Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (panax ginseng)

HÀ NỘI - 2016ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM P

HÀ NỘI – 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

HD1: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG HD2: PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN THỊ ÁNHHƯỜNG, PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ và ThS CAO CÔNG KHÁNH đãtậntình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đềtài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO,banlãnhđạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia và các anh chị, cácbạn công tác tại Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia đã tạo điềukiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trườnghiệnđại

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặcbiệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giátrong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học HoáK24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia

sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia

sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC

Association ofOfficialAnalyticalCommunity

Hiệp hội cộng đồng phân tíchchính thức

AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

PDA Photodiode Array Mảng diod quang

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

TLC Thin layer chromatography Lớp mỏng hiện năng cao

USP United States Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

DANH MỤC BẢNG

Bảng1.1Tácdụngđặctrưngcủatừngloạiginsenosid 7

Bảng 1.2 Các Saponin có aglyconlà protopanaxadiol 9

Bảng 1.3 Các Saponin có aglyconlàprotopanaxatriol 10

Bảng 1.4 Saponin với aglycon làacidoleanolic 11

Bảng 3.1 Chương trình gradient1,2 26

Bảng 3.2 Chương trình gradient3,4 27

Bảng 3.3 Danh mục các pha động HPTLCkhảosát 29

Bảng 3.4 Kết quả định lượng ginsenosid trong mẫu TPCN dạng dung dịch với số lầnchiếtbằng n-butanolkhác nhau 34

Bảng3.5.Độlặplạithờigianlưuvàdiệntíchpiccủacácchất 37

Bảng3.6.ĐộlặplạihệsốlưugiữRf 38

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩnRg1,Rg1 41

Bảng3.8.ĐộlệchcủatừngđiểmchuẩndùngxâydựngđườngchuẩnRg1,Rb1 43

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1trênHPTLC 43

Bảng3.10.ĐộlệchchuẩncủatừngđiểmchuẩndùngxâydựngđườngchuẩnRg1 44

Bảng3.11.ĐộlệchchuẩncủatừngđiểmchuẩndùngxâydựngđườngchuẩnRg1 46

Bảng 3.12 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viênnangcứng 47

Bảng 3.13 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viênnangmềm 48

Bảng3.14.ĐộlặplạicủaginsenosidRg1,Rb1trongmẫunướcsâm 49

Bảng 3.15 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 mẫudạngbột 50

Bảng 3.16 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu viên nang mềmtrênHPTLC 51

Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viênnangcứng 52

Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viênnangmềm 53

Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫudungdịch 54

Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứngtrênHPTLC 55

Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềmtrênHPTLC 56

Bảng 3.32 Kết quả phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 trongcácTPCN 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc kýlớp mỏng 8

Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglyconlàprotopanaxadiol 9

Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglyconlàprotopanaxatriol 10

Hình 1.4 Cấu trúc Saponin với aglycon làacidoleanolic 10

Hình 1.5 Công thức cấu tạo củaginsenosidRb1 11

Hình 1.6 Công thức cấu tạo củaginsenosidRg1 11

Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 vớigradient1 27

Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 vớigradient 2 27

Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 vớigradient3 28

Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 vớigradient4 28

Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ phađộng1 29

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng MeOH ở nồng độ khácnhau 31

Hình 3.7 Sắc đồ sử dụng với dung môi chiếtMeOH70% 31

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng EtOH ở nồng độ khác nhau

32

Hình 3.9 Đồ thị biểu thị hiệu quả chiết mẫu với các dung môi hữu cơloạilipid 33

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình xửlý mẫu 37

Hình 3.11 Sắc đồ củamẫutrắng 39

Hình3.12.Sắcđồdung dịchmẫutrắngTPCNcóthêmginsenosidRg1,Rb1 Hình 3.13 Sắc đồ dung dịch chuẩnginsenosid Rg1,Rb1 39

Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV củaginsenosidRg1 40

Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV củaginsenosidRb1 40

Hình 3.16 Sắc đồ dung dịch thử thêmchuẩnginsenosid 41

Hình3.17.ĐồthịđườngchuẩnRg1,Rb1phântíchtrênHPLC 42

Hình 3.18 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗnhợp500pm 42

Hình3.19.ĐồthịđườngchuẩnRg1,Rb1trênHPTLC 44

Hình 3.20 Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tíchtrênHPTLC 45

Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịchmẫutrắng 45

Hình 3.22 Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần 5 của viênnang cứng 47

Hình 3.23 Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềmlần 1 48

Hình3.24.Sắcđồphântíchđộlặplạimẫunướcsâmlần1 49

Hình 3.25 So sánh độ lặp lại của sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâmdạngbột 50

Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, RB1 trong mẫu viên nang mềmtrênHPTLC 51

Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang cứng lần 1

52

Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang mềm lần 1

53

Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong dung dịchlần1 54

Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứngmãNC3 57

Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềmmãNM4 57

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN

CHƯƠNG 1 –TỔNGQUAN 5

1.1 Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trongnhânsâm 5

1.1.1 Giới thiệu chung vềnhânsâm 5

1.1.2 Tác dụng đặc trưng củanhânsâm 6

1.1.3 Vài nét về nhóm hoạtchấtginsenosid 7

1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1vàRb1 11

1.2 Tổngquanvềcácphươngphápphântíchginsenosid 12

1.3 Các phương pháp xửlýmẫu 16

1.4 Tổng quan về kỹthuậtHPTLC 17

1.4.1 Sắc kýlớp mỏng 17

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệunăngcao 19

2.1 Mục tiêunghiêncứu 21

2.2 Nội dungnghiêncứu 21

2.3 Đối tượngnghiêncứu 21

2.4 Phương phápnghiêncứu 21

2.4.1 Khảo sát các điềukiệnH P L C 22

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosidbằngHPTLC 22

2.4.3 Xây dựng quy trình xửlý mẫu 23

2.4.4 Thẩm địnhquytrình 24

2.5 Phương pháp xử lýsốliệu 24

2.6 Nguyên vật liệu,thiếtbị 24

2.6.1 Thiết bị vàdụngcụ 24

2.6.2 Hóa chất,thuốcthử 25

2.6.3 Dungdịchchuẩn 25

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀKẾTQUẢ 26

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosidbằngHPLC 26

3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosidbằngHPTLC 29

3.3 Xây dựng quy trình xửlýmẫu 30

3.4 Thẩm địnhphươngpháp 37

3.4.1 Tính thích hợphệthống 37

3.4.2 Tính chọn lọc, tínhđặchiệu 38

3.4.3 Khoảngtuyếntính 41

3.4.4 Giớihạnpháthiện,giớihạnđịnhlượng 45

3.4.5 Độ lặp lại củaphươngpháp 46

3.4.6 Độ thu hồi củaphươngpháp 51

3.4.7 KếtquảápdụngphươngphápxácđịnhginsenosidRg1,Rb1trongmộtsốsảnphẩm55 KẾTLUẬN 58

TÀI LIỆUTHAMKHẢO 59

PHỤLỤC 63

Phụ lục1: Sắc đồ đườngchuẩn 63

Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độlặplại 64

Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độthuhồi 65

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã được xemlàthảodược quý hiếm Hoạtchấtchính tạo nên tácdụngkỳdiệucủa nhân sâmlàthànhphầnginsenosid Hợpchấtnày được phân thành hai nhóm chính là nhómRb1vànhómRg1.Vàinămgầnđâynhiềunhàkhoahọchướngtớisựquantâmđặcbiệttớinhânsâm với rất nhiều nghiên cứu được công bố Ở Việt Nam cũng như trênthếgiới,nhân sâm được biết đến không chỉ là nguồn dinh dưỡng quý báu mà cònlàmột vịthuốc vô cùng quan trọng Theo nghiên cứu khoa học và sách đông y thì nhân sâm

có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe conngười

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao Nguồn nguyênliệu này chủ yếu được nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giảmạo,sảnphẩm nhập về chất lượng không đáp ứng được chất lượng Vì vậy việckiểmsoáttính đúng và chất lượng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Tuynhiên,việckiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu nhân sâm và thực phẩm chức năngchứanhânsâm ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng người dân sửdụngnhầmdược liệu hoặc mua phải dược liệu đã bị chiết hết hoạt chất, kém chấtlượng.Điềunày không nhữnggâyảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh, quyềnlợingườitiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi người khi sử dụng thuốc từdượcliệunói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đấtnước

Thông thường các phương pháp được sử dụng để phân tíchhàmginsenosidRg1 và Rb1 bao gồm: các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện dimaoquản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng

sắckýbảnmỏnghiệunăngcao(HPTLC) ởViệtNamphươngphápđượcsửdụngchủ yếu làphương pháp HPLC Phương pháp HPLC được áp dụng tại việnKiểmNghiệm AnToàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính và địnhlượngginsenosid trongthực phẩm chức năng có chứa nhân sâm.Tuynhiên chưa cótiêuchuẩn về việc địnhlượng ban hành ở Việt Nam Dovậyviệc áp dụng phụthuộcvào điều kiện phòng thí

nghiệm cụ thể Ngoài ra, phương pháp HPTLC chothấytiềm năng áp dụng để kiểmtra nhanh chất lượng của nhân sâm và các sản phẩmtừ

sâm Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng mộtphương pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phương pháp phân tích Xuất phát từ

những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài :“Nghiên cứu phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm

(PanaxGinseng)”.

Mục tiêu nghiên cứu:

 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1vàRb1)bằng kỹ thuật HPTLC vàHPLC

 Thẩmđịnhphươngphápđãđãxâydựngtheocáctiêuchícủathếgiới

 Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhânsâm trên thị trường HàNội

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổngquan về nhân sâm và hoạt chất trong nhânsâm

1.1.1 Giớithiệu chung về nhânsâm

Bộ phận thường sử dụng là rễ củ đã được phơi hay sấy khô của

Nhânsâm(Panax ginsengC.A Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Họ Nhân

sâm (Araliaceae Juss.) còn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì Hầu như tất cảcácloàitrong họ nhân sâm (Araliaceae) đều được sử dụng làm thuốc trong Y họccổtruyềnở nhiều nước Á-Âu; đặc biệt là ở các nước Đông-Bắc Á Sâm trồng gọilàviênsâm, sâm mọc hoang gọi là sơn sâm

Viên sâm:Sâm trồng, phơi hoặc sấy khô, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ tròn,

dài khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơixám,phần trênhoặc toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác

và nông phần dưới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài,thườngcó mấu dạng

củ nhỏ không rõ Thân rễ (Lô đầu) sát ở đầu rễ, dài 1 - 4 cm,đườngkính 0,3 - 1,5

cm, thường cong và co lại, có rễ phụ (gọi là Đinh) và có vết sẹothân,tròn, lõm, thưa(gọi là Lô uyển) Chất tương đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơivàng,có tinh bột rõ,tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa,dạngđiểm,màuvàngnâuvànhữngkẽnứtdạngxuyêntâm.Mùithơmđặctrưng,vịhơi đắngvàngọt

Hồng sâm:Hấp, sấy và phơi khô rễ viên sâm thu được Hồng sâm; Hồngsâmcó

dạng rễ cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2cm,mặtngoài trong mờ, màu nâu hơi đỏ, đôi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàngthẫm, có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vòng tròngián đoạn, không rõ nét, phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau

và nhiều rễ con cong queo, hoặc chỉ mang những vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển);một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh) Chấtcứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa như sừng Mùi thơm đặc trưng, vị ngọtvàhơiđắng

Sơn sâm:Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô Dược liệu là rễ cái, dài

bằng hoặc ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm,mặt ngoài màu vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vòng vân ngang,trũng sâu, dày đặc, thường có 2 rễ nhánh, các rễ con trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏsắp xếp có thứ tự; có mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu” Thân rễ mảnh dẻ,nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tương đối dày đặc,trông tựa như hình hạt táo

Nhân sâm mọc hoang và được trồng ở đông bắc Trung quốc, TriềuTiên,Liênxô cũ Việc trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch.Đất phải tốt Cây ưa bóng râm Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ đượcrửasạch,phơi nắng nhẹ, hoặc sấy nhẹ đến khô Người ta cho rằng loại mọc hoang cógiátrịhơn loại trồng Hiện nay nước ta chưa trồng được, còn phải nhập nhânsâmcủanước ngoài

Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thànhphần khác nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng củanhân sâm Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hưởng tích cực đối vớisức khỏe

1.1.2 Tácdụng đặc trưng của nhânsâm

Theoyhọccổtruyềnnhânsâmcócông dụng:Đại bổ nguyên khí, íchhuyết,kiệntỳíchphế,sinhtân,an thần ích trí Chủtrị:Khí hư muốnthoát,chântaylạnh,mạchvi,tỳhư,kémăn,phếhưhosuyễn;tândịchthươngtổn,miệngkhátnước,nộinhiệttiêukhát,đáitháo,bệnh lâungày gầyyếu,tâmhồi hộp,suy timkiệt sức,haychoángngất Thànhphần hoạtchấtcủaginsenosid trong nhânsâm cótácdụngđặctrưngkhácnhauđượctómtắttrongbảng1.1

Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid

Ro Phân giải rượu, chống viêm gan và phục hồi hư tổn gan

Rb1 Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ương

làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan

Rb2 Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đường, phòng chống xơ cứng

gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan

Rc Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein

Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư, ngăn cản hoặc hạn chế sự phát triển của ung thư vú

Rd Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thượng thận

Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy

Rf Làm dịu cơn đau trong các tế bào não

Rg1 Khảnănggâyhưngphấnthầnkinhtrungương,chốngvàphục

hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease

Rg2 Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng

khả năng lưu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống củatếbào

Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu.Rh2 Ức chế các tế bào ưng thư, hạn chế khối u phát triển

1.1.3 Vài nét về nhóm hoạt chấtginsenosid

Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen Khi thuỷ phân cácsaponin này thu được 3 loại sapogenin là: acid oleanolic,20 (s)protopanaxadiolvà20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran CácSaponin trong Nhân sâm gọi là ginsenosid được phân loại dựa vào cấu trúc của basapogenin trên Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp rộng rãitrong thực vật, đôi khi trong động vật (Hải sâm, cá sao) Tuy nhiên Saponin ở Nhânsâm có cấu tạo hoá

học khác so với giới thực vật khác, để phân biệt sự khác biệt này người ta gọi làGinsenosid là từ ghép của Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid).

Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với bộ khung gồmbốn vòng steroid cố định Nhiều gốc đường khác nhau (ví dụ nhưglucose,rhamnose,xylose và arabinose) gắn ở vị trí C-3, C-6 hoặc C-20 Ginsenosidđượcđặt tên là'Rx', với 'R' là viết tắt của gốc và 'x' mô tả mức di động của chúng trên các tấm sắc

ký lớp mỏng, tính phân cực giảm từ chỉ số "một" đến "h".Ví dụ, Ra là một hợp chấtphân cực ít nhất và Rb phân cực hơn so với Ra Độ phân cực của các ginsenosiddẫn đến khả năng phân tách của của các ginsenosid cũng khác nhau được minh họatrên hình1.1

Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng

Chất lượng và thành phần của ginsenosid trong cây nhân sâm bị ảnhhưởngbởicác yếu tố như: loài, tuổi, bộ phận của cây, phương pháp canh tác, mùathuhoạch vàphương pháp bảo quản Tổng hàm lượng Saponin trong nhân sâm làtỷlệthuận với

độ tuổi của nó, đạt tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáutuổi

Hợp chất Saponin thường được cấu tạo từ hai phần:

 Phần đường : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, arabinose,acidgalactunoic, acid D-glucuronic

L-R2O OH

20S 12

11 18 13 14 8 7

15 1

và bảng 1.2, 1.3, 1.4

21

R 1 O

Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose;

ara(f)= arabinose trong dạng furanose;

R2O OH

20S 19

1 10

12

11 18 13 14 8 7

15 9

Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriolBảng 1.3.

Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol

Hình 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic

Bảng 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic

glc = glucose;

1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 vàRb1

a Công thức cấu tạo của ginsenosidRb1

Chất này có tên theo IUPAC: glucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside Cấu tạo chi tiết được biểu diễn trong hình 1.5

(3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1

- Công thức phân tử:C54H92O23

- Khối lượng phân tử:1109,295g/mol

- Nhiệt độ nóng cháy 197 ~1980C

- Độ tan: Dễ tan trong nước (H2O), MeOH (MeOH), alcohol,pyridine,vàdimethyl sulfoxide (DMSO), không tan trong diethyl ether vàbenzen

b Công thức cấu tạo của ginsenosidRg1

Chất này có tên theo IUPAC: dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside Công thức cấu tạo được biểudiễn chi tiết trong hình 1.6

(3β,6α,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,12-Hình 1.6 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1

- M: 801,013 g/mol.

Íttantrong ethyl acetat, cloroform Không tan trong diethyl vàbenzen.

1.2 Tổngquan về các phương pháp phân tíchginsenosid

Ginsenosidlàđốitượngphântíchcóthànhphầnnềnphứctạp.Thôngthường,trongginsenosid không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, màthường chứa một nhóm các chất có tính chất tương đối giống nhau Cácchấttrongcùng một nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thếhoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tínhchất hoá học Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ(UV-VIS, IR,huỳnh quang,…) để phân tích định lượng một thành phần trong dượcliệugặp nhiềukhó khăn và hầu như là không thể thực hiệnđược

Sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng cácchấtthôngdụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại Khác với các phép địnhlượnghoáhọc,cácphươngphápsắckýchophépđịnhlượngriêngtừngchấtcụthểtrongmộthỗ

n hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dược liệu Người ta cóthểđịnhlượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lầnđịnh

lượngnếuchọnđượcđiềukiệnthíchhợp.Cácphươngphápsắckýthườngdùnglà:sắckýkhí(GC),sắckýlớpmỏng(TLC),sắckýđiệndimaoquản,sắckýlỏnghiệunăngcao

(HPLC), sắc kí bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năngcao (HPLC) và sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là phương phápcónhiềuứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiêncứudượcliệunóiriêng.Ưuđiểmlớnnhấtcủaphươngphápnàylàcóthểphân

tíchnhiềuloạihợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc

ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi) Với pha tĩnh ngày càngđượchoànthiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy,ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậmchí ppt để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơitới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnhvựcdượcliệu,HPLCthườngđượcsửdụngnhấttrongđịnhlượngriênglẻcácchấttronghỗnhợpphức tạp của dịch chiết dược liệu bằng việc so sánh diện tích pic vớichấtchuẩntrong cùng điều kiện phân tích Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caocónhiều tácgiả đã sử dụng phương pháp HPLC để phân tích ginsenosid Rg1 vàRb1trong dịchsinh học[17][30][34]

Năm 1996,Trong một nghiên cứuWilliam A.Court và cộng sự[17] đã nghiên

cứu xác định đồng thời (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) ginsenosids trong Panaxquinquefolium bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC Thể tíchbơmmẫu

5 µl, cột Waters Symmetry C18(150mm×3,9 mm, 5µm), tiền cột C18tươngứng Tốc

độ dòng 1,15 ml/phút và bước sóng hấp thụ 203 nm.Phađộnglàdungdịch đệmphốtphát (A),dungdịchacetonitrile(dungdịchB) vàH2O(dung dịchC),Chương trìnhgradient pha động như sau: 0-15 phút: 81%-79% A, 19% -21%B;15-24,5phút:79%-73,7%A,21%-26,3%B;24,5-29phút:73,7%-73%A,

26,3%-27%B;29-43phút:73%-66%A,27%-34%B;43-47phút,66-64%A,34-36%B;47-54phút:54-57%A,36-43%B;54-55phút:57-0%A,43-85%B,0-15%C; 55-59 phút 85%B, 15%; 81%A, 19%B Cách 2: Nhóm tác giả sử dụng vòiphun tự động 1040A, detecter diode array, cột tách carbohydrate cartridge(250 x4,6mm) và cột bảo vệ cùng loại Với cùng bước sóng và thể tích bơm cột

nhƣtrên.Tốc độ dòng 1,5ml/phút Pha động là dung dịch H2O (A) vàacetonitril( B )

Chương trình gradient pha động như sau: 0-28 phút, 9-19%A, 91-81%B; 28-30phút, 19%A, 81%B; 30-35 phút, 19-22%A, 81-78%B; 35-40 phút, 22-25%A, 78-75%B; 40 – 41 phút, 25-9%A, 75-91%B Độ đúng của Rg1 1,2%, Rb1 là 3,8%.

Năm 2003,trong một nghiên cứu khácAik-jiang Lau cùng cộng sự[24] đã phân

tích các saponin trong Tam thất thô và hấp chín sử dụng phương pháp sắckýlỏnghiệu năng cao, sử dụng pha đảo với detector diode array định lượng đồngthời(Rg1,

Re, R1, Rb1, Rc, Rd) Hệ sử dụng bơm 1100 , van bơm mẫu (20 µl) , cột pha đảoWaters Symmetry C18 (250x4,6 mm, 5µm) Phân tíchpha động chếđộgradient,nước(A)vàacetonitril(B).DungdịchBtừ 20% đến 100%trongthờigian80phút.Tốc

độ dòng của pha động 1ml/phút, thể tích bơm mẫu 5µl và duy trì nhiệt độ cột ở

350C.Detector diode array quéttrongkhoảng190nm-400nm, bướcsónghấpthụlà203nm Độ đúngtrong ngày,khác ngày RSD <4%;Hiệusuấtthuhồi 97-102%;Giới hạnphát hiện LOD của Rb1, Rg1lần lượtlà0,011mg/ml;0,010mg/ml.GiớihạnđịnhlượngLOQcủaRb1vàRg1lầnlượtlà0,036mg/ml;0,033mg/ml

Năm2007,Su Na Kim và cùng cộng sự[22] đã nghiên cứu định lượngđồngthời

14 Ginsenosid trong nhân sâm Hàn Quốc bằng phương pháp HPLC -ELSD.Hệ sửdụng bơm L-62020 (Hitachi), cột tách Zorbax SB-Aq C18 (150-4,6 mm, cỡ hạt5µm), bằng dung dịch rửa giải nước (A), dung dịch acetonitril (B) củaMeOHvà 200

mM axit phosphoric với diethyl amin 0,1M và sodium 1-heptane sulphonate 12

mM (1:4, v/v) Tốc độ dòng của pha động 1 ml/phútPhân tíchphađộngchếđộgradient,dungdịchBtừ 21%đến 100%trongthờigian61phút.Rửacột100%Bvớithời gian10phút.ELSD đã được giữ ở nhiệt độ700Cvà máy phun khínitơđã đượcđiều chỉnh để 2,5bar.Detectordiodearray quét trong khoảng 190nm-203nm,bướcsóng hấpthụlà203nm.Độ đúng trong ngày Rg1 2,62%,Rb13,94%,

suấtthuhồiRg1100,46%,Rb1là104,88% Giới hạnpháthiệnLODcủa Rb1,Rg1lầnlượtlà0,2µg, 0,15µg Giớihạnđịnh lượngLOQ củaRb1vàRg1lầnlượtlà0,40µg,0,3µg

Năm 2009, Ying Shi và cộng sự[30] đã xác định đồng thời chín (Rg1, Re, Rf,

Rb1, Rb3, Rg3, 20(S)-F1, 20(S)-F2, 20(S)-Rh2) ginsenosids trong thực phẩm chứcnăng sử dụng hệ thống HPLC, sử dụng cột tách C18 với chiều dài 250mm, 150mmkết quả cho thấy khi sử dụng cột tách cột Gemini 110A (250 mm × 4,6 mm, kíchthước hạt 5 µm) thời gian phân tích ít nhất 1giờ trong khi cột tách Inertsil ODS2(150 mm × 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm) có thể đạt được một sự tách biệt cơ bảntrong thời hạn 30phút Cột bảo vệ (4 mm × 3,0 mm, kích thước hạt 5 µm) Thể tíchbơm mẫu 5 µl Pha động là hỗn hợp dung dịch acetonitrile (dung dịch A) và nước(dung dịch B), tốc độ dòng 1ml/phút Phân tích pha động chế độ gradient, dungdịch A từ 21% đến 70% trong thời gian 30 phút Nhiệt độ cột tách là 100C, detectordiode array quét trong khoảng 190nm - 203nm, bước sóng hấp thụ là 203nm Độđúng trong ngày Rg1 0,96%, Rb1 1,4%, độ đúng khác ngày Rg1 2,7%, Rb1 6,9%.Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lượt là 7,0ng; 14ng Giới hạn địnhlượng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lượt là 120mg/kg; 230mg/kg

Renée J Vanhaelen-Fastré và cộng sự[32] đã sử dụng phương

phápHPTLC.Bảng mỏng Silica gel 60 F254( 20 mm x 20mm) Pha động sử dụng là

hỗ hợp dung môi:1,2-dicloetan : etanol : MeOH : nước (56,8:19,2:19,2:4,8) Quét ởbướcsóng275mm với tốc độ 5mm/giây Đường chuẩn tuyến tính với nồng độginsenosidRg1,Rb1 từ 0,1 - 5µg với Rb1 (r =1), Rg1 (r=0,999) Giới hạn phát hiện10ng/10mm, giới hạn định lượng LOQ từ 30 –50ng/10mm

Nhận xét: Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuậtHPLC đã được dùng để phân tích các chất thuộc nhóm Ginsenosid như: HPLC–

E S I – M S / M S , U P L C , … c á c kỹthuật này cho kết quả tốttuy nhiên cáckỹthuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và vận hànhphức tạp Ở Việt Nam hiện nay trang thiết bị cũng như điều kiện còn khó khăn nênkhó có thể ápdụngrộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất Kỹ thuật HPLC,HPTLC khắc phục đượcnhữngnhượcđiểmtrênvìvậychúngtôichọnphươngphápnàyđểphântíchcác thành phần hóa học ginsenosid trong các thực phẩm chức năngchứa nhânsâm

1.3 Các phương pháp xử lýmẫu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương phápđịnhlượngđó là phương pháp xử lýmẫu

J.B Wancùng cộng sự [33] đã nghiên cứu quá trình xử lý mẫu bột nguyên liệu

khô theo cách: cân 0,5g mẫu bột khô cho vào ống ly tâm 50ml, thêm 30 ml MeOHlắc đều trong 30 giây trước khi rung siêu âm 2 giờ tại nhiệt độ phòng, đểtrongbồnsiêuâm.Saukhilytâmvớitốcđộ2000vòng/5phút,dungdịchđượcgạnđượcđịnhmứcvàobình50ml,lọcdungdịchquamànglọc0,45µmtrướckhiđưavàohệthốngHPLC

Ngoài ra nhóm tác giả [11,19,33] sử dụng hệ thống chiết áp suất lỏng DionexASE200(DionexCorp,Sunnyvale,CA,USA)trongđiềukiệntốiưu.Cân0,5gmẫubộtđặtvàocộtchiết11mllàmbằngthépkhônggỉ.Điều kiệntốiưu:kíchthướchạt0,3 -0,45µm, dung môiMeOH, nhiệt đô 1500C, áp suất 6,895 × 103 Mpa, thời gian là 15 phút và một quátrình khép kín Dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 50ml [19,33] hoặc địnhmức 25ml [15], định mức bằng MeOH Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm[33];0,22µm [15,19] trước khi bơm vào hệ thốngHPLC

Trong một nghiên cứu khácAik-Jiang Lau [24]cùng cộng sự đã nghiên cứu xử

lý 1g mẫu bột, thêm 10ml MeOH 70%, rung siêu âm 230V, trong 20 phút, lọc Quátrình chiết được lặp lại 2 lần Gạn lấy dung dịch cô quay ở 400C Phầncặnthuđượcđượchòatantrong5 m l MeOH70%vàđượclọcquamàng0,45µmtrướckhimang

đi phântích

trước khi phân tích: cân 6g viên nang cho vào bình Thêm 25 ml dungmôiMeOH40%và25mlhexan,lắctrong30phút.Chiếtlấyphầnnướclọcbêndướibằngbìnhchi

ết và được lọc qua màng lọc0,45µm

Lie Licùng cộng sự [26] xử lý 3g bột khô chiết bằng dung dịch 5ml MeOH

80% thêm 1ml dung dịch nội chuẩn 2,5mg/ml, rung siêu âm ở các thời gian khácnhau 30, 60, 90 và 120 phút Kết quả cho thấy chiết siêu âm 120 phút tốt nhất vàgần như không có saponin nào còn thấy lại trong phầnthải

Wei Shicùng cộng sự [29] chiết kết hợp với lò vi sóng Cân 5g bột sâm cho vào

bình, thêm vào 50ml MeOH 70% ở áp suất 500kPa, thời gian 15 phút Mẫu được đểnguội ở nhiệt độ phòng Gạn dung dịch chuyển vào bình cô quay100ml.Cô quaychân không ở 600C Phần còn lại hòa tan trong 30ml nước Dung dịchđầuchiết lặphai lần với 25 ml ether, các lớp nước sau đó được chiết lặp ba lần với20ml nướcbão hòa n-butanol Sau đó, cô quay chân không cho bay hơi hếtn-butanolvàphầncặnđượchòatantrong10mlMeOH.Cácdungdịchmẫuđượclọcquamộtmànglọc 0,45 µm trước khi phântích

Ngoài ra các tác giả [33] đã xử lý mẫu bằng cách chiết solhet

1.4 Tổngquan về kỹ thuậtHPTLC

1.4.1 Sắc ký lớpmỏng

Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứngdụngtừlâu Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít được sử dụng Phổ biến nhất hiện naylàsắckílớpmỏng.Ởnướctaphươngphápsắckílớpmỏngđãđượcsửdụngrộngrãi,đãcó nhiều tàiliệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương phápnày

Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí được tiến hành trên một tờgiấyhaymộtlớpbộtrảiđềuvàđượcgiữtrênmặtmộttấmkính,chấtdẻohaykimloại,vídụnhôm Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang để giữ pha tĩnh trên

đó Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác dụng của lực maodẫn và đôi khi cả trọng lực và điệnthế

a Nguyên tắc củaSKLM

Cũngnhưtấtcảcácphươngphápsắckýkhác,quátrìnhtáchhỗnhợpcácchấtbằng SKLMxảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong SKLM, pha tĩnh đượcrải thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Dưới tác dụng củalựcmao quản, phađộng thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi hỗn hợp chất cần phân tích

đã được đưa lên bản mỏng Trong quá trình di chuyển của phađộngqua lớp mỏngchất hấp thụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình hấp thụ và giải hấp thụ được lặp đi lặp lại

và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khácnhaudichuyểntheohướngchuyểnđộngcủaphađộngvớicáctốcđộkhácnhau.Kếtquảlà

mỗichấttronghỗnhợpphântíchcóthểsẽđượctáchriêngraởcácvịtríkhácnhautrên bảnmỏng Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trongmộtdung môithích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịchthínghiệmdựa trên độ phân cực của các thành phần trong dungdịch.

Đạilượngđặctrưngchomứcđộdichuyểncủacácchấtphântíchlàhệsốlưugiữ Rf Trị sốcủa nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển củachấtphân tích vàkhoảng cách dịch chuyển của phađộng:

Rf

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trêncùng đường đi của vết, tính bằngcm)

Rf: Có giá tr ị dao động từ 0-1

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10–30µm được rải đều vàkếtdínhthành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông Bảnmỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều khicóđưathêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích.Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel

Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăngcường rửa giải thường dùng 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệsốphânbốgiữa2pha.Tuynhiên,lựachọntốiưuhóasắckýchủyếudựavàokinhnghiệm

b Kỹ thuật TLC

 Đưa chất phân tích lên bảnmỏng:

Lượnghỗnhợpcácchấtđượcđưalênbảnmỏngcóýnghĩarấtquantrọngđốivới hiệu quảtách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị Rf, lượng mẫu đưa lên bảnmỏngkhoảng 0,1 -50µg được pha trong dung môi thích hợp Thể tích dung dịch chấm1

– 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc ký điều chế

Đườngxuấtphátcáchmépbảnmỏngkhoảng1,5–2,0cmvàcáchbềmặtdaođộng 0,8 –1,0cm.

o Phun thuốc thử hiện mầu

o Soi dưới đènUV

o Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặtbảnmỏngkhisoidướiđènUV–VIS.Chấtphântíchhấpthụbứcxạđượcghilạithànhpicsắcký

c Ứng dụng của SKLM trong phân tích kiểm nghiệm

cơhọcbảnmỏng.Trongquátrìnhkhaitriển,điềukiệnkhaitriểnvềnhiệtđộvàđộ

ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khitiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh

và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và địnhlượng

Hiệnnayđểtăngcườngđộtincậycủakếtquảphântích,ngườitađưavàothịtrường bảnmỏng hiệu năng cao (high – performance plates) Bản nàyđượctránglớpphatĩnhmỏnghơn(dàykhoảng100µm)vớibộtmịncókíchthướchạt5µmđộđồ

ng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích đượctănglênbởivì:Vếtsắckýnhỏhơn,thờigiansắckýngắnhơn,lượngdungmôidùngíthơn

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(HPTLC) có sẵn trên thị trường Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả HPTLC sai sốcủa phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10%

Ưu điểm của HPTLC:

+ Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng

+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu mộtlúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

+Cácmẫuphântíchvàcácdungdịchchuẩnđượcchấmtrêncùng1bảnmỏngsắc ký, khaitriển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao,hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phântích

Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC để nghiêncứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng ginsenosid Rg1 và Rb1trong thựcphẩm chức năng

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mụctiêu nghiêncứu

Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng quy trình xác định đồng thời haiginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng phương pháp HPTLC và HPLC Qua đó đánhgiákhảnăng ứng dụng của phương pháp HPLC và HPTLC trong việc phân tíchvàkiểmnghiệm chất lượng nhânsâm

2.2 Nội dung nghiêncứu

- Nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hóa điều kiện để phân tích, xác địnhđồnghaiginsenosid(Rb1vàRg1)bằngphươngphápHPLCvàphươngphápHPTLC

- Đánh giá phương pháp phân tích xác định đồng thời ginsenosid Rb1vàRg1dựa trên: khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn,đánhgiáphương pháp phân tích, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giớihạnđịnhlượng (LOQ), đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích, tínhchọnlọc,tính đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, đánh giá độ đúng của thiết

bị và của phương pháp phântích

- Áp dụng phân tích hàm lượng của ginsenosid Rg1 và Rb1 trong mộtsốmẫunhân sâm, sản phẩm nhân sâm đang lưu hành được lấy ngẫu nhiêntrênthịtrường HàNội

2.3 Đối tượng nghiêncứu

Đốitượngmẫuphântíchlàcácmẫunhânsâmtươi,khôvàcácmẫusảnphẩmđược chếbiến tứ nhân sâm: Viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén vàdạnglỏng Các mẫuphân tích được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội có nguồngốctừ các công tysản xuất khácnhau

2.4 Phương pháp nghiêncứu

Hai phương pháp phân tích chính trong nghiên cứu là phương phápHPLCvàHPTLC trong đó hầu hết các điều kiện tối ưu sẽ lựa chọn dựa tài liệu đãcôngbốliên quan và khảo sát một số điều kiện đặc biệt là dung môi triết mẫu vàthành phần phađộng

2.4.1 Khảosát các điều kiệnH P L C

Tham khảo tài liệu [17,22,24], chúng tôi khảo sát lại một thành phần phađộng,giữnguyênmộtsốthôngsốnhằmtìmđượcđiềukiệnphântíchtốiưunhất

- Pha động được lựa chọn khảo sát: nước và acetonitril ở những tỉlệkhácnhau

- Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters( 250mm x 4,6mm; 5µm ) và tiền cộtcùngloại

- Tốc độ dòng: Tốc độ pha động cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắckývìnó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh vàpha động Khi tốc độ dòng nhỏ chất phân tích ra muộn, gây doãng pic và mất nhiềuthời gian phân tích Khi tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợpmẫu chưa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng pic Khi hệ thốngHPLCvậnhành với tốc độ dòng cao sẽ dễ gây áp suất lớn, ảnh hưởng khôngtốttớibộphậncủa máy, đặc biệt là bộ phận bơm trộn sắc ký và cột tách sắc ký Dựa trênnhiều bài báo nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 1,0mL/phút

- Thể tích bơm mẫu: 50µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190nm đến400nm

- Bước sóng phát hiện: 203 nm

- Nhiệt độ cột:300C

2.4.2 Khảosát các điều kiện phân tích ginsenosid bằngHPTLC

Tham khảo tài liệu [13,32] chúng tôi khảo sát điều kiện phân tích HPTLC nhưsau:

- Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm ×20mm)

- Pha động: được lựa chọn để khảo sát với các pha động khác nhauđể lựachọn hệ pha động cho phân tích tốt nhất

- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.

- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80mm

2.4.3 Xây dựng quy trình xử lýmẫu

Phương pháp xử lí mẫu sử dụng các kĩ thuật đơn giản nhằm hướng tới quytrình phân tích nhanh, hiệu quả Dựa trên tính chất chất cần phân tích và tham khảotài liệu [11,19,24,26,31, 33] chúng tôi lựa chọn dung môi chiết: Hỗn hợp dung môi

để chiết mẫu là MeOH hoặc EtOH với nước Dung môi dietyl ete để loại béo đốivới mẫu chứa chất béo, dung môi n-butanol để loại đường đối mẫu chứa đườngtrước khi tiến hành chiết mẫu Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độthường (30oC) để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu

a) Quytrìnhxửlímẫudựkiếnđốivớimẫuviênnén,viênnangcứng(dạngbột):

- Mẫu được đồng nhấtkỹ

- Cân2-3gmẫuvàoốnglytâm,vớinềnmẫuchứanhiềuchấtbéo(loạichấtbéo trước khi phân tích

- Thêm 10ml dung môi chiết mẫu vào ống ly tâmtrên

- Lắc vortex để mẫu và dung môi được đảo trộnđều

- Tiến hành chiết siêu âm ở 300C để tăng khả năng hòa tan của chất phântích

- Để nguội đến nhiệt độphòng

- Ly tâm với tốc độ cao 6000 vòng/ phút, phân tách phần dungdịch

- Lọc gạn phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml, phần cặn được chiếtlặp2 lần với dung môichiết

- Định mức đến vạch bằng dung môi chiết, lọc rồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC,HPTLC

b) Quytrìnhchiếtginsenosidchođốitượngphântíchlàthựcphẩmchứcnăngdạngdung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối vớithựcphẩmchứcnăngdạngviênnén,nangmềmvànangcứngnhưngthêmbướccuốilàmsạchvàlàmgiầumẫubằngphươngphápchiếtpharắn(SPEC18)nhưsau:

- Hoạthóacột:Lầnlượtbằngcácdungmôi6mlMeOH,6mlnướccất

- Nạp dịch lên cột: tốc độ không quá 2ml/phút.

- Rửa, loại tạp chất: 6ml nướccất

- Rửa lấy dịch: 2 ml MeOH/lần × 2lần

- Bơm mẫu vào hệ thống HPTLC, HPLC (pha loãng nếucần)

2.4.4 Thẩm định quytrình

Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPLC và HPTLC được thẩm định về các tiêu chí:

- Độ chọn lọc, độ đặc hiệu của phươngpháp

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của phươngpháp

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phươngpháp

- Độ lặp lại, độ thu hồi của phươngpháp

- So sánh với các yêu cầu của AOAC và các nghiên cứukhác

2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị

- Bản mỏng HPTLC Silicagel GF254(Merck,Đức).

- Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g (XT1200c, ThụySĩ);

- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g (Mettler Toledo, ThụySĩ)

- Máy lắc vortex (VELP, Ý)

- Thiết bị đồng nhất mẫu, thiết bị ly tâm (Hermle,Đức)

- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma,Đức)

- Và các thiết bị dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm: ông ly tâm, ống đong,pietman, phễu lọc, mànglọc,

2.6.2 Hóachất, thuốcthử

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Chất chuẩn :

 Chuẩn ginsenosid Rb1, Rb1 từ Sigma Aldrich độ tinh khiết ≥99%

 Các loại hóa chất, dung môi khác: MeOH (Merck 99,9%), dietyl ete (Merck99,9%),n-Butanol(Merck–HPLCgrade),nướccấtđượclọcquamàng0,45µmvàrung siêu

âm loại khí, một số hóa chấtkhác

2.6.3 Dung dịchchuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc 500ppm: Cân 5,0 mg từng lượng chất chuẩntrêncânphân tích vào cốc có mỏ 50ml, hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình địnhmức 10ml, định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Bảo quản trong điềukiện lạnh

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩngốc vào bình định mức 10ml và định mức bằng MeOH ta được dung dịchchuẩnlàmviệc100ppm

- Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịchchuẩnlàmviệc, được sử dụng trongngày

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ3.1.Lựachọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằngHPLC

Tham khảo tài liệu [17,22,24,30] và khảo sát sơ bộ chúng tôi lựa chọn các điềukiện phân tích ginsenosid (Rb1, Rg1) bằng phương pháp HPLC bao gồm các điềukiện dưới đây trong toàn bộ quá trình nghiên cứu:

- Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột cùngloại

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Thể tích bơm mẫu: 50µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 400nm

- Bước sóng phát hiện: 203 nm Nhiệt độ buồng cột:300C

Để đạt được kết quả tín hiệu và độ phân giải tốt giữa hai chất phântíchviệckhảo sát và lựa chọn thành phần pha động là rất cần thiết Qua khảo sát sơ

bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng cho kết quả phân tách Rg1 và Rb1 khôngtốt do đósửdụngchươngtrìnhdungmôi(gradient)đượcsửdụngđểcóđượcđộphângiảinhưmongmuốn

Pha động nước – acetonitril được lựa chọn khảo sát ở những tỉ lệ khác nhauđược biểu diễn trong bảng từ 3.1, 3.2 và hình tương ứng từ 3.1 đến 3.4

mAU 203nm4nm (1.00)

Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với chế độ gradient 4.

Như vậy, trong 4 chương trình gradient đã khảo sát, chương trìnhgradient4cho pic ginsenosid Rg1, Rb1 sắc ký gọn và cân xứng hơn cả Từ kết quả tối ưuhóapha động, chúng tôilựa chọn quy trình phân tích ginsenosidRg1, Rb1 bằng HPLC với điều kiện cụ thểnhưsau:

3.2.Thiếtlập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằngHPTLC

Tham khảo tài liệu [13, 32] chúng tôi khảo sát các pha động như bảng 3.3, hình 3.5

Bảng 3.3 Danh mục các pha động HPTLC khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động Pha động 1 Cloroform - ethyl acetat - MeOH - nước (15: 40: 22: 10)

Pha động 2 Butanol: nước: ethyl acetat (10:5:2,5)

Pha động 3 CHCl3- MeOH - H2O (65:35: 11)

Pha động 4 Butanol : EtOH (10:2)

Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 1

Nhận xét: Với hệ pha động 1 trong bảng 3.5 cho các vết gọn, đẹp, không bịnhòe, pic cân đối, tách đẹp Từ kết quả khảo sát pha động, tham khảo tài liệu chúngtôi lựa chọn quy trình phân tích ginsenosid bằng HPTLC với điều kiện cụ thể nhưsau:

- Pha tĩnh HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm ×20mm)

- Các thông số của bộ phận chấm mẫu bán tự động Linomat5:

- Các thông số của bộ phận triển khai dung môi tự động ADC2:

 Pha động: Cloroform – ethyl acetat - MeOH - nước (15: 40: 22:10)

 Thể tích dung môi triển khai 10ml, dung môi bão hòa20ml

 Thời gian bão hòa dung môi 20phút

 Kiểm soát độ ẩm 52 ± 2% (dung dịch KSCN bãohòa)

 Thổi khô trước và sau khi triển khai dungmôi

 Các thông số của bộ phận chụp ảnh bản mỏngVisualizer

 Phun bản mỏng với thuốc thử acid sulfuric 10%/EtOH,sấy1050C/5phút

 Chụp ảnh bản mỏng ở ánh sáng trắng và ở bước sóng 366nm

 Sử dụng phần mềm Videoscan để xử lí hìnhảnh

- Các thông số của bộ phận Scanner 4:

 Scan trong khoảng 250nm đến 750nm với khoảng cách100nm/scan

 Định lượng tại bước sóng450nm

3.3.Xây dựng quy trình xử lýmẫu

Để lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu tối ưu nhất, chúng tôithamkhảomột số tài liệu trong nước và trên thế giới Theo các nghiên cứu đã đượccôngbố[16,24,26,27,34] các tác giả sử dụng dung dịch chiết chủ yếu là hỗn hợpgiữa một dung môi hữu cơ phân cực (MeOH, EtOH) và nước cất với các tỉ lệ khácnhau.Đốitượng nghiên cứu của chúng tôi trên nhiều nền mẫu khác nhau: viênnangcứng,v i ê n n a n g m ề m , d ạ n g s i r o l ỏ n g , d ạ n g c a o đ ặ c , d ạ n g

n g u y ê n l i ệ u t ự n h i ê n C á c s ả n p h ẩ m c h ứ a n h â n s â m t r ê n

t h ị t r ư ờ n g h i ệ n n a y t h ư ờ n g đ ư ợ c n h à s ả n x u ấ t p h ố i hợpvớinhiều loại dược liệu khác nhau (như linh chi, đông trùng hạ thảo, sữaongchúa…).Với nền mẫu phức tạp, rất nhiều tạp chất sẽ dễ bị chiết cùng chất phân tích, ảnhhưởng tới quá trình định tính và định lượng Chính vì vậy chúng tôitiếnhành khảosát và lựa chọn dung môi thích hợp dùng để xử lýmẫu

a) Với các mẫu TPCN dạng viên nangcứng