Luận văn thạc sĩ tách và xác định một số độc tố nhóm alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

ĐỖ THỊ THU HẰNGTÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI H

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2015

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2015

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tớiPGS TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia– Bộ Y tế đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiệngiúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thứcquý giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được họctập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểmnghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trìnhlàm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2015

Học viên

Đỗ Thị Thu Hằng LỜI CẢM ƠN

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nhóm alkaloid . 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện 3

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid 3

1.1.3 Cấu tạo của một số alkaloid độc 6

1.1.4 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid 7

1.2 Các phương pháp xác định . 13

1.2.1 Phương pháp điện di mao quản 13

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV 14

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ 16

1.3 Sắc ký lỏng khối phổ . 18

1.3.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 18

1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS) 18

1.3.2.4 Bộ phận phát hiện 22

1.3.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS 22

1.4 mẫuLấy 23

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích . 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu . 26

2.2Phương pháp nghiên cứu . 26

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu . 27

2.3.1Thiết bị 27

2.3.2Dụng cụ 27

2.3.3Chất chuẩn 28

2.3.4Các loại hóa chất, dung môi khác 29

MỤC LỤC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 ưuTối điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS 30

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS) 30

3.1.2 Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 33

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu . 42

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết . 43

3.2.2 Khảo sát dung dịch kiềm hóa 45

3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa . 46

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích . 48

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 48

3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 49

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 51

3.3.4 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi 52

3.4 Phân tích mẫu thực . 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

MỤC LỤC

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc được xác định trong đề tài 6

Bảng 1.2 Các giá trị LD50 của các chất phân tích 8

Bảng3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloid 30

Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS đối với chế đô ̣ ion dương 33

Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát 34

Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau 36

Bảng3.5: Các chương trình gradient khảo sát 37

Bảng3.6: Ảnh hưởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc các alkaloid 41

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid 44

Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 45

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 46

Bảng 3.10: Đường chuẩn các alkaloid 50

Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các alkaloid 51

Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg) 53

Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 0,1-1 mg/kg 54

Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg 55

Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực 57

DANH MỤC BẢNG

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 19

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba 21

Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin 31

Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 1 34

Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 2 35

Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 3 35

Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 4 35

Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 2 37

Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 3 38

Hình 3.9: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 4 38

Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 5 38

Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,6 mL/phút 40

Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,4 mL/phút 40

Hình 3.14: Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độ amoniacetat trong pha động 42

Hình 3.15: Sơ đồ quy trình chiết mâu dự kiến 43

Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid 44

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 46

Hình 3.18 : Quy trình chiết mâu tối ưu 47

Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn 48

Hình 3.20: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng 0,5- 100 ng/mL 49

Hình 3.21: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng 5- 1000 ng/mL 49

Hình 3.22: Đường chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999) 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giới hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6) 51Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5)52Hình 3.26: Sắc đồ atropin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mứcnồng độ 0,1 mg/kg 55Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mứcnồng độ 0,2 mg/kg 56Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin 58Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin 58

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

ionization

Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học

cơ bản và ứng dụng

UPLC-

MS/MS

Ultral performance liquid

chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự pháttriển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc vàdược liệu quý Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều câythuốc Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin dođộng vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon,hydro, nitơ, và thường có oxy Các alkaloid là bazơ hữu cơ tương tự như kiềm (bazơ

vô cơ); tên có nghĩa là như kiềm Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khácnhau của thực vật có hạt, chẳng hạn như cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền….Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, baogồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây Mỗi một phần của thực vật thường có chứa một số chấthóa học liên quan đến alkaloid Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực vậtchưa được biết, nhưng hầu hết các alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống thầnkinh của người và động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid được tìm thấy trong

tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất được sử dụng thương mại Một số alkaloid, chẳnghạn như nicotin, được sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác được sử dụnglàm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, các alkaloid được sử dụng chủ yếu trong y học,bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của hệthần kinh Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê,thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần Chúng được dùng bằng đườnguống và tiêm Ngoại trừ dưới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguyhiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần như tất cả các chất ma tuý làalkaloid) và dùng liều lượng lớn có thể là độc hại

Trong dân gian ta thường sử dụng các cây thảo dược như cà độc dược, mãtiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhưng trong các loại cây này có chứa một hàmlượng không nhỏ các chất độc nhóm alkaloid Hiện nay, một số loại thực phẩm chức

Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng- K23 Hóa học

năng có nguồn gốc thảo dược cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phầnđược chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất như các alkaloid, terpenoid,phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Sử dụng các loại thực phẩmchức năng này có thể là con dao hai lưỡi, dùng với liều lượng vừa phải có tác dụngchữa một số bệnh song dùng không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độchoặc các biến chứng Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa cácalkaloid độc này phải cẩn trọng và phải được sự quản lý và cho phép của các cơquan chức năng Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồng thời các alkaloid đôc̣ trong thực phẩm chức năng vẫn chưa được nghiên cứu Do vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và giúp cơ quan chức năng quản lý đưa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng

các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dược Chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nhóm alkaloid

1.1.1. Lịch sử phát hiện

Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập được morphin

và điều chế được dạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin làhoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ câycanhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhàhóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin vàcinchonin Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin;phát hiện ra cafein trong chè, cà phê Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc

lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện,cocain trong lá coca Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 alkaloid khácnhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã pháthiện ra được rất nhiều alkaloid và cũng đã được đưa vào ứng dụng trong y học ngàymột tăng [15]

1.1.2. Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1 Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:

loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật

một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực yhọc, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [15] [16]

1.1.2.2 Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành mộtchuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạpchí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi

vì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủyếu Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủyếu nằm trong vòng Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tínhbazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiêncứu alkaloid [15]

1.1.2.3 Phân loại

Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500hợp chất alkaloid trong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơbản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng được nên ngày càng có xuhướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin,Yohimbin, Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chiathành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin,Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27]

1.1.2.4 Sự phân bố

Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thựcvật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20%trong tổng số cây có nhựa Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn

300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại

đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid làcây 1 lá mầm và nghành hạt trần Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và câybụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lượng phân tử của alkaloid trong cây gỗthường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo Cây một năm có nhiều alkaloidhơn cây lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ

họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943) Thực ra rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ

ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thựctiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so vớidược liệu khô Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đãđược nghiên cứu Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại(Trelibs,1955) [27]

Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có độ hòatan thấp nhất Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử Oxy bằng bộtkẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường sau đó kếttủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [14]

1.1.3. Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài

phân tử

Khối lƣợng phân tử (g/mol)

1

Brucin

Dimethoxystrychnine

Bảng 1.2 Các giá trị LD50 của các chất phân tích.

Tên chất LD 50 trên chuột đường

uống (mg/kg)

LD 50 trên chuột đường tiêm (mg/kg)

từ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin được ghi vào bảng A của cácdược điển

Trong y học dân gian, mã tiền dùng như thuốc bổ lành bệnh và kích thích sựthèm ăn và là một loại thuốc vi lượng đồng căn, được dùng cho những vấn đề tiêuhóa thông thường, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng nhưthuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trường hợp bị chứng suy tim

Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chếtđộng vật có xương sống nhỏ như các loài chim và động vật gặm nhấm Strychningây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt

Đứng trên quan điểm dược lý, strychnin là một chất kích thích chủ yếu vàotủy sống, đây là hệ thống thần kinh trung ương Nó làm tăng cảm nhận giác quannhư: vị giác, khứu giác, thị giác Với lượng vừa phải trung bình, hoạt động tác dụngvào trung tâm hô hấp nằm trong hành tủy ( bulle rachidien ) và gia tăng biên độ hôhấp Chất strychnin được sử dụng trong chữa trị những chứng rối loạn chức năng cơvòng ( sphinctériens ) nhất định, sự suy hô hấp và viêm đa thần kinh nghiện rượu.Khi dùng với một liều rất nhỏ, theo Stille ( Système de Madica et thérapeutique,

1864 ): dùng trong rối loạn tiêu hóa, để gia tăng bài tiết dịch vị ở dạ dày, ở miệng ởgan và ở tụy tạng Nhưng khi dùng quá liều có thể dẫn đến ngộ độc Khi ngộ độcstrychnin, được thể hiện bởi những cơn động kinh co giật và đôi khi đưa đến tửvong vì ngạt thở.Vì vậy, strychnin không còn sử dụng trong y học hiện đại, mặc dù

nó đã được sử dụng rộng rãi trong y học thời trước thế chiến thứ hai Liều dùng làmthuốc của strychnin sulfat là 1 mg/mL [12] [13]

Chất brucin gần giống như strychnin trong chức năng, nhưng nhẹ hơn, ít độchơn, nó chỉ làm tê liệt hệ thần kinh vận động ngoại vi Cho mục đích y tế, brucinđược sử dụng chủ yếu trong việc điều tiết huyết áp cao và bệnh tim tương đối lànhtính khác Brucin không phải là chất độc hại nhưng một người tiêu thụ hơn 2 mgbrucin tinh khiết gần như chắc chắn sẽ bị các triệu chứng tương tự như ngộ độcstrychnin và có thể gây tử vong ở liều lượng lớn [16] [27] [31]

1.1.4.2 Aconitin

Aconitin là một alkaloid độc có trong củ ấu tàu, còn gọi là củ gấu tàu, là rễ

củ của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum fortunei Cây thường mọc

hoang ở các vùng núi cao biên giới phía Bắc nước ta: Lào Cai, Tuyên Quang, HàGiang Ô đầu được xếp vào loại thuốc rất độc (bảng A) Độc tính của aconitin rấtmạnh: Chỉ cần một liều từ 0,02 - 0,05 mg cho 1kg thể trọng là có thể gây chếtngười Ở nhiệt độ cao, aconitin bị phân hủy thành benzoylaconin và sau đó làaconin kém độc hơn aconitin khoảng 1.000 đến 2.000 lần Loại độc tố này thườngđược dùng để tẩm vào đầu tên khi săn thú rừng, kể cả…voi

Trong Đông y, ấu tàu được dùng ngâm rượu để xoa bóp khi bị đau nhức, têmỏi chân tay Tây y dùng làm thuốc ho, chữa chứng ra mồ hôi nhiều Thường chỉdùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sựchỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc.

Củ ấu tàu ngâm rượu chỉ dùng để xoa bóp Nguy cơ bị ngộ độc thường làtrong những trường hợp uống nhầm tưởng là rượu thuốc, để trong tầm với của trẻ,khi dùng quá liều chỉ định của thầy thuốc Ở một số tỉnh vùng cao như Lào Cai, HàGiang,… người dân thường nấu cháo củ ấu tàu dùng như món đặc sản vùng cao.Tuy nhiên nếu ăn những món ăn có củ ấu tàu chế biến chưa đúng cách sẽ gây ngộđộc Biểu hiện của ngộ độc : Sau khi ăn, aconitin ngấm rất nhanh qua niêm mạc dạdày, ruột để vào máu gây nên các triệu chứng như tê miệng lưỡi, nói khó, tê mỏichân tay, chuột rút, đau đầu, nhìn mờ, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, nặng hơn có thể liệt cơ

hô hấp, loạn nhịp tim,… Nếu không được điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ tử vong[16] [17]

1.1.4.3 Atropin

Atropin là một alkaloid tự nhiên chiết xuất từ cây bac̣ h anh (Atropabelladonna), cây cà đôc dươ

officinarum) và các bộ phận của cây họ cà (Solanaceae) Atropin làm giãn đồng tử,tăng nhịp tim, và làm giảm tiết nước bọt và dịch tiết khác Atropin được xếp vàothuốc độc bảng A, liều độc atropin tác động lên não làm say có khi phát điên, hôhấp tăng, sốt, cuối cùng thần kinh trung ương bị ức chế và tê liệt

Atropin là một trong các alkaloid chính trong cây cà độc dược có ở ViệtNam, với hàm lượng cao nhất ở lá và hột Hàm lượng toàn phần các alkaloid từ 0,2-0,5%, chủ yếu là scopolamin, hyoscyamin, atropin và các saponin, flavonoid,tanin Tác dụng dược lý của cà độc dược chủ yếu là do các alkaloid: làm giãn phếquản, giãn đồng tử, giảm nhu động ruột và bao tử nếu những cơ quan này co thắt,làm khô nước bọt, dịch vị, mồ hôi Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn,

có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau

nhức Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe Ngoài ra cònđiều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng Người ta thường dùng

lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn),dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn.Vì cây cóđộc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc Khi bị ngộ độc, cóhiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô,khô cổ đến mức không nuốt và không nói được Chất độc tác động vào hệ thần kinhtrung ương, có thể gây tử vong do hôn mê [27] [31].

Atropin là alkaloid kháng thụ thể đối giao cảm M (Muscarin), tác dụng lên cảtrung ương và ngoại biên Atropin được dùng để ức chế tác dụng của hệ thần kinhđối giao cảm Với liều điều trị, Atropin có tác dụng yếu lên thụ thể Nicotin [12] [13]

1.1.4.4 Scopolamin

Scopolamin hay còn gọi là “hơi thở của quỷ” hoặc gọi tên khác làBurundanga là một loại ma túy hay ma dược được bào chế từ câyBorrachero ở Colombia và có tác dụng gây mê đồng thời có khả năng làm mất đithần trí của con người và đưa con người vào trạng thái bị thôi miên Cây Borracherothuộc họ cà độc dược và gần giống với cây loa kèn trắng Scopolamin có đặc điểm

là không màu, không mùi và không vị nhưng lại có khả năng tạo ra những giấc mơ

kỳ lạ cho con người khi hít phải thuốc này Do cấu trúc hoá học, thuốc có thể gây ratình trạng hoang tưởng ảo giác rất mạnh Đặc biệt, Scopolamin sẽ ngăn chặn ngay từgiai đoạn đầu, không để kí ức được hình thành, những sự kiện xảy ra trong thời gianthuốc ảnh hưởng tới thần kinh con người sẽ không được ghi lại đến khi thuốc hết tácdụng, người ta vẫn không tài nào nhớ nổi chuyện gì đã xảy ra, nó có thể gây ra tìnhtrạng mất trí nhớ ở mức độ tương tự như thuốc an thần diazepam Nếu sửdụng với liều cao thì có thể gây chết người, Scopolamin còn làm con tim đập nhanhhơn và gây ra tình trạng kích động Scopolamin có thể biến người ta thành dạngkhông có nhận thức giống như các thây ma sống/xác sốngnên người chịu ảnhhưởng của thuốc không thể nhớ chuyện gì đã xảy ra [12] [13] [31]

Scopolamin là một loại thuốc kháng cholinergic Scopolamin có nhiều tácdụng trong cơ thể bao gồm giảm sự tiết dịch, làm chậm dạ dày và ruột, làm giãn

nở con ngươi Scopolamin được sử dụng để làm giảm buồn nôn, nôn, chóng mặt vàliên quan đến say tàu xe và phục hồi từ gây mê sau phẫu thuật Scopolamin cũng

có thể được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson, hội chứng ruột kích thích, viêmtúi thừa [27]

1.1.4.5 Koumin

Koumin là một trong các alkaloid độc được tìm thấy trong lá ngón.Độc tínhcủa lá ngón là do các alkaloid chứa trong toàn bộ cây, trật tự độc giảm từ rễ, lá,hoa, quả và thân cây Tới 17 đơn phân alkaloid đã được chiết ra từ lá ngón trong đóhàm lượng koumin là cao nhất Người bị ngộ độc lá ngón có các triệu chứng khátnước, đau họng, chóng mặt, hoa mắt, buồn nôn… sau đó bị mỏi cơ, thân nhiệt hạ,huyết áp hạ, răng cắn chặt, sùi bọt mép, đau bụng dữ dội, tim đập yếu, khó thở,đồng tử giãn và chết rất nhanh do ngừng hô hấp Tại Trung Quốc, nó được sử dụng

để điều trị eczema, bệnh trĩ, nhiễm trùng răng, phong (hủi), nhọt ngoài da, chống tổnthương và co thắt, nhưng do độc tính cao nên chỉ hạn chế trong các ứng dụng ngoài

da [5] [27] [31]

1.1.4.6 Colchicin

Colchicin là chất độc tự nhiên được chiết xuất từ thực vật thuộc chi Colchicum(nghệ tây) và từ cây tỏi độc Nó được sử dụng để điều trị các bệnh thấp khớp, đặcbiệt là bệnh gút.Ngoài bệnh gút, colchicin được sử dụng để điều trị sốt, viêm màngngoài tim Hiện nay người ta thấy conchicin gây hạ nhiệt, tăng huyết áp, tăng nhuđộng một cách thái quá Trên điểm nối thần kinh cơ (jonction neuro- musculaire),conchicin gây nghẽn biểu hiện bằng tê liệt và nếu kéo dài biểu hiện teo cơ xương

Do tác dụng củacolchicin nên dùng tỏi độc có thể có những hiện tượng ngộ độc như:nôn mửa, đi lỏng, đau bụng Liều chết trung bình là 0.03mg đối với kg thể trọng,1centigam đã gây cho người những hiện tượng ngộ độc, sự bài tiết chất độc củaconchicin chậm do đó những người viêm thận hay thiểu năng thận không nên dùng.Liều dùng làm thuốc của colchicin là 1 mg, khi tiêm hàng ngày liều cao

hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tu ̣ ở mô và có thể

dân

đến ngô ̣ đôc

Colchicin được hấp thu ở ống tiêu hóa và đi vào vòng tuần hoàn ruột-gan.Nồng độ đỉnh huyết tương xuất hiện sau khi uống 2 giờ Colchicin ngấm vào các

mô, nhất là niêm mạc ruột, gan, thận, lách, trừ cơ tim, cơ vân và phổi Colchicinđược đào thải chủ yếu theo phân và nước tiểu (10-20%) Khi tiêm hàng ngày liềucao hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tụ ở mô và có thể dẫn đến ngộ độc

Colchicin có nhiều tác dụng: chống bệnh gout, chống viêm không đặc hiệu,chống phân bào, làm tăng sức bền mao mạch, kích thích tuyến vỏ thương thận, phânhủy tế bào lympho, ức chế phó giao cảm, kích thích giao cảm, chống ngứa, gây ỉachảy, ức chế in vitro khả năng ngưng tập kết tập tiểu cầu [27] [31]

1.1.4.7 Nicotin

Nicotin là một alkaloid được tìm thấy trong các họ cây bac̣ h anh , cây họ Cà(Solanaceae), chủ yếu là trong cây thuốc lá, và với hàm lượng thấp hơn trong càchua, khoai tây, cà tím, và tiêu xanh Nicotin được tạo ra trong rễ và tích tụ trong lácủa cây Nó chiếm khoảng 0,6-3,0% trọng lượng khô của cây thuốc lá Nó có chứcnăng như một chất độc thần kinh rất mạnh với ảnh hưởng rõ rệt đến các loài côn trùng, do đó nicotin được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trừ sâu Các chấttương tự nicotin như imidacloprid hiện đang sử dụng rộng rãi làm thuốc bảo vệ thựcvật Với liều lượng nhỏ hơn (trung bình khoảng 1 mg nicotin hấp thụ), chất này hoạtđộng như một chất kích thích trong động vật có vú, trong khi lượng cao (30-60 mg)

có thể gây tử vong Hiệu ứng kích thích nàycó thể là một yếu tố chính đóng gópvào các thuộc tính phụ thuộc hình thành của người hút thuốc lá (gây nghiện).TheoHiệp hội tim mạch Mỹ, nghiện thuốc lá có lịch sử là một trong những thói nghiệnngập khó khăn nhất để phá vỡ, các đặc điểm dược lý và hành vi để xác định nghiệnthuốc lá cũng tương tự như nghiện heroin và cocain [24] [27] [31]

1.2 Các phương pháp xác định

1.2.1. Phương pháp điện di mao quản

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất khôngion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa

đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ion khácnhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Tác giả Hua-Tao Feng và Sam F.Y Li và cộng sự đã phát triển phương phápxác định 5 alkaloid độc trong hai loại thuốc thảo dược phổ biến bằng phương phápđiện di mao quản Các chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin,benzoylmesaconin được phân tích chỉ trong 15 phút bằng đệm có chứa amoniumacetat 40 mM và acid acetic 0,1% acid trong methanol 80% Khoảng tuyến tính từ

2 ÷ 200 mg/L Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,85 đến 1,90 mg/L Độ thuhồi trong khoảng 95 ÷ 108,8% [22]

Cũng sử dụng phương pháp điện di mao quản để phân tích alkaloid nhưngvới kỹ thuật sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography,MEKC) Đây là phương pháp điện di trong đó các chất được tách ra bởi sự phân bốkhác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dungdịch đệm (pha động) Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dungdịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn Trong phần lớn trường hợp,MEKC được tiên hành trong môi trường kiềm Natri dodecyl sulfat (SDS) là chấthoạt động bề mặt thường sử dụng nhất

Nhóm tác giả Yu L, Xu Y, Feng H đã xây dựng phương pháp xác định cácđộc tố alkaloid nhóm pyrrolizidin trong thuốc thảo dược truyền thống Trung Quốc.Các chất senkirkin, senecionin, retrorsin và seneciphyllin được tách bằng dung dịchđệm có chứa borat 20 mM, SDS 30 mM và methanol 20 % ở pH 9,1 Giới hạn pháthiện của các chất trong khoảng 1,19 ÷ 2,70 µg/mL; giá trị RSD đều nhỏ hơn 5 %.[34]

1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

Phương pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định các alkaloid nên nóđược sử dụng rộng rãi Các tác giả nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng trênnhiều loại detector khác nhau trong đó có detector UV Nguyên lý: chất phân tíchsau khi tách khỏi cột sắc ký bằng hệ pha động được dẫn vào flowcell đo được chiếu

bởi một chùm tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luậtLambert-Beer.

Nhóm nghiên cứu Trần Quốc Bình và Đỗ Thị Oanh thuộc bệnh viện Y học

cổ truyền Trung ương đã nghiên cứu thành phần cà độc dược trong chế phẩm Camatứng dụng trong hỗ trợ cắt cơn nghiện ma túy Nhóm tác giả đã định tính atropin vàscopolamin trong cà độc dược bằng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng Silicagel G254 đãtráng sẵn của Merck và dung môi khai triển là ethylacetat – methanol – amoniacđậm đặc (17:2:1) Định lượng alkaloid toàn phần trong mỗi bộ phận cây cà độcdược tính theo scopolamin bằng phương pháp acid-bazơ Định lượng scopolaminbằng phương pháp HPLC sử dụng cột Bondapak C18 (150 x 4,6 mm; 5µm), phađộng gồm có: tetrabutylamonium hydrogensulfat, acetonitril và đệm acetat.Detector UV bước sóng 257 nm [1]

Nhóm tác giả Lương Thị Phấn, Nguyễn Tiến Vững, Nguyễn Thị Thuậntrường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin vàbrucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Quy trình xử lý mẫu 2 mL mẫuhuyết tương thêm 400 µL acid percloric 1N và 50 µL dung dịch NaOH 1M, lắcxoáy trong 15 giây, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Lọc dịch thu được quamàng 0,45 µm Sử dụng cột tách Acclaim C18 (4,6x150; 5µm), pha động ACN :đệm K2HPO4 1M pH9 (38:62;v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút Detector Diode Arraybước sóng 257 nm [7]

Tác giả Xie Y và các cộng sự đã phát triển phương pháp xác định 6 hợp chấtalkaloid nhóm aconitum thành phần trong thuốc Trung Quốc bằng HPLC vớidetector DAD Các hợp chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin,benzoylmesaconin và benzoylhypaconin được tách trên cột ODS với chương trìnhgradient Pha động gồm acetonitril và đệm amoni bicacbonat (pH 10,0 ± 0,2) Hiệusuất thu hồi trong khoảng 90 ÷ 103 %, giá trị RSD nhỏ hơn 3,28%.[32]

1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các alkaloid Saukhi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ionhoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, cácgốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tínhiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnhion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion,người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Nhóm tác giả Trần Thị Văn Thi và Trần Thanh Minh thuộc trường Đại họcKhoa học, Đại học Huế đã tiến hành nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúcalkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Alkaloid toàn phần được chiết bằngethanol 960 và NH4OH 12,5% và chiết ngâm kiệt bằng ethanol 960 Dịch chiết đượccất loại dung môi, hòa tan cặn bằng H2SO4 2%, lọc lấy dịch lọc (các alkaloid lúcnày ở dạng muối, không tan được trong CHCl3) Đem dịch lọc loại tạp bằng CHCl3,rồi đưa về pH = 9-10 bằng NH4OH đậm đặc (các alkaloid lúc này ở dạng bazơ tự

do, tan được trong CHCl3) và chiết lấy alkaloid bằng CHCl3 Lọc dịch chiết CHCl3qua giấy lọc có Na2SO4 khan, rửa giấy lọc và Na2SO4 khan bằng CHCl3, rồi bayhơi CHCl3 (cô khô ở 50 0 C) thu được alkaloid toàn phần Sử dụng các phươngpháp: chiết phân đoạn trong các môi trường pH khác nhau, chiết phân đoạn bằngcác dung môi có độ phân cực khác nhau, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để phân lậpcác cấu tử alkaloid từ cặn alkaloid toàn phần Xác định độ tinh khiết và địnhtính bằng sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS); điều kiện sắc ký: dung môimethanol - nước (85:15), thời gian 35 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, cột ODS-C18,detector DAD, bước sóng 284 nm; điều kiện ghi phổ khối: Nguồn ion EFI, khí làmkhô N2 (nhiệt độ khí 350 o C, áp suất 30 psi, lưu lượng khí 15 lít/phút) Chân không2,5.10-5 mmbar Điện thế (năng lượng detector) 1118 V [11]

Tác giả Peihong Qiu và cộng sự đã phát triển phương pháp xác định đồngthời 5 alkaloid trong nước tiểu và máu bằng sắc ký lỏng khối phổ Trong đó có cáchợp chất brucin, strychnin, aconitin và colchicin Quy trình xử lý mẫu: 200 µL mẫu

máu và nước tiểu được trộn với 300 µL dung dịch 1 % acid trifluoroacetic trongacetonitril, vortex trong 2 phút và rung siêu âm trong 10 phút Mẫu sau đó được làmsạch bằng SPE với cột Oasis MCX và đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MSvới chế độ ion dương nguồn ESI Cột tách XBridge C18 (5 µm×3.0 mm×250mm),pha động: acetonitril (kênh A), amoni bicacbonat 10 mM chỉnh pH 10,5 (kênh B)theo chương trình gradient Giới hạn định lượng lần lượt là: brucin: 0,03 ng/mL,strychnin: 0,05 ng/mL, ephedrin: 0,20 ng/mL, aconitin: 0,05 ng/mL và colchicin:0,01 ng/mL Hiệu suất thu hồi trên nền nước tiểu từ 96 ÷ 110 % và trên nền máu là

94 ÷ 113 %.[28]

Tác giả Huiqin và các cộng sự tại trung tâm nghiên cứu Quốc gia TrungQuốc đã phát triển phương pháp xác định đồng thời 17 alkaloid độc trong dịch cơthể người bằng LC-MS với nguồn ESI dương chế độ MRM Trong đó có 7 alkaloidtrong đề tài là : koumin, atropin, scopolamin, brucin, strychnin, aconitin vàcolchicin Mẫu máu được chiết lỏng – lỏng như sau: 0,5 mL mẫu được thêm 1 mLdung dịch đệm borat pH 9, thêm 6 mL chloroform và vortex trong 5 phút, ly tâm ở

400 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dung dịch phía dưới, phần dung dịch phíatrên được chiết tiếp băng 12 mL hỗn hợp chloroform : ether (2:1, v/v) Gộp dịchchiết và làm bay hơi đến khô bằng nitơ ở 55 oC Hòa cặn bằng 1 mL methanol vàphân tích bằng LC-MS Sử dụng cột tách Ultimate XB-C18 (4,6 x 250 mm, 5µm)chương trình rửa giải gradient hai kênh A (dung dịch acid focmic 0,2 %), kênh B(methanol); tốc độ dòng 0,6 mL/phút Khoảng tuyến tính của các chất trong khoảng0,5 ÷ 50 µg/L và 0,5 ÷ 500 µg/L, LOD trong khoảng 0,1 ÷ 1 µg/L Hiệu suất thu hồi

từ 81,7 ÷ 102,3%, giá trị RSD nhỏ hơn 10 % và 15 %.[23]

Nhận xét: Các phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector UV);

điện di (CE) thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu.Việc tách và xác định đồng thời 8 chất trong đối tượng thực phẩm chức năng có nềnmẫu phức tạp là khó khăn nên chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng 8

alkaloid độc này bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Đây là phương pháp hiện đại, có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao.

1.3 Sắc ký lỏng khối phổ

1.3.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặcchất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tíchđược chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chấtphân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chấtphân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khảnăng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển vớitốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6] Sau đó các chất phân tích được đưa vào

bộ phận phát hiện và ghi nhận thành tín hiệu sắc ký detector Có rất nhiều loạidetector như UV, RF, khối phổ…

Hiện nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lượng và cấu trúccủa các chất phân tích là detector khối phổ

1.3.2. Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS)

1.3.2.1 Nguyên tắc

Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu được ionhóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao, tạo thành các ion có sốkhối khác nhau, các ion này được phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điệntích (m/z)[29] Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích như loại

bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó chothông tin về khối lượng hay cấu trúc phân tử của hợp chất

Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phântích và detector Các mẫu được ion hóa trong nguồn ion sau đó đưa vào bộ phậnphân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu được sẽ chuyển vàomáy tính xử lý và lưu trữ

1.3.2.2 Bộ nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây làphải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi Theo kỹ thuật ion hoá củaLC/MS, năng lượng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thànhion ở thể hơi Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hai kỹ thuật hay được sửdụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm:

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

- Tạo thành các giọt mang điện tích

- Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt

- Quá trình hình thành pha hơi các ion

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESITùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu bắn vớichế độ ion dương (+) hoặc ion âm (-) Kiểu bắn phá chế độ ion dương thường chonhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

- Loại hình thành ion dương

o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ

o Thường hình thành nên ion [M+H]+

o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+

o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid

o Hình thành nên ion [M-H]-,

[M-nH]n-ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, [M-nH]n-ESI - MS thích hợp cho cảphân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng như phân tử khối lớn củacác phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và khôngphân cực.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI)bắn phá với chế độ ion dương [29]

b) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure ChemicalIonization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dương hay âmvới phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion được tạo ra từ các chất khínhư methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)

1.3.2.3 Bộ phân tích khối phổ (analyser)

Bộ phân tích khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhauthành từng phần riêng biệt Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phântích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thựchiện bắn pha thêm để thu được các ion con Một số bộ phân tích khối phổ :

Bộ phân tích bẫy ion

Bộ phân tích thời gian bay

Bộ phân tích tứ cực

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)

Nguyên tắc: tạo ra một trường tần số vô tuyến biến đổi (trường tứ cực).Bộphân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chậpba

 Bộ phân tích tứ cực đơn (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực bằng kimloại đặt song song và theo hướng của chùm ion Trường tĩnh điện được tạo ra dothế một chiều (DC) và tần số radio (RF) được đặt vào các thanh Các tứ cực như

bộ lọc khối, khi có điện trường thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộcvào tỉ số m/z và từ trường RF Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này.

 Bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequad mass spectometry): Bộ phân tích khối baogồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụtách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyểnđến Q2 Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ

có mặt như khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con Q2không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến.Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làmnhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba

Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phânmảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chấtphân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắcphục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lượngfemtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nềnmẫu Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập được nối với nhau cách nhaubuồng va chạm (Collision Cell) [29]

b) Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight analyser – TOF)

m z

Các ion ra khỏi buồng ion hoá được gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ốngphân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng Tuynhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector Thờigian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với của các ion Các ion sẽđược phát hiện ở các thời điểm khác nhau Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính với thang m/z

c) Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có mộtđiểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy Bằng cách thay đổi thếxoay chiều áp vào các cực các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảngkhông để đến detector Các ion này cũng có thể bị bắn phá trong bẫy để thu đượccác ion con Về nguyên tắc, loại phân tích khối phổ bẫy ion có thể làm đến MSnhiều lần

Bộ phân tích khối ba tứ cực được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật MS/MS và đây chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron

1.3.3. Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS

Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậydựa vào thời gian lưu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từngchất trong hỗn hợp Dùng phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn để định lượngchất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát độ thu hồi của phương pháp

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích

Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này dothiết bị sắc ký có kết nối detercter MS nên chúng tôi sử dụng các phương pháp:

• So sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêmchuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải

có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫuchuẩn

(identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là

4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu

thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tíchmẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích(n=4) Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3, LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10.Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đườngnền

Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ

thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính người ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn cónồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽđường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụthuộc cho đến khi không còn tuyến tính [10][18]

Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ số đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêucầu và hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of corelation), giá trị R phải đạt yêucầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤1

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ củacác phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩntương đối RSD (%):

Trong đó:

xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i

x : Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm

n: Số lần thử nghiệm

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trịđược chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dướidạng độ thu hồi (recovery) Độ thu hồi (đánh giá độ đúng) là tỷ lệ phần trăm giữagiá trị thu được so với giá trị lý thuyết [10][18]

Cf : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng xác định được (ng/ml)

Ca : Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu trắng (ng/ml)

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng cónguồn gốc thảo dược đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần cóphương pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảo

an toàn và sức khỏe người tiêu dùng Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xácđịnh hàm lượng một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin,Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trong thực phẩm chức năng cónguồn gốc thảo dược bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS

các alkaloid

 Khảo sát, tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu

 Ứng dung phương pháp để phân tích trên một số mẫu thực tế

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu của luận văn này bao gồm:

Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên chúng tôi lựa phương pháp chiết lỏng– lỏng Mẫu được thêm dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid về dạng bazơ sau đócác alkaloid được chiết vào pha dung môi hữu cơ

Mẫu sau khi tách chiết được đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS vớichế độ ion dương nguồn ESI, cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phầnmềm Analyst 1.5.1, ABSciex)

• Phương pháp thẩm định:

Để đánh giá phương pháp chúng tôi tiến hành theo quy định của AOAC Phương pháp thẩm định bao gồm:

- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Độ lặp lại và độ thu hồi

Đối tượng mẫu: Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo

dược Phương pháp lấy mẫu: Ngẫu nhiên

Địa điểm: Một số hiệu thuốc trên địa bàn nội thành Hà Nội

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

+ Máy sắc ký lỏng của Shimadzu Model 20 AD-UFLC

+ Máy khối phổ Model AB sciex Triplequard 5500

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo)

2.3.2 Dụng cụ

- Các chất chuẩn: Nicotin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn

độ tinh khiết 98,7 % lọ 1 g; Koumin cung cấp bởi hãng Chengdu Biopurify ởdạng rắn độ tinh khiết 99,72 % lọ 10 mg; Atropin đƣợc cung cấp bởi hãngSigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99 % lọ 1 g; Scopolamin cung cấpbởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99,3 % lọ 1 g; Brucin vàStrychnin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 98%

lọ 5g; Aconitin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết

95 % lọ 5 mg; Colchicin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độtinh khiết 95 % lọ 100 mg

- Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trêncân phân tích có độ đọc 0,0001g, hòa tan và định mức 100 mL bằngmethanol Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin và atropin (10µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất vào bình định mức 10

mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol Bảo quản trong tủ lạnh

40C, sử dụng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1-10 µg/mL): hút 1 mL dung dịchchuẩn gốc của brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin và 1 mL dungdịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin, atropin (10 µg/mL)vào bình định mức 10 mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol.Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tuần

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1-10 µg/mL trong methanol

để thu được các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50;10-100; 20-200; 50-500; 100-1000; 200-2000; 500-5000 ng/mL

2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác

- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck98%), acid acetic băng (Merck), amoniacetat (Merck), ethylacetat (Merck),ether (Merck), chloroform (Merck), NaOH (Merck), acid boric, …

- Dung dịch đệm borat pH 9: Cân 3,09 g acid boric hòa tan hòa tan bằng 500

mL dung dịch KCl 0,1M Thêm tiếp 210 mL dung dịch NaOH 0,1M

mL và định mức đến vạch bằng nước cất