Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống việt nam

Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìmthấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đườngnhưng chưa được nghiê

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU

TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Để có được nền tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ trong nghiên cứu này emxin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tựnhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tận tình truyền đạt kiến thức, chỉ bảo cho emtrong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơntới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thựcphẩm đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật trong suốt thời gian qua.

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn

bè, những người luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm học tập

và nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019

Học viên

Lê Thị Quyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về rượu truyền thống 3

1.1.1 Men rượu 3

1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu 5

1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae 9

1.3 Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam 11

1.4 Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phô (GCMS) 12

1.5 Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng 16

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 17

2.3.Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp phân lập 17

2.3.2 Làm sạch và giữ giống 17

2.3.3 Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào 18

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men 18

2.3.5 Phương pháp tinh chế DNA 18

2.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 19

2.3.7 Phương pháp điện di 20

2.3.8 Nhuộm gel và đọc kết quả 20

2.3.9 Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA 20

2.3.10 Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc 21

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện 23

2.3.12 Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường 23

2.3.13 Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc 24

2.3.14 Đo độ cồn bằng sôi kế 25

2.3.15 Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men 28

3.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào 28

3.3 Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA 34

3.4 Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS 39

3.5 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện 43

3.6 Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường 45

3.7 Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần 47

3.8 P hân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần 49

KẾT LUẬN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam 5

Hình 1.2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase 6

Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 9

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS 13

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS 14

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện 32

Hình 3.2 Phô băng DNA fingerprinting 35

Hình 3.3 Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml) 42

Hình 3.4 Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ 45

Hình 3.5 Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các chủng mốc 46

Hình 3.6 Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu 51

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

°C: độ celsius

CNTP: Công nghiệp Thực phẩm

dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate h:

hour (giờ)

ITS: Internal transcribed spacer

PCR: Polymerase chain reaction

rDNA: ribosomal DNA

rpm: round per minute (vòng/phút)

TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp

HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometer

MỞ ĐẦU

Rượu truyền thống là loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sửdùng rộng rãi trong nhân dân Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình vàcó hương vị đa dạng của từng vùng miền như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượuKim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định) Để tạo nên sự khác biệt đócó nhiều yếu tố như nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đôi của hệ visinh vật trong bánh men Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạngthường gây khó khăn trong quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, vì vậy việcnghiên cứu sâu về chủng giống se rất cần thiết Các loại rượu trên thế giới đều cho thấy

loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu, tuy nhiên nấm

mốc thì khác biệt hơn, với mỗi loại rượu thì loài nấm mốc là khác nhau như khi nói tới

rượu Sake của Nhật Bản thì đều biết đến loài Aspergillus oryzae, khi nhắc tới rượu Hong Qu ở Trung Quốc thì đều biết đến loài Monascus purpureus, thế nhưng ở Việt

Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo tronglên men rượu truyền thống Việt Nam

Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìmthấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đườngnhưng chưa được nghiên cứu kỹ về đặc tính liên quan tới đường hóa Các nghiên cứutrước đây liên quan tới men rượu thì chủ yếu về tính đa dạng vi sinh vật của bánh men

và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả nănglên men rượu tốt để làm bánh men Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh giáđặc tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập từbánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng trong giai đoạnđường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấmmen thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phô hương rượu với các dòngrượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng tronglên men rượu truyền thống Việt Nam Việc sử dụng chủng thuần cũng như phươngpháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phô (GCMS) để nghiên cứu hương rượu cũng lànhững tính mới của luận văn

Để thực hiện mục tiêu đề tài đã nêu, các nội dung chính sau đã được thực hiện:

- Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam

- Phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diệnbằng giải trình tự rDNA

- Đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceaetrong các điều kiện nhiệt độ khác nhau

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột của Mucoraceae trong môi trườngđường

- Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích cáchợp chất bay hơi của dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượutruyền thống khác

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về rượu truyền thống

Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phô biến và đóng vaitrò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người Ở Việt Nam, rượugạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phô biến và chiếm 80% trongtông số các loại đồ uống có cồn Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần và quytrình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương khácnhau như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượuKiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh LongAn) Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đôi hóa sinhcủa hệ vi sinh vật trong men rượu [8]

Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống

khởi động truyền thống ở Châu A là Rhizopus spp và Mucor spp Nhóm nấm men phô biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm men phô biến là Saccharomycopsis fibuligera.

Bảng 1 1 Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á

Sản

Bakhar Ấn Độ Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae

Bubud Philippines

Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp., Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis spp.

cerevisiae

Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp., Saccharomyces cerevisiae

Men

rượu Việt Nam

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera

Murcha Nepal Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomycopsis fibuligera.

Nurock Hàn Quốc

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium

spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala,

Saccharom yces cerevisiae

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium

spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae,

Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp., Rhodotorula spp.

Tapai Malaysia Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera

Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả bộtgạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những thànhphần bô sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của các visinh vật tạp nhiễm Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1 theokhối lượng Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là 55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước Những viên men được nặn hình trònvới đường kính 4 cm, dày 1 cm Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt

B t men ô

độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời [8]

Khối bột với 50- 60% hàm ẩm

Nặn viên men tròn

Hình 1 1 Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam

1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu

Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa

và giai đoạn lên men rượu

1.1.2.1 Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa

Gạo sau khi được nấu chín se được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khốilượng Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủyphân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8]

1.1.2.1.1 Đặc điểm của enzyme amylase

Amylase có thể được tông hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn vàxạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phô biến và ôn định

ủ 2-5 ngày

Hong khô

của enzyme này Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, glucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau Hình 1.2 minh họa vị trí thủy phân liênkết của 3 loại enzyme này.

(α-Hình 1 2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase

a α- amylase

α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạchamylose và amylopectin Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó cắtở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, n- dextrin.α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy phânnhiều vị trí của cơ chất Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và

Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22].

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn:

Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạothành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảmnhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2]

Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bịthủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bịthủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tácdụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7gốc glucose [2]

Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạchpolyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose vàglucose Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thànhmaltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu vớiIodine Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy,người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.[2]

b β-amylase

β-amylase hay exoamylase có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6glycoside Chúng thủy phân glucose ở phía ngoài của mạch amylose và amylopectin [23].β-amylase là một enzyme ngoại bào Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu khôngkhử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucosidenhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sengừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiềuliên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin [2]

c γ-amylase

γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose

và amylopectin, tạo ra glucose Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH 5,5 và nhiệt độ 50ºC Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu,aceton [22]

3,5-1.1.1.2.2 Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa

Quá trình đường hóa tinh bột se cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol cónguồn gốc từ các quá trình lên men Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme cónhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và nhiệtđộ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo Enzyme cótính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn nhưthường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26]

1.1.2.2 Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu.

Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces

cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae

được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóađường thành ethanol Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao trongdịch lên men se ức chế màng sinh chất, thay đôi tính bán thấm tế bào nấm men và các

vi sinh vật khác Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc vào thờitiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn Ví dụ như ở vùng Đồng bằngSông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian ủ chogiai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8]

+ Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao.Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn Ngô và sắnsau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước Quá trình lênmen diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3]

+ Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng Gạo,sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bô sung nước theo tỉ lệ 1:1 Lênmen tiếp trong 3-5 ngày Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắnhơn mùa đông [3]

Sản phẩm sau lên men rượu gạo.

Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 seđược lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những loạirượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu se không bảo quảnđược lâu Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất se tăng hàm lượng cồn bằng cáchhoặc bô sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bô sung cồn vào sau giai đoạn 2, nhưvậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuôi thọ cho sản phẩm [3]

Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động nhưhình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa rượuchưng cất Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65% (v/v)sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau [3]

Hình 1 3 Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 1.2 Giới thiệu về ho Mucoraceae

Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không vách

ngăn Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor, Rhizomucor,

và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129 loài [15] Sau đây

là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở bánh men rượu.

a Rhizopus oryzae

Rhizopus oryzae là thành viên của chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae Hệ

thống phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản Những nghiên cứu gần đây về Mucorales dựa trên trình tự ITS đã đưa ra các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces

rouxii, Rhizopus achlamydosporus, R arrhizus, R boreas, R delemar, R chiuniang,

R javanicus, R oryzae, R maydis, R niveus, R peka, R tonkinensis [26] Mặc dù

nhiều chủng nấm mốc trong bánh men đều có khả năng thủy phân tinh bột gạo

nhưng Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến là chủng điển hình

nhất, được mô tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982) Ông coi chủng này đóng vai tròquan trọng

trong quá trình thủy phân tinh bột gạo Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này và nấmmen thương phẩm ông có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay vì 180 g khi sửdụng bánh men Ngoài ra, nấm này cũng được sử dụng trong nghiên cứu tạo bánh men

để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1] Bên cạnh đó, R oryzae cũng là loài phô biến

và chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, và ở một số Hồng Qu Nó cũng được tìmthấy ở một số giống khởi động khác với khả năng sinh amylase mạnh, đóng góp lớn

cho sản xuất rượu [23] Nghiên cứu trước còn chỉ ra rằng R oryzae cũng có thể tạo ra

các hợp chất dễ bay hơi trong quá trình lên men, chẳng hạn như ethanol, butanol và 3- methyl-1-butanol [4]

2-methyl-1-b Rhizopus microsporus

Rhizopus microsporus là nhóm nấm thuộc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phô

biến thứ hai khi phân lập từ bánh men [6] Các enzyme thủy phân từ các loài

Rhizopus hoạt động tối ưu trong điều kiện pH 4.0-5.5 Nhóm Rhizopus microsporus có khả năng chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var rhizopodiformis có thể sinh trưởng ở 50°C và sinh amylase tối ưu ở 45°C [7] Rhizopus microsporus

var chinensis CICIM-CU F0088 cũng cho thấy khả năng phát triển ở 40°C, và tiết

ra các amylase ở nhiệt độ cao hơn Rhizopus oryzae [17].

Các chủng R microsporus có thể sinh độc tố rhizoxins, nhưng bản thân nó không tạo ra mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên trong tế bào nấm Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã từng được tìm thấy ở chủng Rhizopus

microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu Một lượng đáng kể rhizoxins được

phát hiện trong sản phẩm cuối cùng [7] Tuy nhiên vẫn chưa biết rõ rằng Rhizopus

microsporus từ bánh men có độc tố không.

c Mucor indicus

Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm

đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tụcphân nhánh, với các nhánh dài Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới 75

µm, với các màng khác nhau Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm Bào tử có vách trơn,gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt

là trong ánh sáng Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính lêntới 100 µm [14].

M indicus có khả năng sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác nhau như

glucose, mannose, fructose, hay galactose Chúng cũng có khả năng lên men xylosethành ethanol nhưng chỉ trong điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí Sản lượng ethanol

sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol do Pichia stipites lên men (Pichia stipites

được biết đến là loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose) Tuy nhiên, nhiều chủng nấm

này không có khả năng lên men đường sucrose, vì vậy M indicus không thể thay thế

S cerevisiae để lên men ethanol từ cơ chất chứa sucrose [14].

M indicus là loài nấm mốc lên men ethanol khá hiệu quả và có thể sinh ra

ethanol 5% khi sinh trưởng trong môi trường chứa glucose Bên cạnh đó, một nghiên

cứu khác chỉ ra rằng hoạt lực amylase của M indicus dường như rất thấp hoặc không

có khi sinh trưởng trong môi trường gạo [14]

d Mucor circinelloides

Trong số nấm thuộc chi Mucor tìm thấy trong bánh men, Mucor circinelloides

là loài cũng khá phô biến Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột của chúng kém [12].Chúng là loài dị hình giới tính và có thể phát triển giống nấm mốc và nấm men Bêncạnh khả năng thủy phân tinh bột, chúng còn có khả năng thủy phân cellulose [14]

1.3 Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam

Các nghiên cứu về lên men rượu truyền thống của Việt Nam có thể được phânloại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và (ii) lựa chọncác chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên menrượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25]

Hệ vi sinh của bánh men đã được nghiên cứu khá rõ, mỗi gam bánh menchứa 103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic Bánh

men chứa hệ vi sinh vật tương đối ôn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus

microsporus, Mucor indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis fibuligera, loài nấm men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis,

Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae, Pediococcus pentosaceus, và các loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides Nó được kết

luận rằng hệ vi sinh trong bánh men tương tự như ragi và các dạng men Châu Akhác Tuy nhiên, để có một cái nhìn rõ hơn về đặc tính thủy phân tinh bột của cácnhóm chủng vi nấm xuất hiện phô biến trong bánh men rượu Việt Nam thì vẫn chưacó nghiên cứu nào được thực hiện trước đó

Bên cạnh đó, khi đã chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủngthuần thì rượu sau khi chưng cất chỉ được đánh giá bằng cảm quan mà ít có phân tíchphô hương rõ bằng sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này se phân tích các hợp chất bay hơitrong các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền gạotruyền thống

1.4 Phân tích hợp chất bay hơi

1.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phô (GCMS)

Sắc kí khí kết nối khối phô (GCMS) gồm 2 phần chính là GC và MS, trong đó

GC (Gas Chromatography) là loại sắc kí có pha động là khí mang, thường là các khítrơ như heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bêntrong cột Mẫu được chạy qua cột bởi dòng khí mang Các thành phần của mẫu đượctách nhau ra khi đi qua cột dưới một chu trình nhiệt độ từ thấp tới cao Còn MS (MassSpectrometer) là detector khối phô cho GC, các chất khí sau khi đi qua cột se sang MS

và bị bắn phá thành các mảnh có khối lượng khác nhau, mỗi chất khí có một danh sáchcác mảnh khác nhau, dựa vào thông tin khối lượng trên điện tích m/z, sau đó chất nàyđược so sánh với thư viện phô để biết tên chất [11]

Sắc kí khí kết nối khối phô là một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưngcủa sắc kí khí và khối phô để định tính các hợp chất trong mẫu GC có thể tách hợpchất bay hơi và bán bay hơi nhưng không thể định danh chúng MS có thể cung cấpthông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết các hợp chất và định danh chúng nhưng MS lạikhông tách được chúng khỏi mẫu [16] Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS 1.4.2 Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống

Hương rượu được hình thành bởi nhiều hợp chất dễ bay hơi và nó đặc trưng chotừng sản phẩm Thông thường nồng độ các chất này rất thấp và có ngưỡng cảm giácphát hiện rất thấp (giữa ng/L và µg/L) Để phân tích hương rượu cần cô đặc các chấtbay hơi trước khi thực hiện phân tích sắc ký khí Một số phương pháp chuẩn bị mẫu đểphân tích đã được biết đến như chưng cất, tách chiết pha lỏng (liquid-liquid extraction,LLE), tách chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE), tách chiết khoảng trống(dynamic headspace extraction) và vi tách chiết pha rắn-khoảng trống (headspace-solidphase microextraction, HS-SPME) [28]

HS-SPME GCMS (Headspace-Solid Phase Microextraction GasChromatography Mass Spectrometer) được gọi là phương pháp vi tách chiết pha rắn-khoảng trống kết hợp với sắc kí khí kết nối với khối phô trong đó ở bước đầu tiên, phatĩnh của sợi fiber se hấp phụ các hợp chất hữu cơ ở không gian đầu phía trên mẫu chấtlỏng Sau một khoảng thời gian xác định, sợi được kéo vào bên trong kim để bảo vệ.Tiếp theo, kim được đưa vào injector, và sợi được đẩy ra Dưới ảnh hưởng của nhiệt độcao, các hợp chất được giữ lại trong pha tĩnh được giải hấp rồi nhờ dòng khí mang địnhlượng trên cột sắc ký [28]

Ưu điểm của SPME như sau: là thiết bị cầm tay, sử dụng đơn giản, chi phítương đối thấp, độ nhạy cao, kích thước nhỏ và loại bỏ dung môi; tính năng quan trọngnhất là thời gian chuẩn bị mẫu tương đối ngắn trước khi phân tích Tuy nhiên,

so với các kỹ thuật khác, SPME có nhiều nhược điểm, ví dụ như sự xuống cấp mộtphần của pha tĩnh trong quá trình giải hấp nhiệt ở nhiệt độ cao ảnh hưởng tới khả nănghấp phụ và tuôi thọ sợi fiber.

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS

SPME được phát triển vào những năm 1990 bởi Pawliszyn và cộng sự, mỗi nămcó hàng ngàn bài báo khai thác các khía cạnh khác nhau của phương pháp này và ứngdụng trong các lĩnh vực khác nhau được công bố (phân tích hóa học, phân tích sinhhọc, khoa học thực phẩm, khoa học môi trường, khoa học dược và y) Kỹ thuật chiếtmẫu này đã được mô tả là nhanh, đơn giản, không sử dụng dung môi, và phù hợp choviệc chiết số lượng lớn các hợp chất dễ bay hơi và bán bay hơi từ dung dịch Ngoài ra,SPME chỉ cần lượng mẫu nhỏ, kết hợp với sắc ký khí khối phô (GC/MS) với độ nhạycao Vì những ưu điểm này, nó đã được sử dụng để nghiên cứu hương của nhiều loạitrái cây, rau quả, đồ uống và rượu [28]

Bằng cách sử dụng phương pháp GCMS để đánh giá định tính hoặc định lượngnhững khác biệt này, ngoài các kỹ thuật cảm quan, các nhà phân tích có thể thu đượcnhiều thông tin về sản phẩm của họ Các đặc tính cảm quan độc đáo của các sản phẩmrượu chưng cất thường là do sự khác biệt nhỏ giữa các hợp chất dễ bay hơi [21].Nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp này để định tính và bán định lượng cáchợp chất bay hơi trong mẫu rượu chưng cất sử dụng bánh men rượu truyền thống

Trung Quốc xác định được 118 hợp chất chủ thuộc 5 nhóm chính là ester (32), alcohol(22), acid (23), aldehyde (9) và ketone (15) [11] Các nhóm này cũng xuất hiện ở sảnphẩm makgeolli của Hàn Quốc, ngoài ra còn xuất hiện têm nhóm phenol và terpene[13] Đối với sản phẩm rượu của Combodia, phân tích 5 nhóm rượu từ các nhóm bánhmen tương ứng xác định được 25 hợp chất bao gồm ester, alcohol, acid, aldehyde, andketone Trong đó nhóm xuất hiện nhiều nhất là alcohol (chiếm 93% tông các hợp chấttạo hương) điển hình như 2-methylbutan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, butane-2,3- diol, 2-phenylethan-1-ol [18].

Ngoài rượu và các hợp chất tạo hương, đôi khi có khí tạp như khí lưu huỳnh vàcó thể dẫn đến mùi hoặc hương vị lạ cho sản phẩm Bởi vì ngay cả tỷ lệ nhỏ (ppb) củacác hợp chất lưu huỳnh có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Phần lớn các chấtgây ô nhiễm này có mặt trong pha khí, đòi hỏi phải có hệ thống lấy mẫu và phân tíchpha khí Sắc ký khí (GC) là một công cụ mạnh me trong việc phân tích các sản phẩm

đồ uống có cồn Các hợp chất tạo hương có xu hướng dễ bay hơi trong tự nhiên, đápứng một trong những yêu cầu chính của GC [21]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bánh men (ký hiệu từ MQ1-MQ15) từ các tỉnhNinh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, BắcGiang đã được thu thập và tiến hành thí nghiệm Danh sách các mẫu bánh men vớinhững thông tin cụ thể được trình bày trong phần phụ lục S1

Ngoài ra, một số chủng nấm đã định danh thuộc bộ sưu tập giống của Viện

Công nghiệp Thực phẩm cũng được sử dụng phục vụ nghiên cứu bao gồm:: Rhizopus

oryzae BMM 111, R oryzae BMM 131, R oryzae BMM 1015, Saccharomyces cerevisiae BMQ 467: được dùng làm 3 mẫu rượu từ 1 chủng thuần

mốc với 1 chủng thuần men

Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908: bô sung vào mẫu lên men sử dụng

1 chủng nấm mốc R.oryzae và 1 chủng nấm men S cerevisiae để so sánh với mẫu

không bô sung chủng này

Aspergillus oryzae CNTP 5026 : dùng làm mẫu đối chứng trong thí nghiệm

kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất dùng trong nuôi cấy:

Agar (Việt Nam), Malt (Đan Mạch), Glucose, Yeast extract (Ấn Độ), Maltextract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ)

Hóa chất dùng cho PCR

Thang DNA mẫu dùng trong điện di Thermo Scientific (Mỹ)

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang, box cấy (Bioblock Scientific, Pháp), cânđiện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600-Nikon, Nhật), lò visóng (LG, Hàn Quốc), hệ thống soi và chụp ảnh gel điện di (Syngene), máy đo pH(Toledo - Anh), máy lắc ôn nhiệt, máy ly tâm cao tốc (Heraeus – Sepatech), máy PCR,nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển), tủnuôi cấy (Sanyo,Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products), máyđông khô (VirTis Freeze Dryers 2.0)

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ốngEppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que cấy,

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập

Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu để phân lập nấm mốc, nấm men, giả mentrong bánh men:

Quy trình phân lập như sau:

- Bước 1: Nghiền mịn các mẫu bánh men trong các túi riêng

- Bước 2: Cân 3 gam mẫu bánh men đã nghiền với 27 g dung dịch NaCl 0.9% (đãhấp) trong ống falcon 50 ml, vortex đều

- Bước 3: Pha loãng theo hệ số 10 đến nồng độ 10-6

- Bước 4: Sau đó hút 100 µl dịch pha loãng của từng nồng độ chang trên đĩa thạchMalt 2°Bx rồi nuôi trong điều kiện hiếu khí trong tủ 30°C

- Bước 5: Từ sau 24 giờ, tiến hành quan sát các khuẩn lạc khác nhau Chọn lấycác khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống

2.3.2 Làm sạch và giữ giống

Lấy một ít sinh khối cần làm sạch và cấy lên đĩa Petri chứa môi trường Malt2ºBx, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30ºC trong 2-3 ngày Khi thấy nấm đã mọc mà khôngthấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì lấy một ít sinh khối và cấy giữ giống vào trong ốngnghiệm nút xoáy chứa môi trường Malt 4ºBx Đem các ống nghiệm nuôi cấy ở nhiệt độ30ºC khoảng 2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát Trường hợp khuẩn lạc nào chưa sạch(có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên

Đối với các chủng mốc, sử dụng cách bảo quản cát

Lấy sinh khối mốc thuần cho vào các ống cát sấy khô (kích thước dài 8-10 cm,đường kính 8mm) với độ dày cát 15 mm, mỗi chủng làm 3-5 ống, đảo đều rồi đưa vàobình hút ẩm chứa hạt silicagen sấy khô Đợi 3 đến 5 ngày sau, khi các ống cát khô tơi,tiến hành nhúng đầu bông vào paraffin nóng chảy để khô rồi bảo quản trong tủ lạnh5ºC

Đối với các chủng nấm men và giả men, sử dụng cách bảo quản lạnh sâu, thànhphần môi trường như sau: peptones 1,5%, yeast extract 0,3%, sodium chloride 0,6%,glucose 0,1%, glycerol 15% Dùng pipet Pasteur hút dịch cho vào ống nghiệm đã cógiống lấy hết các tế bào cho vào ông sữa, hàn lại Hấp các ống nghiệm nút xoáy 2ml,mỗi ống đựng 3 ống sữa, mỗi chủng làm 6 ống sữa, rồi để vào tủ -80ºC

2.3.3 Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào

Các chủng nấm mốc, men và giả men được nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBxở 30ºC sau 2 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Tiến hànhlàm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x Sau đóchụp ảnh lại

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBx sau 2 ngày Lấy sinh khối tếbào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 0,75 ml SSC 2x vào mỗi ống Lắc đều và đunở 100ºC trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Hút bỏ phần dịch và tiếnhành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần rửa ly tâm 13000 vòng/phúttrong 1 phút, loại bỏ dịch nôi Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy tinh,

150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút.Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có chứaDNA

2.3.5 Phương pháp tinh chế DNA

Do DNA của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùngDNA làm khuôn cho phản ứng PCR, tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNAGel extraction Kit Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô trùng Bôsung 150µl dung dịch Binding buffer có chứa Silica Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút

trong 1 phút Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh Rửa 3 lầnbằng Washing buffer Sau đó phơi khô trong box cấy rồi bô sung 15 µl nước cất vôtrùng dùng cho PCR Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút, DNA ở phần dịch nôi làDNA đã được tinh chế DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứngPCR.

2.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting

Từ các chủng thuần sau khi phân lập, se có nhiều cách khác nhau để phân loại

và định danh loài trong đó phương pháp truyền thống là dựa vào các khóa phân loạihình thái khuẩn lạc và tế bào, bên cạnh đó các nhà khoa học có thể áp dụng các kỹthuật sinh học phân tử để định danh loài một cách chính xác hơn như kỹ thuật PCR-Fingerprinting

Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting: phương pháp fingerprinting là phương

pháp dùng để phân nhóm loài dựa trên sự tương đồng các đoạn ADN vệ tinh ADN vệtinh là các đoạn ADN có trình tự lặp lại lớn, thường không mã hóa cho gen và ít bị độtbiến, thay đôi Do đó chúng thường được dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại Sửdụng các mồi được thiết kế theo trình tự của các ADN vệ tinh trong phản ứng PCR.Sau đó các đoạn ADN vệ tinh đã khuếch đại se được điện di để so sánh kích thước Sựtương đồng của các phô băng thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm mốc Phản ứngPCR finger printing được tiến hành với thành phần phản ứng như sau:

Tiến hành hút 20 µl master mix vào mỗi ống effendorf nhỏ, rồi bô sug 1 µl DNA,mix đều, spin down Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2trên máy, chương trình MST2.

Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 30 chu kì liêntiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52ºC trong 1 phút vàkéo dài ở 72ºC trong 10 phút

2.3.7 Phương pháp điện di

Sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung dịchđệm là 0,5x TAE Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được đun tan trong đệm TAEbằng lò vi sóng Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70ºC, đô gel vào phiến nhựa điện di(kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳngnằm ngang đã đặt sẵn lược Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gelvào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE Dùngmicropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel Với các gel sửdụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 µl mẫu cho mỗi giếng Điện di với hiệu điện thế 50-100V

2.3.8 Nhuộm gel và đoc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0,5 µg/mlpha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước để loại

bỏ Ethidium Bromide bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA được quan sátbằng máy soi gel InGenius của hãng Syngene

2.3.9 Phương pháp phân loại nấm dựa vào đoc trình tự rDNA

DNA sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằmkhuếch đại vùng ITS hoặc ITS-D1D2 với thành phần master mix như sau:

Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l

Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System

9700 (PE) Chu trình gia nhiệt như sau: Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫuđược nhân lên bởi 30 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 40giây, gắn mồi ở 50ºC trong 40 giây và kéo dài ở 72ºC trong 10 phút

Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằngethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel Sau đó sản phẩm PCR được đọctrình tự với 3 mồi ITS1, ITS4, NL4 Kết quả đọc trình tự được xử lý với các phần mềmBioedit

2.3.10 Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc

Cân 20 g gạo nếp với 20 g nước RO vào các bình tam giác 100 ml, ngâm trong

1 giờ rồi hấp thanh trùng ở 121 °C/15phút Làm nguội rồi bô sung 1 vòng tròn thạchgiống đường kính 1 cm Sau 2 ngày nuôi hiếu khí bô sung 40g hoặc 60 g đệm

CH3COONa 0.1M, PH 5 rồi lắc 150 rpm/1h/27°C để chiết enzyme amylase, ly tâmkhối dịch ở 5000 rpm/20 phút/4°C thu dịch trong rồi lại ly tâm 10000 rpm/10phút/4°C

Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS [23]

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốcthử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ở bước sóng 540

nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS se tínhđược hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Hòa tan và bô sung thêm:

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

- 200 µL D-glucose theo các nồng độ trên được cho vào eppendorf 1.5 mL

- Bô sung thêm 400 µL DNS, mix đều Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm

lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 40 µL dịch phản ứng + 180 µL nước cất, mix đều trong vi đĩa

- Đo OD 540nm Dựng được đường chuẩn y = ax

- Mẫu Blank: nước cất thay cho đường D-glucose và tiến hành tương tự mẫu thí nghiệm

Tiến hành phân tích mẫu enzyme.

Mẫu đối chứng thí nghiệm (kiểm tra lượng đường có sẵn trong enzyme và

ảnh hưởng của các phản ứng phụ khác)-ký hiệu C1:

Bô sung 0.3 ml enzyme với 0.1 ml NaOH 0.1M, gia nhiệt ở 100°C trong 10 phút (để

diệt enzyme), làm lạnh nhanh trong nước đá, cho bô sung 0.6 ml cơ chất vào các ống

đối chứng vortex đều Sau đó tiến hành các bước tiếp theo từ bước 4

Mẫu đối chứng cơ chất- không có enzyme (để kiểm tra cơ chất có đường

không)- ký hiệu C2

Cho 0.4 ml đệm vào 1 ống nghiệm có chứa 0.6 ml cơ chất, vortex đều Gia nhiệt ở50°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước đá Tiến hành các bước tiếp theo từbước 4

IU/ml = (�−��−��)∗�∗� �∗�.��∗�∗�

Trong đó: T: Độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm

C1: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 1C2: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 2D: hệ số pha loãng

V: tông thể tích mẫua: hệ số góc của đường chuẩn0.18: 180/1000 của đường D-glucose khant: thời gian phản ứng (phút)

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện

Để đảm bảo các chủng giống đều khỏe như nhau, tiến hành lấy giống từ các ốngbảo quản cát rắc lên đĩa Malt 2ºBx, sau 1 đến 2 ngày khi có các đĩa giống thuần, tiếnhành cấy chấm sinh khối mốc trên môi trường tinh bột 1%, thạch 1.8% trong 2 ngày ở

6 điều kiện nhiệt: 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C Sau 24 giờ, 48 giờ tiến hành

đo đường kính khuẩn lạc để so sánh sự phát triển của các nhóm chủng rồi chụp ảnh lại

2.3.12 Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường

Như chúng ta đã biết, vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột khi sống trongmôi trường có tinh bột thì chúng se kích hoạt gen, tông hợp enzyme amylase, enzymenày se thủy phân tinh bột thành đường dễ sử dụng để phục vụ sự sinh trưởng và pháttriển của loài đó Tuy nhiên, trong môi trường có cả tinh bột và đường thì liệu rằng cácnhóm nấm khác nhau có xu hướng sử dụng hết đường rồi mới sử dụng đến tinh bột haychúng vẫn sinh enzyme thủy phân tinh bột ngay cả khi môi trường có đường Để trả lờicâu hỏi đó, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm như sau:

Chọn ra các chủng đại diện mỗi nhóm để kiểm tra tính thủy phân tinh bột khitrong môi trường có sẵn glucose, ta tiến hành thí nghiệm như sau: thu sinh khối cácchủng mốc sau 2 ngày nuôi trên đĩa thạch Malt 2°Bx ở tủ 30°C, bô sung 0.7 mL NaCl0.9%, sau đó trộn đều với 25mL thạch Agar-agar Type I 1.5% chứa soluble starch0.5%, đô ra đĩa Petri, cắt miếng tròn d=1.3cm, thả vào mỗi bình dịch YM (đã phaloãng 10 lần có bô sung chloramphenicol 0.1%) với nồng độ đường glucose khác nhaurồi nuôi lắc ở 30°C, 150 rpm (Thành phần môi trường YM gốc không có glusose vàcao malt: cao nấm men 3g/L; peptone 5g/L.)

2.3.13 Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chon loc

Từ các thí nghiệm trên, tiến hành chọn nhóm chủng nấm mốc Rhizopus oryzae

có hoạt lực enzyme amyase cao, có khả năng thủy phân tinh bột khi trong môi trườngđường, và nhóm chủng này được cho là an toàn trong thực phẩm để thử nghiệm lên

men rượu kết hợp với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc giả men

Saccharomycopsis fibuligera

Sử dụng 3 chủng nấm mốc thuần có hoạt lực enzyme amylase cao, 1 chủng nấmmen có khả năng lên men rượu tốt, và 1 chủng giả nấm men của Viện Công nghiệpThực phẩm:

- Chủng nấm mốc: Rhizopus oryzae BMM 111, Rhizopus arrhizus (Rhizopus

oryzae) BMM131, Rhizopus arrhizus (Rhizopus oryzae) BMM1015 Đĩa giống mốc

thu sinh khối sau 2 ngày cấy trên đĩa malt 2°Bx

- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae BMQ 467 (nồng độ 107 tế bào)

- Chủng giả nấm men Saccharomycopsis fibuligera BMQ908 (nồng độ 107bào tử) Nuôi tăng sinh trong các bình tam giác 100 ml, dịch malt 4°Bx sau 24hnuôi lắc

Chuẩn bị cơm gạo để lên men rượu như sau: Cân 250 g gạo với 250 g nước RO(ngâm 2h) vào mỗi bình tam giác 1000 ml Hấp ở 121°C/15 phút, sau đó để nguội, bôsung giống mỗi loại như bảng 2.1 Sau đó lên men ẩm trong 3 ngày, bô sung 500 mlnước để lên men rượu 7 ngày Sau 10 ngày thu dịch đem đo độ cồn và chưng cất.

Lượng giống đươc bô sung như sau:

- Nấm mốc: bô sung 1 vòng tròn thạch đường kính d= 1.3 cm

- Nấm men: bô sung 2 ml dịch sinh khối (107 tế bào)

- Giả nấm men: bô sung 200 µl dịch

Bảng 2 1 Thành phần giống ở mỗi mẫu lên men

LAB 1 Rhizopus oryzae BMM 111

LAB 5

Rhizopus oryzae BMM 131 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

LAB 6

Rhizopus oryzae BMM 1015 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Ký hiệu: d là đường kính (cm)

2.3.14 Đo độ cồn bằng sôi kế

Đo độ cồn, ta sử dụng sôi kế ebulliometer Cách đo như sau:

 Để đo điểm sôi của nước:

- Bước 1: Rửa sạch buồng sôi cẩn thận bằng nước sạch.

- Bước 3: Lắp nhiệt kế rồi đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị

- Bước 4: Khi nước sôi, quan sát nhiệt kế, khi mức thủy ngân ôn định (> 30 giây) ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể Nhiệt độ này là T1

- Bước 5: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước

- Bước 1: Rửa sạch khoang sôi với rượu

- Bước 2: Đo 50mL rượu và đô vào buồng sôi

- Bước 3: Lắp nhiệt kế

- Bước 4: Đô đầy khoang ngưng bằng nước lạnh

- Bước 5: Đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị

- Bước 6: Khi rượu sôi, quan sát nhiệt kế Khi mức thủy ngân ôn định (15-30 giây) ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể Nhiệt độ này là T2

- Bước 7: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước

1 Tính giá trị T = T1 - T2

2 Xác định nồng độ cồn từ bảng hiển thị đi kèm

2.3.15 Phân tích phô hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phô GCMS.

Thông số chạy máy [21].

Việc đánh giá các hợp chất bay hơi trong sản phẩm lên men được thực hiện sửdụng phương pháp vi tách chiết pha rắn kết hợp với sắc kí khí kết nối khối phô(GCMS)

Các mẫu được phân tích bởi GC/MS sử dụng sắc kí khí SCION 456-GC và khốiphô SQ

- Cột: mao quản Rt-Wax, dài 30m, 0.25 mm film thickness

- Khí mang: Heli với độ tinh khiết cao

- Vận tốc khí mang: 42 cm s-1

- Tốc độ dòng là 1.2 ml/min

- Nhiệt độ lò: bắt đầu là 35 ºC giữ trong 2 phút, sau đó tăng 5 ºC/1 phút lên 155 ºC

và giữ 0 phút Tiếp theo tăng 20ºC/1 phút lên 200 ºC và giữ trong 10 phút

- Sợi fiber SPME được đưa vào trong liner và giữ trong 20 phút, sử dụng chế độchia dòng như sau: trong 1 phút đầu là không chia dòng, từ phút 1.01 thì chiadòng 1:10 Đối với MS, nhiệt độ nguồn ion và nhiệt độ transfer line là 230 ºC.Chế độ electron impact mode là 70 eV

Sử dụng 32 mẫu rượu chưng cất bao gồm 26 mẫu thu thập (ký hiệu COM) và 6mẫu của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp (LAB1-LAB6) để phân tích Điều kiện xử

lý mẫu trước khi cho vào injector như sau: Đo cồn kế các mẫu rượu chưng cất rồi phaloãng về độ cồn 12 % (v/v) bằng nước deion, hút 5 ml vào các ống 20 ml chứa 1.5 gNaCl Bô sung 5µl chất nội chuẩn là 2-pentanol,4-methyl với nồng độ 5ppm, sử dụngkhuấy từ trong lúc gia nhiệt mẫu lên 60ºC, giữ sợi hấp phụ fiber The SupelcoCarbowax/divinylbenzene (CW/DVB) 65 mm trong 30 phút rồi đưa vào máy

Việc bán định lượng các chất bay hơi được thực hiện bằng cách sử dụng pentanol,4-methyl là chất nội chuẩn Cách tính bán định lượng của những chất bay hơiđó được tính theo công thức sau [29]

2-C (µg/L) = �� x Cis (µg/L)

is

�

Trong đó: C: nồng độ tương đối của chất phân tích

Cis: nồng độ chất chuẩn nội trong mẫu rượuAc: diện tích chất phân tích

Ais: diện tích của chất nội chuẩn

Phô phô của các hợp chất chưa biết được so sánh với các hợp chất trong thưviện phô Phân tích mỗi mẫu được lặp lại 2 lần, rồi phân nhóm mẫu theo thứ bậc bằngphần mềm ORANGE

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men

Để nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột, bước đầu tiên các chủng nấm mốcđược phân lập từ 15 mẫu bánh men thì kết quả là hầu hết các chủng nấm mốc đềuthuộc họ Mucoraceae

Bằng việc phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc, làm sạch các chủng vi nấmkhác nhau từ 15 mẫu bánh men được thu thập từ các tỉnh Ninh Bình, Tuyên Quang,Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc Giang, có 73 chủng nấm mốc,

16 chủng nấm men và 12 chủng giả nấm men Thông tin chi tiết chủng được ghi rõtrong phụ lục

Tông số chủng được phân lập từ 15 mẫu bánh men là 101, trong đó chủ yếu lànấm mốc chiếm 73 chủng, nấm men 16 chủng và giả men chỉ có 12 chủng Nấm mốcxuất hiện ở tất cả các bánh men, từ 2 đến 8 chủng trên một bánh Tuy nhiên, các chủngnấm men phân lập được chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ4, MQ7, MQ8,MQ9, MQ11, MQ12, MQ13 mà không phân lập được ở bánh men MQ1, MQ5, MQ6,MQ10, MQ14, MQ15 Đối với các chủng giả men cũng vậy, chỉ xuất hiện ở bánh menMQ2, MQ3, MQ7, MQ8, MQ9, MQ12, MQ13, MQ14 mà không có ở bánh men MQ1,MQ4, MQ5, MQ6, MQ10, MQ11, MQ15

3.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào.

Sau khi phân lập, các chủng cần được xếp nhóm trong đó phân nhóm hình tháikhuẩn lạc và tế bào là một bước rất quan trọng Các chủng được cấy trên đĩa Petri Malt2ºBx, sau 2 ngày nuôi trong tủ 30ºC se được xếp nhóm sơ bộ bằng hình thái khuẩn lạcdựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là: hình dạng, kích thước, màu sắc Sau đó,tiếp tục làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi Dưới đây là hình tháikhuẩn lạc mặt trước, mặt sau và hình thái tế bào (thứ tự từ trái sang phải) của cácchủng vi nấm đại diện các nhóm

Nhóm 1 (18 chủng): Rhizopus microsporus MQF 4.2

Nhóm 2(8 chủng): Rhizopus microsporus MQF 1.2

Nhóm 3 (3 chủng): Mucor indicus MQF 12.1

Nhóm 4 (5 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.4

Nhóm 5 (7 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.5

Nhóm 6 (4 chủng): Rhizopus oryzae MQF 1.3

Nhóm 7 (12 chủng): Rhizopus oryzae MQF 10.5

Nhóm 8 (3 chủng): Lichtheimia ramosa MQF 9.4

Nhóm 10(4 chủng): Mucor circinelloides MQF 2.2

Nhóm 11 (5 chủng): Mucor indicus MQF 8.4

Nhóm 12 (2 chủng): Mucor indicus MQF 10.2

Nhóm 13 (2 chủng): Cunninghamella echinulata MQF 8.6

Nhóm nấm men

Nhóm 1(14 chủng): Saccharomyces cerevisiae MQY 4.1

Nhóm 2 (2 chủng): Wickerhamomyces anomalus MQY 11.3

Nhóm giả men

Có 12 chủng Saccharomycopsis fibuligera MQS 14.1

Hình 3 1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện Nấm mốc:

Nhóm 1 (18 chủng): Nhóm này có hình thái khuẩn lạc màu xám ghi, hệ sợi pháttriển nhanh, túi bào tử màu đen Dễ thấy, nhóm khuẩn lạc này rất phô biến, chúng xuấthiện ở hầu hết các bánh men từ MQ4 đến MQ15

Nhóm 2 (8 chủng): Nhóm này đặc trưng bởi hình thái khuẩn lạc màu đen, hệ sợibò lan, ít hoặc không có hệ sợi khí, bào tử đen to Khi quan sát tiêu bản có rễ Nhómnày cũng khá phô biến, chúng xuất hiện ở 7 bánh men MQ 1,4,5,6,10,11,14