Luận văn thạc sĩ nghiên cứu định lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc làsắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC thì định lượng chất bằng phương pháp quangphổ hồng ngoại gầ

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TẠ THỊ THẢO

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ ThịThảo đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bịmáy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016,

mã số 39/2014/HD- NĐT.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng cácthầy cô, cán bộ trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị em học viên K23 chuyên ngành Hóa phân tích đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Huệ

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa

Chuyên ngành hóa phân

Mục Lục

MỞĐẦU 1

CHƯƠNG I:TỔNGQUAN 2

1.1 Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tạiViệt Nam… 2

1.1.1 Định nghĩa vềthuốcgiả 2

1.1.2 Hiện trạng sử dụngthuốc giả 2

1.2 Tổng quan về thuốc kháng sinhnhómSulfamid 3

1.2.1 Lịch sử ra đờinhómSulfamid 3

1.2.2 Cấu tạo chung củanhómSulfamid 4

1.2.3 Tính chất vật lý và hóa học củacác sulfamid 6

1.2.4 Phânloại sulfamid 6

1.2.5 Dượcđộng học 7

1.2.6 Độc tínhcủasulfamid 7

1.2.7 Giới thiệu về Sulfaguanidin, SulfamethoxazolvàTrimethoprim 8

1.3 Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chấtnhómsulfamid 10

1.3.1 Phương pháp địnhtínhsulfamid 10

1.3.2 Phương phápđịnhlượng 11

1.3.1.1 Phương pháp chuẩn độthểtích 11

1.3.1.2 Phương pháptrắcquang 12

1.3.1.3 Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quyđabiến 12

1.3.1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệunăngcao 13

1.4 Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuậttoán hồi quyđabiến 14

1.4.1 Sơ lược về phương pháp quang phổhồngngoại 14

1.4.1.1 Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổhồngngoại 14

1.4.1.2 Nguyên tắc của phép đo phổhồng ngoại 14

1.4.1.3 Điều kiện hấp thụ bức xạhồngngoại 16

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổhồngngoại 16

1.4.1.5 Cáckỹthuật chuẩn bị mẫu và đo phổhồngngoại 17

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa

Chuyên ngành hóa phân

1.4.1.6 Một số ứng dụng của phương pháp phổhồng ngoại 18

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trungbình kết hợpvớichemometrics 19

1.4.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quyđabiến 19

1.4.2.2 Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồngngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quyđabiến 27

CHƯƠNG II:THỰCNGHIỆM 30

2.1 Nội dung và phương phápnghiêncứu 30

2.1.1 Nội dungnghiêncứu 30

2.1.2 Phương phápnghiêncứu 30

2.2 Phương pháp phân tích đối chứng xác địnhcácsulfamid 32

2.2.1 Phương pháp đối chứng xácđịnhSulfaguanidin 32

2.2.2 Phương pháp đối chứng xác định SulfamethoxazolvàTrimethoprim 32

2.3 Hóa chất vàthiếtbị 34

2.3.1 Hóachất 34

2.3.2 Thiết bị và phần mềmmáytính 34

2.4 Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quyđabiến 35

2.4.1 Phương pháp bình phương tối thiểu thôngthường(CLS) 35

2.4.2 Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo(ILS) 36

2.4.3 Phương pháp bình phương tối thiểu từngphần(PLS) 37

2.4.4 Phương pháp hồi qui cấu tửchính(PCR) 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN 41

3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazolvà trimethoprim trong cùnghỗnhợp 41

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ của cáchoạtchất 41

3.1.2 Khảo sáttỷlệ khối lượng mẫu/KBr 44

3.1.3 Khảo sát độ lặp lại của quá trìnhépviên 44

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của cáctádược 45

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa

Chuyên ngành hóa phân

3.2 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất

nhómsulfamid khi có mặt cáctádược 48

3.2.1 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và cáctádược 48

3.2.2 Đánh giá phương pháp phântíchsulfaguanidin 50

3.3 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thờisulfaguanidin, sulfamethoxazolvàtrimethoprim 58

3.3.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin,sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phươngphápPCR 58

3.3.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quyđabiến 61

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồiquy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP vàtádược 64

3.4 Ứng dụng phân tích mẫuthựctế 65

3.4.1 Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhómSulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần vàtrungbình 66

3.4.1.1 Định tính mẫuthựctế 66

3.4.2 Định lượng mẫuthựctế 72

CHƯƠNG IV:KẾT LUẬN 76

TÀI LIỆU THAMKHẢO 83

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bịkhảosát 41

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bịkhảosát 42

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bịkhảosát 42

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol vàtrimethoprim 43

Hình 3.5: Phổ hồng ngoạicủaCanxiphosphat 46

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinhbộtsắn 46

Hình 3.7: Phổ hồng ngoạicủaMaltodextrin 46

Hình 3.8: Phổ hồng ngoại củaMagieStearat 47

Hình 3.9: Phổ hồng ngoạicủaTalcum 47

Hình 3.10: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 25 mẫuchuẩn 54

Hình 3.11: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 30 mẫuchuẩn 60

Hình 3.12: Phổ hồng ngoạicủaSulfaguanidin 66

Hình 3.13: Phổ hồng ngoạicủaSulfamethoxazol 66

Hình 3.14: Phổ hồng ngoạicủaTrimethoprim 67

Hình 3.15: Kết quả định tính mẫutựtạo 67

Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thựctếS1 68

Hình 3.17: Kết quả định tính mẫu thựctếS2 68

Hình 3.18: Kết quả định tính mẫu thựctếS3 69

Hình 3.19: Kết quả định tính mẫu thựctếS4 69

Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thựctếST1 70

Hình 3.21: Kết quả định tính mẫu thựctếST2 70

Hình 3.22: Kết quả định tính mẫu thựctếST3 71

Hình 3.23: Kết quả định tính mẫu thựctếST4 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamidphổbiến 5

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quangtại các số sóngđặctrưng 44

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lầnépviên 45

Bảng3.3:MatrậnhàmlượngbốncấutửSFT,Tbot,Malt,Ca3(PO4)2tronghỗnhợp 49

Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2và Malt đểđánh giá tính phù hợp của phương trìnhhồiquy 50

Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫukiểmtra 51

Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫukiểmtra 52

Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2tìm được trong các hỗn hợp mẫukiểmtra 52

Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫukiểmtra 53

Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra .56

Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểmtra theo phươngpháp PCR 57

Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược tronghỗnhợp 59

Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược đểđánh giá tính phù hợp của phương trìnhhồi quy 62

Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗnhợp mẫu kiểm tra theo phươngphápPCR 63

Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồngthời SFG, SFM, TMP vàtádược 65

Bảng 3.15: Mẫuthực tế 65

Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vàocácmẫu 73

Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫuthựctế 74

Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫuthựctế 74

BẢNG KÍ HIỆU NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Bình phương tối thiểu thông thường

Bình phương tối thiểu nghịch đảo

Bình phương tối thiểu từng phần

Cấu tử chính (Principal component) PC

Hồi qui cấu tử chính (principal

theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4[1]

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa

So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc làsắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất bằng phương pháp quangphổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm đơn giản trong quá trình tiền xử lýmẫu, phân tích trực tiếp mẫu rắn nhanh, giá thành rẻ do không tốn dung môi và nếukết hợp với thuật toán hồi qui đa biến thì không phải tách riêng các chất trước khiphân tích nên có thể phân tích đồng thời các thuốc trong cùng nhóm thuốc Đây

chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng một số hoạt

chấtthuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình” Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế

giữa Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổhồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyếntính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định

xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanhtrong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăngtính thời sự của công tác giám định chấtlượng

Theo định nghĩa của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA):Thuốc giả bao gồm bất kỳ dược phẩm nhái hoặc kém chất lượng nào không đáp ứngđược tiêu chuẩn của FDA nhưng cố tình che giấu sự thật [36] Thuốc giả có thể cómột hoặc nhiều hay tất cả các yếu tố sau:

- Quá mạnh hoặc quáyếu.

- Thiếu các thành phầnchính.

- Được sản xuất từ các thành phần nguyhiểm.

- Nhiễm chất lạ, thậm chí có chấtđộc.

- Được sản xuất trong điều kiện mất vệ sinh hoặc không vôtrùng.

- Được tạo ra theo các tiêu chuẩn không antoàn.

- Được dán nhãn, cất giữ hay bảo quản không đúngcách.

- Quá hạn sử dụng (hếthạn).

1.1.2 Hiện trạng sử dụng thuốcgiả

Theo thống kê của WHO, đã có sự bùng nổ thuốc giả trên phạm vi toàn cầu.Thuốc giả chiếm tới 10% thị trường dược phẩm thế giới với doanh thu 45 tỉeuro/năm, trung bình mỗi năm có khoảng 200.000 người tử vong do thuốc giả [35]

Tại Việt Nam, theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, năm 2011, trong

số hơn 31.000 mẫu thuốc được kiểm tra gần đây thì đã có hơn 1.000 mẫu không đạttiêu chuẩn chất lượng như nhiễm khuẩn, không đủ độ hòa tan, không đủ định lượng.Nguồn tin từ Bộ Y tế cũng cho biết, trong hơn 10 ngày đầu tháng 2/2012, hầu nhưngày nào Bộ cũng phát hiện thuốc giả, thuốc kém chất lượng.[3]

Các thuốc giả, thuốc nhái có thể chứa bất cứ thành phần nào từ phấn bảng,bê-tông nghiền, acid boric hoặc những gì tệ hơn thế và được bán như thuốc thật.Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, chúng còn vô hiệu hóa các liệu phápđiều trị để cứu sống bệnh nhân Trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại

to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnhnhân dễ kháng thuốc [23] Tuy nhiên, việc phát hiện thuốc giả lưu thông trên thịtrường gặp rất nhiều khó khăn Thông thường, do doanh số bán (lượng tiêu thụ) củamột mặt hàng thuốc nào đó giảm nghiêm trọng, nhà sản xuất hoặc nhà phân phốihàng chính hãng mới đặt vấn đề với cơ quan chức năng về hiện tượng làm giả thuốcnày và khi đó cơ quan chức năng mới tiến hành xác minh (kiểm tra đột xuất tại các

cơ sở sản xuất kinh doanh; niêm phong mẫu và đem phân tích theo các phươngpháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm, rồi đưa ra kết luận) [3] Quá trình nàythường rất tốn kém và mất thời gian, do đó đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra mộtphương pháp kiểm nghiệm mới, nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm để kiểm địnhnhanh được chất lượng thuốc ngoài hiệntrường

1.2 Tổng quan về thuốc kháng sinh nhómSulfamid

1.2.1 Lịch sử ra đời nhómSulfamid

Ngay từ những năm đầu thế kỉ các nhà khoa học nhận thấy rằng các phẩmnhuộm có tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên các phẩm nhuộm thường rất độc Trongnhững cố gắng tìm những thuốc kháng khuẩn trên cơ sở các thuốc nhuộm năm

1913, người ta đã tìm thấy phẩm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương

vì gắn chặt vào protein, vìvậyngười ta cũng gắn thêm vào phân tử cryzoidin nhómsulfamido, kết quả là cho một chất có khả năng chống tụ cầu và liên cầu prontosil.Đây là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp toàn phần.Prontosil khó tan trong nước nên người ta thêm vào đó nhóm COOH từ đó có thểtạo muối dễ tan Năm 1935, Domagk, Trefouel và Levaditikhisi dùng prontosilkháng khuẩn thì nhận thấy: mặc dù có kết quả tốt trên liên cầu trên in vivonhưnglạikhôngcótácdụngtrêninvitro,nhưvậycóthểkhivàocơthể,prontosil

đã chuyển hóa thành chất khác có tác dụng kháng khuẩn [15] Khi phân tích côngthức của prontosil ta thấy đó là các azoic được điều chế bằng cách diazo hóa p-amino benzene sulfonamid(sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin Khi thaym-phenylendiamin bằng các amin hoặc các phenol khác chúng ta thu được các dẫnchất có tác dụng kháng khuẩn nhưng khi thay sulfanilamid bằng các anilin khácnhau thì thu được các chất không có tác dụng kháng khuẩn Như vậy, có thể cácsulfanilamid là phần có tác dụng kháng khuẩn Thật vậy, khi thử tác dụng củasulfanilamid cho thấy có tác dụng kháng khuẩn tốt Khi kiểm tra nước tiểu củangười uống prontosil thấy có mặt sulfanilamid dưới dạng acetyl hóa [6,13]

Sulfanilamid đã trở thành sulfamid đầu tiên trong lịch sử Việc phát hiện raprontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỉ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnhnhiễm khuẩn Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiềusulfamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc Ngày nay, việc ra đờicủa các kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh nên các sulfamid được sửdụng ít hơn Tuy nhiên việc sử dụng các sulfamid có ưu điểm:

1.2.2 Cấu tạo chung của nhómSulfamid

Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, cócông thức cấu tạo chung là:

R2 HN SO2 NH R1

là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [6]

Sulfamid có công thức cấu tạo gần giống với PABA (para amino benzoicacid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển.

Do đó sulfamid tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vikhuẩn Ngoài ra, sulfamid còn ức chế dihydrofolat synthetase, một enzym tham giatổng hợp acid folic Về mặt lý thuyết, phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, gồmhầu hết các cầu khuẩn, trực khuẩn gram (+) và (-) Hiện nay, tỷ lệ kháng thuốc vàkháng chéo giữa các sulfamid đang rất cao nên đã hạn chế việc sử dụng sulfamid rấtnhiều Mặt khác do có nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfamid ngàycàng ít dùng một mình, thường dùng dạng phối hợp sulfamethoxazol vớitrimethoprim để tăng khả năng điều trị của thuốc Dưới đây là công thức cấu tạo củamột số sulfamid phổ biến

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến

1.2.3 Tínhchất vật lý và hóa học của cácsulfamid

 Tính chất vậtlý

Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, khôngmùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform Sulfamid tan trong dung dịchacid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [6] Các sulfamid có cácthông số xác định về: độ chảy, phổ IR, phổ UV (do có chứa nhân thơm)

 Tính chất hóahọc

Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: [6]

- Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H ở N- amid linhđộng

- Tính bazơ: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dungdịchacid

Các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá do có nhóm amin thơm tự

do (có thể tham gia phản ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho sản phẩm màu đỏ

da cam)

sulfamid với nhau Đốt khô trong ống nghiệm, sulfamid bị phân huỷ, để lại cặn cómàu điển hình cho từng sulfamid, ví dụ, đốt sunfanilamid sẽ giải phóng ammoniac

và cho cặn màu xanh tím

1.2.4 Phânloạisulfamid

Sulfamid là một trong những kháng sinh tổng hợp đầu tiên được loài ngườiphát hiện và sử dụng Việc tìm thấy sulfamid đã mở ra một kỷ nguyên mới của cácthuốc chống nhiễm khuẩn trước khi có penicilin Khi phân loại kháng sinh theo tácdụng, nhóm sulfamid được xếp vào nhóm các loại kháng sinh có tác dụng kìmkhuẩn Do tác dụng của sulfamid đều giống nhau, việc điều trị dựa vào dược độnghọc của thuốc cho nên người ta chia các sulfamid làm 4 loại: Loại hấp thu nhanh,

trong 24h Dùng điều trị nhiễm khuẩn theo đường máu như sulfadiazin, sulfisoxazol(Gantrisin), sulfamethoxazol (Gantazol) Loại hấp thu rất ít: dùng chữa viêm ruột,

viêm loét đại tràng như sufaguanidin (Ganidan) Loại thải trừ chậm: duy trì được

Hiện dùng sulfadoxin (Fanasil), phối hợp với pyrimethamin trong Fansidar để dựphòng và điều trị sốt rét kháng cloroquin Loại để dùng tại chỗ: ít hoặc khó tantrong nước Dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng) dưới dạng dungdịch hoặc kem Có sulfacetamid, silver sulfadiazin, mafenid.[2]

Hiện nay hầu hết các vi khuẩn đều kháng với sulfamid nên thuốc này rất ítđược sử dụng Để khắc phục nhược điểm này người ta thường dùng sulfamid ở dạngphối hợp Dạng phối hợp phổ biến nhất của sulfamid là việc kết hợp giữasulfamethoxazol và trimethoprim với tỉ lệ 1 trimethoprim và 5 sulfamethoxazolnhằm tạo ra kháng sinh có khả năng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỉ

lệ kháng thuốc của vi khuẩn, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, t/2 của thuốc từ9-11 giờ.[2]

1.2.5 Dượcđộng học

Các sulfamid được hấp thu nhanh qua dạ dày và ruột (trừ loại sulfaguanidin),

70 - 80% liều uống vào được máu, gắn với protein huyết tương 40 - 80%, nồng độtối đa đạt được sau 2- 4 giờ Từ máu, sulfamid khuếch tán rất dễ dàng vào các mô,vào dịch não tuỷ (bằng 1/2 hoặc tương đương với nồng độ trong máu), qua rau thai,gây độc Các quá trình chuyển hóa chủ yếu ở gan của sulfamid gồm: Phản ứng liênhợp với acid glucuronic thành dạng bất hoạt nhưng có tính hòa tan Phản ứng acetylhóa tạo thành dạng bất hoạt và không tan nên thường gây độc (hình thành dạng tinhthể ở thận) Sau đó các sulfamid được bài thải qua thận là chủ yếu (trừ các sulfamidkháng khuẩn đường ruột), một ít qua phân, sữa [2]

1.2.6 Độctính củasulfamid

Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cáthể và đối với mỗi loại sulfamid Dưới đây là một số tác dụng có thể gặp khi sửdụngsulfamid:

Rối loạn hệ thống tạo máu: cơ chế tác dụng rất khác nhau, có trường hợp là

do mẫn cảm, trường hợp khác do sự tan huyết liên quan đến sự hoạt hóa glucose- 6

photsphat dehydrogenase Phản ứng này không phụ thuộc vào nồng độ sulfamid màvào từng cá thể Phản ứng thường xảy ra trong tuần đầu dùng thuốc Triệu chứng cóthể là: buồn nôn, sốt, chóng mặt, vàng da, xanh xao, trong trường hợp nặng có thể làthiếu máu bất sản Một số trường hợp có thể gây tím tái do tạo methemoglobin.

Thận: đây là trường hợp không mong muốn thường gặp nhất khi sử dụngsulfamid Sulfamid có thể gây kết tinh ở thận, gây tổn thương thận, viêm thận, sỏithận, đái ra máu Nhược điểm này đã được khắc phục dần do tìm được nhữngsulfamid ít acetyl hóa, ít kết tinh…

Phản ứng tăng nhạy cảm: phản ứng rất khác nhau với từng loại sulfamid vàvới từng người, thường xuất hiện khi sử dụng các loại sulfamid tác động chậm.Triệu chứng có thể là nổi ban đỏ, xuất huyết…Khi dùng ngoài da có thể gây nám da

do sự kích thích sự nhạy cảm của da khi tiếp xúc với tia tử ngoại.[2]

1.2.7 Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol vàTrimethoprim

Trong số những kháng sinh nhóm sulfamid đã được tổng hợp, sulfaguanidin

và sulfamethoxazol là một trong những hoạt chất được sử dụng phổ biến nhất hiệnnay Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng nên hiện nayngười ta thường sử dụng dạng phối hợp của sulfamid với trimethoprim nhưsulfamethoxazol, sulfadiazin với trimethoprim để tăng thêm hiệu quả điều trị [2]

Do đó trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành đi sâu nghiên cứu ba hoạt chất là:sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (dạng phốihợp phổ biến vớisulfamid)

 Giới thiệu vềSulfaguanidin

Công thức: C7H10N4O2S

Sulfaguanidin là (4-aminophenylsulfonyl)guanidin, tồn tại ở dạng bột kếttinhmịnmàutrắnghoặcgầnnhưtrắng.Rấtkhótantrongnướcvàethanol96%,

khó tan trong aceton, thực tế không tan trong methylen clorid, tan trong dung dịchacid vô cơ loãng [6]

Sulfaguanidin được sử dụng để trị các bệnh đường ruột như tả, lỵ, viêm ruột

Là kháng sinh ít tan trong kiềm, không hấp thu ở ruột, ít độc nên có thể dùng vớiliều cao Tuy nhiên sulfaguanidin có ảnh hưởng tới vi khuẩn đường ruột, nên khi

 Giới thiệu vềSulfamethoxazol

Công thức: C10H11N3O3S

KLPT: 253,3Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzensulfonamid,tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Thực tế không tan trongnước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung dịch acid loãng [6]

Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùngđường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da

 Giới thiệu vềTrimethoprim

Triemthoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêmphế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn tiếtniệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do Pneumocystis carinii.

Hiện nay so khả năng kháng các thuốc nhóm sulfamid ngày càng cao nênngười ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim đểtăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc Bản chất của sulfamethoxazol là mộtsulfonamid, ức chế cạnh tranh sự tổng hợp acid folic của vi khuẩn Trimethoprim làmột dẫn chất của pyrimidin, ức chế đặc hiệu enzym dihydrofolat reductase của vikhuẩn Khi phối hợp trimethoprim và sulfamethoxazol như vậy sẽ ức chế hai giaiđoạn liên tiếp của sự chuyển hóa acid folic, do đó ức chế có hiệu quả việc tổng hợppurin, thymin và cuối cùng DNA của vi khuẩn Sự ức chế nối tiếp này có tác dụngdiệt khuẩn Cơ chế hiệp đồng này cũng chống lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc

và làm cho thuốc có tác dụng ngay cả khi vi khuẩn kháng lại từng thành phần củathuốc [2]

1.3 Tổngquan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhómsulfamid

1.3.1 Phương pháp định tínhsulfamid

 Phương pháp sắc ký lớpmỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp khá đơn giản được sửdụng để định tính các sulfamid Trong phương pháp này người ta thường sử dụngcác hệ dung môi khai triển như dicloromethan- methanol- acid formic khan(70:20:10) để định tính sulfaguanidin; hệ cloroform - methanol - dimethylformamid(20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) để định tính sulfamethoxazol; hệheptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic băng

tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) để định tính sulfadoxin [1] Tiến hành chấm riêng biệt mỗi dungdịch lên bản mỏng silica gel GF254 Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi đượckhoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tửngoại ở bước sóng 254 nm Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phùhợp về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đốichiếu

 Phương pháp phổ hồngngoại

Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt củacác nhóm chức đặc trưng [13, 7] Cụ thể, xác định sự có mặt nhóm sulfoamid bậc 2

của nhóm N-H (amin thơm bậc một)

Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó sosánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu

1.3.2 Phương pháp địnhlượng

1.3.1.1 Phương pháp chuẩn độ thểtích

- Dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid trong môi trường acid cácSulfamid được xác định theo phương pháp chuẩn độ nitrit chậm, điểm tương đươngđược phát hiện bằng phương pháp chuẩn độ điện thế [1] Đây là một phương phápđịnh lượng rất nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm được áp dụng phổ biến để xác địnhcác Sulfamid trong dượcphẩm

brôm làm thuốc thử để xác định các sulfamid trong dược phẩm bằng phươngpháp chuẩn độ gián tiếp [17] Theo đó phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứngcủa các sulfamid với một lượng dư nước brom bão hòa để tạo thành các dẫn xuấtN- bromo tương ứng, quá trình này giải phóng một lượng tương đương của iotkhi phản ứng với iot Iot tự do có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độvởi natri thiosulfat, sử dụng hồ tinh bột làm chỉ thị Hiệu suất thu hồi của phươngpháp là từ 97,8- 102,1 %, hệ số biến thiên là từ 0,1- 2,2 % tùy thuộc vào hàmlượng của các sulfamid trong dượcphẩm

1.3.1.2 Phương pháp trắc quang

Nhóm tác giả Nagaraja P1, Naik SD và cộng sự đã tìm ra một phương phápđơn giản, có độ nhạy cao dùng để xác định một số sulfamid trong các chế phẩmdược [30] Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa của sulfacetamid,sulfadiazin, sulfaguanidin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol và các liênkết của chúng với 8-hydroxyquinolin trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm màu

đỏ có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 500 nm Nồng độ tuân theo định luật Beer từ0,1 đến 7,0 mg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn đinh lượng của phương pháp lầnlượt là 0,03- 0,05 và 0,11-0,18 mg/ml Độ chính xác của phương pháp là từ 97,3-100,8 % Phương pháp này khá thành công trong việc định lượng các sulfamidtrong các mẫu dượcphẩm

Cũng trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid các tác giả PadmarajaiahNagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha, Ramanathapura AVasantha [31] lại đưa ra phương pháp xác định các sulfamid như sulfathiazol,sulfadiazine, sulfacetamid, sulfamethoxazol, sulfamerazin, sulfaguanidin vàsulfamethazin trong dược phẩm dựa trên phản ứng diazo hóa các sulfamid trên, sau

đó tiến hành tạo phức với dopamine trong sự có mặt của ion molybdat trong môi

có độ hấp thụ trong vùng từ 490-510 nm, các dung dịch này có độ bền trong 48 giờtại 27C Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,04 đến 8,0 µg/ml Phương pháp nàyđược áp dụng thành công trong việc xác định các sulfamid trong các sản phẩmthuốc viên và thuốc nhỏ mắt Các tá dược trong thuốc không ảnh hưởng đến kết quả

đo Do đó đây là phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và có độ nhạycao áp dụng để phân tích các sulfamid tron dược phẩm mà không cần chiết tách haygianhiệt

1.3.1.3 Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đabiến

Phương pháp trắc quang kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến như: bìnhphương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS ), hồiqui cấu tử chính ( PCR) là một phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng và tiết

kiệm để xác định đồng thời các thuốc kháng khuẩn như sulfamid và trimethoprimtrong dược phẩm Tập hợp các dung dịch mẫu được hòa tan và pha loãng với dungdịch ethanol pH = 9,9 đến nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ trong vùng bướcsóng từ 200- 350 nm Tiến hành nghiên cứu trên 5 hoạt chất: sulfadiazin,sulfadimidin, sulfamethoxazol, sulfanilamid and trimethoprim xác định đượckhoảng tuyến tính của các đường chuẩn đơn biến đều nằm trong khoảng nồng độ từ1,0 – 24,0 mg/l, giới hạn phát hiện là 0,2 – 1,0 mg/l Mô hình chuẩn của ba phươngpháp đa biến đượcxâydựng trên cơ sở dữ liệu phổ của các mẫu hỗn hợp chứa đồngthời các hoạt chất trên Kết quả phân tích cho thấy độ thụ hồi của hai mô hình PCR

và PLS xấp xỉ 100 %, trong khi mô hình CLS có độ thu hồi kém hơn hẳn Mô hìnhPCR dựa trên ma trận dữ liệu thô đã được lựa chọn áp dụng cho việc phân tích xácđịnh hàm lượng năm hoạt chất nghiên cứu trong các loại thuốc thành phẩm.[39]

1.3.1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năngcao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có độchính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác địnhcác sulfamid trong các sản phẩm dượcphẩm

Theo đó Sulfadoxin (trong viên nén Sulfadoxin và pyrimethamin) được địnhlượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với hệ pha động là: Dung dịch đệm pH 5,9 -acetonitril (4 : 1) Dung dịch đệm pH 5,9: Thêm 1 ml triethylamin và 200 mlacetonitril vào 700 ml nước, điều chỉnh đến pH 5,9 bằng dung dịch acid acetic 1 %,sau đó thêm nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều, lọc Điều kiện sắc ký: Cột thép không

gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5m) với detector quang phổ tử ngoạiđặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng: 2,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20l [1]

Theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37] Sulfamethoxazol (trong hỗn hợpthuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) được xác định với điều kiện sắc ký:Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút,thể tích tiêm: 20 µl Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin(điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natrihydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000ml

Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A Ozkan [16] đã tiến hành nghiên cứuthành công quy trình định lượng Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứaSulfamethoxazol và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vớipha động là hỗn hợp của methanol : nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid

sóng 213 nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể tích tiêm 10l Khoảng tuyến tính củaphương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ mlđối với sulfamethoxazol Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim vàsulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ml

1.4 Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với

thuật toán hồi quy đa biến

1.4.1 Sơ lược về phương pháp quang phổ hồngngoại

1.4.1.1 Lịchsử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồngngoại

Quang phổ hồng ngoại gần lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1881 bởiAbney và Festing khi làm việc với các tấm ảnh [25] Họ đã phát hiện ra sự tồn tạicủa các bức xạ nhiệt ở ngoài vùng phổ của ánh sáng nhìn thấy và chứng minh được

sự hấp thụ của các bức xạnàycó liên quan đến các thành phần hóa học trong các hợpchất nghiên cứu Wiliam W.Coblentz là một trong những người tiên phong đầu tiênnghiên cứu về quang phổ hồng ngoại Năm 1905, ông công bố kết quả nghiên cứucủa các hợp chất mà ông ghi lại từ 1000 nm đến 16.000 nm Việc Coblentz công bốkết quả đã tạo ra một bước đột phá mới cho các nhà nghiên cứu, có liên quan đếnquang phổ của các nhóm nguyên tử trong phân tử, liên quan đến sự hấp thụ ở giữa(2500-50,000nm) Từ đó, chúng ta có thể hiểu về liên kết hóa học như dao độnggiữa hai hay nhiều nguyên tử, các liên kết sẽ dao động và khi năng lượng được bổsung thì các dao độngnàysẽ mạnh hơn Dao động hóa trị đòi hỏi năng lượng cao hơn

so với dao động biếndạng

1.4.1.2 Nguyên tắc của phép đo phổ hồngngoại

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuậtphântíchrấthiệuquả.Mộttrongnhữngưuđiểmquantrọngnhấtcủaphươngpháp

phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia

X, cộng hưởng từ điện tử…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúcphân tử nhanh, không đòi hỏi các phép tính toán phứctạp.[27]

Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khảnăng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại,các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuấthiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.[7]

Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với cácnhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học Bởi vậy,phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì

cả chuyển dộng dao động và chuyển động quay đều bị kích thích Bức xạ hồngngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùngviba, vùng này có thể chia thành ba vùngnhỏ:

Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng

hết các vân hấp thụ của các nhóm chức như OH, NH, C=O, C=N, C=C…Vùng phổnhóm chức tập trung làm bốn vùng mà mỗi vùng, tần số đặc trưng nhóm có giá trị

động hóa trị của các nhóm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đôi kề nhau; vùng

vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các liên kết đơn như C, N, O…và các vân do dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C… nhưng thườngđược dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định các nhóm chức, vì ngoàicác vân hấp thụ trên còn có nhiều vân hấp thụ xuất hiện do tương tác mạnh giữac á c

C-dao động Các vânhấpthụ này đặc trưng cho chuyển động của các phân tử chứkhông thuộc riêng nhóm nguyên tử nào, và vì vậy, vùng phổ này thường được gọi là

hợp chất vô cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ liên quan đến dao động hóa trị củaC-Br, C-I và M-X(M- kim loại;O,N,S,C…) nhưng không phải máy hồng ngoại nàocũng đo được ở vùngnày.[7]

1.4.1.3 Điều kiện hấp thụ bức xạ hồngngoại

Không phải bất kỳ phần tử nào cũng có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại.Mặt khác bản thân sự hấp thụ đó cũng có tính chất chọn lọc Một phân tử chỉ có khảnăng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố sau [7] Một làtần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hoặc nhóm nguyên

tử cấu tạo nên phân tử đó) bằng chính tần số dao động cùng tần số của bức xạ tới.Hai là phân tử đó phải có momen lưỡng cực, vì khi phân tử lưỡng cực được giữtrong điện trường, các điện tích trái dấu sẽ chịu ảnh hưởng bởi các lực theo nhữngchiều ngược nhau, và làm các nguyên tử tích điện này dao dộng, chúng hấp thụ bức

ngoại

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồngngoại

Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử [7]

Do đó phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau:

Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụthuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian vàliên kết nội phân tử

Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: ở trạng thái khí các phân tửchuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại củacác chất ở thể kí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử Tuy nhiênkỹthuật đomẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu hồng ngoại ở dạng rắn hoặcdạng lỏng Các phân tử ở dạng rắn có thế tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau,

do đó phổ hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tácgiữa cấc phân tử

khi thay đổi mạng tinh thể Khi phân tử tồn tại ở các hệ dung môi khác nhau thì hấpthụ hồng ngoại cũng khác nhau, nguyên nhân là do sự tạo thành liên kết hidro giữacác phân tử làm dịch chuyển số sóng và mở rộng các vân hấp thu.

Ảnh hưởng của cường độ và hình dạng vân phổ hồng ngoại: Phương phápđịnh lượng bằng phổ hồng ngoại có độ chính xác không cao còn do hệ số hấp thumol ít lặp lại giữa các lần đo Ngoài ra khi trong quá trình ép viên mẫu rất khó cóthể xác định chính xác được độ dày viên mẫu (do mỗi viên mẫu chỉ có kích thước

ảnh hưởng đến cường độ, hình dạng peak của hợp chất[18]

1.4.1.5 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồngngoại

 Các kỹ thuật đo phổ hồngngoại

Hiện nay có hai phương pháp chính để đo phổ hồng ngoại là phương pháp đohấp thụ và phương pháp đo phản xạ Hai phương pháp này được đặc trưng bởi hailoại phổ kế là: phổ kế tán sắc và phổ kế biến đổi Fourier.Kỹthuật đo phổ tán sắc là

tốc độ quét khoảng 1 phút/ mẫu nhanh hơn nhiều so với loại máy hồng ngoại sơkhai đầu tiên nhưng vẫn rất chậm để phân tích thời gian thực Phổ kế hồng ngoạihiện đại là loại phổ kế biến đổi Fourier Loại phổ kế mới này khác loại phổ kế tánsắc cũ là thay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc cách tử) bằng một giao thoa kếMichelson cho phép khe sáng rộng hơn nên cường độ bức xạ vào detector cũng sẽlớn hớn Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tăng lên nhờ giảm được nhiễu do đó phổnhận được có chất lượng tốt hơn, đặc biệt thời gian ghi phổ nhanh, chỉ khoảng 30giây Khi kết hợp với sự hỗ trợ của máy tính kết nối giúp cho việc đo phổ được tựđộng hóa ở mức cao và phổ có thể được lưu trữ và đối chiếu với phổ chuẩn có trongthư viện của máy.[7]

 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu

Phép đo phổ hồng ngoại cho phép đo các chất ở thể rắn, thể lỏng tinh khiết,trong dung dịch hoặc thể hơi Đối với mỗi thể khác nhau chúng ta có các cáchchuẩn bị mẫu tương ứng như sau:[7,12]

- Mẫu ở thể rắn: có hai cách đo khi mẫu ở thểrắn

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi mộtlớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy

Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu thật đồng đều với bột KBr theotỷlệkhối lượng/ khối lượng là 1:10 đến 1:100, nghiền kỹ bằng cối mã não Ép mẫuthành màng mỏng gần như trong suốt bằng bộ ép viên cầm tay hoặc máy ép thủylực, đặt mẫu vào giá đỡ cuvet đểđo

- Mẫu ở thể lỏng tinh khiết: chuẩn bị mẫu bằng cách ép một lượng nhỏ chấtlỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01- 0,1mm

- Mẫu trong dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưavào cuvet đặc biệt có độ dài 0,1 -1 mm và được làm bằng NaCl Để loại bỏ các chấthấp thụ của dung môi, một cuvet so sánh có chứa dung môi tinh khiết được đặt ở tiasáng

- Mẫu ở thể hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độdài 10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua Trong thực tế

để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoạiđược ghép với máy sắc ký khí, khi đó mỗi hợp phần sau khi được tách ra từ hệ sắc

ký khí sẽ được ghi phổ hồng ngoại và được lưu giữ lại trong máytính

1.4.1.6 Mộtsố ứng dụng của phương pháp phổ hồngngoại

Cùng với sự phát triển của khoa họckỹthuật phương pháp đo phổ hồng ngoạingày càng chứng minh được tính ưu việt của mình và dần trở thành phương phápứng dụng trong nhiều lĩnh vực Dưới đây là một số những ứng dụng chính củaphương pháp này trong phân tích dượcphẩm

- Xác định kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quansát thấy dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài Năm

1985, tác giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụtại bất kì bước sóng nào với kích thước hạt.[21]

- Độ ẩm: hàm lượng nước trong các mẫu là nguyên nhân chính gây ra hệ sốsuygiảmcườngđộhấpthụtrongphổhồngngoạicủacácvậtliệudượcphẩm.Dựa

vào đặc tính này J Luypaert và các đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định hàmlượng nước thông qua việc xác định độ ẩm của mẫu với nhiều loại hoạt chất [25]

- Độ cứng: đây là một trong các ứng dụng quan trọng của phương pháp hồngngoại trong quá trình quản lý chất lượng của quá trình sản xuất Phương pháp IR cóthể xác định được độ cứng của viên thuốc trong quá trình ép viên mà không cần phámẫu Sự thay đổi về độ cứng của thuốc có thể dược quan sát dưới dạng đường phổnền dốc dịch chuyển khi độ cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên Điều này rõrệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng [25,29]

- Định lượng các hoạt chất trong dung môi hay trong hỗn hợp [7]: Cơ sở củaphương pháp này dựa trên phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mốiquan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng và nồng độchất:

Log=

Theo phương trình trên, ở một bước sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỷ lệvới nồng độ C, chiều dày cuvet d và bản chất của chất mẫu Như vậy, khi phân tíchmột chất, đo ở một bước sóng xác định với một cuvet có chiều dày d đã biết thì độhấp thụ quang A chỉ còn tỷ lệ với nồng độ C của mẫu chất Do phương trình trên chỉchính xác với dung dịch có nồng độ loãng nên phương pháp phân tích định lượngbằng phổ hồng ngoại chỉ áp dụng đo trong dung dịch, còn theo phương pháp ép mẫurắn (ép KBr) thì chỉ phân tích bán định lượng do tín hiệu độ hấp thụ quang bị ảnhhưởng bởi các yếu tố như tính chất vật lý, nhiệt độ, độ ẩm, độ dày viên mẫu.Phương pháp phổ hồng ngoại chỉ có thể áp dụng để phân tích định lượng hỗn hợpcác mẫu khi sử dụng các thuật toán hồi quychemometris

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung

bình kết hợp vớichemometrics

1.4.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đabiến

Chemometrics được định nghĩa là việc ứng dụng các phương pháp toán học,thống kê, đồ hoạ,… để qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá họctríchratừtậpsốliệuphântíchvàđưaratốiđanhữngthôngtinhữuíchtừtậpsố

liệu ban đầu [8] Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ70,cho tới nay Chemometrics

đã xác lập được một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học, đặc biệt làtrong hoá học phân tích hiện đại Một mảng lớn trong Chemometrics phát triểnnhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi qui đa biến – kỹ thuật đa biến đượcdùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài toán xác địnhđồng thời nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách loại trước Vềnguyên tắc, chỉ cầnxâydựng dãy mẫu chuẩn có mặt tất cả các cấu tử cần xác địnhvới nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x), đo tín hiệu phân tích củacác dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y và thiết lập mô hìnhtoán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến độc lập x (nồng độ cácchất trong hỗn hợp) Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ của các cấu tửtrong cùng mẫu định phân khi có tín hiệu phân tích của dung dịchđó

Trong luận văn này chúng tôi đã sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại gần

và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính để định lượngcác sulfamid Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phươngpháp hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đabiến tuyến tính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, và phươngpháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần nhưILS

 Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (classical least square-CLS)

K là vecto hệ số của phương trình hồi qui K là ma trận (kx1) nếu y là véc tơcột biểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn với y là vecto (mx1), X là matrận (mxk), và e là vecto số dư (mx1) K là ma trận (kxp) nếu y là số liệu dạng matrận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví

dụ đo độ hấp thụ quang tại p bướcsóng)

 Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least

squares-ILS)

Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS) hay còn gọi là phuơngpháp ma trận P được xây dựng trên giả thiết rằng nồng độ của tín hiệu phân tích làhàm của tín hiệu đo [4, 5, 8]:

C = P ATrongp h ư ơ n g p h á p h ồ i q u i đ a b i ế n , p h ư ơ n g t r ì n h t r ê n c ó t h ể k h a i

Am: Giá trị tín hiệu đo ở thời điểm m

Pxm: Giá trị hệ số hồi qui của cấu tử thứ x tại thời điểm m

Do trong tập số liệu C và A đều có chứa sai số ngẫu nhiên nên để P mô tảchính xác quan hệ giữa C và A ta cần xác định P bằng phương pháp bình phương tốithiểu (tổng bình phương của sai số giữa giá trị tính theo mô hình và giá trị thựcnghiệm là nhỏ nhất)

* Xác định công thức tính P:

C = A P

AT C= AT A P[AT.A]-1.AT.C=[AT.A]-1.[AT.A].P [AT.A]-

số hàng tối thiểu bằng số cột Mỗi hàng trong A là tín hiệu của một mẫu, mỗi cột làtín hiệu của các mẫu ở một thời điểm nhất định Vì vậy, trong phương pháp ILS sốmẫu không được ít hơn số thời điểm đo Do yêu cầu về số mẫu tối thiểu nhưtrênnên

để tiến hành sử dụng phương pháp này, ta cần lựa chọn số thời điểm đo tối thiểuđặc trưng nhất trên toàn dải phổ, vì vậy, phương pháp ILS còn được gọi là phươngpháp phổ riêng phần Các điểm đo đặc trưng này thường là những điểm thỏa mãncác yêu cầusau:

- Giá trị tín hiệu đo tại các thời điểm này lớn so với các điểm đo khác để tăngđộnhạy

- Tín hiệu của các cấu tử khác nhau tại mỗi điểm đo được lựa chọn phải biến đổi khác nhau tức là có sự khác biệt lớn về tín hiệu đo tại mỗi điểm của các cấutử

- Tại các điểm này, tín hiệu của các ion cản trở phép đo là nhỏnhất

*Dự đoán thông tin của mẫu chưa biết:

được nồng độ các chất dựa vào ma trận P đã tính:

Cunk= Aunk P

PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độclập X và biến phụ thuộc Y, từ đó có thể đoán được thông tin trong Y khi đã biết cácthông tin của X và ngược lại PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance)giữa ma trận X và Y Hai ma trận X và Y được phân tích thành một ma trận số(score matrices) T chung và ma trận nạp (loading matrices) P và Q

Hay X= T x P + E

Y= T x Q + F

Tính chất quan trọng của PLS là chúng ta có thể nhận được một ma trận Tchung cho cả 2 phương trình [4, 8]

PCR - phương pháp hồi quy cấu tử chính, gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tửchính chuyển sang tập dữ liệu mới, chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết.Sau đó sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo để phân tích tập dữliệu mới này

Trước tiên, chiếu tập số liệu tín hiệu phân tích đó lên không gian có ít chiềuhơn theo PCA mà không làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tíchhồi qui đa biến trên không gian mới này Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập

số liệu có thể được gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập

số liệu và sử dụng giá trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồiqui đa biến tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu

Cũng cần lưu ý rằng, do phương pháp này phát triển trên cơ sở của phươngpháp ILS nên để sử dụng được các phương pháp này trong phân tích phổ hồngngoại chúng ta cần số mẫu chuẩn tối thiểu phải bằng số thời điểm sử dụng trongđường chuẩn mã hóa, tức là số mẫu chuẩn không nhỏ hơn số PC lựa chọn Lấy một

ví dụ cụ thể, khi đo phổ của 15 mẫu chuẩn tại 100 bước sóng, để sử dụng phươngphápILS,chúngtacầnphảigiảmkíchthướcphổxuốngsốbướcsóngkhôngquá

15 Cách đơn giản nhất là chọn ít hơn 15 bước sóng để đo độ hấp thụ nhưng sai số

sẽ lớn nếu không chọn được các bước sóng đặc trưng cho phổ các chất Với môhình PCR ta có thể sử dụng toàn phổ để tính các PC, sau đó chọn số PC nhỏ hơn 15

để tính toán tiếp Thông thường, với một tập số liệu có mức độ tập trung tốt thì chỉ

có một số ít các PC đầu tiên là có nghĩa (có tổng phương sai tích lũy đủ lớn để coirằng chúng đã chứa toàn bộ thông tin hữu ích đặc trưng của tập số liệu) Như vậy,

sử dụng mô hình PCR có thể giảm được kích thước tập số liệu mà không làm mấtthông tin đồng thời có thể loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc [4,8]

* Các bước chính của PCR bao gồm:

1 Xử lý ban đầu (không bắtbuộc)

Nội dung chính của bước này là chuẩn hóa tập số liệu

2 Các xử lý cầnthiết:

Với một tập số liệu đã chuẩn hóa hoặc chưa chuẩn hóa, trước khi sử dụng đều cầnbước bình phương toàn tập dữ liệu - đây là yêu cầu bắt buộc đối với hầu hết cáchàm tính vectơriêng

D = AT ATrong đó A là ma trận số liệu biểu diễn độ hấp thụ quang theo các thời điểm đo của

3 Xác định các vectơ riêng hay cácPC:

Có thể tính toán các vectơ riêng của tập số liệu bằng nhiều hàm toán học khác nhau

Có 3 hàm chính, thường sử dụng là hàm NIPALS (hàm phi tuyến lặp sử dụng kĩthuật bình phương tối thiểu riêng phần), hàm SVD (hàm phân tách các giá trị riêng)

và hàm Princomp (hàm tính các cấu tử chính) Cần lưu ý rằng, tất cả các hàm nàyđều tính toán và đưa ra tất cả các cấu tử nhưng thường không sử dụng tất cả mà chỉ

sử dụng N cấu tử đầu đủ để xác định không gian mới :

NIPALS là hàm lặp thường sử dụng cho các tập số liệu kích thước lớn hoặc

có độ đa cộng tuyến cao Với tập số liệu có kích thước nhỏ, quá trình tính lặp tronghàm NIPALS sẽ làm khuếch đại sai số của tập số liệu nên thông thường người takhông sử dụng hàm này để tính các PC

SVD là hàm tính PC sử dụng phương pháp tách tập số liệu ban đầu thành cácnhân tố Các vectơ riêng và trị riêng của ma trận dữ liệu đều là những tập con riêngcủa các nhân tố trong SVD Hàm SVD sử dụng hình thức chéo hóa cho phép khốngchế thang đo một cách hợp lí nên giảm thiểu được sai số do làm tròn Vì vậy hàmnày sử dụng được với các kiểu tập số liệu rộng rãi hơn hàm NIPALS

Princomp là hàm tính toán trực tiếp các cấu tử chính (PC) có vai trò tươngđương các vectơ riêng Tuy nhiên, so với hàm SVD thì việc sử dụng hàm Princompvới tập số liệu lớn có ưu điểm là phương sai tập trung không cao nên vị trí các PC

sẽ chênh lệch không quá lớn, do đó sai số trong quá trình làm tròn số và chuyển hóatập số liệu sẽ nhỏ hơn.

-là ma trận trong đó mỗi cột -là một vectơ hay nhân tố mới - PC - của ma trận dữ liệu

và số hàng ma trận là số thời điểm đo Mỗi nhân tố hay vectơ này lại là tổ hợp bậcnhất của các điểm phổ ban đầu, phần đóng góp của các điểm này vào mỗi vectơ làkhác nhau tùy thuộc vào giá trị hàm phụ thuộc tại điểm đó Những điểm có giá trịđóng góp lớn vào các PC chứa phương sai lớn sẽ là những điểm đo có ảnh hưởngquyết định tới kết quả tính ma trận hệ số hồi qui và kết quả hồi qui sau đó Ma trậnkết quả thứ hai cũng rất quan trọng là ma trận phương sai của các PC: đó là dạng matrận chéo đối với hàm SVD, là một vectơ cột đối với hàm NIPALS và hàmPrincomp

4 Lựa chọn các vectơ cónghĩa

Đây là bước có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến bước xử lý tiếp theo Nếugiữ lại nhiều vectơ hơn số cần dùng thì những vectơ đó sẽ chứa cả tín hiệu nhiễu vànhư vậy, kết quả hồi qui sẽ mắc phải sai số Nếu giữ lại không đủ số vecto cần thiết

sẽ làm mất đi thông tin có ích từ tập dữ liệu, điều này cũng sẽ gây nên sai lệch giữa

mô hình hồi qui thu được và mô hình thực Vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn cácvectơ có nghĩa là rất quan trọng Dưới đây là một số phương pháp phổ biến để xácđịnh số PC có nghĩa :

(tính phần trăm phương sai tích lũy), hàm IEF,

tin từ dữliệu

Các phương pháp này đều có những ưu điểm riêng khi sử dụng và kết quảđánh giá tương đối thống nhất với nhau Phương pháp được sử dụng rộng rãi để lựachọn các PC có nghĩa khi các PC này được tính bằng hàm SVD hay Princomp làphương pháp tính và đánh giá qua phần trăm phương sai tích lũy của các PC đó.Cách tính này đơn giản hơn và các hàm tính PC trên đã cho sẵn dữ liệu để có thểđánh giá nhanh.

5 Tính toán lại

Sau khi loại bỏ các vectơ riêng không có nghĩa, chúng ta cũng loại được tínhiệu nhiễu của dữ liệu gốc và cần tính lại dữ liệu sau khi loại bỏ sai số Như vậy,khi tính toán ở hệ tọa độ mới ta đã loại bỏ được tín hiệu nhiễu trong tập dữ liệu banđầu

6 Xây dựng đườngchuẩn

Khi xây dựng đường chuẩn PCR theo phương pháp ILS, điểm khác biệt duy nhất là tập số liệu sử dụng

Các bước tiến hành bao gồm:

- Xác định phép chiếu trong hệ tọa độ mới:

Aj= A Vc

Trong đó:

A: ma trận gốc

F = (AjT Aj)-1 AjT CNồng độ chất phân tích trong mẫu chưa biết được tính theo công thức:

Cx= Ax Vc F

= Ax Fcal

Ưu điểm của phương pháp PCR:

- Hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương pháp ILS đồng thời khắc phụcđược các nhược điểm của phương pháp ILS do tiến hành tính toán trên toànphổ.

nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phùhợp

khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ nênkém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc Khi sử dụng mô hìnhPCR,tuykết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp của các điểm đo sẽkhác nhau tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này vào các PC được chọn màlượng đóng góp này lại được phân tích dựa trên tín hiệu đo tại từng điểm của cácmẫu chuẩn Do có sự phân biệt và chọn lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quảthu được sẽ chính xác hơn phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phươngpháp phổ toàn phần khác [4,8]

1.4.2.2 Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng

ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đabiến

Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây NIR đã trở thành một trong những công

cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp Đây là một kỹ thuật phân tích rấtnhanh: chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉtrong vòng một vài giây [22] So với phương pháp phân tích truyền thống để địnhlượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất hữu

cơ trong phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trongquá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản,chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [25].Tuy nhiên, NIR có một số nhược điểm như: giới hạn phát hiện cao do đó không phùhợp với các phép phân tích lượng vết, không đưa ra được các thông tin đặc trưngnếu chỉ đo tại một bước sóng Kết quả đo phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽcủa các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viênmẫu, tỷ lệ ép viên Vì thế NIR thường không được sử dụng như một kỹ thuật phântích trựctiếp

Việc sử dụng phổ hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồiquyđa biến đãgóp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượngmẫu Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguca và các cộng sự [27] đã nghiên cứu thànhcông phương pháp định lượng nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoạigần Không giống như các phương pháp định lượng truyền thống là dựa trên cơ sởcác phản ứng dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượngaminoglycosides [34, 37], trong nghiên cứu này các tác giả đã đưa ra một phươngpháp hoàn toàn mới để xác định các hoạt chất này Theo đó, phương pháp này đãđược phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và

ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đãđược chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắnthương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate Mẫu đượctiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier.Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gầnphù hợp với hàm lượng neomycin sulphate Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong cácmẫu thương mại Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác địnhthành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số6,6%

Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định Tuy nhiên phươngpháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký S.T.H.Sherazi [33] đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác địnhroxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tíchthống kê đa biến Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống cònkhoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu

Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kếthợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thờiglycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [32]

Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ramộtkỷnguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường-công nghệ hóa học xanh Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻtrên thế giới Hiện nay, tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech(Pháp), nhóm nghiên cứu đã ứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tíchcủa hỗn hợp các chất trong sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả củatừng biến đã có rất nhiều nghiên cứu thu được kết quả tốt [20, 22, 24] Đặc biệt,việc áp dụng các thuật toán đã mở ra những phương pháp đo nhanh có thể đưa cácphép phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giớithiệu các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả Các máynàyđều có ưu điểm là khágọn nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường khôngđưa ra được các kết quả có độ chính xác cao Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúnglại không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu.

Do đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trungbình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc

là một vấn đề vô cùng cầnthiết

Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamidbằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố Đâychính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạtchất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồngngoại gần và trung bình Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiêncứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đophức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phépphân tích ra khỏi phòng thínghiệm

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung và phương pháp nghiêncứu

2.1.1 Nội dung nghiêncứu

Để xây dựng qui trình phân tích định lượng nhanh ba hoạt chấtsulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoạikết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đềsau:

- Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ IR trong vùng hồngngoại gần và trung bình của các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol vàtrimethoprim

- Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính, lựa chọn cácthông số tối ưu của các mô hình trên cơ sở của mẫuchuẩn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo độ hấp thụ của chất phântích trong vùng hồng ngoại gần và trungbình

- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phươngpháp hồiquyđa biến xác định đồng thời các hoạt chấttrên

- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu được để định lượng nhanh thành phầnhoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường So sánh kết quả tìmđược với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong dượcđiển

2.1.2 Phương pháp nghiêncứu

Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa vào phổ hấp thụ của ba hoạt chất

là sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (thườngdùng kết hợp với sulfamethoxazol để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc)

trên trong dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đabiến

Tiến hànhxâydựng mô hình hồi quy đa biến xác định một hoạt chất và các tádược gồm 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra, mô hình hồiquyđa biến xác định cả bahoạt chất và các tá dược gồm 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra bằng cách chuẩn bịcác mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra theo như quy trình như dướiđây: