Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích auramin o trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ

dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứuphương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên,hiện nay vẫn chưa có báo cáo nghi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HỌC

Hà Nội - Năm2018

LỜI CAMĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi.Các số liệu vàkết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳcông trình nào trước đó

Lê Thị Nhƣ Thủy

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tạ Thị Thảo, chủ nhiệm Bộmôn Hóa Phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu

và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại họcv à cácthầy,côgiáoKhoaHóa-TrườngĐạihọcKhoahọctựnhiênHàNộiđãtân

tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập vàthực hiện đề tài thuận lợi.

Xintrântron gcảmơn Ban lãnhđ ạ o c ô n g t y , P h ụ t r á c h q u ả n l ý

P h ò n g T h ử Nghiệm1-

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

ĐẶTVẤNĐỀ 1

1 CHƯƠNG 1:T Ổ N G Q U A N 3

1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại ViệtNam .31.2 Tổng quan về Auramin O 4

1.3 Các phương phápxácđịnh 6

1.3.1 Phương phápquangphổ 6

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năngcao(HPLC) 7

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hailần(LC-MS/MS) 9

1.4 Phương pháp tách Auramin O ra khỏinềnmẫu 14

1.4.1 Lựa chọn dung môichiếtlỏng-lỏng 14

1.4.2 Chiếtpharắn 15

1.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phương pháp mặt mục tiêutâmxoay 15 2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 18

2.1 Đối tượng và mục tiêunghiêncứu 18

2.1.1 Đối tượngnghiêncứu 18

2.1.2 Nội dungnghiêncứu 18

2.2 Hóa chất, dụng cụ vàthiếtbị 18

2.2.1 Hóachất 18

2.2.2 Thiếtbị 19

2.3 Phương phápnghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháplấymẫu 20

2.3.2 Phương pháp phântích mẫu 20

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm và xử lýkếtquả 22

3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN 23

3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên hệthống UPLC-MS/MS 23

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khốiphổMS/MS 23

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên hệthốngUPLC 25

3.2 Khảo sát giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và khoảng tuyến tính xác định sự phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chấtphântích 31

3.2.1 Giới hạn phát hiệnthiếtbị 31

3.2.2 Khoảngtuyếntính 32

3.3 Tối ưu hóa phương pháp chiết Auramin O ra khỏinền mẫu 33

3.3.1 Khảo sát đơn biến để chọn các thông số ảnh hưởng và khoảng biếnthiên 33 3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu vớipp mặt mục tiêu tâm xoay (RSM) 36 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng củaphương pháp 45

3.4.1 Tính đặchiệu/chọn lọc 45

3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn địnhlượng(LOQ) 47

3.4.3 Xây dựngđường chuẩn 48

3.4.4 Độ chính xác của phương phápphântích 52

3.4.5 Ước lượng độ không đảmbảođo 55

3.5 Phân tích mẫuthựctế 57

KẾT LUẬN VÀĐỀ XUẤT 60

TÀI LIỆUTHAMKHẢO 62

PHỤLỤC 69

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn Ion hóaESI+ 23

Bảng 3.2 Điều kiện tối ưu hóatrênMS/MS 24

Bảng 3.3 Chương trình đẳng dòngphađộng 26

Bảng 3.4 Chương trình gradientphađộng 27

Bảng 3.5 Diện tích pic khi thay đổi tốcđộdòng 29

Bảng 3.6 Kết quả tiêm lặp lại 6 lẫn mẫu chuẩn tại nồng độ0,02µg/kg 31

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ba loại dungmôi chiết 33

Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi khảo sát trên cột chiếtpharắn 35

Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi ở các tỉ lệ dung môi rửa giảikhácnhau 36

Bảng 3.10 Khoảng biến thiên của các yếu tố cầnkhảosát 37

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm tiến hành theo mô hình bậc 2tâmxoay 38

Bảng 3.12 Bảng hệ số thực của phương trìnhhồiquy 39

Bảng 3.13 Phân tích phương sai của hiệu suất thuhồiAO 40

Bảng 3.14 Sai số giữa kết quả thực nghiệm với kết quả tính từmôhình 40

Bảng 3.15 Kết quả phân tích 6 lần lặp lại tại điều kiệntối ưu 43

Bảng 3.16 Ion mẹ và 2 ion concủaAO 47

Bảng 3.17 Tỉ lệ S/N phân tích 6 lần lặp lại tại nồng độ10µg/kg 47

Bảng 3.18 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độAuraminO 48

Bảng 3.19 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồngđộAO 50

Bảng 3.20 Kết quả phê duyệt độchínhxác 53

Bảng 3.21 Bảng tính kết quả độ không đảm bảo đo củaphươngpháp 57

Bảng 3.22 Kết quả phân tích mẫuthựctế 58

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình hệthốngLC-MS/MS 10

Hình 1.2.T ứ cực 11

Hình 3.1 Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóatrênMS/MS 24

Hình 3.2 Cơ chế phân mảnh phổ khốicủaAO 25

Hình 3.3 Sắc đồ chương trình đẳng dòng pha động 1và2 26

Hình 3.4 Sắc đồ các chương trình 3,4,5chạygradient 28

Hình 3.5 Sắc đồ tại tốc độ dòng0,1 ml/phút 29

Hình 3.6 Sắc đồ tại tốc độ dòng0,2 ml/phút 30

Hình 3.7 Sắc đồ tại tốc độ dòng0,3 ml/phút 30

Hình 3.8 Sắc đồ tại nồng độ0,02µg/kg 32

Hình 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độAuraminO 32

Hình 3.10 Công thức cấu tạo của chất tạo hạt nhồi trongcộtHLB 35

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mặt mục tiêu phụ thuộc thuộc tỉ lệ dung môi chiết và khối lượng mẫu và thể tíchrửagiải 42

Hình 3.12 Các đường đồng mức biểu diễn hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc tỉ lệ dung môi chiết trên khối lượng mẫu và thể tíchrửagiải 42

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu trắngthêmchuẩn 46

Hình 3.14 Sắc đồ tại nồng độ10µg/kg 48

Hình 3.15 Đường chuẩn AO trong dungmôi MeOH 49

Hình 3.16 Đường chuẩn Auramin O trongnền mẫu 51

Hình 3.17 Đường chuẩn AO trên nền mẫu và dungmôiMeOH 51

Hình 3.18 Sắc đồ không phát hiện pic của các mẫu phân tíchthựctế 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Communities

Hiệp hội các cộng đồng phân

tích chính thức

APCI Atmospheric pressure chemical

ionization

Chế độ ion hóa hóa học ở áp

suất khí quyển

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịchliên kết với enzymeESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tửHLB Hydrophilic – lipophilic Balance Cân bằng ưa nước-ưa dầuIARC International Agency for

Reasearch on Cancer

Cơ quan nghiên cứu Ung thư

quốc tếIDL Instrumental detection limit Giới hạn phát hiện của thiết bị

MRM Multiple Reaction Monitoring Kiểm soát đa phản ứngLC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2

lần

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đốiSCX Strong Cation Exchange Nhựa trao đổi cation mạnh

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Siêu sắc ký lỏng hiệu năng caoWAX Weak Anion Exchange Nhựa trao đổi anion axit yếu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi (TĂCN)tại Việt Nam có xu hướng tăng tuy nhiên vẫn không đáp ứng được nhu cầu trongnước Cùng với việc phát triển mạnh mẽ về quy mô, sản lượng, chủng loại thì chấtlượng của sản phẩm cũng còn khá nhiều bất cập như công bố chất lượng khôngđúngtrên bao bì, nguyên liệu không đạt chuẩn, tỷ lệ các chất phụ gia quá cao, lạmdụng kháng sinh, chất cấm nhằm mục đích tạo nạc, đặc biệt việc sử dụng chất tạomàu công nghiệp trong TĂCNđang gây bức xúc dư luận, được người tiêu dùng, các

cơ quan quản lý, phương tiện thông tin đại chúng rất quan tâm

Những năm gần đây, cục cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường đãphát hiện hàng trăm tấn thức ăn chăn nuôi tại các cơ sở sản xuất ở Việt Nam đã sửdụng chất tạo màu công nghiệp, chủ yếu là Auramin O (AO), để tạo màu vàng chothức ăn chăn nuôi Auramin O là chất tạo màu công nghiệp, căn cứ vào cấu tạo hóahọc, tính chất vật lý hóa học và độc tính của AO, Viện Ung thư quốc gia NCI Hoa

Kỳ, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế IRAC của Tổ chức Y tế thế giới WHOxếp các thuốc nhuộm vat yellow trong đó có AO thuộc nhóm 3 các chất gây ungthư[52].Ngoài ra còn nhiều thí nghiệm trên chuột cho thấy chất AO còn gây hại các

tế bào gan, thận và tủy xương [18].Vì vậy khi vật nuôi ăn phải thức ăn có chứa AO

sẽ gây tổn hại trực tiếp đến sức khỏe gia súc, gia cầm Tồn dư của loại hóa chất nàytrong thực phẩm sẽ dẫn đến nguy cơ gây ung thư cho con người

Hầu hết các nhà nghiên cứu đều chú ý nhiều hơn đến việc xác định hàmlượng thuốc nhuộm trong thực phẩm vì mối liên hệ trực tiếp đối với sức khoẻ conngười Tuy nhiên, như chúng ta đã biết, có rất nhiều chất tạo màu độc hại đượcthêm vào thức ăn cho động vật, những chất này sẽ chuyển hoá và tồn dư trong cơthể vật nuôi và chính những vật nuôi này lại là nguồnthựcphẩm cho con người Vìvậy việc phát hiện sớm các chất độc hại này trong TĂCN là để ngăn ngừa chúngbước vào chuỗi thức ăn của con người, đồng thời tăng chất lượng vật nuôi, đảm bảomột nguồn thực phẩm sạch cung cấp trong nước và xuất khẩu nước ngoài.Ở nước

ta, kể từ khi các cơ quan chức năng phát hiện AO được các cơ sở sản xuất TĂCNsử

dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứuphương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên,hiện nay vẫn chưa có báo cáo nghiên cứu chính thức nào về việc đánh giá các yếu tốảnh hưởng và tối ưu hóa phương pháp xác định Auramin O bằng LC-MS/MS Từnhững yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đềtài:

“Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích Auramin O trong thức

ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)”

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật

phân tích hiện đại sắc ký lỏng khối phổi 2 lần (LC-MS/MS) để phân tích nhằm đưa

ra những kết quả đáng tin cậy Việc sử dụng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay

để tối ưu hóa các điều kiện phân tích giúp tránh lãng phí thời gian phân tích, hóachất sử dụng nhưng vẫn đạt được hệ số thu hồi cao nhất Quy trình phân tích đãđược ứng dụng để xác định AO trong mẫu thực tế tại phòng thínghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại ViệtNam

Thức ăn chăn nuôi là những sản phẩm mà vật nuôi ăn, uống ở dạng tươisống hoặc đã qua chế biến, bảo quản, bao gồm: nguyên liệu TĂCN hay thức ăn đơn,thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh, thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung, phụ gia TĂCN,premix, hoạt chất và chất mang [8]

Thức ăn chăn nuôi hoàn chỉnh là hỗn hợp của nhiều nguyên liệu thức ănđược phối chế theo công thức nhất định đảm bảo có đủ các chất dinh dưỡng để duytrì đời sống và khả năng sản xuất vật nuôi theo từng giai đoạn sinh trưởng của chu

kỳ sản xuất mà không cần thêm bất kỳ loại thức ăn nào khác ngoài nước uống [8]

Chất lượng của thực phẩm thường được đánh giá thông qua màu sắc của nó.Tạo màu trong thực phẩm nói chung, hay tạo màu trong TĂCN nói riêng đều nhằmmục đích: phục hồi lại màu sắc cho sản phẩm do những biến đổi trong tự nhiên, bảoquản, chế biến, đóng gói, phân phối…; làm tăng độ đồng nhất cho sản phẩm; giúpduy trì những tính chất đặc chung của sản phẩm; tăng cường màu sắc, làm tăng tínhhấp dẫn của sản phẩm Việc sử dụng phụ gia tạo màu có những yêu cầu bắt buộcnhư: không dùng để che đậy khuyết điểm của thực phẩm, không độc tính, chất màu

sử dụng là những chất không gây ung thư, những sản phẩm chuyển hóa của nhữngchất màu trong quá trình chế biến và bảo quản không gây độc hại… [42]

Thức ăn chăn nuôi được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhaunhư: cám gạo, khoai lang, ngô, đỗ tương, bột thịt xương, bột đầu tôm…tùy thuộcvào mỗi nguồn nguyên liệu, các cơ sở sản xuất sẽ tạo cho sản phẩm có màu đặctrưng theo từng nguyên liệu bằng cách trộn với các chất phẩm màu tự nhiên hoặctổng hợp Tuy nhiên, nhằm tính toán đến lợi nhuận, một số cơ sở sản xuất đã không

sử dụng những phụ gia tạo màu được phép [3] như vàng curcumin, vàng Riboflavin,tartrazin, sunset FCF với hàm lượng được phép mà sử dụng chất tạo màu côngnghiệp, rẻ tiền và vô cùng độc hại như AO.Điều đáng lo ngại, dù trên thùng sảnphẩm hóa chất công nghiệp đều khuyến cáo chỉ sử dụng trong công nghiệp khôngsửdụngtrongTĂCNvàthựcphẩmnhưngcáccôngtysảnxuấtTĂCNvẫncốtình

mua và sử dụng sai mục đích nhằm trục lợi Chính điều này đã gây hoang man vàbức xúc trong toàn xã hội.

Để chấn chỉnh tình trạng sử dụng chất cấm trong chăn nuôi, Bộ NôngNghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành thông tư số 42 về danh mục bổ sunghóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong TĂCNgia súc, gia cầm tại Việt Nam[1].Theo đó, bổ sung 5 loại Vàng Ô (vat yellow) vàodanh mục này gồm: vat yellow 1, vat yellow 2, vat yellow 3, vat yellow 4, Auramin

và các dẫn xuất của Auramin hay còn được gọi là màu vàng cơ bản 2, sử dụng trongcông nghệ dệt nhuộm Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất lén sửdụng AO để tạo màu vàng cho thức ăn gia súc gia cầm vì vậy việc định lượng chínhxác hàm lượng chất này trong TĂCN là vấn đề cần được quan tâm trong công táckiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời cũng rất cần thiết về mặt quản lý để đánhgiá tình hình mức độ sử dụng AO trong chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệsinh an toàn thực phẩm nếu có,nhằm kiểm soát việc sử dụng chất cấm cũng nhưđảm bảo cung cấp một nguồn thực phẩm sạch trong nội địa và xuấtkhẩu

1.2 Tổng quan về AuraminO

Auramine O thuộc nhóm thuốc nhuộm Diphenylmethane, trong nhóm này

có hai loại thuốc nhuộm quan trọng có tính thương mại là Auramin O và Auramine

G Ở dạng tinh khiết, tinh thể Auramin có màu vàng, tan tốt trong nước và ethanol [24], [33]

Công thức cấu tạo của Auramin O [44]:

Công thức phân tử: C17H21N3.HCl

Tên đầy đủ của AO:

4,4’-Carbonimidoylbis[N,N-dimethylbenzenamine]hydrochloridTên thương mại: Auramin O,

Vàng Ô, basic yellow 2

Auramin và muối của nó có thể được tạo ra bằng cách nung nóngđimethylaminođiphenyl với hỗn hợp urê, axit sufamic, và sulfur trong amoni tại

175oC Muối của Auramin được tạo thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếptrong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển đổi thành Auramin cơ bản hay Auramin

Auramin được dùng trong công nghiệp nhuộm sợi như lụa và sợi bông;ngoài ra còn để nhuộm da, giấy.Nó cũng được sử dụng trong việc in ấn, tạo màutrong các loại mực.Ngoài ra, AO còn được áp dụng trong các nghiên cứu về y tếnhư sử dụng AOnhư một chất huỳnh quang để phát hiện nhiễm trùng vi khuẩn laokhông điển hình (ví dụ như Mycobacterium) trong mô tế bào[29], [39] hoặc nóđược kết hợp với Rhodamine B tạo thành chất auramine-rhodamine được sử dụngnhư chất khử trùng[45].Ngoài ra các thuốc nhuộm huỳnh quang như Rhodamine và

AO còn được áp dụng trong nghiên cứu hóa học, sinh học, y tế[19,[45]

Thuốc nhuộm tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệpcũng như thực phẩm vì so với hầu hết các thuốc nhuộm tự nhiên, chúng có độ ổnđịnh cao hơn và giảm được chi phí sản xuất.Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của một sốthuốc nhuộm tổng hợp có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người.Vì những lý

do này, việc sử dụng các thuốc nhuộm tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm hiệnnay bị cấm ở Châu Âu và nhiều nước trên thế giới.Quy định EC số 1333/2008 phụlục II đưa ra danh sách các phụ gia thực phẩm của Liên minh Châu Âu để sử dụngtrong thực phẩm và các điều kiện của chúng, bao gồm một danh sách các chất tạomàu cho phép và AO không nằm trong danh sách[20].Tại Việt Nam, cấm nhập

khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong chế biến TĂCN các loại chất tạo màucông nghiệp trong đó có AO.

Theo quyết định số 846/QĐ-CN-TĂCN ngày 17/112015 của Cục trưởngCục chăn nuôi về việc mở rộng phạm vi chỉ định phòng thử nghiệm thức ăn chănnuôi gia súc, gia cầm thì giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích AO phải đạtđược 1 mg/kg [2]

1.3 Các phương pháp xácđịnh

Các nghiên cứu phân tích về Auramin bắt đầu vào những năm 1970 và tiếp tụcđến năm 1980, các phương pháp chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng và sắc ký bản mỏng

để xác định Auramin trong mô tôm và thuốc nhuộm sinh học[38],[54]

Hiện nay, các công trình nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khácnhauđểxác định các nhóm thuốc nhuộm trên nhiều nền mẫu thực phẩm và thức ănchăn nuôi trong đó phải kể đến một số phương pháp như phương phápđiện hóa,phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA [57],tuy nhiên, hiện nayphương pháp phổ biến để xác định AO, đặc biệt để ứng dụng phân tích tại phòng thínghiệm là quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năngcao

1.3.1 Phương pháp quangphổ

Cơ sở của phương pháp quang phổ là dựa trên bức xạ điện từ được phát rahay hấp thụ từ mẫu phân tích, từ các cường độ phát xạ hay hấp thụ này có thể địnhtính hoặc định lượng thành phần có trong mẫu

Nhóm nghiên cứu người Nhật, Jingjing Yan và cộng sự [27] đã nghiên cứuphương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang trong thuốcthảo mộc dựa trên sự tương tác gắn kết với Albumine huyết thanh bò (BSA).Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ chế là tắt huỳnh quang Khi ở trong môitrường đệm axit acetic pH 7 AO có khả năng làm tắt huỳnh quang của BSA (do sự

va chạm giữa các phân tử, không biến đổi về mặt hóa học, quá trình tỏa nhiệt).Nghiên cứu cho thấy, tại bước sóng 339 nm, độ nhạy cũng như cường độ huỳnhquang của BSA giảm mạnh khi tăng dần nồng độ AO từ 0- 5.10-5mol/l, màu sắc củadung dịch chuyển đổi rõ rệt từ màu vàng sang màu vàng đậm có nghĩa có thể sử

dụng BSA để định lượng AO Phương pháp bị ảnh hưởng của 3 yếu tố là pH, nồng

độ BSA và thời gian phản ứng Khoảng tuyến tính của phương pháp khoảng từ 0,16đến 50 µmol/l và giới hạn phát hiện 0,05 µmol/l Nghiên cứu đã xác nhận phươngpháp trên một số nền mẫu thuốc với hiệu suất thu hồi cao từ 96-101 % và độ lệchchuẩn tương đối từ 0,15-2,6%

Năm 2017, Hou ZHANG, Zhi LI [25] cùng các cộng sự đã nghiên cứuthành công phương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ tetrahertztrong thuốc thảo dược Mẫu được nghiền thành dạng bột, sau đó ép thành viên trònbằng máy ép thủy lực dưới áp suất 12 MPa Độ dày của viên chỉkhoảng 1,50 mm.Mẫu được phân tích trên máy đo phổ miền thời gian tetrahezt (THz-TDs) Phổ hấpthụ AO được đo trong khoảng 0,2-1,6 THz sau đó chuyển đổi phổ miền thời gianthành phổ tần số bằng phương pháp chuyển đổi nhanh Fouier Kết quả cho thấy, AOhấp thụ tại 0,43 THz; 1,21 THz; 1,32 THz, có thể sử dụng các tín hiệu hấp thụnàyđểphân tích định lượng AO Phương pháp được đánh giá là nhanh chóng, đơn giản,chính xác để định lượng AO trong dược thảo Phương pháp có ưu điểm là tiết kiệm

và thân thiện với môi trường vì không sử dụng thuốc thử, không có dư lượng hóahọc trong quá trình thí nghiệm

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và phađộng là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động

và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất líhoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và phađộng khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏinhau[4]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong việc xácđịnh hàm lượng các chất tạo màu bị cấm với độ tin cậy cao

Một nhóm tác giả người Anh, đã nghiên cứu xác định 19 loại thuốc nhuộmtrong đó có AO trong các nền mẫu thực phẩm như bột ớt, thì là; cá, thịt gà đóng hộp

bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV[30].Tác giả đã sử dụng hỗn hợp dungmôi axetonitril: axeton tỉ lệ thể tích 90:10 để chiết chất cần phân tích ra khỏi nềnmẫu ở nhiệt độ 40oC Dịch chiết được lọc và định lượng AO trên hệ thống HPLC-

UV tại bước sóng 436 nm Khoảng tuyến tính từ 1-20 mg/l, hiệu suất thu hồi đối với

AO trong khoảng từ 73-103 % và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt tại các nồng độ 5mg/l; 10 mg/l; 20 mg/l là 4,1%; 1,4 %; 1,9 % tươngứng

Tác giả Tan Enling, Xiao Jian [46] cũng đã phát triển phương pháp xác địnhđồng thồi ba chất Orange II cơ bản, Axit Orange II và AuraminO trong các sảnphẩm làm từ đậu bằng HPLC-UV Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng, độđúng và độ chụm cao Giới hạn phát hiện của Auramin O đạt 0,05mg/kg

Tại Nhật Bản, việc kiểm soát hàm lượng các chất cấm tạo màu trong thựcphẩm chế biến là vấn đề rất được quan tâm Tác giả người Nhật Chiye Tatebe vàcộng sự[17] đã phát triển một phương pháp nhanh và đơn giản để xác định đồngthời3 chất Rhodamine B, Auramin O và pararosanilin bằng HPLC-PDA trong nhiềunền mẫu khác nhau như: cà ri, sốt ớt, bột tôm, sốt gà, súp bột.Nghiên cứu đã tối ưuhóa các điều kiện trên HPLC với cột pha tĩnh là octadecylsilan ODS (4,6x150mm, 5µm), nhiệt độ cột là 40oC Pha động gồm hai kênh A là amoni acetate 20 mMpH=4,5 và kênh B là axetonitril, gradient pha đông pH của dung dịch pha độngđược đánh giá là yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp, qua khảo sát tại

ba giá trị pH khác nhau: 3,5; 4,5; 6,5 kết quả cho thấy tại pH 4,5 thì cả ba chất phântích đều có độ nhạy cao nhất

Nhóm tác giả Yang Shuang, Yu ZiXuan, Wang YongFang, Ge BaoKun [56]

đã định lượng Chrysoidin II và Auramin O trong nền mẫu đậu khô bằng phươngpháp HPLC-PDA Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đốivới Auramin là 0,02 mg/kg và 0,05 mg/kg Hiệu suất thu hồi trong khoảng nồng độkhảo sát 0,05; 2,0 và 10 mg/kg đạt từ 95-103,1 % Độ lệch chuẩn phương pháp dưới

5 % Phương pháp được đánh giá là đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp phù hợp đểứng dụng phân tích trong phòng thửnghiệm

Auramin O đã được phát hiện trong mẫu thuốc làm từ vỏ cây Hoàng Bá (loạicây được sử dụng làm thuốc đông y chữa bệnh) bằng phương pháp HPLC-DAD.Nhóm tác giả LI Yun cùng cộng sự [35] đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên

hệ thống sắc ký bằng phương pháp sàng lọc nhanh Cột pha tĩnh ZORBAX SB-C18(4,6 mmx250 mm, 5µm) đã được sử dụng để tách AO, nhiệt độ cột là 30oC Phađộng gồm hỗn hợp dung dịch axetonitril và KH2PO4 0,025M pH=3 tỉ lệ 35:65 Tốc

độ dòng là 1,0 ml/phút AO được phát hiện tại bước sóng 432 nm Nghiên cứu đãphân tích 30 mẫu thuốc, kết quả cho thấy có 6 mẫu dương tính với Auramin O Cáckết quả được xác nhận lại bằng phương pháp HPLC-MS/MS, đánh giá kết quả làphùhợp

1.3.3 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ hai lần(LC-MS/MS)

Sắc ký lỏng khối phổ là một phương pháp phân tích công cụ kỹ thuật hiệnđại với những tính năng vượt trội được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực nhưdược phẩm, môi trường, đặc biệt là xác định hàm lượng chất cấm trong thực phẩmdành cho người và động vật

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử củacác hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (M/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tíchcủa chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ

số M/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tửcủa hợp chất [4]

Cấu trúc của hệ thống LC-MShình 1.1

Hình 1.1 Mô hình hệ thống LC-MS/MS

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phậnphân tích khối phổ và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu được ion hóa trongnguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số M/z.Tiếp tục các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyểnthành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

Bộ phân tích tứ cực dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽdao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môitrường di chuyển của nó

Bộ tứ cực gồm 4 thanh cực ghép song song nối với nhau từng đôi một đốidiện nhau, tạo thành hai cặp, sau đó chúng nối với điện áp một chiều tạo thành 2 cặpdương và âm Ngoài điện áp một chiều, hai cặp điện cực còn được nối với điện ápxoay chiều Tổ hợp điện áp này đặc biệt là điện áp xoay chiều sẽ thay đổi theo chu

kỳ để quét khối lượng các ion

Hình 1.2 Tứ cực

Một số ion có tỷ số M/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác định cóthể đi thẳng qua khoảng không đến detector Trong khi đó các ion khác không sẽ cóquỹ đạo không ổn định va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó Tuy nhiên để thuđược tất cả các ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến một điện áp nhất địnhtăng dần sau đó lại trở lại zero, lần lượt các ion sẽ vượt qua được tứ cực cũng cókhối lượng từ nhỏ đến lớn để đến detector

Kỹthuật MS một lần có một số nhược điểm như: không nghiên cứu được cơchế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoáhọc, chịu ảnh hưởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nênkhối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử…

Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăngthêm độ nhạy, tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu

Máy khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ khốiphổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng vachạm (collision cell).Bộ tứ cực thứ nhất (tứ cực Q1), có nhiệm vụ tách các ion Lựachọn ion mẹ với M/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến buồng va chạm Tại buồng

va chạm, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ cómặt như khí N2, Ar, He,ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tạo ra các ion con(daughter ions).Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tứ cực Q3.Bộ tứ cực

thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ buồng va chạm để đi tới detector

và chuyển thành tín hiệu

 Bộ phận pháthiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phầncuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khốiphổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã đượckhuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận pháthiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Ưu điểm chung của phương pháp là có độ nhạy cao, đặc biệt phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ có độ nhạy đạt đến mức µg/kg , độ chọn lọc tốt, thời gian phântích nhanh, tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bịcao

Ở Trung Quốc, chất tạo màu trong thực phẩm cũng rất được quan tâm Trongmột tạp chí khoa học, tác giảPeng Cao và cộng sự[40] đã sử dụng phương phápUPLC-MS/MS để nghiên cứu xác định 6 loại chất tạo màu công nghiệp(Chrysoidin

II, Rhodamin B, Auramin O, Rhodamin 6G and Safranin T,Orange II)trong thựcphẩm Mẫu được chiết bằng dung dịch amoniacetate 50 mmol trong 50 % methanol

và 1 % axit fomic và làm sạch bằng cột chiết pha rắn WAX, định lượng trên hệthống UPLC-MS/MS theo chế độ MRM Giới hạn phát hiện của AO là 1,6 µg/kg vàgiới hạn định lượng là 6 µg/kg Khoảng tuyến tính trong khoảng từ 1-100 µg/kg với

hệ số tương quan R2=0,999 Hiệu suất thu hồi từ 70,3 %-109,2 % và độ lệch chuẩntương đối từ 2,6 %-14,1 % Phương pháp được đánh giá là đơn giản, có độ nhạy vàchọn lọc tốt, có thể xác định đồng thời 6 loại chất tạo màu trong thực phẩm

Trong một nghiên cứu khác tại Trung Quốc tác giả Zheng Xiao-yanđã báo cáonghiên cứu xác định đồng thời Chrysoidin, Auramin O, Safranin T trong thực phẩmbằng UPLC-MS/MS[60] Mẫu được chiết bằng MeOH và làm sạch bằng n-hexan

Sử dụng UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng cả ba thuốc nhuộm Khoảngtuyến tính nằm trong khoảng từ 0,01 -0,05 µg/ml ( R= 0,995) Hệ số thu hồi khoảng

từ 74,3% đến 91,1 % và độ lệch chuẩn là 2,4 %-9,4 % (n=6).Giới hạn phát hiện lầnlượt là 0,3;0,6;0,7 µg/kg đối với Chrysoidin, Auramin O, Safranin T

Dựa trên độ nhạy và độ chính xác cao của phương pháp LC-MS/MS nhóm tácgiả Juan Li, Xiao-Ming Ding, Dan-Dan Liu…[28] đã tối ưu hóa phương pháp xácđịnh đồng thời tám chất nhuộm (Sudan (I-IV), Para Red, Rhodamin, Chrysoidin andAuramin O) bị cấm sử dụng trong các sản phẩm chứa ớt (bột ớt, nước tương, ).Nghiên cứu đã khảo sát bốn loại hỗn hợp pha động khác nhau để tách tám chất phântích trên HPLC, kết quả cho thấy hỗn hợp pha động methanol và amoni acetate5mM với chế độ chay gradient cho tín hiệu pic cao nhất và pic cân đối nhất Phươngpháp định lượng trên hệ thống MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ Các điềukiện trên MS/MS được tối ưu như sau: mảnh ion m/z=268,1được lựa chọn là ion mẹvới thế phân mảnh là 35V, hai mảnh ion con dùng để định tính và định lượng làm/z=147,1và m/z= 252,1 với năng lượng va chạm là 28V Giới hạn phát hiện vàgiới hạn định lượng của phương pháp đối với AO lần lượt là 0,05 µg/kg và 0,3µg/kg Các thông số xác nhận phương pháp như độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độchụm, độ thu hồi đều đạt yêu cầu củaAOAC.

Nhóm tác giả LI Jing-Qing, QI Yan, LIAO Gui-Fu, CHEN Man-Ying, đã tối

ưu hóa các điều kiện xác định Auramin O và dimethyl yellow [31] trong các sảnphẩm được làm từ đậu trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ vàchế độ quét phổ MRM Các thông số tối ưu đối với nguồn ion hóa ESI+ như sau:nhiệt độ nguồn 150oC, điện thế mao quản 2,82 kV, nhiệt độ sấy khô 500oC, lưulượng khí (Argon) 800L/h Mảnh ion mẹ là m/z=268,2, hai mảnh ion con dùng đểđịnh tính và định lượng lần lượt là 107,0 và 147,0 Hiệu suất thu hồi của phươngpháp đối với AO trong các khoảng nồng độ khảo sát 6; 10; 50 µg/kg đạt từ 89,1%-100,7 % Độ lệch chuẩn nhỏ hơn 12 %(n=6)

Năm loại chất tạo màu vàng công nghiệp (Chrysoidin G, chất màu vàng dạngbazo 2, Axit Orange I, Axit Orange II and chất màu vàng dạng xxit) đã được pháthiện đồng thời trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ HPLC-MS/MS [34] Sự tách chấtđược thực hiện với cột Agilent ODS C18, tốc độ dòng chảy 0,3 mL / phút Hỗn hợppha động được lựa chọn là amoniacetat 5mM và axetonitril tỉ lệ 3:2 Phân tích dướicác điều kiện đã tối ưu, các kết quả cho thấy khoảng tuyến tính cho Chrysoidin G và

Basic Yellow 2 là 5,0-80,0 mg/L, và đối với Axit Orange I, Axit OrangeII và AxitYellow 36 là 10,0-160,0 μg / L Giới hạn định lượng cho Chrysoidin G, Basicg / L Giới hạn định lượng cho Chrysoidin G, BasicYellow 2, Axit Orange I, Axit Orange II và Axit Yellow 36 lần lượt là 20, 20, 40,

40 và 40 ng/g.Phương pháp này được áp dụng để xác định hiệu suất thu hồi củanăm loại thuốc nhuộm trên các nền mẫu thịt gà, các sản phẩm đậu và cà tím vàng,kết quả hiệu suất thu hồi đạt từ 79,8%-95,2%

Tác giả Yu Xin-qi và cộng sự [58] đã nghiên cứu phát triển phương pháp pháthiện và định lượng Auramin O trong nền mẫu thuốc bằng phương pháp HPLC- MS/

MS với chế độ ion hóa dương ESI+ và mảnh m/z=268,1 được chọn làm mảnh mẹ.Điều kiện trên HPLC được tối ưu ở điều kiện cột pha tĩnh C18 (250mmx4,6mm;5µm), hỗn hợp pha động axetonitril và amoniacetate 0,05M tỉ lệ 30:70.Kết quả xácnhận phương pháp cho thấy hiệu suất thu hồi cao đạt từ 95-99 % đối với 3 mứcnồng độ thấp, trung bình, cao Phương pháp được đánh giá là đáng tin cậy và có độchính xác cao, có thể sử dụng để xác định AO trong nền mẫuthuốc

1.4 Phương pháp tách Auramin O ra khỏi nềnmẫu

1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết

Đối với một phương pháp định lượng thì bước xử lý mẫu là quan trọngnhất, sao cho chất phân tích được chiết hoàn toàn ra khỏi nền mẫu và tạp chất phảiđược loại bỏ Phương pháp chiết tách Auramin O ra khỏi các nền mẫu chủ yếu làphương pháp chiết lỏng-rắn Auramin O là chất phân cực vì vậy sẽ tan tốt trong cácdung môi hữu cơ phân cực Đối với các nền mẫu như thực phẩm, thuốc, thức ănchăn nuôi, Auramin O thường được chiết bởi các loại dung môi chính nhưAcetonitril [23],[28], [43], [50], Methanol [23], [36], [55], [60] và Ethanol [56]…Tuy nhiên, với mỗi loại nền mẫu khác nhau cần phải lựa chọn tỷ lệ dung môi chiếtphù hợp, việc sử dụng tỷ lệ 100 % dung môi hữu cơ thường cho hiệu suất chiếtkhông cao, vì vậy để tăng hiệu suất chiết các nghiên cứu thường khảo sát tỷ lệ chiếtgiữa dung môi hữu cơ và nước hoặc với axit hữu cơ như axit acetic, axit formic [28],[40],[43]

Một số nền mẫu thực phẩm nói chung hay nền thức ăn chăn nuôi nói riêng

thì hàm lượng protein tồn tại trong mẫu rất lớn, đây cũng là một yếu tố gây cản trở

cho quá trình phân tích trên hệ thống LC-MS/MS Theo một số tài liệu tham khảo

[43], [56] thì protein sẽ bị kết tủa sau khi mẫu được chiết bằng dung môi hữu cơ

như Methanol, Ethanol, Acetonitril và ly tâm lạnh tại nhiệt độ thấp, loại bỏ protein

bằng cách lọc qua giấylọc

1.4.2 Chiết pharắn

Khi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS đối với nền mẫu có thành phần

phức tạp có thể ảnh hưởng bất lợi đến quá trình phân tích như làm tăng hoặc ngăn

cản quá trình ion hóa Nền mẫu TĂCN chứa một lượng lớn các thành phần khác

nhau như muối vô cơ, ion kim loại, carbohydrat, protein, các chất phụ gia khác…Để

giảm thiểu những ảnh hưởng này các nghiên cứu thường sử dụng phương pháp chiết

pha rắn để làm sạch Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp được sử dụng để loại bỏ

hầu hết các chất ảnh hưởng ra khỏi nền mẫu

Trong các tài liệu tham khảo có rất nhiều loại cột SPE được dùng trong

phân tích xác định các chất tạo màu công nghiệp như cột WAX (Weak Anion

Exchange) [23], [40],cột SCX (Strong Cation Exchange)[37], cột HLB(Hydrophilic

–lipophilic B a l a n c e ) [ 1 6 ] , [ 1 7 ] Nh óm tácg iả ngườiNhật H i y e T a t e b e và cộngsự[16] đã nhận định cột chiết pha rắn có chứa hạt chất nhồistyrene-divinylbenzene

polymeric có khả năng lưu giữ tốt các chất cần phân tích AO trong báo cáo xác định

nhóm chất cấm tạo màu trong chế biến thực phẩm (rhodamine B, Auramin O,

pararosaniline)

1.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phương pháp mặt

mụctiêutâmxoay

Hiện tại, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, để tách chiết AO

ra khỏi nền mẫu đa phần được khảo sát theo phương pháp đơn biến Phương pháp

này chỉ đánh giá được sự ảnh hưởng của các yếu tố riêng rẽ nhưng không đánh giá

đượcsựảnhhưởngtươnghỗgiữacácyếutố.Đểkhắcphụcnhữngnhượcđiểmcủa

phương pháp đơn biến có thể sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) để khảosát sự ảnh hưởng của các điều kiện xử lýmẫu.

Phương pháp mặt mục tiêu là tập hợp các kỹ thuật toán học và thống kê sửdụng để mô hình hóa và phân tích trong trường hợp hàm mục tiêu chịu ảnh hưởngcủa nhiều biến độc lập Trong phương pháp này, mối quan hệ giữa hàm mục tiêu vàbiến độc lập chưa xác định trước, vì vậy cần phải xác định mối quan hệ gần đúnggiữa hàm mục tiêu và các biến Sau khi có mô hình gần đúng, có thể tìm điều kiệntối ưu bằng phương pháp đạo hàm từng biến và cho bằng 0 để tìm điều kiện tối ưu[12]

Có nhiều phương pháp tìm phương trình hồi quy bậc 2 nhưng phổ biến nhất

là 2 phương pháp: ma trận trực giao và ma trận tâm xoay Trong phương trình hồiquy bậc 2 có bao nhiêu số hạng thì ít nhất có bấy nhiêu phương trình để tìm đượccác hệ số hồi quy tương ứng cho mỗi số hạng

Hàm mục tiêu được biểu diễn bằng một phương trình hồi quy dạng đa thức:

𝑌=𝑏0.𝑥0 +𝑏𝑖.𝑥𝑖+𝑏𝑖𝑗.𝑥𝑖.𝑥𝑗+𝑏𝑖𝑖.𝑥𝑖2

Phương trình hồi quy bậc 2 mô tả một mặt mục tiêu trong không gian nchiều, có lồi lõm tương ứng với các giá trị cực trị của hàm mục tiêu Các cực trị nàychính là điều kiện thực nghiệm tối ưu tìm được

Ở đây, chúng ta nghiên cứu mô hình hóa thực nghiệm bậc 2 tâm xoay:

Số thí nghiệm của ma trận bậc 2 tâm xoay:

Để đánh giá tính có nghĩa của hệ số trong phương trình hồi quy bậc hai tâmxoay ta sử dụng chuẩn Student Nếu ttính> tbảngthì hệ số hồi quy mới có nghĩa hay trị

số Pvalue<0,05 thì hệ số hồi quy mới có nghĩa

Để đánh giá tính phù hợp của mô hình ta sử dụng chuẩn Fisher

phlà phương sai của thí nghiệm lặp lại ở điều kiện tối ưu

S02là phương sai của thí nghiệm lặp lại ở tâm của mô hình

fphbậc tự do của phương sai phù hợp

f0bậc tự do của thí nghiệm lặp lại ở tâm

Hiện nay, phương pháp RSM được sử dụng phổ biến để xác định các điềukiện chiết tách các chất cần phân tích trong nhều nền mẫu khác nhau như [14], [41],[44], [58] nhưng chưa có nghiên cứu nào ứng dụng phương pháp này để tối ưu hóacác điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết AO

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiêncứu

2.1.1 Đối tượng nghiêncứu

Nghiên cứu đã tiến hành phân tích trên đối tượng thức ăn chăn nuôi hoànchỉnh được mua từ các đại lý phân phối là sản phẩm của các công ty sản xuất thức

ăn chăn nuôi lớn ở ViệtNam

2.1.2 Nội dung nghiêncứu

Nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa các điều kiện chiết tách và xác địnhAuramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS Sau đó xác nhận giá trị sửdụng của phương pháp với các thông số gồm:Độ đặc hiệu/chọn lọc , đường chuẩn,giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ, độ chính xác của phương pháp(độ đúng và độ chụm) Từ các kết quả phê duyệt nghiên cứu đã tính toánđộ khôngđảm bảo đo của phương pháp Cuối cùng, áp dụng phương pháp phân tích để xácđịnh một số mẫu TĂCN đang bán trên thị trường

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Hóachất

Hóa chất gốc

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Chất chuẩn Auramin hydrochloric (Auramin O),(Sigma), độ tinh khiết 85%

- Methanol (MeOH),(Merck) dùng cho phân tích sắcký

- Axetonitril (ACN), (Merck); 99,8% dùng cho phân tích sắcký

- Axit fomic (CH3COOH), (Merck), độ tinh khiết 99,8%

- Nước cất được lọc qua thiết bị deion, đạt độ dẫn điện 4,3µS (điện trở 18,2MΩ))

- Cột SPE Oasis® HLB, (Waters),đường kính hạt nhồi 30 µm, 60mg

Hóa chấtpha

- Dung môi pha động A: Dung dịch 1 % axit fomic trongaxetonitril

Lấy 990 ml Axetonitril cho vào bình chứa pha động 1000 ml Thêm 10 ml dung dịch Axit Fomic Đậy nắp.Lọc và lắc siêu âm đuổi khí

- Dung môi pha động B: Dung dịch 1 % Axit Fomic trongnước:

Lấy 990 ml nước cất cho vào bình chứa pha động 1000ml Thêm 10 ml dungdịch axit formic Đậy nắp Lọc và lắc siêu âm đuổi khí

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc AO 1000ppm:

Cân chính xác 11,76 mg chất chuẩn AO.HCl (độ tinh khiết 85 %) cho vàobình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng methanol.Lưu trữ ở nhiệt độ từ 2-

8oC, trong tối đa 1 tháng

Các dung dịch chuẩn trung gian được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốctrong dung môi MeOH Sử dụng hằng ngày

2.2.2 Thiếtbị

Các thiết bị sử dụng đều được hiệu chuẩn theo ISO 17025

- Hệ thống UPLC-MS/MS-Waters Xevo TQ MS (Waters, Mỹ) với kỹ thuật ion hóa

tại áp suất khí quyển (API) và 2 kiểu hình thành ion: ion hóa tia điện (ESI), ionhóa học tại áp suất khí quyển (APCI) Đầu dò khối phổ tứ cực (tandemquadrupole) Phần mềm xử lý số liệu: Mass Lynh4.1

- Cột pha tĩnh ACQUITY UPLC ® BEH C18 (2,1x50 mm; 1,7µm)(Waters).

Các thiết bị và dụng cụ khác:

- Cân phân tích 5 số KERN ABT100-5M

- Cân phân tích 4số SartoriusENTRIS2241-ES

- Máy ly tâm Mikro220R

2.3 Phương pháp nghiêncứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

- Thu thập mẫu:Mẫu được mua tại các đại lý thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm với

0,5kilogam/mẫu

- Chuẩn bị mẫu:Đối với mẫu dạng rắn, thực hiện quá trình nghiền để đồng nhất,

đảm bảo mẫu thử đại diện trung thực cho mẫu phòng thí nghiệm, mẫu thử phải lọtqua lỗ sàng 1 mm [9].Bảo quản mẫu: Nhiệt độ25oC±5oC

- Chuẩn bị mẫu trắng: Lựa chọn một mẫu TĂCN bất kỳ được mua, phân tíchlặp lại 6 lần Mẫu trắng được chọn là mẫu không phát hiện AO

2.3.2 Phương pháp phân tíchmẫu

2.3.2.1 Chuẩn bị mẫu

- Đối với mẫutrắng

Cân khoảng 1g mẫu trắng đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống lytâm nhựa 50 ml Mẫu trắng được tiến hành như mẫu thử Thực hiện tối thiểu 1 mẫutrắng trong một lô mẫu

- Đối với mẫuthử

Cân khoảng 1g mẫu thử đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống lytâm nhựa 50 ml Mỗi mẫu thử lặp lại ít nhất 2lần

- Đối với mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 100 µg/kg (mẫu kiểm soát)

Cân khoảng 1g mẫu trắng đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống lytâm 50 ml, hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 1000 µg/kg AO bằng micropipetcho vào ống.Lắc xoáy nhẹ để trộn đều dung dịch thêm chuẩn vào mẫu

- Chiếtmẫu

Thêm chính xác 15 ml hỗn hợp dung dịch MeOH:H2O (tỉ lệ 90:10).Lắc xoáykhoảng 1 phút Sau đó lắc 30 phút trên máy lắc, ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 rpm,nhiệt độ 4oC Lọc và lấy toàn bộ dịch chiết AO Hút chính xác 1,0 ml dịch chiết AOhòa vào 4 ml nước cất (Hỗn hợp dung dịch A)

2.3.2.2 Chuẩn bị dãy dung dịchchuẩn

Pha dãy dung dịch chuẩn gồm 6 điểm nồng độ: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 20 µg/kgtrong dung môi MeOH

Tiến hành phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS

Trình tự bơm mẫu:

- Dung môi pha mẫu

- Dãy dung dịchchuẩn

- Mẫutrắng

- Mẫu mẫu kiểmsoát

- Mẫuthử

-Mẫu dung dịch chuẩn kiểm soát

Sử dụng phần mềm MassLynx 4.1 để thu thập số liệu và xây dựng đường chuẩn

Tính toán kết quả

Hàm lượng AO (µg/kg) trong mẫu được tính theo công thức

𝐻𝐿=𝐶𝑚𝑥𝑉𝑥𝐹𝑚Trong đó:

HL: hàm lượng AO trong mẫu phân tích (µg/kg)

Cm: nồng độ AO khi tiêm vào thiết bị (µg/kg ), được xác định theo đườngchuẩn

V: thể tích dung dịch rửa giải (V= 4 ml)

F : hệ số pha loãng (F= 15/1=15)

m : khối lượng cân mẫu (g)

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm và xử lý kếtquả

- Tiến hành khảo sát đơn biến, lựa chọn các điều kiện phù hợp để chiết tách

AO ra khỏi nền mẫu như: dung môi chiết, cột chiết pha rắn để làm sạch, dung môirửa giải saucột

- Sau khi đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp, tiên hành khảo sát và đánhgiá các thông số ảnh hưởng đến quá trình chiết bằng phương pháp mặt mục tiêu(RSM) sử dụng mô hình bậc hai tâm xoay với 20 thí nghiệm được tiến hành theoquy hoạch thực nghiệm, dùng phương pháp đạo hàm để tìm các điều kiện tối ưu để

xử lý mẫu

- Sử dùng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel để tính toán xử lý sốliệu

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên hệ thốngUPLC-MS/MS

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổMS/MS

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát xác định Auramin O trên hệ thống MSbằngkỹthuật ion hóa phun điện tử (ESI+) với chế độ bắn phá ion dương dưới dạngion phân tử [M+H]+ Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, sử dụng hệ thống bơm tựđộng của thiết bị, bơm trực tiếp dung dịch chuẩn AO nồng độ 100µg/kg vàodetector MS/MS Chọn chế độ khảo sát tự động IntelliStart được tích hợp trong hệthống vàkỹthuật ghi phổ MRM để tối ưu hóa và lựa chọn ion mẹ và ion con để địnhlượng và định tính.Quan sát quá trình khảo sát tự động trên thiết bị (kết quả trungbình của 3 lần lặp lại), cho thấy thế mao quản Capillary, điện thế Cone Volt , nănglượng va chạm là những thông số ảnh hưởng lớn đến cường độ tín hiệu của các ionphân tích khi phân tích khối phổ và các mảnh ion con có cường độ tín hiệu khácnhau, mảnh ion con M/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh con thứ 2

có cường độ thấp hơn dùng để định tính chất phântích

Các điều kiện tại nguồn ion hóa ESI đã được hệ thống UPLC-MS/MS Xevo

TQ MS tự động tối ưu hóa theo tốc độ dòng pha động, để đảm bảo độ nhạy của thiết

bị [49] Phần mềm IntelliStart sẽ tự động cài đặt các thông số khi chúng ta cài đặttốc độ dòng vào thiết bị Điều kiện nguồn ESI+ tại tốc độ dòng 0,3 ml được trìnhbày ở bảng3.1

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn Ion hóa ESI +

Chế độ ion hóa/ Ionization ESI+(chế độ ion dương)/MRM

Nhiệt độ nguồn ion hóa 150oC

M/z=122,05

M/z=106,96

Các kết quả tối ưu hóa điều kiện phân tích trên MS/MS được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS

Chất

phântích

Ion mẹ(M/z)

Ion con(M/z)

Mục đích Điện áp

mao quản(KV)

Thế phânmảnh (V)

Năng lượng va chạm (V)

Auramin O 268,24 147,05 Định

Hình 3.1 Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS

Dựa vào tín hiệu píc trên hình 3.1 và hình 3.2, cho thấy mảnh ion conM/z=147,05 có tín hiệu độ nhạy cao nhất (6,26e7) nên được lựa chọn làm mảnh ionđịnh lượng và mảnh ion con M/z=122,08 có tín hiệu thấp hơn được lựa chọn làmmảnh ion định tính

Cơ chế phân mảnh phổ khối lượng của AO được giả định như ở hình 3.2

Hình 3.2.Cơ chế phân mảnh phổ khối của AO

Nhận xét: Tại các điều kiện tối ưu ở bảng 3.1 của hệ thống MS/MS cho tínhiệu píc ổn định và độ nhạy, độ chọn lọc cao

3.1.2 Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích trên hệ thốngUPLC

3.1.2.1 Lựa chọn cột phatĩnh

Nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp UPLC để thực hiệnphép tách sắc ký, để khai thác các tính năng của thiết bị này nhằm tăng cường độphân giải, phép phân tích chọn lọc hơn, cân bằng xảy ra nhanh hơn, rút ngắn thờigian phân tích cũng như đáp ứng được tính chất phân cực và cấu trúc phân tử củachất phân tích cần lựa chọn cột pha tĩnh phù hợp Dựa vào các tài liệu tham khảo[34], [35], [60] và tính chất hóa học củaAO là chất phân cực trung bình nghiên cứu

đã sử dụng cột pha tĩnh không phân cực C18(2,1x50 mm; 1,7µm) với hạt nhồi cóđường kính nhỏ được chế tạo theo công nghệ polyethoxysilan, chịu được áp suấtcao cũng như môi trường axit và bazơ tốt để tiến hành AO trên hệ thốngUPLC

3.1.2.2 Thành phần pha động và chế độgradient

Về nguyên lý, phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector MS có đặc điểmgiống các phương pháp LC sử dụng các detector khác Tuy nhiên, với detector MS,

Chương trình 1

Chương trình 2

pha động cần phải có thành phần phù hợp Đối với detector MS cùng với việc sửdụng kỹ thuật ion hóa tia điện ESI thì thành phần pha động không chứa các chất khóbay hơi như đệm phosphate, EDTA… và dung môi cần có sức căng bề mặt thấp đểquá trình phun điện tích dễ dàng ion hóa chất phân tích và bay hơi dung môi diễn ra

dễ dàng hơn [13] Do vậy, nghiên cứu lựa chọn Acetonitril và nước cất kết hợp với

1 % axit formic để làm phađộng

Để đảm bảo chất phân tích được tách hoàn toàn ra khỏi cột, góp phần tăng

độ nhạy của chất và độ ổn định của phương pháp, nghiên cứu đã thực hiện khảosátthay đổi thành phần pha động ở hai chế độ là đẳng dòng và gradient Sử dụngdung dịch chuẩn có nồng độ 6 µg/kg để tiến hành phân tích tại các điều kiện trênHPLC: tốc độ dòng 0,3 ml/phút, cột pha tĩnh C18 (2,1x50 mm; 1,7µm) và điều kiện

đã tối ưu trên hệ thống MS/MS.Quá trình thay đổi các chế độ chạy đẳng dòng phađộng được thực hiện tại hai tỷ lệ khác nhau được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Chương trình đẳng dòngpha động

Tên chươngtrình

Kênh A: axit fomic 0,1% trong ACN

Kênh B: axit fomic 0,1% trong nước

Hình 3.3 Sắc đồ chương trình đẳng dòng pha động 1 và 2

Kết quả ở sắc đồ hình 3.3 cho thấy khi phân tích trên UPLC với chươngtrình chạy đẳng dòng pha động thì pic ra quá sớm (thời gian lưu 0,37 phút) vì cộtpha tĩnh ngắn (50 mm) nên AO được rửa giải nhanh ra khỏi cột, điều này còn làmcho píc bị chẻ, tín hiệu pic không ổn định và làm giảm độ nhạy của phương pháp.

Nghiên cứu tiếp tục khảo sát tại điều kiện gradient pha động như bảng 3.4

Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động

Hình 3.4 Sắc đồ các chương trình 3,4,5chạy gradient

Sắc đồ hình 3.4 cho thấy tín hiệu pic của dung dịch chuẩn 6 µg/kg khi phântích tại các chương trình 3; 4; 5 cân xứng, nhọn đẹp Độ nhạy của 3 píc tại 3 chươngtrình xấp xỉ bằng nhau điều này cho thấy tỉ lệ gradient thành phần pha động cho kếtquả tương đối ổn định Việc thay đổi thời gian gradient chỉ làm thay đổi thời gianlưu của píc

Qua quá trình khảo sát chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 5 cho diệntích píc cao nhất, píc cân xứng và thời gian lưu ra sớm hơn chương trình 3 và 4

3.1.2.3 Tốc độ dòng phađộng

Tốc độ pha động đối với hệ UPLC ảnh hưởng nhiều đến sự ổn định củachươngtrìnhgradient,thờigianrửagiảivàđộlặplạicủaquátrìnhsắcký.Nghiên

cứu sử dụng cột pha tĩnh có kích thước hạt nhồi rất nhỏ 1,7 µm nên tốc độ dòng lựa chọn khoảng 0,1-0,3 ml/phút để đảm bảo áp suất của toàn hệ thống không quá cao (nhỏ hơn áp suất chịu đựng của hệ thống) và không thay đổi lớn trong suốt quá trình gradient.

Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng phù hợp được thực hiện như sau: tiến hànhphân tích dung dịch chuẩn 5 µg/kg trên hệ thống UPLC-MS/MS cố định các điềukiện như điều kiện MS/MS, cột pha tĩnh, thành phần pha động đã tối ưu và thay đổitốc độ dòng tại các mức: 0,1; 0,2; 0,3 ml/phút Tiêm lặp lại 3 lần tại nồng độ 5µg/kg ở mỗi tốc độ dòng tương ứng Kết quả thu được ở bảng3.5:

Bảng 3.5 Diện tích pic khi thay đổi tốc độdòng

Tốc độ dòng Thời gian lưu (phút) Diện tích pic trung bình

Hình 3.5 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,1 ml/phút

Hình 3.6 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,2ml/phút

Hình 3.7 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,3ml/phút

Dựa vào kết quả của bảng thì diện tích píc tại nồng độ 5 µg/kg là tương đốibằng nhau, độ nhạy gần như không đổi tại ba tốc độ dòng khác nhau, tuy nhiên tạitốc độ dòng 0,3 ml/phút píc thu được tương đối cân đối hơn, giảm hiện tượng kéođuôi, thời gian lưu ra sớm hơn so vớithời gian lưu ở hai tốc độ dòng còn lại nhưngvẫn đảm bảo được áp suất cho phép của hệ thống Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn phântích tại tốc độ dòng là 0,3 ml/phút