Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

Hà Nội - 2016ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ---Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUY

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

 -Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

 -Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN

GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Lã Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học củaPGS TS Nguyễn Quang Huy và

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Quang Huy –Trưởng khoa Sinh học-Trường đại học Khoa học

Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội vàTS Lã Thị Huyền– Phụ trách phòng Công

nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn thạcsĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và thầy cô giáo chuyên ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luậnvăn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh và các khoa phòng liên quan của Bệnh viện Thanh Nhàn đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng phòng Công nghệ Tế bào Động vật cùng toàn thể các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Phạm Thị Thùy

MỤC LỤC

MỞĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUANTÀILIỆU 3

1.1 Nhiễmkhuẩnhuyết 3

1.1.1 Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và ViệtNam 3

1.1.2 Dấu hiệu của nhiễmkhuẩnhuyết 7

1.2 Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyếtthườnggặp 7

1.2.1 Tụ cầu khuẩnStaphylococcusaureus 8

1.2.2 Acinetobacterbaumannii 9

1.2.3 Klebsiellapneumoniae 11

1.2.4 Pseudomonasaeruginosa 12

1.2.5 Escherichiacoli 14

1.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễmkhuẩnhuyết 15

1.3.1 Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương phápcấymáu 15

1.3.2 Lai huỳnh quangtạichỗ 15

1.3.3 Các kỹ thuật khuếchđạiDNA 16

1.3.4 Giảitrìnhtự 18

1.4 Multiplex PCR vàứngdụng 19

1.4.1 Giới thiệu chung vềmultiplexPCR 19

1.4.2 Các loại phản ứngmultiplexPCR 19

1.4.3 Thiết kế mồi cho phản ứngmultiplex PCR 20

1.4.4 Ưu điểm của phương phápmultiplexPCR 21

1.4.5 Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứngmultiplexPCR 22

1.4.6 Ứng dụng của phản ứngmultiplexPCR 24

1.4.7 Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhânnhiễmkhuẩnhuyết 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 27

2.1 Vậtliệu 27

2.1.1 Hóa chất vàsinhphẩm 27

2.1.2 Thiết bị 28

2.2 Phương phápnghiêncứu 28

2.2.1 Thiết kếprimer 29

2.2.2 Tách chiếtDNA 29

2.2.3 Phương pháp làm giàu DNAvikhuẩn 30

2.2.4 Xác định nồngđộDNA 31

2.2.5 Phương pháp điện di DNA trêngelagarose 31

2.2.6 Phươngpháp PCR 32

2.2.7 Phương pháp giải trìnhtựgen 33

2.2.8 Đạo đức trongnghiêncứu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệugenđích 35

3.2 Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằngthựcnghiệm 38

3.2.1 Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủngvikhuẩn 38

3.2.2 Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích.39 3.2.3 Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩnStaphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,KlebsiellapneumoniaevàPseudomonasaeruginosa 40

3.2.4 Kiểm tra tính đặc hiệu của cáccặp mồi 43

3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trongphản ứngmultiplexPCR 45

3.3 KếtquảtốiưuphảnứngmultiplexPCR xácđịnh đồng thời5vikhuẩn đích47 3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứngmultiplexPCR 47

3.3.2 Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứngmultiplexPCR 48

3.3.3 Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứngmultiplexPCR 50

3.4 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễmkhuẩnthuần 51

3.5 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫubệnh phẩm 53

3.5.1 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu

bệnhphẩmcấy máu 53 3.5.2 Kết quả thửnghiệm phươngphápmultiplexPCRtrên các mẫulâmsàng58

KẾT LUẬN VÀKIẾNNGHỊ 61 TÀI LIỆUTHAMKHẢO 62

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP /SCCM[16] 4

Bảng 2.1 Trình tự Nucleotide của cáccặpmồi 27

Bảng 3.1 Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR theo tính toánlýthuyết 37

Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm phản ứngmultiplexPCR 52

Bảng 3.3 So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩmcấymáu 55

với kết quả của phương phápcấymáu 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng

giaonhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết[16,56] 5

Hình 1.2 Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩnStaphylococcusaureus 8

Hình 1.3 Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩnAcinetobacter baumannii10 Hình 1.4 Hình ảnh và tác động của vi khuẩnKlebsiellapneumonia 11

Hình 1.5 Hình ảnh và tác động của vi khuẩnPseudomonasaeruginosa 13

Hình 1.6 Hình ảnh và phân loại vi khuẩnEscherichiacoli 14

Hình 1.7 Mô hình mô tả phản ứngmultiplexPCR 20

Hình 3.1 Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủngStaphylococcus aureus,Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,Klebsiella pneumoniaevàPseudomonas aeruginosatách chiết từ cácchủngchuẩn 38

Hình 3.2 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vikhuẩn gây nhiễm khuẩn huyếttương ứng 40

Hình 3.3 Kiểmtrakhả năng nhân bảnđặchiệucủa các cặpmồifemA,gltA, oprL,mdh,phoAvớicácchủngStaphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonasaeruginosa,Klebsiella pneumoniaevàEscherichiacoli 43

Hình 3.4 Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứngmultiplexPCR 45

Hình 3.5 Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứngmultiplexPCR 47

Hình 3.6 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứngmultiplexPCR 49

Hình 3.7 Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứngmultiplexPCR 50

Hình3.8.ThửnghiệmphươngphápmultiplexPCRtrênmẫubệnh phẩmcấymáu 53

Hình 3.9 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫulâmsàng 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACCP American College of Chest Physicians

DNA Deoxyribonucleic acid (acid Deoxyribonucleic) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBt Ethidium bromide

ICU Intensive care unit (Đơn vị chăm sóc đặc biệt ) MLST Multilocus sequence typing(Xác định trình tự nhiều

gen đặc trưng) MRSA Methicillin-resistantStaphylococcus aureus(Tụ cầu

vàng kháng Methicillin) Mutiplex PCR Phản ứng khuếch đại nhiều DNA đích

NKH Nhiễm khuẩn huyết

NVYT Nhân viên y tế

PAF Platelet-activating factor

RNA Ribonucleic acid (Acid Ribonucleic)

SCCM Socity Critical Care Medicine

SDS Sodium dodecyl sulfate

SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình sợi đơn ) TAE Tris-EDTA-Acetic acid

Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong mười nguyên nhân chủ yếu gặp

ở bệnh nhân nhập viện Theo báo cáo của Trung tâm thống kê quốc gia chămsóc sức khỏe của Mỹ cho thấy: Năm 2008, bệnh nhân nhiễm khuẩn huyếtnhập viện tăng gấp đôi so với năm 2000 (326.000 so với 727.000) Đặc biệt,nghiên cứu của Elixhauser A và tập thể (2009), nhiễm khuẩn huyết ngay lúcnhậpviệnlà836.000ca.ChiphíđiềutrịmỗicaNKHdaođộngtừ10.000-50.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô la mỗi năm cho các trường hợp NKH và thờigian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày Theo thống kê củaFleischmann C và tập thể (năm 2016) dựa trên 1553 báo cáo từ năm 1979đếnn ă m 2 0 1 5 c ủ a c á c n ư ớ c c h o t h ấ y : Đ ố i v ớ i c á c n ư ớ c t h u n h ậ p c a o ,

c ứ

100.0 người nhập viện mỗi năm có 437 trường hợp nhiễm khuẩn huyết(sepsis) và 270 trường hợp nhiễm trùng khuẩn nặng (severe sepsis) và tỉ lệ tửvong là 17% đối với nhiễm khuẩn huyết và 26% đối với các nhiễm khuẩnhuyết nặng trong thời gian này Theo tính toán ngoại suy của các nhà khoahọc này ước tính toàn cầu có khoảng 31,5 triệu ca nhiễm khuẩn huyết và 19,4triệu trường hợp nhiễm khuẩn huyết nặng, và khoảng5,3triệu ngườichếtmỗinăm

Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh,đặc biệt là ở các đối tượng trẻ em và người già Vì vậy, việc phát hiện sớm tácnhân gây bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạnchế

biến tính, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết Hiện nay,cấy máu kết hợp với xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất đểphát hiện mầm bệnh Phương pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chiphí thấp nhưng có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, không loại trừ đượctrường hợp âm tính giả.

Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân đượccho là một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao Tuy nhiên, cho đếnhiện nay vẫn chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho

là chuẩn để ứng dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết Vì vậy,nghiêncứuxây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ đặchiệu cao đang là nhu cầu bức thiết hiện nay Multiplex PCR có thể coi là giảipháp cho những vấn đề trên Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trongcùng một phản ứng cho phép phát hiện nhiều loại tác nhân gây nhiễm khuẩnhuyết trong thời gian ngắn với độ chính xáccao

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplexPCRxác định một số tác nhângâynhiễm khuẩn huyết”nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị

cho các bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam Nội dungchính của đề tài baogồm:

 Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩnhuyết

 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplexPCR

 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm khuẩnhuyết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhiễm khuẩnhuyết

1.1.1 Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam

Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định

và chẩn đoán Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27TCN) đãmôtả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không thểnhìn thấy bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các bệnhnguy hiểm” Tiếp đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và tiêubiểu là một học giả thời kì phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527) trongbáo cáo của mình cũng đã lần lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩnhuyết

Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩnhuyết Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễmkhuẩn huyết bởi trong giai đoạn y học chưa phát triển, việcmôtả nhiễm khuẩnhuyết rất khó để được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên rõ ràng

và khó khăn trong điều trị cùng với tính nghiêm trọng của bệnh thì người tabắt đầu quan tâm hơn và nỗ lực tìm hiểuđưara khái niệm về nhiễm khuẩnhuyết [8] Trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây bệnh hay độc

tố của chúng trong máu hoặcmôdẫn tới sự phủ định của những khái niệmchung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các công

cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm khuẩn huyết[9]

Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) vàSocity Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm củanhiễm trùng huyết (Bảng 1, Hình 1) [16] Đây là một trong những khái niệmphổ biến nhất về nhiễm khuẩn huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế

đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm sóc sức khỏe chuyên sâu khácnhaut r ê n

khắp thế giới Việcmôtả biểu hiện của các phản ứng viêm toàn thân và đưa rađịnh nghĩa cụ thể cho nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn huyết nặng, sốcnhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những vấn đềquan trọng trong lĩnh vực nhiễm khuẩn huyết [14, 16,56].

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16]

Tế bào bạch cầu ≥ 12,000 / µl hoặc ≤ 4000 / µl hoặc > 10%

chưa phát triển các triệu chứng

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng,

vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết[16, 56].

Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tửvong hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới Đây là mộttình trạng bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các

vi sinh vật gây bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưuhành trong máu và đi tới khắp các cơ quan trong cơ thể Nhiễm khuẩn huyếtgây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ

lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%), trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặngcủa nhiễm khuẩn huyết[15]

Mặc dù tần suất mắc nhiễm khuẩn huyết khác nhau tùy theo quốc gia,bệnh viện, mùa trong năm, đường vào của vi khuẩn và đối tượng bệnh nhân,nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ NKH chỉ chiếm 3 - 10% bệnh nhân(BN) nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị tại khoa Hồi sứctích cực (HSTC) Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30 - 50% tùy theonghiên cứu của các tác giả ở những bệnh viện (BV) khác nhau trên thế giới[12, 24] NKH trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt là một thách thức lớn đốivới các bác sĩ điều trị [68]

Tại Mỹ, một nghiên cứu trong vòng 22 năm từ năm 1979 - 2000 trênnhững

BN xuất viện cho thấy, có tổng số 10.319.418 trường hợp được chẩn đoán làNKH, chiếm 1,3% số BN nhập viện, trong đó các trường hợp mắc mới là17,3%/năm Tần suất mắc bệnh trên 100.000 dân cư tăng từ 164.000 ca(82,7ca/100.000 dân) năm 1979 lên tới 660.000 ca (240,5 ca/100.000 dân)trong những năm gần đây Tuy nhiên, ngược lại tỷ lệ tử vong lại giảm từ28,7% (năm 1979 – 1984) xuống còn 17,9% (năm 1995 – 2000) do những nỗlực can thiệp trong chẩn đoán, điều trị đem đến [55] Một nghiên cứu kháccủa Lambiase và tập thể (2011) cho thấy tỷ lệ NKH tiên phát tăng từ11,6/10000 ca (năm 2000) lên đến 24/10000 ca (năm 2008) vàNKHmắc phảitrong quá trình nằm viện tăngtừ22,1/10.000 ca (năm 2000) lên đến 37/10.000

ca (năm 2008)[48]

Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và tập thể (2006) trên 92.673 BNnhập viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầutăngtừ23,5%(1996)lênđến28,7%(2004)vàtửvongcũngtăngtừ9.000ca

(48,3%) năm 1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [37]

Nghiên cứu của Jason và tập thể (2011), tại 150 khoa HSTC của 16nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa HSTC tỷ lệ daođộng từ 5 – 53% tùy theo quốc gia [40] Nghiên cứu của Divatia và tập thể(2012), ở Ấn độ trên BN nhập vào khoa HSTC cho thấy, tỷ lệ NKH là 26% và

tử vong là 38% [27]

Tại Việt nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và Tập thể (2008),khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKHnói chung là 8% [3] Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và tập thể (2013)

ở các khoa HSTC của 15 bệnh viện trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKHchiếm 10,4%[4]

1.1.2 Dấu hiệu của nhiễm khuẩnhuyết

 Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thởnhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phùnề

 Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: Tăng hoặc giảm số lượng tế bàobạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin,interleukin-6)

 Thay đổi huyết áp động mạch: Hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanhkhông rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượngnước tiểu giảm

 Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổnthương phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giảithích được thay đổi chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầuhoặc đông máu nội mạch rải rác, không rõ nguyên nhân thay đổi trongcác thử nghiệm chức năng gan (bilirubin), không dung nạp thức ăn(thay đổi nhu động ruột)[21]

1.2 Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thườnggặp

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từcác ổ nhiễm khuẩn ởmôvà cơ quan như: Da,mômềm, cơ, xương khớp, hô hấp,tiêu hóa Ban đầu, bệnh đượcmôtả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm.Nguyên nhân là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thểvới nội độc tố (endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩnGram âm Tuy nhiên trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễmkhuẩn huyết do vi khuẩn Gram dương lại chiếm ưu thế[17]

Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn

huyết,Staphylococcusaureuslà chủng Gram dương phổ biến nhất, cònAcinetobacter baumannii,Escherichia coli,Klebsiella pneumoniaevàPseudomonas aeruginosachiếm ưu thế trong các chủng Gram

âm [38]

Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm và Gramdương bởi bệnh cảnh lâm sàng thường nặng và hay kèm theo có sốc nhiễm

khuẩn Tử vong ở bệnh nhân có sốc nhiễm khuẩn, có thể lên tới 80% Hơnnữa, việc điều trị mầm bệnh là vi khuẩn rất khó khăn do khả năng đề khángvới kháng sinh cao của chúng [79] Do đó phương pháp xác định nhanh tácnhân gây nhiễm khuẩn là hết sức quan trọng Phương pháp multiplex PCRhiện nay là phương pháp có khả năng đáp ứng được yêu cầu của thực tế Vìvậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5 chủng vi sinh vật gây nhiễm

trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus,Acinetobacter

baumannii,Escherichia coli,Klebsiella pneumoniaevàPseudomonas aeruginosa) sử dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần

vào việc phát hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần điều trị hiệu quả

1.2.1 Tụcầu khuẩnStaphylococcusaureus

Staphylococcus aureuslà vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều

bệnh khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đờisống bệnh nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội

chứng sốc độc tố.Staphylococcus aureuskháng Methicillin (MRSA) vàStaphylococcus aureusmẫn cảm với Methicillin (MSSA) là nguyên nhân

gây tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn [65]

Hình 1.2 Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩnStaphylococcus aureus

(

http://suckhoedoisong.vn/han-che-benh-do-vi-khuan-tu-cau-n80035.html ) http://www.jenner.ac.uk/staphylococcus-aureushttps://

www.pinterest.com/pin/519462138241501307/

Theo nghiên cứu của Anthony và tập thể (2016), trong số 71 bệnh nhânđược chăm sóc đặc biệt thì số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết chiếm 49%,

nguyên nhân doStaphylococcus aureuschiếm tỉ lệ cao nhất (18,2%) và 8%Staphylococcus aureusđược phân lập kháng Methicillin [11].

Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng,MRSA gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồngbao gồm viêm nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêmphổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [39] MRSA kháng methicillin ở tụ cầuqua trung gian PBP2a, một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin(78 kDa) Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam

GenfemAmã hóa cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này được sử

dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA [40,42]

Staphylococcus aureuskháng Methicillin được phát hiện trong một

nghiên cứu của Hassanain và tập thể (2009) Trong nghiên cứu này các tác giả

sử dụng phương pháp nhân bản gen đa mồi 5 gen được nhân bản bao gồm:

16S rRNA của chiStaphylococcus,MecAcủaStaphylococcus aureus, genMecAmã hóa cho kháng methicillin, genLuksmã hóa sản xuất của Panton-

Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử và một gen nội chuẩn để tránhhiện tượng âm tính giả Thử nghiệm trên 230 chủng phân lập lâm sàng, chothấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới 99,3% [38, 75]

1.2.2 Acinetobacterbaumannii

Acinetobacter baumanniilà cầu trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, không

lên men glucose Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các

điều kiện môi trường rất cao do vậyAcinetobacter baumanniixuất hiện phổ

biến trong môi trường và là một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [44].Trong những nghiên cứu gần đây, chúng ngày càng được chỉ ra là một vi sinhvật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm

nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu,

nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [45].Acinetobacter baumanniicó

khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận vàtích lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt[22, 48]

Hình 1.3 Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi

khuẩnAcinetobacterbaumannii

http://acinetobacterbaumannii.com/http://

journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2013.00095/full

Nguyễn Thị Thanh Hà đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng trên 287 bệnh

nhân NKH doAcinetobacter baumannii và nhận thấy: NKH gặp nhiều ở trẻ

em, tử vong cao (33,1%), lâm sàng thường nặng và diễn tiến nặng gặp ởngười lớn nhiều hơn trẻ em với tỷ lệ tử vong cao hơn (50,8% so với 20,4%),hônmênhiều hơn (26,6% và 13,7%), phải hô hấp hỗ trợ nhiều (40% và22,1%), tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn cao (45,8% và 26,3%), suy đa tạng nhiều hơn(45,8% và 31,7%), phải sử dụng thủ thuật xâm lấn nhiều hơn và người lớn cónguy cơ tử vong cao hơn trẻ em [2] Bằng kỹ thuật sinh học phân tửMultiplex-PCR đã phát hiện gen OXA trên 62

chủngAcinetobacterbaumanniit ừ n h ữ n g B N đ ư ợ c c h ẩ n đ o á n N K H : 6

2 c h ủ n g đ ề u m a n g g e n

OXA_51 (100%); 36 chủng mang gen OXA_23 rải rác ở cả 6 bệnh viện của 3miền Bắc, Trung và Nam, 7 chủng mang gen OXA_58 chỉ gặp ở miền Bắc và

Nam Đặc biệt, các chủngAcinetobacter baumanniimang gen OXA_58 kháng

kháng sinh lên đến 100% với nhóm carbapenem, 100% với ceftazidin Cácchủng mang gen OXA_23 có mức kháng thấp hơn với imipenem (66,7%),meropenem (55,6%) và kháng rất cao với ceftazidine (91,6%) và thấp nhấtvới cefepim (30,5%)[2]

1.2.3 Klebsiellapneumoniae

Klebsiella pneumoniaelà vi khuẩn gram âm và là mầm bệnh cơ hội

chiếm tới 10% tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến của bệnhnhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhânsuy giảm miễn dịch, đồng thời là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với bệnh

nhiễm trùng cộng đồng [49] Tầm quan trọng củaKlebsiella pneumoniaetrong

cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ

rộngβ-lactamasecủa chúng Các nghiên cứu chỉ ra rằng sinh vật kháng kháng sinh

phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn tới khả năng thất bại trong điều trị

Do vậymàchúng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng bệnhviện và nhiễm trùng cộng đồng[50]

Hình 1.4 Hình ảnh và tác động của vi khuẩnKlebsiella pneumonia

https://www.pinterest.com/pin/383087512037727953/

Một số phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng cho việc phát

hiệnKlebsiella pneumoniaenhư phân tích đa hình nhân bản ngẫu nhiên DNA

(RAP-PCR), điện di trường xung đẩy hoặc đa hình khuếch đại các đoạn dài(AFLP) [51] Tuy nhiên, các phương pháp này dựa trên các băng điện di vìvậy kết quả có thể không rõ ràng, nhưng nhìn chung các phương pháp này rấtthích hợp để điều tra khu trú dịch tễ học Tuy nhiên, rất khó để so sánh kếtquả do phòng thí nghiệm khác nhau công bố cho thực hiện một phân tích dịch

tễ học trên toàn thế giới Để khắc phục những hạn chế của các phương pháptrên, phương pháp xác định trình tự nhiều gen đặc trưng (MLST) đã đượcphát triển, đó là một phương pháp giải trình tự nucleotide các đoạn trình tựđiển hình của vi khuẩn hoặc nấm [52] Phương pháp này dễ dàng được chuẩnhóa, lưu trữ và trao đổi thông tin điện tử Nó được áp dụng thành công choviệc khu trú dịch tễ học của một loạt các vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở mức

lâm sàng nhưStreptococcus pneumoniae, Staphylococcus

aureus,Enterococcus faecium, Neisseria meningitidis và Campylobacter jejuni Gần đây, phương pháp MLST nhằm phát hiệnKlebsiella pneumoniaesử

dụng 7 gen quản gia bao gồmrpoB, GAPA, MDH, PGI, phoE, infB,vàtonBđã

được phát triển[53]

1.2.4 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosalà trực khuẩn, Gram âm được tìm thấy phổ

biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật Chúng sinh trưởngmạnh trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu

cơ.Pseudomonas aeruginosagây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử

vong cao ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhângây nhiễm trùng bệnh viện [54, 55]

Hình 1.5 Hình ảnh và tác động của vi khuẩnPseudomonas

aeruginosahttps://www.pinterest.com/pin/9689782945810861 5/

Pseudomonas aeruginosalà sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ

phổi của 80% bệnh nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi Sự có mặt củachủng vi sinh vật này tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệuchứng lâm sàng của bệnh nhân Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng

cụ có liên quan đóng vai trò như một nguồn cung

cấpPseudomonasaeruginosavà những nguồn này trở thành tiêu điểm cho việc

bùng phát lây lan vi sinh vật [16]

Kích thước hệ gen củaPseudomonas aeruginosakhoảng từ 5,2 -7,1Mbp.

Mức độ dao động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối vớicácphương phápđược sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật này.Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các chủng(chủng PAO1) được công bố (chỉ với 0,5% nucleotide bị phân tán) Trong khi

đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp di truyền phân tử đượcsửdụngđểnghiêncứudịchtễ họcvàphântích di truyềnquầnthể Lomholtvàtậpthể (2001), Pirnay vàtậpthể (2002) sửdụngkỹ thuật giải trình tựcủa gen

đặctrưngvàpyoverdineđểnghiêncứu ditruyền khảmnhiễmthểmởrộng,đặc

biệtlà ở genoprD[53,66].

1.2.5 Escherichia coli

Escherichia colilà vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng bệnh viện

và chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hôhấpvà nhiễm

trùng đường tiết niệu Cả hai chủngEscherichia coli và

Pseudomonasaeruginosađều là các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện

nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế đặc biệt và gây ra nhiễm khuẩn y tế

và nhiễm khuẩn cộng đồng[57]

Hình 1.6 Hình ảnh và phân loại vi khuẩnEscherichia

coli http://www.wikilinks.fr/escherichia-coli-en-photo/?lang=enhttp:// www.slideshare.net/shrekym/detection-of-stx-gene-of-ecoli-o157

Escherichia colilà vi khuẩn Gram âm, thường có liên quan nhiều đến

nhiễm khuẩn bệnh viện và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi Họ vi

khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của

người và động vật, đang là mối quan tâm lớn trong nhiễm khuẩn bệnh viện do

có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside,β-lactamasevà

có khả năng truyền tính kháng qua plasmid Nhiều nghiên cứu trong nước và

quốc tế đã kh ng định,Escherichia coligây nhiễm trùng chủ yếu trên đường

tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm trùng vếtmổ[59]

1.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩnhuyết

1.3.1 Chẩnđoánnhiễmkhuẩnhuyếtbằngphươngphápcấymáu

Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trongmôi trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhângâybệnhbằngcáchsửdụngxétnghiệmsinhhóatiêuchuẩn.Phươngphápcấy máuđược thực hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi sinh vậtbằng cách phân tích sự giải phóng CO2bởi huỳnh quang hoặc cảm biến hoặccách khác là thay đổi áp suất trong bình nuôi cấy do sự tiêu thụ và sản xuấtkhí này dùng để chỉ thị sự phát triển của vi sinh vật [30] Mặc dù có những ưuđiểm nhất định nhưng thời gian thực hiện của phương pháp là quá dài dẫn tớikhó khăn để đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng trong những trường hợpcần thiết [60] Trong khi đó độ nhạy của phương pháp còn bị ảnh hưởng bởikhoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình nuôi cấy [30, 61]; mầm bệnh dễ

bị suy yếu trong thời gian chờ kết quả Hơn nữa để có kết quả, cần thêm mộtthời gian phát triển của sinh vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ và việcnhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua đêm để thu được khuẩn lạc riêng rẽcho xét nghiệm Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ có thể được kết luận sau 5-7ngày Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc kháng sinh hoặc mầmbệnh khó nuôi cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương pháp[62]

1.3.2 Lai huỳnh quang tạichỗ

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp đượcnghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại Phương pháp này phùhợp cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính.Trong khoảng 2,5- 3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấmmen thường được tìm thấy trong máu [63, 64] Kết quả cấy máu dương tínhđược chuẩn bị, lai với mẫu dò oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tớiđích là rRNA và quan sát bằng kính hiển vi [64] Tuy nhiên phương phápn à y

có nhược điểm là một số vi khuẩn chỉ có thể được phát hiện ở cấp độ chi bởi

vì không sẵn có mẫu dò cho đặc hiệu cấp độ loài

1.3.3 Cáckỹthuật khuếch đạiDNA

1.3.3.1 Kỹ thuậtPCR

PCR là kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầmbệnh từ cấy máu dương tính Sử dụng xét nghiệm thương mại có sẵn hoặcbroad-range PCR hoặc multiplex PCR

Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn DNA

có trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi

củaDNApolymeraseđể nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần

so với ban đầu Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợpkhuôn-mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thànhsợi bổ sung với sợi khuôn Vì vậy để nhân bản được đoạn DNA đích, người tacần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu Kỹ thuật PCR rất nhạy,chỉcầnmộtlượngnhỏDNA khuôn(ởmức nanogam)làphản ứngđãcó thểchokếtquảdương tính.Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác, phát hiện đượcnhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn

1.3.3.2 Kỹ thuật MutiplexPCR

Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tácnhân gây bệnh trực tiếp từ máu Mutiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đíchtrong cùng một mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi Kỹthuật này thường được dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của

vi sinh vật Đây là vùng khôngmãhóa của DNA có vị trí giữa các gen và cótính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinhvật khác Phương pháp có mức độ nhạy cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa[30]

Mặc dù kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gâybệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoánnhưng không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu Trong nhiềunghiên cứu, tỷ lệ phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp caohơnhn sovớichỉthực hiệnPCRhoặc nuôi cấymáuriênglẻ.Toànbộquátrình xétnghiệm bằngPCRđếnkhi cho kếtquảcó thểđượchoànthànhtrongkhoảng5giờ.Phươngphápnàyrútngắnthờigian cần thiếtcho xácđịnh kiểuhìnhvàkháng sinhđồđồngthời có ưuđiểmlàđộnhạy,độđặc hiệurất cao[70].

1.3.3.3 Kỹ thuật Broad-rangePCR

Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trongmáud ự a

t r ê n g e n mãcho 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18SrRNA của nấm Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được pháthiện bằng các phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự,pyrosequencing, hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu[32]

1.3.3.4 Kỹ thuật Real-timePCR

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩmkhuếch đại khi tiến trình phảnứngđang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnhquang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên củatín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sảnphẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ Tùy thuộc vào số lượng bản DNAđích ban đầu có trong ống phản ứngmàgiá trịCt(chu kỳ ngưỡng) của các mẫu

là khác nhau Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích

có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đíchbanđầu

Real-time PCR là phương pháp nhanh hơn so với PCR truyền thống vàkhông cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn Áp dụng các

phương pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài

vi khuẩn cụ thể từ các mô hoặc nhiễm trùng, như viêm màng não do vi khuẩn.Đối với các vi khuẩn nhiễm trùng bệnh viện, có rất nhiều nghiên cứu sử dụngrealtime PCR để xác định các đối tượng này [67, 69]

1.3.4 Giải trìnhtự

Một số phương pháp giải trình tự DNA được nghiên cứu nhằm xác định

vi khuẩn, nấm gây bệnh được lấy trực tiếp từ mẫu máu dương tính trong môitrường cấy máu Một số tác giả đã sử dụng MicroSeq 500 kit (Perkin-ElmerApplied Biosystems, CA), một phương pháp về trình tự đầu tiên để xác định

527 base của gene 16S rRNA nhằm xác định các chủng sinh vật gây bệnh [67,71] Turenne và tập thể (2000) đã sử dụng phân tích đa hình sợi đơn kết hợpvới PCR để phân biệt giữa các sinh vật [78] Một số nghiên cứu đã sử dụngpyrosequencing để nhận dạng nhiều vi khuẩn, nấm men và nấm[72,73] Ưuđiểm chính của pyrosequencing là nhanh chóng và giá cả thấp hơn so với giảitrình tự thông thường đồng thời cung cấp nhanh chóng trình tự các đoạn ngắnkhoảng 30 bp trong khoảng 30 phút Phương pháp này đã được sử dụng đểphân loại, xác định nhiều loài vi khuẩn [74] Tuy nhiên giải trình tự và giảitrình tự thế hệ mới đòi hỏi thiết bị phức tạp, tốn kém do đó không phải dễdàng chuyển sang thực hành lâmsàng

Ngoàira,cònnhiềuphươngphápphântửkhácnhư:KhốiphổhayDNA chip(microarray)… đượcứngdụng để phát hiện và chẩn đoán tác nhân gây nhiễmkhuẩn huyết Ưu điểm của các phương pháp này là có độ nhạy, chính xác cao

và tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, do đòi hỏi về chi phí vận hành và yêu cầutrình độ kỹ thuật nên các phương pháp này không được sử dụng phổ biến

1.4 Multiplex PCR và ứngdụng

1.4.1 Giới thiệu chung về multiplexPCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằmkhuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trìnhphân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụngnhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phảnứng Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phươngpháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiệnmàlại không ảnh hưởng tới kết quảthínghiệm

1.4.2 Các loại phản ứng multiplexPCR

1.4.2.1 Phản ứng multiplex PCR dùng mộtkhuôn

Phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen,cùng với các cặp mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một số vùnggen khác nhau có chứa trong sợikhuôn

1.4.2.2 Phản ứng multiplex PCR dùng nhiềukhuôn

Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiềucặp mồi Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kếtchéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này vàkhuôn kia Do đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng

Hình 1.7 Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR

(http://www.premierbiosoft.com)

1.4.3 Thiếtkếmồi cho phản ứng multiplexPCR

Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sựthành công của phản ứng multiplex PCR Các lưu ý quan trọng khi thiết kếmồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới Đây có thể coi là chìa khóaquyết định sự chính xác của quá trình khuếch đại các trình tự ADN với hàmlượng sản phẩm caonhất

* Chiều dàimồi

Phản ứng multiplex PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy nó đòihỏi các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp Thông thường các mồi

có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide

* Nhiệt độ nóng chảy của mồi(Tm)

Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằmtrong khoảng từ 55°C - 60°C Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm củamồi có thể cao hơn (khoảng 75°C - 80°C) Độ dao động về Tm giữa các mồinên nằm trong khoảng 3°-5°C

* Độ đặchiệu

Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết

kế mồi Với phản ứng multiplex PCR nó càng trở nên quan trọng, đặc biệt làtrong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và khuôn

* Tránh hình thành dimerprimer

Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra xem chúng có hình thànhdimer không Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đếnviệc khuếch đại không đặc hiệu

Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1phản ứng PCR thông thường Thông thường, khi tỷ lệ Mồi/Khuôn quá caocũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số củacác thành phần trong phản ứng

* Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mềnPrimerPlex

PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phảnứng multiplex PCR Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng cóphản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi.Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đóchương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn

1.4.4 Ưuđiểm của phương pháp multiplexPCR

* Đối chứng nội kiểm (Internalcontrol)

Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiệntượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại

là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm Phương pháp multiplex PCR đãkhắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cungcấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác

* Hiệu quảcao

Chi phí về hóa chất và thời gian tiến hành multiplex PCR giảm đáng kể

so với một phản ứng PCR đơn lẻ Các phản ứng multiplex PCR cũng bảo đảmđược độ bền của enzyme polymerase và khuôn.

ức chế phải được xác định sau mỗi mỗi chu kỳ khuếchđại

Phản ứng multiplex PCR có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khi chuỗinày được chuyển thành dạng cADN Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôncho phảnứng

1.4.5 Tối ƣu hóa các thành phần cho phản ứng multiplexPCR

* Nồng độmồi

Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM

Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ,người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độmồi với các locus “mạnh” Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứngnên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM Với số lượng bản sao thấp hayADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3 µM đến 0.5 µM.Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độmồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM

* Nồng độ dNTP vàMgCl2

Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM Nồng độ dNTP có thểdao động từ 0.5 mM đến 1.6 mM Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP

là từ 0.2 mM đến 0.4 mM Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng.Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứngnhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quátrình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm Đểkhắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trướckhi bảo quản ở -20ºC.

Do MgCl2ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADNpolymerase nên nồng độ Mg2+phải được kiểm tra chặt chẽ Enzyme Taqpolymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2nên nồng độMgCl2phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này Hơn nữa, nếu khuôn hoặcmồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl2cũng sẽ được điều chỉnh.Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính Nồng độ

Mg2+cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nótác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn Tuy nhiên nếu hàm lượng

Mg2+không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết

* Sự cân bằng dNTP/MgCl 2

Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh

Mg liên kết với dNTP và ADN) Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTPthì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kếtquả ngược lại 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2là hợp lí

* Nồng độ dung dịch đệm(buffer)

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phảnứngmultiplexPCR Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol,BSA) Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạtđộng tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân cácđoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối caohơn

* Lượng ADN khuôn và Taq ADNpolymerase

Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu củaphản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi Người ta tiến hành thửnghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra đượcnồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/50µl dịch phản ứng Nếu quá nhiềuenzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằngquá trình khuếch đại làm tăng sự nhiễu Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụthuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng nhưMgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích Vì vậy, một loạt các cải tiến đượcthực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào cácyếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi.

* Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol,BSA

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗtrợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine Nhữngphụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằngnhiệt nhanh hơn Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO vàglycerol lại gây ra sự cạnh tranh Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nênđược xem xét kiểm tra chặt chẽ Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tănghiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol

1.4.6 Ứngdụng của phản ứng multiplexPCR

Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặtcùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâmnhiễm khác Đồng thời, phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác địnhcác thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định

sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen

Phản ứng multiplex PCR đƣợc sử dụng vào các mục đích:Xác định tác

nhân gây bệnh; Hiệu suất SNP genotyping cao; Phát hiện đột biến; Phát hiệnđột biến mất đoạn trong gen; Định lượng mẫu; Phân tích các liên kết; Phát

hiện ARN; Nghiên cứu pháp y…

1.4.7 TìnhhìnhứngdụngkỹthuậtPCRtrongviệcxácđịnhcáctácnhân nhiễm khuẩnhuyết

Hiện nay, khá nhiều các nhà khoa học đã tập trung phát triển kỹ thuậtPCR, multiplex PCR, multiplex realtime PCR trong kiểm soát các tác nhângây nhiễm khuẩn

Anbazhagan D và tập thể (2011) phát triển các xét nghiệm PCR thôngthường và multiplex realtime PCR để phát hiện mầm bệnh bệnh viện [7].Gadsby NJ và tập thể (2016) dùng các kỹ thuật PCR xác định tác nhân gâybệnh đường hô hấp trong cộng đồng viêm phổi mắc phải [32] Aydemir O vàtập thể (2014) xác định vai trò của multiplex PCR xác định các vi khuẩn gâybệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [13] Ở Thổ NhĩKỳ,Kurutepe S và tậpthể (2012) điều tra nguyên nhân do vi khuẩn bằng phương pháp PCR thôngthường và multiplex ở bệnh nhân người lớn bị viêm phổi cộng đồng [46].Eser O.K và tập thể (2012) so sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp

realtime PCR trong việc phát hiện vi khuẩnStreptococcus

pneumoniaevàHaemophilus influenzaetrong viêm tai giữa cấp mẫu vật tràn

dịch [29] Jbara I và tập thể (2007) So sánh phương pháp nuôi cấy và các

phương pháp PCR cho các phát hiện củaHaemophilus

influenzae,Streptococcus

pneumoniaevàMoraxellac a t a r r h a l i s t r o n g d ị c h n ã o t ủ y v à t r à n d ị c h t a i

g i ữ a [ 4 1 ] T h o n g

K.L và tập thể (2011) đã xây dựng phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng

thờiStaphylococcus aureuskháng methicillin, Acinetobacter baumannii,Escherichia coli, Klebsiella pneumoniaevàPseudomonas aeruginosa.Kếtquả khảo sát trên 50 mẫu kết quả dương tính và âm tính tương

đồng 100% so với kết quả xác định bằng phương pháp nuôicấy

Ở Việt Nam, có một số nghiên cứu cũng như các nhà khoa học sử dụng

kỹ thuật PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết cũng như

nhiễm khuẩn bệnh viện: Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Hữu Song, nhómcác bác sỹ ở Viện truyền nhiễm Trung ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnhviện Nhi Trung Ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Việt Đức, BạchMai, Thanh Nhàn,… Đa số các nghiên cứu sử dụng các Kit ngoại nhập hoặccác cặp mồi tham khảo trên tạp chí quốc tế ví dụ một nghiên cứu đăng trêntạp chí Y học thực hành của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và tập thể đã sửdụng bộ Kit Real Time PCR đa mồiSeptiFast (Roche)trong chẩn đoán cănnguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương [5].Nhóm nghiên cứu phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương phápcấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% tác nhân gây bệnh nhiễm trùnghuyết Các tác nhân nhiễm trùng huyết thường gặp nhất

làKlebsiellapneumonia/oxytocacó tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp sau làEnterobacter cloacae/aerogenesvới 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó là các vi khuẩn và nấm khác như:Staphylococcus aureus,

Pseudomonasaeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonasmaltophilia.

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

nhân do bệnh viện Thanh Nhàn cungcấp

 Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấythuần)

 Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 68 bệnh nhânngười Việt Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnhviện ThanhNhàn

 Mẫu máu được lấy trực tiếp từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩnhuyết do bệnh viện Thanh Nhàn cungcấp

 Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich,Corporation, USA) (Bảng2.1)

Bảng 2.1 Trình tự Nucleotide của các cặp mồi

 Hóa chất: Mastermix, Tris-base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr,Agarose và các hóa chất khác do hãng Merck, Invitrogen,Promega, Bioline… cung cấp Kit tách chiết DNA tổng số củahãng QIAgen(Đức).

2.1.2 Thiếtbị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Tế bào Động vật vàPhòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng nổitiếng khác nhau Các thiết bị thường sử dụng như:

 Máy Nanodrop1000

 Bộ điện di DNA của Bio- Rad, HoaKỳ

 Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ)

 Máy soi DNA (Mini -transllumminator Bio-Rad, HoaKỳ)

 Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge-Sorvall,Mỹ)

 Máy PCR (PCR system 9700, Applied Biosystem,Mỹ)

 Tủ lạnh 4oC, tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, NhậtBản)

 Máy ủ ổn nhiệt (Memmert,Đức)

 Máy vortex (RotoLab,OSI)

 Máy khuấy từ (RotoLab,OSI)