Luận văn thạc sĩ xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV VIS

Trong luận văn này, chúng tôi sẽtiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàmlượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc kýlỏng

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20

Môc lôc

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Một vài nét về rhodamine B 3

1.1.1 Công thức cấu tạo 3

1.1.2 Tính chất lý học 3

1.1.3 Tính chất sinh học… 4

1.1.3 Ứng dụng 4

1.2 Các phương pháp xác định rhodamine B 5

1.2.1 Phương pháp sắc ký cổ điển - phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng- TLC 7

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8

1.2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 8 1.2.2.2 Giới thiệu chung về phương pháp chiết lỏng- lỏng 10

1.2.2.3 Các kết quả nghiên cứu về rhodamine B bằng phương pháp HPLC 11 1.2.3 Phương pháp UV- Vis xác định rhodamine B 13

Chương 2 14

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 14

2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Detector UV-Vis 16

2.2.2 Phân tích định lượng bằng HPLC 17

2.3 Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu 18

2.3.1 Hoá chất 18

2.3.2 Máy móc và thiết bị 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký 21

3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 21

3.1.2 Chọn bước sóng của detector 22

3.1.2.1 Phương pháp 1 24

3.1.2.2 Phương pháp 2 26

3.2 Chọn pha tĩnh 28

3.3 Tối ưu hóa pha động 30

3.3.1 Ảnh hưởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký 30

3.3.1.1 Pha động thứ nhất 31

3.3.1.2 Pha động thứ hai 36

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình tách sắc ký 40 3.3.2.1 Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm 40

3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm 43

3.3.3 Ảnh hưởng của các chất phụ 45

3.3.3.1 Ảnh hưởng của trietylamin đối với hệ pha động gồm MeOH và đệm 45 3.3.3.2 Ảnh hưởng của natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN và đệm fomat có pH=3 48

3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động 51

3.3.4.1 Hệ pha động MeOH – đệm 51

3.3.4.2 Hệ pha động ACN – đệm 53

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 57

3.4.1 Tổng kết các điều kiện đã chọn 57

3.4.2 Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm với pha động ACN- Đệm 57

3.4.3 Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD) 61

3.4.3.1 Phương pháp tính toán theo đường chuẩn 61

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20

3.4.3.2 Phương pháp trực tiếp 63

3.4.4 Giới hạn định lượng (limit of quanlity- LOQ) 64

3.4.5 Độ đúng của phép đo 64

3.4.6 Độ lặp lại của phép đo 68

3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích 69

3.5.1 Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B 69

3.5.1.1 Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 69

3.5.1.2 Chọn dung môi chiết 70

3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 74

3.5.2.1 Mẫu hạt dưa 74

3.5.2.2 Mẫu bánh xu xê 77

3.5.2.4 Mẫu siro dâu 79

3.5.2.5 Mẫu nước ngọt hương dâu 80

KẾT LUẬN 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20

Danh môc b¶ng

Bảng 3.1 Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector

đối với hệ dung môi 75% metanol-25% nước 25

Bảng 3.2 Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector đối với hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1- heptansunfonat) 27

Bảng 3.3 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 31

Bảng 3.4 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 37

Bảng 3.5 Sự phụ thuộc k ’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 40 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc k ’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 43 Bảng 3.7 Hệ số dung lượng k i ’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin 45

Bảng 3.8 Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat 48

Bảng 3.9 Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 51

Bảng 3.10 Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 54

Bảng 3.11 Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B 58

Bảng 3.12 Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm 65

Bảng 3.13 Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,5ppm 66

Bảng 3.14 Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 1,0ppm 67

Bảng 3.15 Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ 69

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B 70

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B 72

Bảng 3.18 Kết quả phân tích mẫu hạt dưa 75

Bảng 3.19 Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê 77

Bảng 3.20 Kết quả phân tích mẫu siro dâu 79

Bảng 3.21 Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu 81

Hình 3.1 Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B 23

Hình 3.2 Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của detectơ 26

Hình 3.3 Diện tích píc sắc ký của rhodamine B 28

Hình 3.4 Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau 29

Hình 3.5 Sự phụ thuộc k ’ vào tỷ lệ % MeOH trong pha động 32

Hình 3.6 Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau 34

Hình 3.7 Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau 35

Hình 3.8 Sự phụ thuộc k ’ vào tỷ lệ % ACN trong pha động 37

Hình 3.9 Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau 39

Hình 3.10 Sự phụ thuộc k i ’ vào giá trị pH của dung dịch đệm 41

Hình 3.11 Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42 Hình 3.12 Sự phụ thuộc k i ’ vào giá trị pH của dung dịch đệm 43

Hình 3.13 Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau 44

Hình 3.14 Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA 46

Hình 3.15 Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA 47

Hình 3.16 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat 49

Hình 3.17 Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ 50

Hình 3.18 Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 52

Hình 3.19 Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động 53

Hình 3.20 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động 54

Hình 3.21 Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động 56

Hình 3.22 Đường chuẩn theo diện tích pic trong khoảng nồng độ 59

Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B 61

Hình 3.24 Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B tại các nồng độ 63

Hình 3.25 Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm 66

Hình 3.26 Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,5ppm 67

Hình 3.27 Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 1,0ppm 68

Hình 3.28 Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết 71

Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết 73

Hình 3.30 Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với mẫu hạt dưa75 Hình 3.31 Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê 78

Hình 3.32 Đường chuẩn(a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro 80 Hình 3.33 Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu nước ngọt82

Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngạiđối với người tiêu dùng Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vựckhác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm.

Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp,bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp Phẩm màu công nghiệp nóichung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vìkhó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơthể con người, đặc biệt có thể gây ung thư Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có

độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp Do vậy nhiều người đã lạmdụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thựcphẩm Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn

đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoáhọc khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưunhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đây là mộtphương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây Nó được ápdụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phươngpháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợpchất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu

điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiềuchất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,…

Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sửdụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo Trong luận văn này, chúng tôi sẽtiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàmlượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis Phương pháp này có độchọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta,

có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao Phân tích một số mẫu thực phẩmnhư hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàmlượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này Dựa trên các kết quả nghiêncứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thểđánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Một vài nét về rhodamine B

1.1.1 Công thức cấu tạo

Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp

Công thức phân tử là C28H31ClN2O3

Phân tử khối là 479,02g/mol

Công thức cấu tạo của rhodamine B

[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride

1.1.2 Tính chất vật lý

Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu nâu

đỏ Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C

Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trongmethanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) Dung dịch nước và rượu etylic có màu

đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dungdịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có  = 526 và 517 nm

1.1.3 Tính chất sinh học

Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặclàm mẩn ngứa da, mắt, Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đaungực Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận Nếu tích tụdần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinhcũng như có thể gây ung thư [17,21] Thực nghiệm trên chuột cho thấyrhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêmvào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành aminthơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư vàphát triển khối u dạ dầy Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác độngmạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơquan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29] Một số thực nghiệm khác cho thấyrhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôicấy tế bào [24,19]

Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộmhuỳnh quang Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấydầu [23]

Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấpdẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia Việc tổng hợp màu ngàycàng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21]

Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong

đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụngrộng rãi tại Jakarta Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằngtrong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều cóchứa rhodamine B [21] Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được chovào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứucũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung

có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21]

Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộcnhóm azo có khả năng gây ung thư Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất

rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹphẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này

Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết cácnước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thựcphẩm [24, 19]

1.2 Các phương pháp xác định rhodamine B

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi sinh và hóa học Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ chọn lọc kém [12] Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang

5

Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thờigian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10].

Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng

sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]…Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại,thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn(SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký

Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử

lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc Rhodamine B cókhả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏngvới detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B Vì vậychúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng chonghiên cứu này Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vịvẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho cácnghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học

Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thựcphẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe vàgia tăng số người mắc bệnh ung thư Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ giatrong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của giavị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu vàhạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tếThành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sởKim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuấtngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia

vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg Cơ sở này buộc phải tiêuhủy 77,5kg ớt bột và 258kg gia vị có mầu đỏ vì không đảm bảo vệ sinh an toàn

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

thực phẩm [13]… Điều này hết sức nguy hại đối với sức khỏe người tiêu dùng vàgóp phần làm gia tăng trực tiếp số người mắc bệnh ung thư trong cộng đồng

Hiện ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về phẩm mầu côngnghiệp nhóm azo [7, 8], nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về rhodamine B tronglĩnh vực thực phẩm Do đó việc xây dựng một quy trình chuẩn áp dụng chophòng thí nghiệm địa phương là rất cần thiết Tiêu chuẩn giới hạn hàm lượngphẩm màu rhodamine B trong thực phẩm, hàng tiêu dùng…, và những quy địnhtiêu chuẩn sức khỏe liên quan tới sức khỏe cộng đồng của Việt Nam hiện nayvẫn chưa có

1.2.1 Phương pháp sắc ký cổ điển- phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản

mỏng (TLC)

Phương pháp này khá đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng đểkiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích Phương pháp này có tính ưu việt, tiếnhành nhiều mẫu song song trong một lúc rất tiện lợi TLC được trang bị phầnphát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng [25,26]

Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn trongethanol tuyệt đối để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml Rồi tiếnhành xác định định tính trong điều kiện sắc ký sử dụng bản mỏng silicagel60F254, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút Pha động được sử dụng gồm hai hệ:

Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10)

Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13)

Phát hiện vết bằng cách quan sát vết ở ánh sáng thường hoặc soi dưới đèn

tử ngoại, bước sóng 366nm So sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết mẫu của rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn để đánh giá kết quả [26]

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùngquan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môitrường,…đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định rhodamine B trongthực phẩm với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác

vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao…

Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải.Ngày nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiệnnhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng thì người

ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong cácđối tượng phức tạp Còn thông dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơhuỳnh quang Dùng detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưngdetectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác docác hợp chất có trong nền mẫu Ngoài ra còn dùng một số detectơ khác nhưdetectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá [16],… các detectơ này cũng thườngđược ứng dụng để phân tích các chất có trong phẩm nhuộm

1.2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quátrình Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và phađộng, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫuphân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cộttách Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trongkhi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

hay gradient Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nóluôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký.Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khácnhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau Khi ởtrong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trênpha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại Như vậy là có mộtkhoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian nàyphụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúccủa mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thànhphần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫnđến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký [6]

Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:

 Tương tác hấp thụ

 Tương tác trao đổi ion

 Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau

 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC và hấp phụ pha ngược RP- HPLC)

 Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)

 Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC)

Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật táchchất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứacác chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụthuộc vào hệ số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đápứng hiệu quả tách sắc ký tốt Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt đượclực rửa giải phù hợp nhất Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển

9

tới detectơ để phát hiện Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detectơ khác nhau [6].

1.2.2.2 Giới thiệu chung về phương pháp chiết lỏng- lỏng

Mẫu phân tích trong kỹ thuật HPLC thường ở trạng thái lỏng, đa số cáctrường hợp không thể chuyển mẫu trong trạng thái nguyên thủy lên cột táchđược Phương pháp xử lý mẫu hay được áp dụng trong phân tích là chuyển mẫu

về trạng thái lỏng Phương pháp chiết lỏng- lỏng được áp dụng để xử lý mẫu chosắc ký lỏng Cơ sở chính của phương pháp này dựa vào cân bằng phân bố củachất tan trong hai hệ dung môi, hệ dung môi chiết và nền của chất mẫu Yêu cầuchủ yếu là chọn được một dung môi chiết thích hợp để chiết chất phân tích chohiệu suất thu hồi tốt và không ảnh hưởng cho quá trình chạy sắc ký sau này

Ví dụ theo thạc sĩ Nguyễn Đắc Kiên- Trường Đại học Nha Trang- Khoanuôi trồng thủy sản, để phân tích độc tố aflatoxin B1 trong thức ăn nuôi trồngthủy sản, mẫu phân tích được cân từ 10- 20 gam cho vào bình nón dung tích250ml Chiết mẫu bằng 100ml clorofom (CHCl3), lắc 30 phút, tốc độ 140vòng/phút Sau đó tiến hành lọc vào bình 250ml và cô quay cạn ở 400C Hòa cặnbằng 10ml diclometan (CH2Cl2), sau đó mẫu phân tích mới được bơm vào cột tách.[5]

Theo tiêu chuẩn xác định hàm lượng Histamin trong sản phẩm thủy sảnbằng phương pháp HPLC dựa theo tiêu chuẩn NMKL số 99-1981(Nordiccommittee on food analysis No 99- 1981), mẫu được nghiền bằng máy nghiềnđồng thể, cho vào bình tam giác 150ml, thêm 50ml etanol, lắc đều trong haiphút Đặt bình chứa dung dịch mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 600C trong 15phút, sau đó chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình tam giác bằngmetanol Để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng rồi định mức tới vạch bằngmetanol Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc Mẫu đã chiết được bơm vào cột

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

1.2.2.3 Các kết quả nghiên cứu về Rhodamine B bằng phương pháp HPLC

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu để xác định rhodamine B.Tháng 2 năm 1989, Carcinogen và Pesticide Branch [13], phòng thí nghiệmhóa phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, đã xác định rhodamine B bằng phương pháp HPLC, sử dụng detectơ huỳnh quang với các điều kiện như sau: Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m

Tháng 6 năm 1996, L Gagliardi, D De Orsi, G Multari, D Tonelli [16] đãphân tích rhodamine B trong mỹ phẩm với các điều kiện phân tích được thực hiệnnhư sau:

Cột tách: C- 18

Pha động: Axetonitril và nước chứa 0,1M natri peclorat với tỷ lệ thành phần thay đổi từ 50: 50 đến 70: 30

Mẫu phân tích được pha trong metanol và nước với tỷ lệ 8: 2

Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch phân tích có chứa0,3g/ml rhodamine B, píc xuất hiện ở 9,15 phút [16]

Ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectorhuỳnh quang tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã xác định rhodamine B trongnước bề mặt Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 pg/l [17]

Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] đã tiến hành phântích Rhodamine B trên các mẫu dược liệu Các điều kiện sắc ký đã được thựchiện như sau:

1.2.2 Phương pháp UV- Vis xác định rhodamine B

Để xác định rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp UV- Vis.Lấy mẫu chất đem hoà tan trong dung môi thích hợp, lắc, rung siêu âm và chiếtlấy dung dịch Đem dung dịch chiết được đo bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đạihấp thụ ta có thể định tính và định lượng rhodamine B [11, 15]

Chương 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine

B có trong thực phẩm, cụ thể là các mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạtdưa, nước ngọt hương dâu

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector hấp thụ phân tử Vis được lựa chọn Từ đó xây dựng một quy trình phân tích để áp dụng xác địnhrhodamine B trong thực phẩm

UV-2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Với mục tiêu nghiên cứu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứutách và xác định rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis

Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹthuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với độ nhạy và độ chính xác cao.Vì vậy, cầnnghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

1- Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC,

cụ thể là:

 Chọn bước sóng của detector

 Chọn pha tĩnh

 Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động

 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

 Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo

2- Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:

 Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi.

 Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu

3- Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xácđịnh hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ

an toàn của thực phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu thực phẩm và chấtphân tích là phẩm mầu Thông thường, trong các mẫu thực phẩm có rất nhiềuthành phần, nền rất phức tạp Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp HPLC (HighPerformance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sátđiều kiện tách và định lượng Rhodamine B

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắtnhư trong hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá

2.2.1 Detector UV-Vis

Loại detector này thực chất là các máy đo hấp thụ phân tử vùng tử ngoại(UV) và vùng khả kiến (Vis) Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thếbằng các cuvet đo dòng chảy (flowcell) Việc đo để phát hiện các chất phân tíchhay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất

ở trong dung dịch tại một độ dài sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là phađộng của quá trình sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo(flowcell) Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trựctiếp của chính nó Như vậy nói chung tất cả các chât phân tích hay hợp chất của

nó đối với một thuốc thử mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóngnào đó trong vùng phổ UV-Vis đều có thể được phát hiện và xác định bằng loạidetector này Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo địnhluật hấp thụ ánh sáng

 là hệ số độ hấp thụ quang phân tử (độ tắt phân tử)

l là bề dầy của lớp hấp thụ (chiều dài của flowcell)

Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm các phần chính như sau:

 Nguồn sáng điểm S: là đèn D2 (cho vùng phổ UV), hay đèn W- Halid (chovùng phổ Vis)

 Buồng mẫu và môi trường hấp thụ (flowcell)

 Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo Trong các detector đơn giản thì đây là một kính lọc cho các vùng phổ nhất định

 Bộ phận điện tử thu nhận và khuếch đại tín hiện đo

16

 Bộ phận chỉ thị kết quả

Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại vớimột thuốc thử phân tích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detectơnày Detectơ UV- Vis đang được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC vì nó

có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt

2.2.2 Phân tích định lƣợng bằng HPLC

Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất làthời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưunày để định tính (thông qua mẫu chuẩn) Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tíchthu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất

Để biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha là bao nhiêu, tadựa vào hệ số lưu k’

m(SP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh

m(MP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha động

tRi là thời gian lưu của chất thứ i

tR0 là thời gian chết của cột tách

Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng

độ chất phụ thuộc vào chiều cao píc hoặc diện tích

H= k.Cb

S= k Cb

Trong đó:

k

H là chiều cao pic sắc ký của chất

S là diện tích pic sắc ký của chất

k là hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b- là hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b  1

Ở vùng nồng độ nhỏ thì b= 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:

H= k1.C = f(C)S= k2.C =f(C)

Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theophương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn Dùng phương phápđường chuẩn nhanh, đơn giản Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cầnxác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn

Đối với các píc tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan củadiện tích píc vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn.Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích.Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic.Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc

đo diện tích pic lại chính xác hơn

Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vàonông độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác địnhnồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn

2.3 Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu

2.3.1 Hoá chất

Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC

Dung dịch chuẩn:

 Dung dịch chuẩn gốc 50 ppm: cân một lượng chính xác chất chuẩnRhodamine B vào cốc 50 ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 50 ml,định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ, bảo quản tránh ánhsáng ở 40 C.

 Dung dịch chuẩn 2 ppm: lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm cho vàobình định mức 50 ml, định mức tới vạch bằng methanol và lắc kỹ, bảoquản ở 40 C, tránh ánh sáng

 Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sửdụng trong ngày

Các loại hoá chất khác

 Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

 Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

 Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

 Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

 Natri 1-heptansunfonat của Merk

 Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

 Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

2.3.2 Máy móc và thiết bị

 Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 190-

1100 nm, điều khiển bằng phần mềm Chemstation

 Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy tinh Red- Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động

 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm:

 Bộ loại khí cho dung môi, Degasser- DGU- 14AM

 Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP

 Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP

 Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP

 Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng mẫu (sample loop) 20 l

 Detector UV-Vis SPD- 10AVVP

 Hệ điều khiển SCL- 10AVP

 Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1

 Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký

3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop)

Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầuđược nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở ápsuất bình thường, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dòng pha độngnạp vào cột tách Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột táchkhông những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹthuật nạp mẫu vào trong cột

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổiđược thể tích mẫu bơm vào cột Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào sự mởrộng chân pic sắc ký (doãng pic) Nếu như vòng chứa mẫu quá dài, lượng mẫubơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng píc xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấnpíc trong quá trình tách

Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn.Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì bơm mẫu vào cột tách chiềucao hay diện tích của píc sẽ tăng một cách tuyến tính Đến giới hạn Vmẫu > V0,nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao píc sắc ký cũng không tăng đượcnữa mà lúc đó píc sắc ký sẽ tù và doãng, không sắc nét nữa Vì vậy việc chọn thểtích vòng mẫu cũng rất quan trọng

Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường chỉ nên dùng vòng mẫu càng nhỏcàng tốt để tạo nên píc có độ sắc nét cao, tránh sự doãng píc Trong phân tíchHPLC người ta thường dùng vòng mẫu 10, 20, 50, 100l, trong đó vòng mẫu20l là phổ biến nhất Trong trường hợp phân tích Rhodamine B chúng tôi lựachọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20l

3.1.2 Chọn bước sóng của detectơ

Việc chọn bước sóng đo phát hiện chất rất quan trọng vì nó quyết địnhtrực tiếp tới độ nhạy của phép phân tích Vì phương pháp nghiên cứu được lựachọn là HPLC ghép nối detectơ UV- Vis, detectơ cố định bước sóng do vậy phảitiến hành khảo sát điều kiện để chọn ra được bước sóng phù hợp nhất cho phântích chất

Việc đo phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó dựa trên cơ sởtính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một bước sóng nào

đó Chính vì thế để thu được pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo ở cựcđại hấp thụ

Chúng tôi tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến trênmáy UV-Vis 8453 với dung dịch chuẩn rhodamine B được pha trong các thànhphần dung môi khác nhau:

 Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước

 Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin

 Rhodamine B 1ppm trong 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri heptansunfonat

1- Rhodamine B 1ppm trong 100% methanol

 Rhodamine B 1ppm trong 100% nước

Kết quả phổ thu được đưa ra trong hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn Rhodamine B

trong các thành phần dung môi khác nhau.

(a) 80% methanol- 20% nước (b) 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin(c) 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri 1-heptansunfonat

Nhìn vào phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B trongcác thành phần dung môi khác nhau ta thấy được cực đại hấp thụ nằm trongkhoảng 520- 555nm

Tuy nhiên để kết quả chính xác hơn và đánh giá được sự ảnh hưởng củatốc độ dòng chảy trong quá trình sắc ký cần khảo sát sự thay đổi diện tích pic sắc

ký theo bước sóng của detectơ Để khảo sát sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký,chiều cao píc vào bước sóng quan trắc của detectơ, tiến hành bơm rhodamine Blên cột sắc ký trong cùng điều kiện tách nhưng bước sóng khác nhau

Chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp:

Bảng 3.1 Diện tích và chiều cao của píc phụ thuộc vào bước sóng detectơ đối

với pha động: 75% metanol-25% nước.

STT Bước sóng (nm) Chiều cao pic (mAu) Diện tích píc (mAu.s)

Dựa vào các số liệu trên chúng tôi tiến hành biểu diễn mối quan hệ trên đồ thị Kết quả biểu diễn như trong hình 3.2.

Hình 3.2 Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của detectơ

Qua bảng kết quả và qua đồ thị nhận thấy rằng, ở bước sóng 550 nm diệntích píc sắc ký cực đại

3.1.2.2 Phương pháp 2

Các điều kiện đo được tiến hành như sau:

1 Nồng độ Rhodamine B: 0,5 ppm

2 Thành phần pha động: 85% ACN- 15% nước( 0,005M 1-heptansunfonat

Natri, được điều chỉnh tới pH= 3 bởi axit fomic)

Bảng 3.2 Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector đối với pha động:85% axetonitril- 15% nước (5mM natri 1-heptansunfonat).

STT Bước sóng (nm) Chiều cao pic (mAu) Diện tích píc (mAu.s)

Dựa vào các số liệu trên chúng tôi tiến hành biểu diễn mối quan hệ trên đồthị Kết quả biểu diễn như trong hình 3.3.

Hình 3.3 Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của detectơ

Qua bảng kết quả và qua đồ thị nhận thấy rằng, ở bước sóng 555 nm diện tíchpíc cực đại

Từ các kết quả thu được khi nghiên cứu phổ hấp thụ ánh sáng của

rhodamine B trong các thành phần pha động khác nhau và sự ảnh hưởng của diện tích píc vào bước sóng của detectơ với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi tiến hành khảo sát rhodamine B ở bước sóng 550- 555nm

3.2 Chọn pha tĩnh

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định tới hiệu quả tách Bản chất pha tĩnh quyết định cơ chế tách và khả năng lưu giữ của chất tan Tùy theo bản

sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo như RP- C18, RP- C8,…

Tiến hành nghiên cứu khả năng tách rhodamine B trên cột C18 và C8 với cùng điều kiện sắc ký: 90% MeOH, 10% đệm axetat có pH=3,01; tốc độdòng 0,8 ml/phút, tại bước sóng 576nm, sắc ký đồ được thể hiện trong hình 3.4

RP-mV

1.0

mAU(x1,000) 0.018 0.015 0.5

0.013 0.0

0.010

-1.0

0.005 0.003 -1.5

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

(a)

0.000 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

(b)

Hình 3.4 Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau

Dựa vào việc khảo sát sắc ký đồ của Rhodamine B trên các cột RP- C18

và RP- C8 trong những điều kiện như nhau cho ta thấy khả năng tách Rhodamine

3.3 Tối ưu hóa pha động

Đây là yếu tố quan trọng sau pha tĩnh, nó quyết định hiệu suất tách sắc kýcủa mẫu phân tích Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của quá trình sắc ký.Hai yếu tố này quyết định thời gian lưu giữ chất và hiệu quả tách Khác với phatĩnh, pha động là một yếu tố linh động, có thể thay đổi dễ dàng để được điều kiệnphân tích tối ưu Do đó sau khi chọn cột pha tĩnh thì thành phần pha động là yếu

tố tiếp theo được khảo sát Trên cơ sở tổng quan tài liệu thì có hai pha động đượcchọn là:

1-3.3.1 Ảnh hưởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trìnhrửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thìlực rửa giải của pha động thay đổi, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chấtphân tích, và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích

Do đó, để có được một thành phần pha động phù hợp thì cần tiến hànhkhảo sát các tỷ lệ khác nhau với các thành phần pha động đã lựa chọn gồm:

Pha động thứ nhất:

Dung dịch đệm có pH=3 và dung môi hữu cơ methanol (MeOH), thay đổi

tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH- 35% H2O; 70%MeOH- 30%

H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH- 15% H2O;90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH- 0% H2O

Pha động thứ hai:

ACN- nước được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit HCOOH, có thêm 0,005Mnatri 1- heptansunfonat, thay đổi tỷ lệ pha động: 60%ACN- 40% H2O;65%ACN- 35% H2O; 70%ACN- 30% H2O; 75%ACN- 25% H2O; 80%ACN-20% H2O; 85%ACN- 15% H2O; 90%ACN- 10% H2O; 95%ACN- 5% H2O;100%ACN- 0% H2O

Tiến hành lần lượt đối với từng pha động như sau:

Tốc độ của pha động: 0,8ml/phút, thành phần như trong bảng 3.3

Sau khi chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu của rhodamine B, thiết lậpđược mối quan hệ giữa hệ số lưu của rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha độngcủa pha động thứ nhất

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.5

Bảng 3.3 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động

STT %MeOH %H 2 O t R0 (s) t Ri (s) k i ’ =(t Ri - t R0 )/t R0

Dựa vào đồ thị nhận thấy rằng ở các tỉ lệ khác nhau của thành phần phađộng thời gian xuất hiện các pic khác nhau Cụ thể, khi tăng dần tỷ lệ thành phầnđệm fomat trong pha động thì mất nhiều thời gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn,

hệ số lưu khác nhau nhiều, cùng với đó là píc sắc ký thu được không gọn và sắcnét, có hiện tượng doãng píc sắc ký Nếu chọn tỷ lệ đệm trong pha động thấphơn thì píc sắc ký xuất hiện sớm