Một coenzymekhi kết hợp với các apoenzyme tạo thành các holoenzyme khác nhau xúc tác choquá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng.Coenzyme trực tiếp tham
Trang 1Lời nói đầu
Trong cơ thể sống, hầu như không có một quá trình hóa học nào lại không
có liên quan mật thiết đến các quá trình sinh học do các enzyme xúc tác Có thểnói rằng sự sống gắn liền với enzyme
Ngoài một nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, các enzyme đều
có bản chất protein; chúng bảo đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong
cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướngxác định
Enzyme học (Enzymology) là một môn học có vị trí then chốt trong hóasinh đang phát triển mạnh mẽ và xâm nhập vào rất nhiều ngành khoa học, đặcbiệt thu hút sự chú ý cửa các nhà sinh học và sinh y học vì những hiểu biết cơbản về enzyme có liên quan mật thiết đến sinh học phân tử và y học phân tử và
là những kiến thức cơ bản rất quan trọng cửa sinh học và sinh y học
Mục lục Hình ảOh Bảng Tài liệu tham khảo
Chương 1: Enzyme 1.1 Định nghĩa enzyme
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sựtrao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi cửa mộtchất là tập hợp các quy luật cửa rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Cácphản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫnnhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó
Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo
cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàngtrong cơ thể sống
Enzym là chất xúc tác sinh học, được tạo ra trong tế bào sinh vật, có bảnchất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng
Chúng có trong hầu hết các loại tế bào cửa cơ thể sống Chính do nhữngtác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chấtxúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóahọc
Trang 21.2 Lược sử ngbiên cứu enzyme
Do enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần lớn cácnghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme
về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII
- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX
- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX
- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay
Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cốgắng đi sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men Van Helmont đã nhận thấythực chất của sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức ăn và giải thích cochế của nó với sự so sánh nó với quá trình lên men rượu Danh từ ferment (từ
ghữ iIaa-íẹniJiiVerểi,^c|i,i
Itị1it’eac- siíấêĩrmenquárợfnVỉêhimlmrưộuỊùng để chỉ tác nhân
Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumurcũng đã nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa Nhà tự nhiên học này đã cho chimquạ đen nuốt những miếng thịt đặt sẵn trong ống kim loại có thành đã được đụcsẵn và buộc vào dây thép Sau vài giờ đã không thấy gì ở trong ống Hiện tượngnày đã thúc đẩy sự nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả năngtiêu hóa của dịch dạ dày Sau thí nghiệm này một thời gian, vào năm 1783, nhàbác học người Ý là Spalanzani đã lặp lại thí nghiệm bằng cách lấy dịch dạ dàytrộn với thịt mới và thấy có hiện tượng hòa tan xảy ra
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quátrình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nướcchiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt
Trang 3độ thường Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen vàPessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thểtách được ở dạng bột Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịchchiết cửa lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa Kết tủa được hìnhthành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tácdụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là doPayen và Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc bấy giờ
Tiếp đó người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác nhưenzyme phân giải protein của dịch tiêu hóa trong dạ dày như Pepsin (Emberle vàShwan) - những nhà khoa học người Đức, năm 1836)
Sau đó, lý thuyết xúc tác đã ra đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius cóquan điểm cho rằng tăng tốc độ phản ứng là hiện tượng xúc tác Đây là một quanđiểm đúng Song thật đáng tiếc là nhà khoa học này đã coi các chất xúc tác nàyhoạt động được là do " lực sống" không theo sự điều khiển của con người Đây
là quan điểm duy tâm, siêu hình đã làm trì trệ sự phát triển của khoa học nhất làảnh hưởng sâu sắc đến sưh phát triển của ngành enzyme học
Giai đoạn 4
Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết
Utt^MđWỌfcQMhlmViệNăHrMO6i «hpihó’iiffiễưọMỵếtrtỊriỉ¥ổừ hạpaậurt
Trong thời kỳ này I.B.S Hardane đã viết quyển "Enzymes" Mặc dù lúc
đó bản chất phân tử của Enzyme hầu như vẫn còn là bí mật, nhưng tác giả đãđưa ra dự đoán tuyệt vời về vai trò của các tương tác và liên kết yếu giữaenzyme và cơ chất trong cơ chế hoạt động của enzyme Điều này vẫn giữnguyên tính thời sự trong thời đại của chúng ta
Các công trình của Sumner và Northrop đã mở ra một chương mới tronglịch sử phát triển của enzyme học hiện đại Những kết quả đạt được đã cho phép
Trang 4xác định được một cách dứt khoát bản cbất bóa bọc của enzyme là protein Pbải nói rằng bản cbất bóa bọc của pbần lớn enzyme là protein và địnb ngbĩa có tínb cbất kinb điển về Enzyme pbải xem lại từ sau pbát biện của T.R Cecb năm
1981 Cecb đã pbát biện một RNA có boạt tínb xúc tác nbư enzyme và gọi là ribozyme (xuất pbát từ các tên ribose và enzyme) Ribozyme xúc tác cbo quá trìnb cbuyển bóa tiền cbất RNA tbông tin (pre - m RNA) tbànb m-RNA Do đó enzyme kbông nbất tbiết pbải là protein! Đây là một pbát minb có ý ngbĩa rất
<ớn Tiác)zy|ìii1iẽ-Uđãiđti'lợ-U’inếtncvtewrằNgbb ữnm 1929tCn» áMở kêảđã
mở màn cbo giai đoạn tbứ tư của lịcb sử pbát triển enzyme bọc kéo dài cbo đếnbiện nay
Từ giữa tbế kỷ tbứ XX, nbất là tbời gian gần đây enzyme bọc pbát triểnrất mạnb Nbờ ứng dụng các pbương pbáp mới, biện đại nbư: điện di, sắc ký,quang pbổ, đồng vị pbóng xạ đã cbo pbép ngbiên cứu cấu trúc cũng nbư cơcbế tác dụng của nbiều enzyme, cơ cbế của quá trìnb sinb tổng bợp enzyme và
sự điều bòa boạt động của enzyme trong tế bào
Người ta đã xác địnb được cấu tạo của coenzyme Đã xác đ^ được mối
Ci.êe1nby^h■UlVcà■|^Pế-yl^veớ■vàctìlcc■v^lđrtiiM teíptrongviướ® là lếàAếà|Pếầ?
coenzyme)
Người ta cũng đã xác địnb được các enzyme xúc tác cbo các quá trìnbtrao đổi cbất nbư: bệ tbống enzyme đường pbân, Embden - Meyerboí - Parnasnăm 1933, bệ tbống enzyme của cbu trìnb Kreps - Szent Gyorgy năm 1937 (cbutrìnb citric acid), cbu trìnb ornitbrin trong trao đổi cbất của protein năm 1932(Krebs - Henseleit) Nbờ nbững pbương pbáp mới trong việc tácb và làm sạcbenzyme, người ta đã xác địnb được vai trò rất quan trọng của kim loại trong sựxúc tác của enzyme và tác dụng boạt bóa của cbúng Đã xác địnb được sự pbân
bố của các enzyme trong tế bào Đã ngbiên cứu cơ cbế tác dụng cũng nbư cấutạo các prọtein enzvmc Bằng, pbương Ấp.bứp Rbengen, người ta iđã ngbiên cứu
c u nuc cua cua p ân tử enzyme, n ư c u trúc cua 1 uonuc ease (197U, Ste n)
Trong vòng bơn 40 năm trở lại đây đã ngbiên cứu các enzyme sinb tổngbợp nbư nucleotide pbospborylase (Greenberg Marago, 1955), DNA -polymesase ( Kornberg,1956), RNA - polymesase (Spieglman, Hurwist, 1958 -1961) và các ngbiên cứu về điều bòa s^ tổng bợp protein - enzyme của Jacob,Monod (1961)
Từ năm 1961 đã pbát biện ra isoenzyme trong cơ tbể là enzyme xúc tác cótbể tồn tại dưới nbiều dạng kbác nbau, xúc tác trong cùng một cơ tbể, cbo mộtpbản ứng, có sai kbác một số tínb cbất nbư độ di động điện di
Trang 5Năm 1969 người ta đã tổng hợp được enzyme đầu tiên là ribonuclease(Denkewalter và Hirschmann, Gutte và Merriíield) Đây là enzyme gồm 124amino acid, bền với nhiệt, có thể đun nóng lên 800C với thời gian ngắn.
Có thể tổng hợp enzyme bằng hai phương pháp khác nhau:
- Tổng hợp từng peptid riêng biệt rồi sau đó nối lại với nhau
- Dùng chất giá (polymer): cắm lên trên này một gốc amino acid, sau đócắm tiếp 123 gốc amino acid khác Việc tổng hợp này đã thành công trong 3tuần bao gồm 11931 giai đoạn, 369 phản ứng Đã nêu lên được một phươngpháp mới về tổng hợp enzyme ở đây người ta đã dùng phương pháp tự độnghóa, khi được 124 gốc amino acid thì chuỗi polypepid tự tách ra Điều này chothấy mỗi khi chuỗi polypeptid đã được lựa chọn theo một trật tự đúng đắn thì cóthể tự uốn cong trong không gian Đấy chính là khả năng tự tổ chức
Những thành tựu nghiên cứu cơ bản về enzyme là cơ sở để phát triển cácnghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tế
Trong mấy chục năm cuối cửa thế kỷ XX và đầu thé kỷ XXI, người ta đãchú ý nghiên cứu việc ứng dụng enzyme Người ta đã tận dụng các nguyên liệugiàu enzyme để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến cácnguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau ở nhiều nước đãhình thành ngành công nghệ enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chếphẩm enzyme để phục vụ cho các ngành sản xuất khác nhau và cho y học
Chương 2: Câu trúc pbân tử cửa Enzyme
-Ể r» •? V Ấ 1 V r V •?
2.1 Bản cbât hóa bọc cửa enzyme
Từ gần một thế kỷ trước đây, các nhà khoa học đã đổ xô vào việc xácđỉnh bản chất hóa học cửa enzyme Cho đến nay, có thể nói rằng, ngoài nhómnhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa số enzyme có bản chất là
protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4cửa phân tử protein và trạng thái tự nhiên cửa chúng Thực tế là bản chất hóaenzyme đầu tiên nhận được ở dạng tinh thể là urease cửa đậu tương (Sumner,
1926), tiếp theo là pepsin và trypsin (Northrop và Kunitz, 1930, 1931) Sau đónhững tác giả khác cũng đã kết tinh được một số enzyme khác và có đử bằngchứng xác nhận các tinh thể protein nhận được chính là các enzyme
Kết quả nghiên cứu tính chất hóa lý cửa enzyme đã cho thấy enzyme cótất cả các thuộc tính hóa học cửa các chất protein về hình dạng phân tử: đa sốenzyme có dạng hình cầu (dạng hạt) Tỷ lệ giữa trục dài và trục ngắn cửa phân
tử vào khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6
rất rộnV ềừd12i) 00ợngtpnâtííửi 000.eMzymổtoố khốc lượniơnhVí ^lổnonucyeđổĩ
có khối lượng phân tử là 12700, glutamat dehydrogenase có khối lượng phân tửhọc cửa enzyme chỉ được xác đỉnh đúng đắn từ sau khi kết tinh được enzyme
Trang 6là 1.000.000 Đa số enzyme có khối lượng phân tử từ 20.000 đến 90.000 hoặc vài trăm nghìn.
Do kích thước phân tử lớn, các enzyme không đi qua được màng bánthấm Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo; chúng cũng tantrong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác.Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng cửa nhiệt độ cao.Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính cửa
mạnWkitiươlioạiụnặnvớ^ũn|Ụcà,độ
chếnstízymửa)prn>iẽnitroũgg;hhiphểmeHịềmzỹmể
cũng có tính chất lưỡng tính
2.2 Tbànb pbần cấu tạo cửa enzyme
Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phứctạp Trên cơ sở đó, người ta thường phân enzyme thành hai nhóm: enzyme mộtthành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử).Trường hợp enzyme là một protein đơn giản gọi là enzyme một thành phần.Trường hợp enzyme là một protein phức tạp nghĩa là ngoài protein đơn giản còn
có một nhóm ngoại nào đó không phải protein gọi là enzyme hai thành phần
Phần protein cửa enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hayapoenzyme, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme.Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặtvào phần protein hoặc có thể chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách khỏi phầnprotein khi cho thẩm tích qua màng Coenzyme là phần không phải protein cửaenzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme khi cho thẩm tíchqua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập Phần không phải protein cửaenzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic, khi nó liên kết chặt chẽvới phần protein cửa enzyme bằng liên kết đồng hóa trị Một phức hợp hoànchỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme Một coenzymekhi kết hợp với các apoenzyme tạo thành các holoenzyme khác nhau xúc tác choquá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng.Coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phảnứng mà enzyme xúc tác và làm tăng độ bền cửa apoenzyme đối với các yếu tốgây biến tính Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác cửacoenzyme và quyết định tính đặc hiệu cửa enzyme Các coenzyme thường là cácdẫn xuất cửa các vitamin hòa tan trong nước Cần chú ý là sự phân biệtcoenzyme và nhóm ngoại chỉ là tương đối, vì khó có thể có một tiêu chuẩn thậtrành mạch để phân biệt „liên kết chặt chẽ— và „liên kết không chặt chẽ—, nhất làtrong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng, nhiều coenzyme cũngkết hợp vào apoenzyme cửa chúng bằng liên kết đồng hóa trị Do đó, ngày nayngười ta ít chú ý đến sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại Ngoài ra, trongthành phần cấu tạo, rất nhiều enzyme có chứa kim loại Thuộc loại enzyme haithành phần gồm có hầu hết các enzyme cửa các lớp 1, 2, 4/ 5, 6: Các enzyme
Trang 7thủy phân (lớp 3) thường là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại hoặc đòi hỏi ion kim loại làm coíactor (đồng yếu tố).
2.3 Trung tâm boạt động cửa enzyme
Enzyme là protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống protein, enzyme còn cócấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động enzyme Không phải toàn bộ cácphần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ một bộ phận rấtđặc biệt mang, tính đặc hiêu trongphân hử.protein mới, tham gia xúc tác phảnứng DỤ phậnmày gọi là trung tâmmoạt động, của enzyme
Trong quá trình xúc tác của enzym chỉ có một phần tham gia trực tiếp vàophản ứng để kết hợp với co chất gọi là "trung tâm hoạt động".Cấu tạo đặc biệtcủa trung tâm hoạt động quyết đỉnh tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác củaenzym
Trung tâm hoạt động của enzyme gồm:
- Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cochất
- Những nhóm hóa học.inhữnglỉên kết peptide không tiến,xúc , trực tiếpvới co chát' nhưng có chức năng trực tiếp ĩrong qua trình hiếp xúc r
- Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid cónhóm chức hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine, cysteine,arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan Các nhóm hóa họcnày thực hiện hoạt động gắn với co chất để tạo thành phức chấtenzyme-co chất
- Các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme:
+ Nhóm NH2 của lysine
+ Nhóm -SH của cysteine , ,
+ Nhóm Y-carboxyl của glutamic acid
Ngoài các nhóm chức hóa học, trung tâm hoạt động enzyme còn có cácion kim loại như Fe2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+ và các nhóm chức của co-enzyme
Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phầnkhác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thànhtrung tâm hoạt động Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thườnggặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOHcủa aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch
Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kếthợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzym và các nhómngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động
Trang 8ở enzym chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạo trung
tâm hoạt động
Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt hainhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác cửa enzym) và
"nền tiếp xúc" (giúp enzym kết hợp đặc hiệu với co chất)
Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động Nhưng có những
hnzy mộn^ẫitsung tâmym1gđốnge(ỗửípfeầlTh»erí)genase cửa gan), và 4 trung tâm
Hoạt động xúc tác cửa enzyme có liên quan đến co chất với những điểmquan trọng sau:
- Chỉ những co chất có cấu trúc phân tử thich hợp với trung tâm hoạt độngcửa enzyme mới có thể kết hợp được với trung tâm hoạt động cửa enzyme
để tạo thành phức hợp enzyme-co chất (tính đặc hiệu)
- Các enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không giannhất đỉnh
- Trung tâm hoạt động cửa enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác độngcảm ứng với co chất, làm cho các amino acid, các nhóm chức cửa trungtâm hoạt động di chuyển, đỉnh hướng một cách thích hợp, chính xác đểgắn co chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá trình xúc tác
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với co chất bằng những yếu tố liên kết,nhờ đó sẽ tạo ra hệ enzym - co chất Phức hệ này thường không bền Phản ứngtạo ra hệ enzyme - co chất thường xảy ra rất nhanh và hỏi ít năng lượng
Giai đoạn thứ hai: khi co chất tạo phức với enzyme sẽ bỉ thay đổi cả cấu hìnhkhông gian, cả về mức độ bền vững cửa các liên kết Kết quả là các liên kết bỉ
Gìaivsnvn Wr ba^âỹlàbuối cùng cửa giai đoạn, sản phẩm quá trình phản ứngđược tạo thành và tách ra khỏi enzyme
Trang 9Cơ chế tác động tổng quát của enzymc9
E + 5 < " ES - ► E + P
Trong đÔ9E- Enzym (enzym) S- Cơ chất (Substrate) P- Sản phẩm (Products)
Chương 3: Tính đặc hiệu cửa enzyme 1 Khái niệm chung
Do cấu trúc lý hôa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạtđộng mà enzyme cô tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thôngthường khác Mỗi enzyme chỉ cô khả năng xúc tác cho sự chuyển hôa một haymột số chất nhất đỉnh theo một kiểu phản ứng nhất đỉnh Đặc tính tác dụng lựachọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hôa của enzyme Tính đặchiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme
ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hôa và phản ứngvận chuyển nhôm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần cô một enzyme đặc hiệutương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase vàaminotransíerase
3.2.2 Đặc hiệu cơ chất
Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hôa một hoặc một số chất nhất đỉnh.Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người tathường phân biệt thành các mức như sau9
3.2.2.1 Đặc hiệu tuyệt đoi
Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hôa một cơ chất xácđỉnh và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi
Ví dụ9 Urease, arginase, glucoseoxydase v.v Đối với các enzyme này, ngoàicác cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginine, K - D - Glucose (theo thứ tựtương ứng) chúngcũng cô thể nhân giải một vài chất khác nhưng với vận tốc.thấp nơn nhiều vhăng hạn như urease, ngoài ure nô còn cô thể phân giải
Trang 10hydroxyure nhưng với tốc độ thấp hơn 120 lần Như vậy urease có thể xúc tác cho hai phản ứng sau:
Enzyme này có khả năng phân giải 10 cơ chất song với khả năng nhỏ hơn nhiều
Ví dụ: nếu coi tốc độ oxy hóa tương đối acid p-D-glucose là 100% thìư.D.glucose chỉ bằng 0,64 % (ngoài ra maltose 0,19%, D.galactose 0,14%)
Hình như trong trường hợp đặc hiệu tuyệt đối, cấu trúc trung tâm hoạt động cửaenzyme tương ứng rất chặt chẽ với cấu trúc cửa cơ chất đến mức chỉ một saikhác nhỏ về cấu trúc cửa cơ chất cũng đử làm cho enzyme không xúc tác được.Những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để đỉnh lượngchính xác cơ chất cửa nó
3.2.2.2 Đặc hiệu nhóm tuyệt đoi
Các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử,một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác đỉnh đối với nhóm nguyên tử ở phầnliên kết chỉu tác dụng Ví dụ: maltase thuộc nhóm ư ư- glucosidase chỉ xúc táccho phản ứng thửy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OHglucoside cửa ư ư- glucose với nhóm OH cửa một monose khác
3.2.2.3 Đặc hiệu nhóm tương đời
Mức độ đặc hiệu cửa các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên Enzyme
có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất đỉnh trong phân tử cơchất mà không phụ thuộc vào cấu tạo cửa các phần tham gia tạo thành mối liênkết đó Ví dụ lipase có khả năng thửy phân 'được tất cả các mối liên kết este.Aminopeptidase có thể xúc tác thửy phân nhiều peptid
Trang 113.2.2.4 Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa làenzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian cửa cơ chất.Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học cửa các chất
Ví dụ phản ứng khử nước cửa malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tácdụng cửa fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L - malic acid mà không tác dụng
lên D - malic acid:
Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis hoặctrans Ví dụ: enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans cửa fumaricacid mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành L - malic acid:
COOH
hydratase
Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổgiữa các cặp đồng phân không gian tương ứng Ví dụ, lactatracemase cửa vikhuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau giữa D và L - lactic acid, aldo
1 epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa a a D glucose thành K
-D - Glucose, maleinat cis - trans isomerase cửa vi khuẩn xúc tác cho phản ứngđồng phân hóa giữa maleic acid (dạng cis) và fumaric acid (dạng trans)v.v Cácpháp1hó^học óvY aíírồguỗ1ìhẽọasụyểósả&xuấ cá c '< cạng 'nhMôg í jffig sửiượng
được thành dạng có thể hấp thụ
Trang 12Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong pbân tử giốngnbau hoàn toàn về mặt hóa học Ví dụ, hai nhóm - CH20H trong phân tửglycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate
từ ATP đến C3 cửa glycerin (chứ không phải Cl)
Chương 4: Hoạt tính xúc tác cửa Enzyme 4.1 Cơ chế cửa phản ứng có xúc tác nói chung
Vận tốc phản ứng hóa học được xác đỉnh bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức làmức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kếtcần thiết và hình thành các liên kết mới Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì vậntốc phản ứng càng chậm và ngược lại Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phảnứng, các chất xúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học
Ví dụ, bột platin là một chất xúc tác hóa học được sử dụng rộng rãi Vì các chấttham gia phản ứng trên bề mặt platin đều được chuyển sang trạng thái có khảnăng phản ứng cao hơn Do vậy năng lượng hoạt hóa sẽ nhỏ hơn và tốc độ phảnứng sẽ cao hơn
Như vậy, trong các phản ứng có xúc tác, chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạthóa cửa phản ứng hóa học, có nghĩa là nó chỉ tham gia vào các phản ứng trunggian mà không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng Sau phản ứng, chất xúctác lại phục hồi về trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc tác
4.2 Cơ chế cửa xúc tác enzyme
Hầu như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúctác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa sốcác chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao
Chính nhờ việc tạo được môi trường đặc hiệu (bởi trung tâm hoạt động cửaenzyme liên kết với cơ chất) có lợi nhất về mật năng lượng để thực hiện phảnứng mà enzyme có được những khả năng đặc biệt đã nêu trên
Trong phản ứng có sự xúc tác cửa enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trunggian Wzyme - xơ chất mà cơ chất được hoạt hoa Khi cơ chát Kết hợp vàoenzyme, do kết quả cửa sự cực hóa, sự chuyển dịch cửa các electron và sự biếndạng cửa các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi độngnăng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt độnghơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng
Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều sovới trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chấtxúc tác thông thường
Ví dụ trong phản ứng phân hửy H202 thành H20 và 02 nếu không có chất xúctác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì nănglượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì nănglượng hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy
Trang 13quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi pbức bợp này thànb sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau.
E + S -? ES -? p + E
Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơchất, p là sản phẩm (Product)
- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo
thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất
- Ma^đoạ^^ứ^<hanănxẵ}yưíợngihoạhhóêithấpshất dẫn tới sự kéo căng và phá
vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra
dưới dạng tự do
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là:tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals Mỗi loại liênkết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi cónước
Với phương pháp nghiên cứu bằng tia X và phương pháp hóa học người ta đãlàm sáng tỏ cách thức gắn cơ chất và cơ chế hoạt động của một số enzyme nhưlysozyme, chymotrypsin, carboxypeptidase A v.v Sau đây sẽ giới thiệu chi tiếthOT, cơ chế phản lins củỊ.caiboxypeptidạse A
Carboxypeptidase A (EC 3.4.17:1) thuộc nhóm peptidhydrolase, xúc tác cho sựthủy phân liên kết peptid, phản ứng xảy ra với vận tốc lớn nếu amino acid đầu C
là amino acid thơm Enzyme này cũng thủy phân liên kết este
Carboxypeptidase A có khối lượng phân tử 34,3 KDa chứa 1 mol Zn/1 mol E
Zn tham gia trong hoạt động xúc tác của enzyme Khi thay thế Zn bằng các kimloại hóa trị hai khác làm thay đổi hoạt độ và có thể cả tính đặc hiệu của enzyme.Trong phân tử enzyme, Zn ở gần bề mặt phân tử, tương tác với gốc His - 69, His
- 196 và Glu - 72
Các gốc amino acid có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme là:
Arg - 145, Tyr - 248 và Glu - 270.
Cơ chế phản ứng xúc tác của Carboxypeptịdase A được xác định trên cơ sở kếtquả nghiên cứu phản ứng của nó với đipeptid glycyltyrosine Quá trình phân giảiliên kết peptid có thể được phân thành các bước sau:
- Tạo thành phức ES: Khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm trong trung tâm hoạtđộng của enzyme thay đổi vị trí trong không gian Nhóm guanidin của Arg - 145cũng như nhóm carboxyl của Glu - 270 dịch chuyển 2Ả, nhóm hydroxyl của Tyr
- 248 dịch chuyển 12Ả từ chỗ gần trên bề mặt phân tử chuyền vào trong đếnvùng gần với liên kết peptid của cơ chất
Tương tác giữa các nhóm chức của trung tâm hoạt động với glycyltyrosine nhưsau:
Trang 14HÌNH: Sơ đồ biểu diễn tương tác giỡi glycyltyrosine với các nhóm
nhụđ âmng trong trung tâm hoạt động của carboxypeptidase A (cơ chất viết
- Nbóm carboxyl tự do của cơ cbất kết bợp với nhóm tícb điện dương của Arg
-145 của enzyme qua liên kết ion
- Nbóm NH trong liên kết peptide của cơ cbất tạo tbànb liên kết bydrogen vớinbóm - OH của Tyr - 248
- Oxy trong nbóm - CO - của liên kết peptide tương tác với Zn, còn carbon trongnbóm - CO - này tương tác với nbóm carboxyl của Glu - 270 qua pbân tử nước
- Cắt đứt liên kết giải pbóng sản pbẩm Nguyên tử Zn pbân cực liên kết - CO,tăng tínb ái điện tử của nguyên tử carbon, do đó làm tăng tương tác của nó vớinước boặc với nbóm ái nbân của pbân tử protein enzyme
Gốc Glu - 270 boạt bóa pbân tử nước, nbóm - OH được tạo tbànb tấn cộng trựctiếp vào nguyên tử cacbon của - CO - (trong liên kết peptide của cơ cbất), liênkết peptid bỉ kéo căng ra và bỉ đứt Gốc Tyr - 248 nbường bydrogen cbo nbóm
NH trong liên kết peptiê cbo cơ cbất, giải pbóng sản pbẩm đầu tiên là tyrosinecủa cơ cbất và acyl - enzyme
Trang 15Hìnb Cơ cbế pbảo ứng xúc tác cửi cirboxypeptidise A
Sau kbi liên kết peptide bị cắt đứt, trạng thái ion bóa của các nbóm acid và base
bị biến đổi tương ứng với pH môi trường, Tyr - 248 kết hợp với proton, trở vềtrạng thái ban đầu
Cbưong 5: Kĩ tbuật proteio
năng của đa phần các protein/enzyme phụ thuộc không chỉ cấu trùc bậc một, mà là cấutrúc không gian của phân tử protein, quá trình thiết kế thường được tiến hành, môphỏng với sự trợ giúp của máy tính với các công cụ tin sinh chuyên biệt Hiện nay, cấutrúc và chức năng của một protein tổng hợp (hóa học) hay tái tổ hợp (sinh tổng hợp)đều có thể được thiết kế thông qua các công cụ tin sinh trên máy tính hoặc sản xuấtthông qua quá trình phát triển/tiến hóa định hướng không chỉ ở quy mô phòng thínghiệm, mà còn ở mức công nghiệp
Kỹ ■ thuật nrotein là công cụ quan trọng được, sử dụng để tăng cường hoạt tính enzyme
va tính ■ chọn lọc cơ chất, sự bền nhiệt Nó đã tạo ra một cuộc cách mạng trong pháttriển các enzyme có sẵn trên thị trường thành các chất xúc tác công nghiệp tốt hơn Kỹthuật này liên quan đến việc thiết kế và xây dựng các protein với các chức năng mongmuốn Hiện có hai phương pháp khác nhau được sử dụng, bao gồm phương pháp ngẫunhiên được gọi là tiến hóa có định hướng và một phương pháp được gọi là thiết kế duy
lý (rational design) Các sản phẩm protein được tạo ra từ kỹ thuật protein có thể đượccải biến bằng việc thay đổi một hay nhiều amino axit hoặc thay đổi con đường cuộngập các chuỗi amino axit và lắp ghép với nhau để tạo ra các protein sẽ cung cấp cácenzyme bền vững và có lợi Có nhiều công cụ được sử dụng trong cải biến enzymetùy thuộc vào mục tiêu cụ thể (bảng 1)
Bảng 1 Cảc công cụ sử dụng trong kỹ thuậtproteỉn.
Mục tiêu Pbưong pbáp
Cấu trúc protein Kết tinh, tinh thể học tia X, cộng hưởng từ hạt nhân
