (ppm)Sum Hải Nam)

Adinandra integerrima T And (ppm)sum nguyên vẹn)

Adinandra microcarpa Gagn., (ppm)sum trái nhỏ)

Adinandra millettii (ppm)H.&A.) Benth & Hook f ex Hance (ppm)Sum millet)

Adinandra petelotii Gagn., (ppm)Sum petelot)

Adinandra poilanei Gagn (ppm)Sum Poilane) [1], [3].

Mô tả thực vật: Cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung Lá đơn, mọc so

le, có kích thước trung bình hay lớn Hoa mọc đơn độc ở nách lá, lưỡng tính, mẫu 5

Lá đài có lông mềm hay lông ráp Cánh hoa không lông hay chỉ có lông ở mặtngoài Nhị nhiều, tới 25 Bao phấn có lông ngắn hay dài và có mũi nhọn Bầu trên,không lông hay có lông mềm; noãn nhiều Quả khô không tự mở; hạt nhiều, nhỏ[3]

Phân bố: Chi Adinandra được tìm thấy ở rừng nhiệt đới các nước ở các nước

như Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh, Cam-pu-chia, Indonesia, Lào, Malaysia,Myanmar, Nhật Bản, New Guinea, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam; vàvùng nhiệt đới Châu Phi [26]

Ở nước ta, chi Sum hay Dương đồng (ppm)Adinandra) ở khắp miền rừng núi các

tỉnh miền Bắc, miền Trung và miền Nam [3].

Công dụng: Theo y học cổ truyền, các loài thuộc chi Adinandra được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh Cây Sum millett (ppm)A millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày, cây Sum nguyên A integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn Cây Sum đỏ hay Dương đồng Hải Nam A hainanensis (A rubropunctata) được

dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [2]

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Adinandra.

Trên thế giới có khoảng hơn 80 loài thuộc chi Andinandra phân bố ở nhiều

vùng khác nhau [26] Trong số hơn 80 loài thuộc chi Adinadra cho đến nay mới chỉ

có công bố kết quả nghiên cứu của loài A.nitida Loài Adinandra nitida chủ yếu

phân bố ở vùng Nam Trung Quốc, là một nguồn thực vật giàu flavonoid Lá của nóđược sử dụng làm chè, uống tốt cho sức khỏe (ppm)Shiyacha), và là dược liệu đã được

sử dụng hàng trăm năm tại Trung Quốc [26], [10] Các nghiên cứu về thành phầnhóa học cho thấy lớp chất trong loài này bao gồm flavonoid, triterpen và một sốnhóm chất khác [23], [37], [38] [45] Về hoạt tính sinh học, nó được báo cáo cónhiều tác dụng điều trị, như giảm huyết áp, cũng như tính kháng khuẩn, chống oxyhóa và giảm đau [10], [41]

1.2.3.1 Hợp chất flavonoid

Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự đã phân lập được 3 hợp

chất apigenin (ppm)1), camellianin A (ppm)2), quercitrin (ppm)3) [37] (ppm)Hình 1.1).

O

O OH

HO

OH

O HO

OH

OH O

OH OH

O O

3 2

4 5 6

10 1'

2' 3'4' 5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8''

1'''

3''' 2'''

4'''

5''' 6'''

O O

OH HO

HOMe

2 3 4 5 6

7 8 9

10

1' 2' 3' 4' 5' 6'

1'' 2'' 3'' 4''

5'' 6''

O

OH

OH OH

HO

OH

O HO

OH

OH O

OH OH

3 2 4 5

6

7 8 9 10

1'

2' 3'

4' 5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 1''' 3''' 2''' 4''' 5''' 6'''

HO

Hình 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập được từ loài Adinandra nitida

Một số nghiên cứu khác đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin,quecitrin, camellianin A và camellianin B có hoạt tính sinh học và có hoạt tínhkháng oxy hóa

Zhang và cộng sự (ppm)2006) đã sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (ppm)2D-LC) kết hợp

phổ khối để phân tích thành phần hóa học trong lá A nitida Có hơn 57 chất đã xuất

hiện, tuy nhiên chỉ có 5 hợp chất epicatechin (ppm)4), camellianin A (ppm)2), rhoifolin (ppm)5),

camellianin B (ppm)6) and apigenin (ppm)1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu và phổ

Cũng trong năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại

camellianin A từ lá của loài A.nitida bằng phương pháp HPLC và chứng minh được

khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng phương pháp làm sạchDPPH và gốc tự do [22]

Theo nghiên cứu của Liu và cộng sự (ppm)2010) hàm lượng camellianin A,camellianin B và apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ 41.98, 2.67, và 1.73%tương ứng Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong dịch chiết EtOH [23]

Từ hướng nghiên cứu này, năm 2013, Liu và cộng sự đã phân lập, tối ưu hóa

phương pháp tách chiết flavonoid và thu được camellianin A từ lá của loài A.nitida.

Điều kiện tách chiết tối ưu là: thời gian chiết: 30,25 phút, nồng độ ethanol: 63,84%,tần số siêu âm: 45 KHz Flavonoid thu được trong điều kiện tối ưu là 84,52 ± 1,65,đồng thời chứng minh được hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid ở nồng độ 0,02mg/ml [24]

 Hợp chất triterpen

Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự đã phân lập được 3 hợp

chất kajiichigoside F1 (ppm)7), nigaichigoside F2 (ppm)8), and peduncloside (ppm)9) [37] (ppm)Hình

1.2)

HO HO

HO

O O O

OH OH HO

OH

HO HO

HO

O O O

OH OH HO

O

OH OH HO

OH

OH

HO

HO HO

CH3

H3C CH3

O O

O

OH OH HO

OH

CH3

H3C

HO HO

HO

CH 3

O O O

OH OH HO

HO

O O

O

OH OH HO

OH

OH

HO HO

HO

O O

O

OH

OH HO

OH

HO HO

HO

O O

O

OH

OH HO

OH

OH

O O

O

OH

OH HO

OH HO

HO

Hợp chất mới (15)

Hình 1.2 Các hợp chất triterpen phân lập được từ loài Adinandra nitida

Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Wang tiếp tục công bố một số hợp chất

triterpene glycosides như arjunetin (ppm)10), sericoside (ppm)11), glucosyl tormentate (ppm)12), nigaichigoside F1 (ppm)13) and arjunglucoside I (ppm)14) [38].(ppm)Hình 1.2).

Gần đây nhất, năm 2019, Yuan và cộng sự đã phân lập được bốn hợp chất

triterpenoid saponins, trong đó có một hợp chất mới (15) từ cây Adinandra nitida

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Adinandra

Qua các nghiên cứu trên thế giới Adinandra nitida cho thấy các loài thuộc

chi này có nhiều hoạt tính sinh học phong phú như giảm huyết áp, kháng khuẩn,kháng oxy hóa và giảm đau [10], [37]

 Hoạt tính chống oxy hóa:

Yuan và cộng sự (ppm)2009) đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid

chiết xuất từ lá Adinandra nitida bằng cách đo DPPH và hoạt tính bắt gốc tự do

DPPH và giảm năng lượng Điều kiện tách chiết tối ưu như sau: thời gian khai thác

36 phút, nhiệt độ nước 100 oC và tỷ lệ nước với vật liệu 20:1, và trong điều kiệnnhư vậy, giá trị dự đoán và thực tế (ppm)trung bình 3 lần lặp lại) của flavonoid là 8,24%

và 8,20%, cho thấy rằng hiệu lực của mô hình hồi quy được thiết lập là tốt Phântích HPLC chỉ ra rằng chiết xuất flavonoid chứa 59,3% camellianin A Chiết xuấtflavonoid có thể làm sạch đáng kể các gốc tự do DPPH và superoxide phụ thuộcvào liều [44]

Liu và cộng sự (ppm)2010) đã đã sử dụng phương pháp DPPH và Rancimat đểxác định hoạt tính kháng oxy hóa, và sử dụng assay kit với cơ chất hippuryl-glycyl-glycine để xác định hoạt động ức chế men chuyển angiotensin (ppm)ACE) của các hợpchất flavonoid chính (ppm)camellianin A, camellianin B, apigenin) và dịch chiết ethanol

(ppm)EE) của lá A.nitida Kết quả cho thấy, hàm lượng của camellianin A, camellianin B

và apigenin trong EE được xác định tương ứng là 41.98, 2.67, và 1.73% Hoạt tínhkháng oxy hóa của flavonoid thấp hơn nhiều so với dịch chiết tổng Kết quả này cho

thấy hoạt tính kháng oxy hóa của lá cây A.nitida có thể phụ thuộc vào các thành

phần hóa học khác [23]

Hangao và cộng sự (ppm)2016) đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các

hợp chất phenolic từ lá Adinandra nitida được thu thập vào mùa xuân và mùa thu và

tác dụng chống tăng sinh của chúng trên các tế bào Hep-G2 Hàm lượng phenol tự

do và hàm lượng flavonoid tự do từ lá Adinandra nitida mùa thu cao, tương ứng các

giá trị là 142,69 ± 0,58 mg GAE / g DW và 112,98 ± 0,37 CE / g DW ORAC, PSC

và CAA của các chất phytochemical miễn phí từ chiết xuất lá là tương đối mạnh và

các giá trị là 1723.08 ± 109.27 μmol TE / g DW, 24.07 ± 1.98 μM VCE / g DW và

900.84 ± 2.68 μmol QE / 100 g, tương ứng A.nitida rất giàu chất phytochemical, và đặc biệt là lá rụng A.nitida là một nguyên liệu thô mới cho các chất chống oxy hóa

tự nhiên [16]

Tiếp tục hướng nghiên cứu này, năm 2017, Chen và cộng sự tiếp tục đánhgiá hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tăng sinh trên dòng tế bào Caco-2 của lá cây

A nitida Sự thay đổi của hoạt tính kháng oxy hóa của A nitida được đánh giá dựa

trên các giá trị PSC, ORAC, and CAA sau khi tiêu hóa Những kết quả này chỉ ra

rằng các phytochemical của A nitida được hấp phụ hiệu quả hơn vào màng tế bào

môi trường đường ruột [13]

 Hoạt tính giảm huyết áp, ức chế men chuyển (ppm)angiotensin converting

enzyme :ACE)

Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế men chuyển (ppm)ACE): ở nồng 500 μg/mL,tác dụng ức chế men chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A,camellianin B và apigenin tương ứng là 29.7%, 30.16%, 40.68%, và 30.27% Cáchợp chất flavonoid thể hiện hoạt tính tốt hơn so với dịch chiết tổng [20]

 Hoạt tính chống ung thư

Chen và cộng sự (ppm)1998) trong nghiên cứu về hoạt tính sinh học của flavonoid

được chiết xuất từ A nitida, sự ức chế sự tăng trưởng khối u và ức chế gen ức chế

p53 của khối u ở mức phiên mã ở tế bào chuột Sarcoma-180 được đánh giá bằngcác xét nghiệm kháng u và RT-PCR Kết quả cho thấy các chất chiết xuất không chỉ

ức chế đáng kể sự tăng trưởng của tế bào Sarcoma-180 cấy dưới da ở chuột mà còntăng tuổi thọ ở chuột mắc ung thư biểu mô Ehrlich ở liều 500mg / kg mỗi ngày × 10

mà không có dấu hiệu độc tính Tỷ lệ ức chế khối u là 64,0 % ở chuột S-180 và sựgia tăng tuổi thọ (ppm)ILS) là khoảng 51 2% ở chuột Ehrlich ung thư cổ tử cung Hoạttính chống ung thư của chiết xuất flavonoid cao hơn so với thuốc chống ung thưFtorafur trong cùng một điều kiện Kết quả RT-PCR cho thấy các chiết xuấtflavonoid có thể ức chế đáng kể sự biểu hiện gen p53 đột biến ở chuột Sarcomar-

180 ở mức phiên mã ở liều 500mg / kg mỗi ngày × 1 0 [11]

Trong nghiên cứu năm 2010, Han Gao và cộng sự đã đánh giá khả năng

kháng tế bào ung thư của A nitida, hợp chất chính Camellianin A được thử nghiệm

hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư vú

MCF-7 Ở nồng độ 200 μM, Camellianin A ức chế 33.8% và 8.7% tế bào ung thư MCF-7

và Hep-G2 Kết quả cho thấy, camellianin A có thể ức chế sự tăng sinh của tế bàoung thư gan Hep-G2 và ung thư vú MCF-7 ở người phụ thuộc vào nồng độ và gây

ra sự gia đáng kể của quần thể tế bào G0/G1 Sau được điều trị bằng camellianin A,phosphatidylserine của tế bào Hep-G2 và MCF-7 có thể chuyển vị đáng kể đến bềmặt của màng, và cho thấy sự gia tăng dân số của tế bào giai đoạn đầu Sự gia tăngdân số ở giai đoạn đầu chết theo chu trình của tế bào Hep-G2 và MCF-7 Kết quảcho thấy camellianin A không chỉ ảnh hưởng đến tiến trình của chu kỳ tế bào, màcòn khiến tế bào chết theo chu trình [15]

 Hoạt tính khác

Năm 2019, Yuan và cộng sự đã công bố kết quả liên quan đến tác dụng

chống béo phì và hợp chất ức chế quá trình tạo mỡ của A nitida Mô hình nhận

dạng hướng dẫn hoạt tính sinh học để xác minh tác dụng ức chế của trà Shiya đốivới quá trình tạo mỡ Bốn saponin triterpenoid trong đó có một hợp chất mới (ppm)2α,

3α-dihydroxyursolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, hợp chất 15) và 01flavonoid đã được xác định bằng cách sử dụng NMR (ppm)1D và 2D NMR) và sắc kýlỏng (ppm)LC) −MS Hợp chất 15 thành phần chính ức chế quá trình tạo mỡ có giá trị

IC50 là 27,6 μg/mL [45]

Ngoài các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của A nitida,

gần đây có thêm nghiên cứu của Chen và cộng sự (ppm)2015), so sánh thành phần phenolic,

flavonoids, tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư của 4 loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A nitida, A glischroloma, A millettii và A latifolia [12].

Tổng các hợp chất phenolic trong A nitida chiếm 140.54 ± 1.04mg/g, sau đó tới A millettii (ppm)125.96 ± 3.19 mg/g), A jubata (ppm)84.14 ± 2.97 mg/g) A latifolia có

hàm lượng phenolic ít nhất (ppm)71.29 ± 2.69 mg/g)

Tương tự, thành phần flavonoid ở trong A nitida là cao nhất 88.72 ± 2.13 mg/g, tiếp đó tới A jubata (ppm)44.74 ± 1.79 mg/g) và A millettii (ppm)43.54 ± 1.48 mg/g),

A latifolia có hàm lượng flavonoid ít nhất (ppm)19.13 ± 0.54 mg/g).

Do vậy, trong kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa, A nitida và A millettii có tác dụng tốt nhất Trong thử nghiệm chống ung thư, A nitida và A millettii có tác dụng cao hơn so với A jubata và A latifolia Tuy nhiên có thể thấy tác dụng của

các cây này là không cao [12]

Bảng 1.1 Tác dụng chống ung thư trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7

chi Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu Việc tiến hành nghiên

cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học

1.3 Tổng quan về cây Sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata).

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata).

Cây Sum điểm đỏ có tên khoa học A rubropunctata Merr & Chun

Tên đồng nghĩa: Adinandra hainanensis Hayata (ppm)1913), Adinandra

hainanensis Merrill (ppm)1923), not Hayata (ppm)1913); A maclurei Merrill;

Tên Việt Nam: Sum điểm đỏ, Sum đỏ; Sum Dương đồng hải nam; Thạch

1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata).

Hình 1.3 Một số hình ảnh về cây Sum điểm đỏ (Adinandra rubropunctata).

Mô tả thực vật: Đại mộc 7-10 m; nhánh non có lông màu sét dày, mau rụng.

Lá có phiến dai, to 9-10 x 3-4 cm, bìa có răng mịn, mặt dưới có đốm đỏ, gân cólông, gân- phụ 10-12 cặp; cuống có lông, dài 5-7 mm Hoa ở nách lá, vàng vàng;cọng 7-10 mm, có lông sét như lá đài và mặt ngoài cánh hoal cánh hoa 12 x 6 mm;tiểu nhụy vào 25, chỉ không lông, bao phấn có lông ngắn; noãn sào và vòi có lông.Trái không tự khai [3]

Phân bố: Tiên Yên, Quảng Trị; Văn Bản, Lào Cai [3]

Công dụng chữa bệnh: Cây Sum điểm đỏ hay Dương đồng Hải Nam A.

hainanensis (A rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm

họng [2]

1.3.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của A hainanensis (A rubropunctata) tại Việt Nam.

Năm 2019, nhóm nghiên cứu của TS Lê Nguyễn Thành đã tiến hành nghiên

cứu thành phần hóa học cây sum điểm đỏ Adinandra rubropunctata hay sum hải

triterpen gồm lupeol (ppm)1), betulinal (ppm)2), acetyl ursonic acid (ppm)3), oleanolic acid (ppm)4), betulinic acid (ppm)5) [36] (ppm)Hình 1.4)

Hình 1.4 Các hợp chất phân lập từ loài Adinandra hainanensis tại Việt Nam.

Quá trình sàng lọc cho thấy dịch chiết ethyl acetat của loài Adinandra ở Việt Nam

đã cho thấy hoạt tính chống ung thư rất tốt trên nhiều dòng tế bào ung thư khácnhau như ung thư phổi (ppm)A549), ung thư gan (ppm)Hep-G2), ung thư vú (ppm)MCF-7)

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học bộ phận lá

cây loài Adinandra rubropunctata.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu lá cây sum điểm đỏ (ppm)A rubpropunctata) được thu hái tại Văn Bản, Lào Cai

vào tháng 02 năm 2008 và được TS Nguyễn Quốc Bình (ppm)Bảo tàng Thiên nhiên ViệtNam) định tên Mẫu tiêu bản ký hiệu VN-1968 được lưu giữ tại phòng tiêu bản củaViện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam

2.2 Phương tiện nghiên cứu

Trang thiết bị

Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc :

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (ppm)1H-NMR,13C-NMR, DEPT) được đo trên máyBruker Avance 500 MHz (ppm)Viện Hóa học) hãng Sigma-Aldrich

- Phổ khối lượng (ppm)ESI-MS) được đo trên hệ thống sắc kí lỏng ghép khối phổ

LC/MS Agilent 1260, sử dụng phương pháp phun mù điện tử (ppm)Viện Hóa sinhbiển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Thử hoạt tính gây độc tế bào:

- Phiến 96 giếng (ppm)SPL Life Sciences, Hàn Quốc)

- Ống ly tâm 1.5 ml, 2 ml, máy ly tâm (ppm)Universal 320R)

- Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt

- Buồng đếm tế bào (ppm)Fisher Hoa Kỳ)

- Máy đọc ELISA (ppm)ELISA Bio-Rad machine, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng, tủ ấm CO2 (ppm)INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàncấp II, tủ lạnh sâu -25oC, -80oC

- Kính hiển vi (ppm)Zeizz), máy quang phổ (ppm)Genios, Tecan), bình nito lỏng bảo

quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

- Thiết bị: máy quang phổ BIOTEK – USA

Dung môi, hóa chất

Chiết xuất và phân lập:

Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập gồm: n-hexan, ethylacetat, ethanol, methanol, dichloro methan đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (ppm)silica gel, 240-430mesh, Merck, Đức) hoặc Sephadex LH-20

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (ppm)Merck 60 F254),quan sát với ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm, hoặc bằng thuốc thử

H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu

Thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase

Hóa chất: enzym a-glucosidase (ppm)CAS No 9001-42-7, Sigma), p-Nitrophenyl-aD-glucopyranoside (ppm)CAS No 3767-28-0, Sigma), 4-Nitrophenol (ppm)CAS No 100-02-7,Sigma), Dimethyl sulfoxide (ppm)CAS No 67-68-5, Sigma)

-2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết tách

2.3.1.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấykhô ở nhiệt độ 25 oC, sau đó đem xay nhỏ

Mẫu lá cây Sum điểm đỏ được ngâm chiết theo quy trình chung: ngâm chiết

4 lần với dung môi methanol ở nhiệt độ thường Gộp dịch chiết của 4 lần chiết, sau

đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết lần lượt với

n-hexan và ethyl acetat (ppm)EtOAc) Các dịch chiết được gom lại và cất loại dung môithu được các cặn chiết tương ứng

2.3.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

từ mẫu thực vật

Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng cácphương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lớp mỏng (ppm)TLC), sắc ký cột với các chấthấp phụ khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, giải hấp bằng các hệ dungmôi thích hợp

Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản mỏng

đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm Dung

môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi như n-hexane/ EtOAc, CH2Cl2/

Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (ppm)230

- 400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi với

tỉ lệ thích hợp

Sắc ký Sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi MeOH hoặc hỗn hợp MeOH/CH2Cl2 (ppm)9/1, v/v)

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương phápphổ hiện đại như phổ khối (ppm)ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (ppm)1H-,

13C-NMR, DEPT) và hai chiều (ppm)HSQC)

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư:

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn visinh vật Hoa Kỳ (ppm)American Type Culture Collection) gồm tế bào ung thư gan(ppm)Hep-G2), ung thư phổi (ppm)LU) và ung thư vú (ppm)MCF-7) Chất đối chiếu là

enzyme DNA topoisomerase II Sử dụng phương pháp MTT được mô tả bởiScudiero [31]

+ Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môitrường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine,

10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetalbovine serum – FBS (ppm)GIBCO)

+ Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (ppm)1:3) và nuôi trong tủ ấm ở

 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (ppm)cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ(ppm)National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn

nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặcdiệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Sử dụng phương pháp MTT assay:

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh

nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ Dừng phản ứng bằng DMSOđọc mật độ quang (ppm)OD -Optical Density) trên máy quang phổ bước sóng 540

nm trên máy spectrophotometer Genios TECAN Mật độ quang phản ánh sốlượng tế bào sống sót

Giá trị IC50 (ppm)nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào thử nghiệm) đượctính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần

Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (ppm)1991) Phép thửtiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang

đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine

B (ppm)SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tửprotein, do đó lượng tế bào càng nhiều (ppm)lượng protein càng nhiều) thì giá trị

OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí

nghiệm

190 L môitrường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloracetic acid(ppm)TCA)

 Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy

giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC

Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi

 Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút

và sử dụng máy ELISA Plate Reader (ppm)Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượngmàu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm Khả năngsống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thứcsau:

IC %=OD(mẫuthử ) – OD¿ ¿% ức chế = 100% - % sống sót

 Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine

(ppm)Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm

ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL DMSO 10%luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (ppm)nồng độ ức chế 50% sựphát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.Chất thử nào có IC50 < 20 g/mL (ppm)với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóahọc) hoặc IC50  54 M (ppm)với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạttính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ungthư

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính α-glucosidase

Nguyên lý: Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất

p-Nitrophenyl-a-D-glucopyranoside do tác động của enzyme a-glucosidase, qua đó giải phóng

sản phẩm là p-Nitrophenol có màu vàng [20].

Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phútsau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánhhoạt độ của enzyme a - glucosidase

Các bước tiến hành:

hiện trên đĩa 96 giếng Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO và nước deion thành 1dãy các nồng độ, nồng độ lần lượt trong phản ứng là 128, 32, 8 và 2 g/ml.Acarbose là thuốc điều trị tiểu đường qua ức chế enzyme glucosidase được sử dụnglàm chất tham khảo

Các thành phần phản ứng bao gồm: 40 µl Phosphate buffer 100 mM pH 6,8;25µl a-glucosidase 0,2 U/ml, 10µl mẫu thử, 25µl p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside 2,5 mM

Ở mẫu đối chứng, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng Thí nghiệm được

ủ ở nhiệt độ 37o C Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3 Độ hấpthụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (ppm)A)

Tính kết quả:

Khả năng ức chế enzyme a- glucosidase của mẫu thử được xác định bằngcông thức:

Độ ức chế (ppm)%) = [A(ppm)đối chứng) – A(ppm)mẫu thử)] / A(ppm)đối chứng) x 100%

IC50 (ppm)half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50%

3.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết xuất

Mẫu lá cây Sum điểm đỏ (ppm)A rubpropunctata) khô, xay nhỏ (ppm)2,96 kg) được

ngâm chiết với dung môi MeOH (ppm)10 lít x 4 lần) ở 25 oC trong 24 h Dịch chiết đượcgộp và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết MeOH (ppm)255 g).Thêm 1 L nước vào cao chiết tổng và chiết lần lượt với dung môi n-hexan và ethylacetat (ppm)EtOAc) (ppm)mỗi dung môi 500 mL x 3 lần) Dịch chiết n-hexan, EtOAc được cô

cất chân không thu được cặn chiết n-hexan (ppm)31 g) và EtOAc (ppm)100 g) tương ứng.

lá cây Sum điểm đỏ 2,96 kg

Dịch chiếtMeOHBã

Cặn MeOH

255 g

Cất loại dung môiChiết phân bố 3 lần với

EtOAc (ppm)1 lít/lần)

Cất loại dung môi

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Sum điểm đỏ.

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat

Cặn chiết EtOAc (ppm)100 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel, rửa giảivới gradient dung môi CH2Cl2 /Aceton 0-100% thu được 16 phân đoạn ký hiệu là E1

- E16 Các phân đoạn E2 và E4 được lựa chọn để nghiên cứu do có độ phân cực

thấp, chứa nhiều thành phần hợp chất triterpene, dựa trên khảo sát sắc ký lớp mỏng

Phân đoạn E2 (3 g) được được đưa lên cột silica gel, rửa giải với hệ dung

môi n-hexan/EtOAc (ppm)8/2) để thu được 7 phân đoạn E2.1-7 Phân đoạn E2.6 (ppm)0,32 g)

được tinh chế tiếp qua cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/Aceton (ppm)9/1) thu được

EtOAcDịch nước

Cặn chiết EtOAc(ppm)100 g)