Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10 HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

Hà Nội, 2019ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Văn Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯ

Hà Nội, 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Văn Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-VĂN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

10-ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS DƯƠNG HỒNG ANH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn PGS.TS Dương Hồng Anh đã giao đề tài, nhiệt tìnhhướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luậnvăn

TôixintrânthànhcảmơnTrungtâmNghiêncứuMôitrườngvàPháttriểnBền vững –Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện và cung cấp các trangthiếtbịnghiêncứu,đặcbiệtlàcácanhchị,cácbạntrongnhómĐiện dimaoquảnđã giúp đỡ tôirất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài, luận văn được thực hiệntrong khuôn khổ đề tài QG.18.05 của Đại học Quốc gia HàNội

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Hóa học nói chung và Bộmôn Hóa Phân tích nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian họctập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên

Bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứunày

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Văn Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

MỞĐẦU 1

PHẦN 1:TỔNGQUAN 3

1.1 SỮAONGCHÚA 3

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữaongchúa 3

1.1.2.Thành phần hóa học của sữaongchúa 4

1.1.3.Thu hoạch sữaongchúa 7

a Quy trình bắt cócongchúa 7

b.Quy trình giả làm tổongchúa 7

1.1.4.Tác dụng của sữaong chúa 8

1.2.Axittrans-10-hydroxy-2-decanoic(10-HDA) 9

1.2.1.Một số nghiên cứuvề10-HDA 11

a.Hoạt tínhsinhhọc 11

b.Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữaongchúa 13

c.So sánh phương pháp và đề xuất phương phápthíchhợp 17

1.3.Giới thiệu về phương pháp điện dimaoquản 18

1.3.1.Dòng điện di thẩmthấu(EOF) 20

1.3.2.Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụđiện(C4D) 21

1.3.3.Kỹ thuật bơm mẫu trong điện dimaoquản 22

1.3.4.Các thông số đánh giá trong phương pháp điện dimaoquản 23

1.3.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện dimaoquản 24

PHẦN 2:THỰCNGHIỆM 26

2.1 Mục tiêunghiêncứu 26

2.2 Nội dungnghiêncứu 26

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tíchtrênCE 26

2.2.2 Khảo sát quy trình xửlímẫu 27

2.3 Đánh giáphươngpháp 28

2.4 Dụng cụ, thiết bị vàhóachất 30

2.2.2 Dụng cụ vàthiếtbị 30

2.3.2.Hóa Chất 31

2.4 Thông tinmẫuthực 32

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN 35

3.1.Khảo sát điều kiện tối ưu nhằm phân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ongchúa bằng phươngphápCE-C4D 35

3.1.1 Khảo sát thành phần và pH của dung dịch đệmđiệnli 35

3.1.2 Khảo sát nồng độ và pH của dung dịch đệmđiệnli 37

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gianbơmmẫu 39

3.1.4 Khảo sát điệnthếtách 41

3.2 Khảo sát và tối ưu quy trình xửlímẫu 42

3.2.1.Khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích píc của10-HDA 42

3.2.2 Khảo sát dung môihòatan 45

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ thành phần dung môihòatan 47

3.3 Đánh giá phương phápphântích 49

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ sốtươngquan 49

3.3.2 Đánh giáđộchụm 51

3.3.3 Độ đúng (độthu hồi) 52

3.3.4 So sánh với phương pháp tiêuchuẩnHPLC 54

3.3.5 Phân tích mẫuthực tế 55

KẾTLUẬN 57 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Quátrìnhpháttriểncủa ongchúavàongthợ 4

Bảng1.2.Thànhphầncủasữaongchúatươivàsữaongchúađôngkhô 6

Bảng1.3.Đềsuấthàmlượngcủamộtsốquốcgiavàtổchức 10,11 Bảng2.1Thôngtin về các mẫu đượcnghiêncứu 33,34 Bảng 3.1.Điềukiện thiếtbịđiệndimaoquản 42

Bảng 3.2.Khảosátdiệntíchpictrung bìnhcủa10-HDAvới các tỉ lệ dung môikhác nhau.48 Bảng3.3.Sựphụthuộccủadiệntíchpicvàonồngđộ10-HDA 50

Bảng3.4.Kếtquảsosánhgiữagiátrịavớigiátrị0củaphươngtrìnhđường 51

Bảng 3.5.Cácthôngsốđánhgiáphươngpháp 52

Bảng 3.6.Giá trị độlệchchuẩn 53

Bảng 3.7.Hiệusuấtthuhồicủa10-HDA 54

Bảng3.8.KếtquảsosánhgiữaCE-C4DvàHPLCvớisốmẫuthựctế 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng bên trong sữaong chúa 4

Hình 1.2: Sữaong chúa 4

Hình 1.3: Công thức hóa học của 10-hydroxyl-trans-2-decenoicacid (10-HDA) 9

Hình 1.4: Sơ đồ của một hệ điện di mao quảnđơngiản 19

Hình 1.5: Hệ điện di mao quản1kênh 19

Hình 1.6: Bộ ghitínhiệu 19

Hình 1.7: Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của cáciontrong 21

Hình 1.8: Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụđiện(C4D) 22

Hình 1.9: Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện dimaoquản 23

Hình 3.1: Điện di đồ của lựa chọn thành phần đệm (tại pH 9) phân tích 10-HDA (20 mg/L) 36

Hình 3.2 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 20 mM Tris/Ace pH 8÷9 37

Hình 3.3 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 50 mM Tris/Ace pH 8÷9 38

Hình 3.4 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 100 mM Tris/Ace pH 8÷9 38

Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới tín hiệu của 10-HDA 40

Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách tới tínhiệu10-HDA 41

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến việcphân tích 10-HDA(mẫu 1) 43

Hình 3.8 Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọcbằng PTFE, nilon vàxenlulozoaxetat 44

Hình 3.9 Điện di đồ phân tích 10-HDA với không ly tâm, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozoaxetat 44

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện diện tích pic trung bình của 10-HDA với các dung môi hòatan 46

Hình 3.11 Điện di đồ phân tích 10-HDA với các dung môi chiết khác nhau (mẫu 1) 46

Hình3.12.Điệndiđồphântích10-HADvớicáctỉlệdungmôichiếtkhácnhau(mẫu 4) 48Hình 3.13 Đườngchuẩn10-HDA 50Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu thêmchuẩn 53Hình 3.15 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong một số mẫu sản phẩm sữa ong chúa;mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 4

và 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ongsữachúa 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

GC-MS Sắc kí khí – detector khối phổ

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, các ngành sản xuất thực phẩm chức năng và sảnphẩmlàmđẹpngàycàngpháttriểntrêntoànthếgiớiđặcbiệtlàởViệtNamgiúpduytrì sức khỏe,cải thiện nét đẹp của con người Các sản phẩm làm đẹp và dinh dưỡng hiện nay tậptrung chủ yếu vào những sản phẩm tự nhiên có sẵn như sữa ong chúa, đông trùng hạthảo, sâm… Trong dân gian, Sữa ong chúa (RJ) đã được biết đến với nhiều tácdụng như cải thiện trí nhớ, tăng năng lượng, giảm lo lắng hoặc căng thẳng, khángviêm, chống ung thư, và đặc biệt có khả năng chống oxi hóa, ngăn ngừa lãohóa Nhiềunămtrởlạiđây,sữaongchúađãđượcsửdụngtrongcácchếđộănkiêng,

làmđẹpvàtrởthànhsảnphẩmthươngmạiđượcưadùng.Vớithànhphầnhóahọcđa dạng phongphú, giàu protein, chứa nhiều axit amin thiết yếu, các axit béo cần thiết như axitpantothenic (B-5) và pyridoxin (B-6) … sữa ong chúa có nhiều tác dụng tốt với conngười ở mọi lứatuổi

Trong tất cả các sản phẩm làm từ ong như phấn hoa, keo ong, mật ong, … thìđiểm khác biệt giữa sữa ong chúa và những sản phẩm khác là chỉ trong sữa ongchúa

có thành phần axit 10-Hydroxy-2-decenoic (10-HDA) Do đó sự hiện diện của 10- HDA có thể được sử dụng làm dấu chuẩn (“marker”)

để phân biệt sữa ong chúa với các sản phẩm khác Và hàm lượng của 10-HDA có thể được sử dụng như một thông số cho chất lượng sữaong chúa Theo quy định của Bộ Nông nghiệp (MOA) Trung Quốc, hàm lượng 10-HDA không được thấp hơn 1,4% đối với sữa ongchúa nguyên chất dạng kem và 4,2% đối với dạng đông khô Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng chống và ngăn ung thư, khángviêm và chống oxi hóa,… của 10-HDA [9] Với những tác dụng của sữa ong chúa và đặc biệt là 10-HDA đã dẫn đến sự nhậpkhẩusốlượnglớnsữaongchúamỗinămởnhiềuquốcgia.Nhucầusửdụngtăngcao dẫn đến sự xuấthiện của các mặt hàng giả, hàng kém chất lượng Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần củasữa ong chúa được sản xuất, đánh giá chất lượng của các sản phẩm thương mại là rấtcầnthiết

Việc phân tích 10-HDA ở Việt Nam hiện này vẫn là vấn đề mới, chưa có tiêuchuẩnquyđịnh cho sản phẩm cũng như quy trình tiêu chuẩn theo QCVN 10-HDAđược phân tích định tính, định lượng chủ yếu bằng phương pháp sắc ký (như: sắc kýlỏnghiệunăngcao(HPLC),sắckýkhíkhốiphổ(GC-MS),…).Cácphươngphápnàyđều có độnhạy, độ chính xác cao, nhưng phải sử dụng thiết bị có chi phí đầu tư lớnvàsửdụngnhiềudungmôihữucơ.Việcxâydựngmộtphươngphápphântíchnhanh,

thuậntiện,dễápdụngvàkinhtếđểxácđịnh10-HDAlànhucầucầnthiếttrongđiều kiện ViệtNam, một trong số các lựa chọn đó là phương pháp điện di mao quản Phương phápđiện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụđiện(CE-

C4D)gầnđâyđượcbiếtđếnlàmộtcôngcụhữuhiệutrongphântíchthực phẩm với các ưu điểmnổi trội như thiết bị nhỏ gọn có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại Việt Nam, hoạtđộng đơn giản, lượng mẫu và dung môi hóa chất ít,chi phí đầu tư và vận hành thấp, từ đó cho chi phí phân

tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp phân tích sắc ký Với đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình

phântích hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điệndi mao quản”, bản luận văn này tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển

ứng dụngcủaphươngphápđiệndimaoquảnsửdụngdetectorđộdẫnkhôngtiếpxúctheo kiểu kếtnối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định 10-HDA trong một số sản phẩm sữa ongchúa

PHẦN 1: TỔNG QUAN1.1 SỮA ONGCHÚA

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ongchúa

Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong, được sảnsinh từ tuyến tiết niệu và tuyến sau tại vùng hàm dưới của ong thợ trên 7 ngày tuổi[17] Ong thợ chọn một vài ấu trùng nhỏ để phát triển thành ong chúa và cho chúngănmộtlượnglớnsữaongchúa,kiểuchoănnàykíchhoạtsựpháttriểnvềkíchthước,

khảnăngsinhsảnvàtuổithọ.Ongchúadùngloạithứcănnàycảcuộcđời,cònnhững ấu trùng ongđược dùng trong 3 ngày đầu tiên của cuộc đời đến ngày thứ tư thì được chuyển qua ăn mậtong và phấn ong, lớn lên thành ong thợ, điều này gây ra sự khác biệt giữa ong chúa và ongthợ Ong chúa là con ong cái duy nhất có quyền đẻ trứng trong đàn ong, dài và to hơn các ongđực, ong thợ (là ong cái mất khả năng sinh sản và có khả năng làm ra mật), cánh ngắn hơnthân, có nhiệm vụ đẻ trứng nhưng không làmramật.Tuổithọcủaongchúakhoảng5-6năm,gấp40lầnsovớiongthợlàchỉ sống được từ 30 - 40 ngày tuổi Vào thời gian sinhsản, ong chúa có thể đẻ lên đến 2000 quả trứng trong một ngày (lớn hơn cả trọng lượng

cơ thể của nó) Kích thước cơ thể của ong chúa lớn gấp rưỡi ong thợ, không có giỏ

mìnhvàkhôngcótuyếngiápnhưongthợ.Mỗitổchỉcómộtconongchúa,nếutrong tổ có nhiềuong sẽ tách thành tổ mới, thường vào mùa xuân Ong chúa sinh sản tốt nhất là đầu năm.Nếu mất ong chúa, các ong thợ có thể tạo chúa mới [3, 13,25]

Ong là côn trùng, không có tuyến vú nên không tiết sữa Sở dĩ gọi là “sữa” vìloại thức ăn đặc biệt này ở nhiệt độ thường sánh như bơ, khi nằm trong nụ chúa, nó

có màu trắng ngà giống sữa, và nó dùng để nuôi các ấu trùng ong non

Hình 1.1 Sự phát triển của ấu trùng

bên trong sữa ong chúa

Hình 1.2 Sữa ong chúa

Quy trình phát triển của ong chúa và ong thợ được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ

1.1.2 Thànhphần hóa học của sữa ong chúa

Sữaongchúacóthànhphầnhóahọcđadạngvàphongphú,baogồmcácthành phần chính lànước, cacbonhydrat, protein, lipit và axit béo, còn lại là các vitamin,aminoaxittựdo,muốikhoáng….Hàmlượngcủacácthànhphầntrongsữaongchúa được thểhiện trong bảng 1.2 [12,27]

Hàm lượng các nhóm chất trong sữa ong chúa thay đổi phụ thuộc vào nguồnsản xuất như chất lượng đàn ong, thời tiết, môi trường nuôi; vào điều kiện bảo quảnnhư nhiệt độ, thời gian

Nước(60%-70%): Hàm lượng nước trong sữa ong chúa khá ổn định,

chiếmkhoảng60%v ớ i mọiđiềukiệnthuhoạch,bảoquảnkhácnhauvàcócùnghoạtđộaw(làlượng nước có trong sữa ong chúa) là khoảng 0,92 Ở bên trong các tổ ong, sữa ongchúa liên tục được tạo ra bởi những con ong thợ cùng sự hút ẩm từ môi trường xungquanh và khả năng hòa tan của một số hợp chất Do đó độ ẩm hay hàm lượng nướctrong sữa ong chúa hầu như không thay đổi [4,12]

Protein:Theomộtsốnghiêncứu,proteinchiếmkhoảng27-41%làmộttrong những

phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô Các axit amin có mặt với hàm lượng phầntrăm cao nhất là: prolin, lysin, axit glutamic, β-alanin, phenylalanine, aspartatin và serin[11, 12,27]

Cacbonhydrat: Trung bình phần này chiếm 30% sữa ong chúa khô Giống

nhưtrongmậtong,cóhailoạimonosaccaritchínhchiếmhơn90%tổnglượngđường là glucozo

và chủ yếu là fructozo Saccarozo thường ở nồng độ rất cao, các oligosaccarit khác nhưtrehalozo, mantozo, gentiobiozo, isomantozo, raffinozo,erlozo,melezitozomặcdùcónồngđộrấtnhỏnhưngchúngrấthữuíchđểsosánhvới mật ong vàxác định được tính thật giả của sản phẩm [4, 12,27]

Lipid và axit 10-hydroxy-2-decenoic: Thành phần này cũng xuất hiện trong

sữa ong chúa cũng khá khiêm tốn, chỉ khoảng 8-19% trong thành phần sữa ong chúakhô.Nhưngkhôngthểphủnhậnnólàthànhphầnquantrọngnhấtcủacácthànhphần của sữa ongchúa Thực tế, phần lipid bao gồm chủ yếu là các axit hữu cơ (chiếm khoảng80-90%),hầuhếtlàtồntạiởdạngtựdo,vớicấutrúchiếmgặptrongtựnhiên Chúng là axit mono-, axitdihydroxy và axit dicacboxylic với 8 và 10 nguyên tửcacbon,đượcsắpxếptheocáchđặctrưng.Cácaxithydroxyvới10nguyêntửcacbon (như axit 10-hydroxydecenoic và 10-hydroxy-2-decenoic) có thể được tìm thấy ởnồngđộcao.Chúngkhôngchỉđượccoilàmộtthànhphầnquantrọngđểsosánhsữa ong chúa vàcác sản phẩm khác được làm từ ong, mà còn được xác định là chất cócáchoạttínhsinhhọcquantrọnggắnliềnvớichấtlượngcủasảnphẩmsữaongchúa [13]

Các muối khoáng: chiếm khoảng 0,8-3% trong sữa ong chúa Các khoáng

chất này giảm dần theo thứ tự: K, Ca, Na, Mg, Zn, Fe, Cu và Mn

Các vitamin: Vitamin B-complex, vitamin B1 (thiamin), vitamin B2

(riboflavin), axit pantothenoic, biotin, niacin, axit folic, inositol, axetincolin, mộtlượng nhỏ vitamin C Các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K thường không cóhoặc nếu có thì hàm lượng cũng ít [3]

Bảng 1.2 Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô [4]

Sữa ong chúa tươi Sữa ong chúa đông khô

-1.1.3 Thu hoạch sữa ongchúa

Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể phântích,xácđịnhmà“khôngthểtáitạo”.Dođóđiềumàcácnhàkhoahọccóthểlàmlànghiên cứu cặn kẽ mọisinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào đólấysản phẩm phục vụ conngười

Trong công nghệ nuôi ong lấy mật, con người đã vô tình nhưng may mắnbiếtcách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống Ngày nay, sữa ong chúa được bán trên khắp thế giới chủ yếu là sảnphẩm thu được từ công nghệ nuôi ong Còn sữa ong chúa được lấy từ tự nhiên hầu như không được làm sản phẩm thương mại Sauđây là trình bày sơ lược về quy trình sản xuất và thu hoạch sữa ong chúa:

a Quytrình bắt cóc ongchúa

Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong nhiệm kỳ.Theođặctínhcủaloàiong,đểchođànongđượctồntại,khicácchúongthợthấymất đi ong chúa,chúng lập tức chọn một trong những ấu trùng ong thúc dưỡng để trở thành ong chúa Việc bắtcóc, biệt lậphaygiết đi ong chúa đương nhiệm nhằm thúc đẩy ong thợ sớm chọn vàthúc dưỡng nhiều ấu trùng ong để trở thành ong chúa.Quytrình này chỉ thích hợpdưới dạng tiểu sản xuất, lượng sữa ong chúa thu đượcít

b Quytrình giả làm tổ ongchúa

Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những mùi vị

từ ong chúa đem trét vào những tổ ong mới đã chuẩn bị sẵn Mùi vị của các tổ onggiả đã đánh lừa các chú ong thợ Khi các chú ong thợ khám phá ra tổ ong đang bịtrống,chúngliềnchọnlựanhữngconấutrùngongvàthúcdưỡngđểtrởthànhnhững con ongchúa mới Quy trình này hiện đại hơn so với quy trình bắt cóc ong chúa và mang nhiềutính khoa học hơn như việc lấy enzym, tạo mùi vị… Nhiều nhà sản xuất với quy môdạng xuất khẩu, họ có thể tạo hàng loạt ấu trùng ong và đặt máy hút tựđộngtạicáctổongchúalúccònlàấutrùngong.Sựhútsữaliêntụcgâythiếudinh

dưỡng cho ấu trùng chúa làm cho các ong thợ phải liên tục tiết ra sữa để nuôi ong chúa Do vậy con người thu được nhiều sữa ong chúa hơn.

1.1.4 Tácdụng của sữa ongchúa

Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú nên nó có nhiềutác dụng tốt đối với cơ thể con người Sữa ong chúa có chứa colagen, lecithin và cácloạivitaminA,E…tấtcảđềucólợichoda.Nếuthoasữaongchúalêndahàngngày có thể làm

da trắng mịn và chống viêm da Ngoài ra sữa ong chúa còn có nhiều hợpchấtcóthểlàmgiảmhàmlượngcholesterol.Mộtđánhgiáchothấysửdụng50-100 mg sữa ongchúa mỗi ngày có thể giảm 14% cholesterol và 10% triglycerit Sử dụng sữa ong chúathường xuyên có thể ngăn ngừa và làm chậm sự phát triển của xơ vữa động mạch

Trong một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố, sữa ong chúa đượcbáo cáo như một tác nhân làm thay đổi miễn dịch, cũng được báo cáo là có tác dụngđốivớihệthầnkinhđệmvàcáctếbàotủysống.Ngoàira,sữaongchúacònđượcsử dụng nhưmột loại thực phẩm chức năng có khả năng chống lại mệt mỏi, chống dị ứng, chống lãohóa, chống vi khuẩn… rất có lợi cho cơ thể Sữa ong chúa còn làm tăng khả năng sinhdục ở cả hai giới…[3]

Mộtsốnghiêncứuvàonăm2005,L.A.SalazarOlivo[23]vàcáccộngsựcũng đã khẳng địnhsữa chúa có hoạt tính sinh học đa dạng, nó có thể ảnh hưởng tới sựpháttriểntếbào,cókhảnăngchốnglạisựpháttriểncủacáctếbàoungthưcủaRJP30 (phần chiếtprotein bằng amoni sulfat 30%), ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLaởngười,làmgiảmmậtđộtếbàobanđầugấp2,5lầnsaubảyngày điềutrị.Šimúth,

J [36] cũng đã quan sát thấy apalbumin-1 và apalbumin-2, hai protein chính trong

RJ, kích thích các đại thực bào chuột giải phóng TNF-α (tế bào hoại tử khối u)

Gầnđâyđãcónhiềunghiêncứuvềhoạttínhchốngoxyhóacủacácchấtphân

hủyenzym(pepsin,trypsinvàpapain)vàproteincủaRJ[32,33].Thờigianthuhoạch

vàtuổiấutrùngcónhiềuảnhhưởngđếnhoạttínhchốngoxyhóacủaRJvàRJđãthu thập được 24giờ sau khi chuyển ấu trùng cho thấy có tác dụng chống oxy hóamạnh

nhất [18] Hoạt tính chống oxy hóa của RJ cũng đã được chứng minh trong các môhìnhthínghiệminvitrokhácnhau.Năm2007,AzizaA.El-Nekeety[5]đãtiếnhành nghiêncứu thử nghiệm trên chuột và kết quả là RJ có tác dụng bảo vệ chống lại độc

tínhcủaFumonisins(chấtđượcsinhratừnấm,làchấtđộchạichoconngườivàđộng vật) Năm

2008, Polona Jamnik [30] đã nghiên cứu trên các tế bào nấm menSaccharomyces

cerevisiaenhư một sinh vật mẫu, cho thấy rằng RJ làm giảm quá trình oxi hóa nội

bào Và khả năng chống lại tổn thương gan do paracetamol gây ra và tác dụng đối

với độc tính sinh tinh củacisplatinđã được xác nhận trong các thí nghiệm trên các

động vật thí nghiệm [7, 28,37]

Hoạt động giống như insulin: có tác dụng chống lại bệnh tiểu đường, RJ cóthể làm giảm lượng đường trong máu thông qua các peptit Vàgiữcho lượng đườngtrongmáuởtrạngtháibìnhthườngbằngcáchthamgiavàoquátrìnhoxyhóaglucozo để thu đượcnăng lượng [6,7]

Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của một số peptit thuđượcthôngquaquátrìnhthủyphânenzymcủaRJđốivớichuộtbịhuyếtápcao.Các peptit đã ức

chế enzym chuyển đổiangiotensin 1(ACE) và áp lựcsanguineđã giảm sau khi uống

RJ Hiệu quả chống tăng huyết áp đã lên tới 38%[7]

1.2 Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic(10-HDA)

TênIUPAC:Axittrans-10-hydroxy-2-decanoichoặcaxit(E)-10-hydroxydec- 2-enoic HDA) là axit béo dồi dào nhất (FA – fatty acid) và là thành phần lipid chính của sữaong

(10-Hình 1.3 Công thức hóa học của axit 10-hydroxy-trans-2-decenoic

nước

Mộtsốtiêuchuẩncủahàmlượng10-HDAtrongsữaongchúacủamộtsố

Mặcdùsữaongchúalàmộtsảnphẩmđầyhứahẹnvớigiátrịtàichínhngày

càng tăng cho người nuôi ong và ngành công nghiệp nhưng phát triển thị trường lạikhá chậm Điều mà phần lớn những người nuôi ong không khuyến khích mở rộngkinhdoanhlàthiếucáctiêuchíchấtlượng,kiểmsoáttínhxácthựcvànguồngốcđịa lý Ngàynay, không có tiêu chuẩn nào ở cấp độ châu Âu hoặc quốc tế cho các sản phẩm củaong, chỉ có một số quốc gia đã thiết lập các tiêu chuẩn Quốc gia đầu tiênđặttiêuchuẩnchoRJlàArgentinanăm1979,tiếptheolàBungarinăm1984,BaLan năm 1996,Thổ NhĩKỳnăm 2000, Brazil năm 2001, Serbia năm 2003,ThụySĩ năm 2005 (sửađổi năm 2014), Nhật Bản và Trung Quốc năm 2008, Ấn Độ năm 2012 và Hàn Quốcnăm 2014 Một vài năm trước, một nhóm nghiên cứu của Ủy ban ongmật Quốc tế (IHC) đã

đề xuất sơ bộ về tiêu chuẩn dựa trên những thông tin họ thu thập được[9]

Bảng 1.3 Đề xuất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức [9]

Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia

Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia

1.2.1 Mộtsố nghiên cứu về10-HDA

Một số tính năng độc đáo và thú vị của sữa ong chúa có được là do sự có mặtcủa các chất béo Axit béo chính trong sữa ong chúa là 10-HDA, một loại axit béokhông bão hòa tự nhiên Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng 10-HDA thúc đẩysựtăng trưởng của các tập hợp tế bào lympho T và interleukin-2, điều này có thể gợi ýlàloạiaxitbéonàycótácdụngứcchếmiễndịchvàchốngungthư.Đâylàmộthướng điều trị có lợi

để hạ đường huyết, chống lão hóa và khối u; vì vậy 10-HDA có giá trị quan trọng trong lĩnhvực điều trị y tế và chăm sóc sức khỏe[19]

a Hoạt tính sinh học

Hoạt tính chống ung thư của 10-HDA

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng sữa ong chúa giúp bảo vệ cơ thể khỏibệnh ung thư Sử dụng thường xuyên thậm chí có thể ngăn ngừa bệnh này xảy ra

Vào năm 1959, trên tạp chí Nature Publishing Group, Gordon F., Townsendvàcộngsựđãkhẳngđịnhsữaongchúacókhảnăngchốngubiếu.Nguyênnhânlàvì

trongsữaongchúacóchứanhiềuloạiaxitbéo,đặcbiệtlà10-HAD.Sữaongchúacó khả năngngăn chặn sự phát triển khối u cổ trướng và bệnh bạch cầu ở AKR chuột [33,34]

Vào năm 2007, Hiroshi Izuta [14] và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ứcchế đối với VEGF (vascular endothelial growth factor – yếu tố tăngtrưởng mô mạchmáu)trongtếbàonộimôtĩnhmạchrốncủaconngười(HUVECs–Humanumbilical veinendothelial cells) gây ra sự hình thành tế bào, ức chế sự tăng sinh và di chuyểncủatếbàoungthưdẫnđếnứcchếmạchmáukhốiu.Ngoàira,RJcũngđãđượcchứng minh là có hoạttính chống estrogen bằng cách ức chế sự tăng trưởng của bisphenol (BPA)–mộtloạiestrogenkíchthíchsựtăngsinhcủatếbàoungthưvúởngười

MCF-7 [21, 26] Tuy nhiên, việc điều trị các tế bào MCF-7 bằng các hợp chất lipittrong RJ thì làm tăng sinh các tế bào này, nhưng điều trị đồng thời với tamoxifen thì

sẽ ngăn chặn được sự tăng sinh của tế bào MCF-7, do các hợp lipit ức chế liên kết17b-estradiol với ERb (estrogen b) nhưng không ảnh hưởng đến sự gắn kết của 17-bestradiol với Era (estrogen a) [22]

Vào năm 2017, Chi Chung Peng [9] và các cộng sự đã chứng minh rằng HDA trong RJ có khả năng ức chế hoạt động tyrosinase, ức chế sự biểu hiện củamelanogen bao gồm tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 (tyrosinase-related protein 1 và 2)bằngcáchứcchếMITF(microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)trongcáctế bào u áctính Đo đó, làm giảm sắc tố của melanin trong tế bào u ác tínhB16F10

10-Một bằng chứng chống ung thư khác là RJ có tác dụng kích thích miễn dịch,bằngcáchngănchặnsựsuytủygâyrabởisựtiếnhóacủakhốiuquaứcchếtạomáu lách ở nhữngngười mang khối u hạch (EAT - Ehrlich ascetic tumor) và điều trị tùy thuộc vào thờigian và liều RJ[8]

Hoạt tính chống oxi hóa của 10-HDA

Khiperoxidhóalipidbịứcchếtrongốngnghiệmvàtrongcácthínghiệmtrên chuột, HDA đã được tìm thấy để bảo vệ tế bào DNA khỏi quá trình oxy hóa Nghiên cứu về chế

10-độ ăn kiêng RJ đối với chuột, người ta đã chứng minh rằng sau khi cho chuột ăn RJ trong

16 tuần, nồng độ 8- hydroxy-2-deoxyguanosin (một chấtchốngoxyhóa)đãgiảmđángkểtrongDNAvàhuyếtthanhcủathậnvàtuổithọtrung bình của chuộtC3H / HeJ được tăng lên thông qua cơ chế chống oxy hóa [7,38]

10-Hydroxy-2-decenoicacid(10-HDA),đãđượcchứngminhlàlàmtăngtuổi thọ

củaCaenorhabditis elegans(loài giun tròn) không thông qua insulin mà thông qua

chế độ ăn kiêng và tín hiệu TOR (một loại protein trong người), cụ thể là ức chếmTOR để giảm quá trình lão hóa[41]

Hyejung Gu và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của sữaong chúa sau khi được khử với enzyme (ERJ) bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) Tác dụng chống oxy hóa của ERJ là do giảm số phản ứng oxy hóa nội bào

(ROS) và sản sinh oxit nitric (NO) trong các đại thực bào Hơn nữa, ERJ làm tăng

hoạtđộngchốngoxyhóasuperoxideeffutase(SOD)vàglutathione(GSH).Cáchoạt

độngchốngoxyhóanàycủaERJmạnhhơnsovớicáchoạtđộngcủaRJkhôngđược qua xửlý[15]

Một số hoạt tính khác

Tác dụng nơron thần kinh: Theo dân gian, sữa ong chúa đã được biết đến đểcải thiện trí nhớ, ngăn ngừa lão hóa, tăng năng lượng, giảm lo lắng và làm giảm tínhhiếuđộng.10-HDAcủaRJcókhảnănglàmtăngsựsảnsinhtếbàothầnkinhvàbảo vệ các tếbào thần kinh của não chuột trưởng thành[7]

Tác dụng kháng sinh, kháng viêm: Axit 10-hidroxy-2-decenoic cũng có hoạt

tínhkhángsinhchốnglạimộtsốvikhuẩnvànấm(trongđócóMicrococcuspyogenes,Escherichiacol

i,Neurosporasitophila).10-HDAđãđượcnghiêncứuvớichứcnăng chống viêm trên các tế

bào ung thư ruột của con người (WiDr), cũng như tác dụngcủanóđốivớisựpháttriểncủavikhuẩngâybệnh.10-HDAđóngvaitròlàchấtdiệt khuẩn mạnh

chống lại mầm bệnh đặc trưng cho động vật hoặc người, bao gồmStaphylococcus

aureus,Streptococcus alactolyticus,Staphylococcustrung gian

b Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong

chúa Xác định 10-HDA bằng phương

phápHPLC

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và phađộng là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dướidạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục

giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử vàtính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với phatĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau [11] Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sửdụng phương pháp này, để phân tích 10-HDA có thể kể đến như:

Năm 2007, Jinhui zhou [19] và các cộng sự đã xây dựng phương pháp xácđịnh 10-HDA trong mẫu sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô bằng phươngpháp HPLC pha đảo với chất nội chuẩn methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Các điềukiện sắc kí được dùng để phân tích như sau: Cột sử dụng là cột C18 (3,9

nm 𝖷150nm 𝖷 5µm) với nhiệt độ 30oC, pha động là methanol : nước : axitphotphoric có tỉ lệ 50 : 50 : 0,3 (v/v/v), với tốc độ dòng là 0,8 mL / phút, tổng thờigian chạy sắc kí để tách được 10-HDA là 7,2 phút Trước khi bơm mẫu vào thiết bịHPLC, mẫu sữaong chúa được chiết bằng etanol tuyệt đối và lọc bằng màng nilon 0,2 µm Phương phápphântíchchođộthuhồitrungbìnhlà95,0-99,2%vớiRSD=1,3%-2,1%,giớihạn phát hiệnLOD = 0,5 mg/kg, giới hạn định lượng là LOQ = 1,5 mg/kg

Năm2010,JoonyeongKim[20]vàcộngsựđãnghiêncứuxácđịnhhàmlượng HDAtrongsảnphẩmsữaongchúabằngphươngphápHPLCvàsửdụngchấtnội chuẩn làmethyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điều kiện sắc kí để phân tích 10-HDA như sau: Sửdụng cột XDB-C18 (150 nm 4,6 nm) với nhiệt độ là 25 𝖷 oC, bước sóng UV là 215 nm,pha động là hỗn hợp metanol : nước : axit photphoric (55 : 45 : 2,7,v/v/v),vớitốcđộdòngchảylà1,0mL/phútvàtổngthờigianchạysắckílà10phút Mẫu đượcchiết bằng metanol với tỉ lệ metanol : nước là 50 : 50 (v:v), rồi lọc qua màng nilon 0,2 µm

10-và 0,45 µm rối sau đó được đưa 10-vào thiết bị HPLC với thể tích bơm là 3 µL Phươngpháp phân tích chođộthu hồi trung bình trong khoảng9 7 , 4 %

- 100,4%vớiRSD=2,4%-3,4%,giớihạnpháthiệnLOD=0,05µg/mLvàgiớihạn phát hiệnLOQ = 0,25µg/mL

Năm 2017, Ivana Flanjak [16] và các cộng sự đã xác định 10-HDA trong sữaong chúa ở Croatia bằng phương pháp HPLC với detector UV, có bước sóng hấpthụ

là 215 nm và sử dụng chất nội chuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điềukiệnphântíchsắckí10-HDAlà:SửdụngcộtphađảoC18(4,6µm𝖷150µm)điềuchỉnh đến 35oC, phađộng là metanol : nước (50 : 50, v/v) và tốc độ dòng là 1,0 µL / phútthể.Mẫuđượcchiếtvàhòatanbằngdungmôimetanolvớitỉlệ metanol:nướclà50

: 50 (v:v), sau đó đem lọc lần lượt qua màng lọc nilon 0,2 µm, rồi đưa vào hệ sắc kíHPLC, trong đó tỉ lệ hỗn hợp giữa thể tích mẫu : thể tích MHB là 75 : 25 (v:v).Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 – 99,0%

Xác định 10-HDA bằng phương pháp GC-MS

Trong sắc kí khí, pha động là một khí mang, thường là một khí trơ như Helihoặc một khí không hoạt động như Nitơ Pha tính là một vi lớp chất lỏng hoặcpolymer được phủ trên một lớp rắn đặt trong cột sắc kí Các hợp chất cần phân tích

sẽ được chuyển sang dạng khí và tương tác với thành cột – được phủ bởi pha tĩnh,dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác nhau – gọi là thời gianlưucủahợpchất.Khicácchấthóahọcđiraởcuốicột,sẽđượcpháthiệnvàxácđịnh bằng detectornhư làMS

Năm 1992, Hikoto ohta [42] và các cộng sự đã tiến hành xác định 10-HDAbằngphươngphápsắckýkhíghépnốivớidetectorkhốiphổ(GC-MS).Phươngpháp

Năm 2011, V.A Isidorov [39] và cộng sự đã công bố đề tài xác định các hợpchấtaxitbéocótrongsữaongchúabằngphươngphápGC-MSkếthợpvớichiếtpha

rắnSPE.Cụthểcácaxitbéolà:axít7-và8-hydroxyoctanoic,3-hydroxydecanoic,9-

hydroxydecanoic,9-hydroxy-2-decenoic,10-hydroxydecanoic,10-hydroxy-2-Ứng dụng của điện di mao quản (CE) để tách và xác định thành phần hoạtchất,cụthểlàaxit10-hydroxy-2-decenoictrongsữaongchúavớidetectorUVởbước sóng 215 nmđược nghiên cứu bởi Li Jia và các cộng sự [24] Phương pháp sử dụng có đầu bơm mẫu là catot

và đầu gắn với detector là anot Mẫu được bơm vào thiết bịphântíchtrong40s,tạiđiệnáp20kV.Axit10-HDAđượctáchravàđượcpháthiện trongcộtmaoquảnbằngsilicacóchiềudàilà60cmvớiđườngkínhtronglà75µm

decenoic (10-HDA), 3,10-dihydroxydecanoic, 2-octene-1,8-dioic và dioic Dẫn xuất hóa 10-HDA với bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamit (BSTFA) vàpyridin để có thể tách ra được trên máy sắc kí khí Trước khi đưa vào hệ sắc kí, hỗnhợp phản ứng được làm nóng ở 60oC trong 30 phút Điều kiện thiết bị GC – MS đểphân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa là: Sử dụng cột mao quản silicanóngchảyHP-5MS(30m 0,25𝖷 mm𝖷0,25µm),vớinhiệtđộtáchbanđầulà50oC và tăng lên

2-decene-1,10-300oC với tốc độ tăng 5oC / phút, nhiệt độ ở buồng tiêm là 250oC nhiệt độ ởtranferline là 250oC, nhiệt độ của nguồn ion là 270oC và tốc độ dòng khí Helà 1 mL /phút, Kết quả thu được độ nhạy của phương pháp cỡ 0,05µg/µL

Xác định 10-HDA bằng phương pháp điện di mao quản với detector UV

Điện di mao quản (CE) là mộtkỹthuật tách các chất dựa trên cơ sở sự dichuyểnkhácnhaucủacácphầntửchất(chủyếulàcácionmangđiệntích)trongdung dịch chất điệngiải (có chất đệm pH), dưới tác dụng của điện trường E nhất định (do thế V đặt vào hai đầumao quản sinh ra) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (EOF) [1,2] trong sựphụ thuộc vào điện tích và kích thước củachúng

Theo Orlando Munoz [29] và các cộng sự đã nghiên cứu phương pháp xácđịnh 10-HDA với cột mao quản có bước sóng hấp thụ là 215 nm Điều kiện thiết bịđiện di để phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa như sau: Tổng chiều dài mao quản

là 85 cm với chiều dài hiệu dụng là 60 cm, thời gian bơm mẫu vào hệ thiết bị là 20 stại thế cao áp là 15 kV, đệm được sử dụng trong phương pháp phân tích 10-HDA làhỗn hợp 20 mM photphat pH 7,2 và 0,4 mM MTAB Kết quả cho thấy LOD củaphương pháp là 12,618 ppm và LOQ là 42,06 ppm

Dung dịch đệm được sử dụng là đệm photphat ở pH 7,3 Trong nghiên cứu này sửdụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)làmchất điều chỉnh dòng điện chophép tách nhanh 10-HDA khỏi các thành phần khác trong sữa ong chúa bằng cáchđảongượchướngcủadòngđiện.Kếtquảchothấyđộnhạycủaphươngphápcỡ0,02 mg/mL.

c So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thíchhợp

Các phương pháp sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao đều có ưu điểmchung là khả năng tách chất tốt, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị cao Ngoài ra,khi vận hành với các detector khác nhau kết hợp với làm giàu mẫu có thể mang lạinhữngđặctínhưuviệtnhưgiớihạnpháthiệnkháthấp(cỡvàippm)vớicácdetector

FIDvàdetectorMS.Tuynhiên,đâylàcácphươngphápsửdụngthiếtbịcógiáthành cao (GC-MShay HPLC) và chi phí phân tích cũng cao khi phải sử dụng pha động làkhímang(nhưheli)haydungmôichuyêndụngchoHPLC(nhưaxetonitril,metanol)

vớiđộtinhkhiếtcao.Hơnthếnữa,quytrìnhxửlýmẫukhisửdụngcácphươngpháp này tương đốiphức tạp, do cần có bước dẫn xuất hóa chất phântích

Phương pháp điện di mao quản ngoài những ưu điểm là khả năng tách chấtcao, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị khá cao, còn có ưu điểm về giá thành phântích vì chỉ sử dụng pha động là các dung dịch đệm có giá thành thấp, dễ vận hành vàcũng có thể kết hợp sử dụng nhiều loại detector như detector MS, detector UV,… vàđặc biệt quy trình xử lý mẫu khi sử dụng phương pháp điện di mao quản tương đốiđơn giản, không yêu cầu việc dẫn xuất hóa các chất phân tích Hơn thế nữa, ở môitrường pH khác nhau, 10-HDA là chất mang điện, nên việc sử dụng detector đo độdẫn không tiếp xúc (C4D) là phù hợp vì detector này cho sự phân tách tốt giữa cáctiểu phần mang điện Bởi vậy, với ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quảntrong phân tích 10-HDA sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (phương phápCE-C4D) sẽ có thể là sự lựa chọn tiềm năng

1.3 Giớithiệu về phương pháp điện di maoquản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyểnkhác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịchchất điện ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh

ra do thế V Hiện nay, CE được phân loại theo các cơ chế tách như sau: điện di maoquảnvùng(CapillaryZoneElectrophoresis-CZE),điệndimaoquảnđiểmđẳngđiện (Isoelectricfocusing - IFF), điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP), điện di mao quảngel (Capillary Gel Electrophoresis - CGE) và sắc ký điện di mao quản điện động họckiểu micelle (Micellar electrophoresis capillarychromatography

- MECC) Tuy nhiên điện di mao quản vùng (CZE) là phương pháp được sử dụngphổ biến nhất do đơn giản trong vận hành và hiệu quả trong phân tích Trong nghiêncứu này, thuật ngữ CE được hiểu làCZE

TheophươngphápCE,cáciontrongmaoquảndichuyểnvớitốcđộkhácnhau theocôngthức:

𝑣𝑖=𝜇𝑖

Từcôngthức(1)cóthểthấy,tốcđộdichuyểntỷlệthuậnvớiđiệntíchcủahạt mang điện(q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (Ƞ), bánkínhhyddrat của hạtmang điện (r) Nghĩa là, trong một điện trường E nhất định, chất nào có điện tíchlớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với các chất mang điện cócùngđiệntích,chấtnàocókíchthướcnhỏsẽdichuyểnnhanhhơn;vớicácchấtmang điện có cùngbán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanhhơn

Hình 1.4.Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản

Mao quản trong điện di có thể được làm từ teflon, polyme, tuy nhiên vật liệuthường dùng là silica, và thường có đường kính trong nằm trong khoảng 25 ÷ 100

´m Dưới đây là hình ảnh của hệ điện di mao quản được sử dụng trong nghiên cứu:

Hình 1.5.Hệ điện di mao quản 1 kênh

Trong đó: (1): dung dịch điện li nền

(2): Detector C4D

Hình 1.6.Bộ ghi tín hiệu

Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Dòng điện di thẩm thấu trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thànhmao quản và chất điện li chứa trong nó Với mao quản silica, các nhóm silanol(Si-OH) trên bề mặt mao quản có khả năng bị deproton hóa chuyển thành SiO-khi tiếpxúcvớidungdịchchấtđiệnli,đặcbiệtlàtrongmôitrườngkiềm.Đâylàđiềukiệnđể hình thànhnên lớp điện kép, trong đó lớp di động nằm bên ngoài mang điện dương.Khiápvàohaiđầumaoquảnmộtđiệnthế,lớpdiđộngnàydichuyểnvềphíacựcâm với một vậntốc nhất định, tạo thành dòng, gọi là dòngEOF

Độ lớn của dòng EOF tỉ lệ thuận với lực điện trường E do thế V đặt vào haiđầumaoquản,độlớncủathếξ,hằngsốđiệnmôivàtỉlệnghịchvới độnhớtcủapha động điện ditheo biểu thứcsau:

ɛξ

4ȠΠTrong đó: ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm

ξ: thế zeta của lớp điện tíchképDòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điệntrường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn,ngượclạicácaniondichuyểnngượcchiềuvớidòngEOFdođódichuyểnchậmhơn còn cácphần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ vớidòng EOF Do vậyđể có được hiệu quả tách cao, cần tìm được dòng EOFcócườngđộphùhợpvớichấtphântích,cónghĩalàphảitốiưuhóacácđiềukiệncủa quá trìnhđiệndi

Hình 1.7 Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong EOF 1.3.1 Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện(C 4 D)

Việc phát hiện chất trong CE được thực hiện nhờ detector Một số detectorthôngdụngnhưdetectorđoquang(hấpthụphântử,huỳnhquang),điệnhóa(đodòng, đo thế, độ dẫn)

và khối phổ Trong đó, detector điện hóa loại đo độ dẫn, đặc biệt là detector đo độ dẫn không tiếpxúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) được sử dụng rộng rãi do có khả năng phân tích rộng và

độ nhạytốt

Nguyêntắcthiếtkếcủadetectorđộdẫnkhôngtiếpxúclàsửdụnghaiđiệncực hình ống đặtvòng quanh và không tiếp xúc với mao quản Khi áp vào một hiệu điện thế, hai điệncựcnàysẽ đóng vai trò hai tụ điện còn khối dung dịch trong mao quảngiữahaiđiệncựcđóngvaitròđiệnmôi.Sựchênhlệchvềgiátrịđiệntrởsẽtạoracác tín hiệu đo.Tại đầu ra của điện cực thứ hai, tín hiệu sẽ được thu nhận đưa đến bộ khuếch đại và xử lýcho ra tín hiệu phân tích Khi sử dụng detectornày,tín hiệu củachấtphântích(pic)thuđượclàgiátrịđiệnthếdướidạngtínhiệusố.Việchiểnthịtín hiệu được thựchiện dễ dàng bằng các phần mềm ghi tín hiệu trên máytính

Hình 1.8.Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D)

1.3.2 Kỹthuật bơm mẫu trong điện di maoquản

Có hai kĩ thuật bơm mẫu chủ yếu được sử dụng, bao gồm bơm mẫu kiểu thủyđộng học và bơm mẫu kiểu điện động học

- Phương pháp thuỷ động học: dùng một áp suất khoảng 50 đến 300 mBar

áp vào vùng mẫu ở đầu cột sau một thời gian t nhấtđịnh

- Phương pháp thủy tĩnh (xy phông): dựa vào lực hút của trái đất, sự chênh lệch chiều cao giữa hai đầu mao quản tạo ra một lực đẩy dung dịch mẫu đi vào maoquản

- Phương pháp điện động học: dựa vào tính chất điện di thẩm thấu khi có điện

áp được cấp cho mao quản, người ta đã đưa mẫu vào mao quản chính bằng dòng điện di thẩm thấuEOF

Hình 1.9.Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 1.3.3 Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di maoquản

Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trongCE.Diệntíchpictỉlệvớinồngđộchấtphântíchđiquadetector.Dựavàogiátrịdiện tích pic, ta cóthể xác định được nồng độ của chất phân tích có trongmẫu

Trongđó: S là diện tích pic thu được(V.s)

k là hệ số tỉ lệ (V.s.mL/mg)

C là nồng độ chất phân tích (mg/mL)Việc xác định diện tích pic được thực hiện đơn giản nhờ các phần mềm ghi dữ liệu

Trong đó: tivà tjlà thời gian di chuyển của hai chất i và j (ti> tj) (s)

wivà wjlà độ rộng đáy của hai pic chất i vàjTheo lí thuyết, hai pic được coi là tách hoàn toàn khỏi nhau (với độ tin cậy95%) khi độ phân giải R ≥ 1,5

1.3.4 Mộtsố yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di maoquản

Dung dịch điện dinền

Dung dịch điện di nền (BGE) có vai trò quyết định trong quá trình tách chất.Nhưđãthấytrongcôngthức(1),chấtđiệndinềnảnhhưởngtớitốcđộdichuyểncủa

cácion,thôngquagiátrịđộnhớtcủadungdịchvàkhảnăngsolvathóa(thểhiệnqua bán kínhhiđratr)

BGE thường được sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trường nước.Thành phần của hệ đệm bao gồm một hợp phần mang tính axit, hợp phần còn lạimangtínhbazơ.Cácyếutốcầnquantâmkhilựachọndungdịchđiệndinềnphùhợp bao gồmthành phần, nồng độ các hợp phần và pH dungdịch

Điện thế tách

Điện trường được tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớn,cỡkV,theocôngthứcE=V/L.Đâylàđộnglựcchoquátrìnhdichuyểncủacácion, ảnh hưởngtrực tiếp tới khả năng tách chất và tín hiệu thu được Khi hiệu điện thế nhỏ, chân picdãn và diện tích pic lớn hơn, tuy nhiên thời gian phân tích dài hơn Trong khi đó, hiệuđiện thế lớn có thời gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thu hẹp lại, đồng thời còngây ra hiệu ứng nhiệt Do đó, giá trị độ lớn của hiệu điện thế đặt vào là yếu tố quantrọng cần quantâm

Lượng mẫu đi vào mao quản

Lượng mẫu đi vào mao quản ảnh hưởng lớn tới diện tích và khả năng phântách các pic Lượng mẫu ít dẫn tới diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiệnchất,trongkhilượngmẫulớn,diệntíchpictăng,làmgiảmđộphângiải.Đốivớimột

hệđiệndimaoquảnđơngiản,vậnhànhbằngtay,sửdụngphươngphápbơmmẫuxi phông thìlượng mẫu đi vào mao quản phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu Mặc dù vậy,với phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cố định.

Ngoài ra, còn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưởng tới quá trình táchchất như chiều dài và đường kính trong của mao quản Tuy nhiên, thông thường,các yếu tố này được giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp điện di mao quản để phân tíchxác định hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa Thực nghiệm bao gồm: khảo sátlựa chọn dung môi chiết thích hợp và vận dụng phương pháp đã xây dựng được tiếnhành xác định hàm lượng 10-HDA trong các mẫu thực tế được thu mua ngoài hiệntrường.Trêncơsởkếtquảnghiêncứucụthể,tiếnhànhsosánh,đánhgiávớiphương pháp tiêuchuẩnHPLC

Phương pháp nghiên cứu

Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách 10-HDA được thực hiện trên

hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có tổng chiều dài 60 cm, đường kính trong 50µm.Mẫuđượcbơmvàomaoquảnbằngphươngphápthủyđộnglựchọctheokiểuxi phôngbằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao 10cmsovớiđầumaoquảncònlại.Độcaonàyđượccốđịnhtrongtấtcảcácthínghiệm

Dungdịchchuẩncủa10-HDAởnồngđộ20mg/Lđượcsửdụngđểkhảosátcácđiều kiện phântích Trong các thí nghiệm, điện thế tách được giữ cố định ở giá trị -15kVvàthờigianbơmmẫu30s;trừcácthínghiệmkhảosátđiềukiệnđiệnthếvàthờigian bơm Điều kiệnphân tích được lựa chọn trên cho cơ sở đường nền ổn định, tín hiệu của các chất phân tích

có diện tích lớn, hình dạng sắcnét

2.2 Nội dung nghiêncứu

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên CE

Khảo sát thành phần dung dịch điện linền

Qua tham khảo tài liệu, một số loại dung dịch điện li nền có giá trị pH thấp(pH< 2) là các axit hữu cơ với các nồng độ khác nhau được lựa chọn để nghiên cứuquy trình phân tách 10-HDA, bao gồm axit axetic, axit lactic, hydroxymetylaminometan (Tris), axit 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MES), axít 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MOPS), axít N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic

(CHES) với cùng một nồng độ là 100 mM và pH = 9 Sau khi lựa chọn được thànhphần dung dịch điện ly nền thích hợp, tiếp tục nghiên cứu sự thay đổi nồngđộ và pH vớicác giá trị khảo sát pH = 8 ÷ 9 và nồng độ là 20 mM, 50 mM và 100mM.

Khảo sát và tối ưu thời gian bơm mẫu

Ảnhhưởngcủathờigianbơmmẫuđếndiệntíchvàhìnhdạngtínhiệucủachất phân tíchđược khảo sát với thời gian bơm mẫu thay đổi từ 10 s tới 60s

Khảo sát và tối ưu điện thế tách

Điệnthếđặtvàohaiđầumaoquảntạoramộtđiệntrường,làđộnglựcchoquá trình dichuyển của các ion, ảnh hưởng tới quá trình tách chất Trong khảo sát này, điện thế táchthay đổi từ 10 ÷ 20kV

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu

MẫutrướckhibơmvàothiếtbịCEđểtáchvànhậnbiếtcầnphảihòatantrong dung môithích hợp và lọc Việc khảo sát quy trình xử lý mẫu được thực hiện như sau:

Khảo sát giấy lọc và quy trình ly tâm mẫu

Ba loại giấy lọc được lựa chọn trong nghiên cứu này là: giấy lọc xenlulosoaxetat,giấylọcnilonvàgiấylọcPTFEđềucócỡlỗ0,2µm.Mẫuđượchòatantrong 50 mLnước deion, sau đó được chia làm 2 phần Phần 1 được đem đi ly tâm 1500 rpm trong

15 phút và lọc với từng loại giấy lọc đã nêu trên Phần 2 không ly tâm mà được đemlọc trực tiếp trên từng loại giấy lọc Dịch lọc được bơm trực tiếp vào thiết bị CE-C4D

và so sánh diện tích tín hiệu 10-HDA thuđược

Khảo sát dung môi hữu cơ và hệ dung môi hòa tan

Bốnhệdungmôidùngđểhòatanmẫuđượckhảosátlà:nướcdeion,hỗnhộp

củanướcdeionvớimetanol,etanolvàisopropanolcótỷlệthểtíchnướcdeion:dung môi hữu cơ

là 1:1 Thực nghiệm được tiến hành với ba loại mẫu: mẫu sữa ong chúatươi,mẫusữaongchúadạnggelvàmẫusữaongchúadạngbột.Cânlượngchínhxác