Hoa sinh phn III ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN VÀ AXIT AMIN

mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau: - Trong trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột h

1

PHẦN III:

THÍ NGHIỆM

2

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN VÀ AXIT AMIN Bài 1 : Định lượng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl

1 Nguyên tắc

Bản chất của phương pháp Kjeldahl là khi đun nóng chất hữu cơ trong môi trường axit sunfuric đậm đặc sẽ giải phóng ra anhydric của axit sunfuric (SO3) Chất này sẽ phân li thành SO2 và giải phóng oxy nguyên tử Oxy giải phóng ra sẽ hóa hydro và cacbon của hợp chất hữu cơ để tạo thành CO2, H2O còn nitơ sẽ tạo thành NH3 Ví dụ :

NH 2 -CH 2 COOH + 3H 2 SO4 = 2CO 2 + 3SO 2 +4H 2 O +NH 3

Khi amoniac tạo thành sẽ kết hợp ngay với axit-sunfuric dư và tạo thành sunfat amoni:

2NH 3 + H 2 SO 4 = (NH 4 ) 2 SO 4

Sunfat amoni sẽ bị phân hủy trong môi trường kiềm:

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na 2 SO 4 + 2NH 3 + 2H 2 O

Khí amoniac thoát ra khi cất lại được thu vào bình chứa H2SO4 đã biết trước

số lượng Căn cứ vào lượng H2SO4 dư sau khi cất ta biết được lượng NH3 đã thoát ra và do đó đã biết được lượng nitơ chứa trong mẫu phân tích

2 Tiến hành

Xác định đạm toàn phần trong nước chấm hay dung dịch có lượng đạm 5-30 g/lít Dùng pipet hút 5 ml nước chấm cho vào bình định mức 100 ml rồi thêm nước cất tới ngấn bình Lắc đều rồi lấy 10 ml cho vào bình Kjeldhal 100 ml Tiếp đó cho khoảng 3,5 gam hỗn hợp CuSO4 + K2SO4 (theo tỷ lệ 6:1 hay 10:1) để xúc tác hoặc cho selen vào xúc tác Quá trình vô cơ hóa với 2 ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,835) Dùng ít nước sạch tráng sạch cổ bình Kjeldhal rồi đặt bình vao bếp điện hoặc đèn cồn đun cho tới khi dung dịch có màu xanh của sunfat đồng hoặc xanh vàng cũng được

Đun xong để nguội rồi chuyển toàn bộ dung dịch vào bình cầu của máy cất đạm 5-30 g/lít Tráng bình Kjeldhal nhiều lần bằng nước cất rồi đổ vào bình cất Mặt khác hút 15 ml dung dịch H2SO4 0,1N cho vào bình tam giác 250 ml, cộng thêm 5-10 ml nước và 3 giọt methyl đỏ hay phenolphtalein rồi đặt bình vào vị trí làm việc Chuẩn bị xong ta lấy cho tới khi thử giấy quỳ với nước ngưng thoát ra không còn phản ứng kiềm là được bình thường cất tiến hành khoảng 40 – 50

3

phút Cất xong dùng bình tia rửa sạch axit bám ở ống ngưng nhúng trong bình tam giác Sau đó đem chuẩn lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N rồi suy lượng H2SO4 đã tác dụng với NH3

3 Tính kết quả

Hàm lượng nitơ trong 1 lít nước chấm tính theo công thức (tính lượng toàn phần) bao gồm các loại nitơ có trong dung dịch:

Ntf = ×1000 (g/l) = ×1,4 (g/l) trong đó:

a: số ml dung dịch H2SO4 0,1N cho vào bình tam giác;

b: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân lượng axit dư;

0,0014: số gam nitơ ứng là 1 ml dung dịch H2SO4 0,1N;

0,5: số ml nước chấm chứa trong mẫu phân tích hoặc số ml dịch đạm đem phận tích theo phương pháp lấy mẫu và pha loãng

Bài 2: Định lượng NH 3 (trong nước chấm)

Nước chấm cũng như một số sản phẩm thực phẩm khác thường chứa một lượng NH3 ở dạng muối vô cơ hoặc hydroxyd Hàm lượng của chúng phụ thuộc quá trình sản xuất và điều kiện bảo quản Nếu nước chấm chứa nhiều NH3 thì không những gây mùi vị khó chịu, làm giảm chất lượng của sản phẩm mà có thể gây độc hại cho cơ thể Hạn chế sự tăng hàm lượng NH3 trong sản phẩm là một yêu cầu quan trọng trong kỹ thuật bảo quản thực phẩm

Để xác định ta lấy vào bình cất đạm 10 ml nước chấm sau đó cho thêm khoảng 50 ml nước cất Nối bình với hệ thống cất đạm rồi qua phễu cho vào 10g MgO (bảo đảm cho hỗn hợp có tính kiềm) và tiến hành cất trong 30 – 40 phút ở nhiệt độ khoảng 40 – 50 °C NH3 bay ra cũng thu vào bình chứa axit sunfuric (tương tự xác định đạm toàn phần)

Chất chỉ thị Tashiro được chuẩn bị từ 100 ml methyl đỏ 0,3% trong cồn + 15

ml methylen xanh 1% trong cồn

2 Các bộ cất đạm để thu NH3 bay ra có thể tự lắp đơn giản nếu các phòng thí nghiệm không có các bộ cất đạm đầy đủ hệ thống từ bộ cất đơn giản, bộ cất phức

4

tạp có đủ các bộ phận, bộ cất đạm tự động cao có cả bộ phận chuẩn và đọc số dịch đo luôn

3 Bộ vô cơ hóa các chất bằng H2SO4 đậm đặc từ vô cơ hóa đơn giản trên bếp điện bếp cát, bếp dầu từ bộ vô cơ hóa kín nhiệt độ cao sẽ rút ngắn được thời gian

vô cơ hóa

Bài 3: Định lượng axit amin bằng phương pháp chuẩn độ formol

1 Nguyên tắc

Cơ sở của phương pháp là khi thêm formaldehit vào dung dịch chứa axit amin thì dưới tác dụng của formaldehyt, các nhóm amin sẽ bị methyl hóa và mất tính kiềm Nhờ đó axit amin trở thành axit mạnh hơn và có thể tác dụng với kiềm Căn

cứ vào lượng NaOH tiêu hao ta tính được lượng axit và do đó biết được lượng nitơ theo sơ đồ phản ứng sau:

Phản ứng xảy ra hoàn toàn ở pH: 9,0 – 9,5 Vì thế khi dùng chỉ thị là phenolphtalein phải chuẩn dung dịch tới màu sẫm

+ Dung dịch axetat chỉ trung tính: Cân 20gam PbO và 6 gam Pb(CH2COO) cho vào cốc rót vào 10ml nước và đặt trên nồi cách thủy cho đến khi dung dịch có màu trắng hoặc trắng hồng Sau đó cho thêm 190 ml nước khuấy đều rồi để cho lắng

và gạn lấy dịch trong Tiếp theo cho dung dịch vào bình nút nhám để bảo quản khỏi tác dụng của CO2

+Dung dịch Na2SO4 bão hòa

3 Tiến hành

Lấy 5-10 ml nước chấm hay dịch đạm khác nhau từ 8-20g/l cho vào bình định mức 100ml, thêm vào đó mảnh giấy quì rồi trung hòa đến môi trường kiềm yếu

5

Tiếp theo cho vào 10ml dung dịch axetat chì rồi thêm nước ngấn bình Lắc đều và đem lọc rồi lấy 20ml cho vào bình định mức khác có dung tích 100ml Thêm vào

đó 10ml dung dịch Na2SO4 để khử lượng chì dư rồi đổ nước cất tới ngấn bình, lắc đều và đem lọc

Lấy 10ml dung dịch cho vào bình tam giác 250ml, nhỏ vào vài giọt phenolphtalein rồi trung hòa bằng NaOH 0,1N đến xuất hiện màu hồng nhạt Tiếp theo cho vào 5ml hỗn hợp formol, lắc đều rồi để yên cho phản ứng Sau 2 phút đem chuẩn hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,1N đến xuất hiện màu đỏ đậm (có thể màu xanh tím)

4 Tính kết quả

Hàm lượng đạm amin tính theo công thức sau:

Namin = × 1000 = (g/l) trong đó:

+ a: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân;

+ số ml nước chấm tham gia mẫu phân tích trong trường hợp cụ thể của thí nghiệm (hệ số pha loãng):

n = × × 10 = 1 ml;

+ 0,0014: số gam nitơ với 1 ml dung dịch NaOH 0,1N

6

ĐỊNH LƯỢNG GLUXIT Bài 1 Định lượng đường khử (bằng phương pháp Bertrand)

Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu+ trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH)2 Muối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehut hoặc xeton dễ dàng khử Cu+2

thành Cu+ tạo ra kết tủa oxit đồng (Cu2O)

có màu đỏ, bản thân đường bị oxy hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling

Để định lượng oxit đồng I được tạo thành trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt

3 hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit sunfuric, Cu+ sẽ bị oxi hóa trở lại thành Cu+2, còn Fe+3 bị khử thành Fe+2

Cu 2 O +Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2H 2 SO 4 = 2CuSO 4 + FeSO 4 + H 2 O

Tiếp đó lượng Fe+2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịch KMnO4 chuẩn độ trong môi trường axit

10FeSO4 + 2KMnO 4 + 8H 2 SO 4 = 5Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 +H 2 O

Dựa vào lượng KMnO4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMnO41/30N và lượng đường khử (bảng 1) để dễ sử dụng

2 Dụng cụ

7

+ Phểu lọc đường (xốp) chuyên dùng để xác định thành phần đường

+ Bình Bunzen nối chân không

+ Bơm chân không

+ Bình tam giác 100ml, bình định mức 50ml, 100ml, cốc và phểu lọc

3 Hóa chất

+ Fehling I: 40g CuSO4·5H2O/1 lít

+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g NaOH/ 1 lít

+ Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: 50g Fe2(SO4)3 + 200ml H2SO4 đậm

đặc (d = 1,4)/lit Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni

+ 86g (NH4)2SO4·Fe2(SO4)3 ·24H2O + 200g (108,7ml) H2SO4 d = 1,84/l

+ KMnO4 1/30N ; 1,06g KMnO4/1 lít nước cất đun sôi Nồng độ KMnO4 được

xác định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha

Bảng 1: Bảng thực nghiệm của Luxisun

KMnO4

1/30N

(ml)

Glucose (mg)

Fructose(mg)

KMnO41/30N (ml)

Glucose (mg)

Fructose(mg)

8

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:

- Trong trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 - 80°C Chuyển toàn bộ hổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít Đun cách thủy 70 - 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat [Pb(C2H2O2)2·3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO3)2] 10% Tránh dùng quá dư chì axetat (dùng 2 - 5ml chì axetat) Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cố hay bình khô Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm

- Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì axetat vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ như cà chua, dứa, chanh, khế cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0

9

không mất đi trong 20-30 giây Biết lượng định phân, tra bảng suy ra lượng đường trong dung dịch thí nghiệm Làm thí nghiệm kiểm chứng song song thay dung dịch đường bằng nước cất

+ 1000: hệ số chuyển đổi sang mg

Bài 2: Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

Khi trộn hai dung dịch Fehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn:

Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trời:

CuSO 4 + 2NaOH = Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịch màu xanh thẫm:

10

Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling:

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường H2SO4 sẽ giải phóng ra iot tự do

CuSO 4 + 4KI + H 2 SO 4 → I 2 + CUI 2 + 2 K 2 SO 4

Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosunfat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch

I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 = Na 2 S 4 O 6 + 2NaI

2 Hóa chất

+ Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO4·5H2O trong 500ml H2O

+ Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H2O

+ Dung dịch KI 30%

+ Dung dịch H2SO4 25%

+ Dung dịch Na2S2O3 0,1N

3 Tiến hành

Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:

- Trong trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 - 80°C Chuyển toàn bộ hổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít Đun cách thủy 70 - 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat [Pb(C2H2O2)2·3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO3)2] 10% Tránh dùng quá dư chì axetat (dùng 2 - 5ml chì axetat) Sau đó

11

loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cố hay bình khô Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm

- Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì axetat vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ như cà chua, dứa, chanh, khế cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0

ít hơn hoặc pha loãng dung dịch đường Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng

I oxit thì phải tăng lượng dung dịch đường, giảm nước cất (luôn đảm bảo thể tích

a – số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng,

b – hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,

f – hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N

3,3 – hệ số chuyển thành đường

12

V – tổng thể tích dịch chiết từ m gam nguyên liệu (ml)

1 Nguyên tắc

Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử là glucozo và fructozo Định lượng đường khử tạo thành cho pháp tính được lượng saccarose có trong mẫu thí nghiệm

C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 (Saccarose) (Glucozo) (Fructozo)

2 Hóa chất

+ Dung dịch HCl 5%

+ Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa

+ Metyl đỏ 0,02% (o,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất + Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo phương pháp Bertrand

3 Tiến hành

+ Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xác định đường khử cho vào bình nón 250ml)

+ Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%

+ Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30 – 40 phút, làm nguội nhanh

+ Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH 6,5 – 7,0 với chỉ thị metyl đỏ (3 giọt)

+ Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

+ Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand

Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thể kết quả sẽ bị sai khác, bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một số phần hay hoàn toàn Trong quá trình thủy phân những chất này cũng

13

tạo thành các monosacarit Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung dịch đạt 75 – 80%

4 Tính kết quả

Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo công thức:

X = (a – b)×0,95

Trong đó: X – hàm lượng saccarose tính theo %

a – hàm lượng đường khử theo glucozo của dịch đường sau khi thủy phân bằng axit (%)

b – hàm lượng đường khử của dung dịch đường (trước khi thủy phân) (%)

0,95 – hệ số chuyển từ glucozo sang saccarose

Bài 4 - Phương pháp Định lượng saccarose

1 Nguyên tắc

Làm trong dung dịch trước khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có góc quay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo Các chất làm trong thường sử dung là:

Axetat chì trung tính Pb(CH3COO)2·3H2O và axetat chì kiềm tính 2Pb(CH3COO)2·Pb(OH)2 ở dạng bột hoặc dung dịch Axetat chì lắng hàng loạt các chất như axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màu melanoidin Chú ý là không dùng quá lượng axetat chì vì một số kết tủa

có khả năng hòa tan khi dư axetat chì như các protein

Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp gồm hai dung dịch Pb(NO3)2 và NaOH 340 g Pb(NO3)2 /1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượng bằng nhau (5-10 ml) Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau

Chú ý: Lượng chì dư trong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH2PO4 hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc

Thước đo độ đường: theo quy định thước đo độ đường trong kế chỉ 100°S khi

ta hòa tan 26g đường saccaroza tinh khiết trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200 mm ở 20°C 26g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn Khi cân mẫu với lượng cân chuẩn và phân cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước đo cho ta biết % đường trong mẫu Trong thực tế phân tích ta có thể lấy bội số hoặc ước số của chúng Ví dụ nếu lấy 13g pha trong 100ml phân cực trong ống 200 mm thì thành phần đường sẽ là P×2, trong đó: P –

số đọc trên máy Hoặc pha 26g trong mẫu 100 ml phân cực bằng ống 100 mm thì thành phần đường cũng bằng P×2

2 Dụng cụ và hóa chất

Đường kế

50 ml nước cất Đun sôi trong ½ giờ để thủy phân oxit Để nguội, lọc, pha bằng nước cất đến 1 lit (54Bx)

Dung dịch nitrat chì: 340 g Pb(NO3)2 trong 1 lit; 32g NaOH trong 1 lit

Xác định hàm lượng saccaroza trong đường kính

Cân 26 g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã cân trọng lượng cốc) Hòa tan đường trong cốc bằng khoảng 40 – 50 ml nước cất đã đun nóng dùng đũa thủy tinh khuấy cho đường tan hết Rót toàn bộ dung dịch đường sang bình định mức, rửa sạch đường trong cốc, que thủy tinh và phễu bằng một ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức Thêm nước cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng 15-20 phút cho nhiệt độ dung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 phút rồi lọc Khi lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng kính thủy tinh để tránh nước bay hơi làm thay đổi nồng độ Mẻ lọc đầu đổ đi Nước lọc phải trong suốt Rót dung dịch vào ống phân cự 200 mm; nhớ tráng ống bằng dung dịch nước lọc 1-2 lần và rót bằng cách đẩy nhẹ trên miệng ống để tránh tạo bọt Đậy nắp ống phân cực bằng nắp thủy tinh bằng cách đẩy nhẹ nắp trên miệng ống Giữ yên rồi vặn nút cao su vào miệng ống Lau khô hai đầu ống bằng một miếng giấy lọc Đưa ống

ra ánh sáng quan sát, ống phải được nhìn thông suốt và không có bọt, nếu có bắt buộc phải làm lại Đặt ống phân cực vào máy, bật điện và bắt đầu đo Ghi kết quả

và ghi nhiệt độ t

4 Tính kết quả

Hàm lượng đường saccaroza tính theo %; X

Bài 4 : Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác

Muốn biết riêng hàm lượng của glucose và fructose, người ta phải định lượng fructose Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucose bằng hiệu hàm lượng đường khử và hàm lượng fructose Trước hết phải xác định lượng đường khử tổng số, sau đó mới xác định lượng fructose

1 Nguyên tắc

Đầu tiên oxi hóa glucose và các đường khử khác bằng dung dịch kiềm của iôt

CH 2 OH(CHOH) 4 CHO + I 2 + 3NaOH = CH 2 OH(CHOH) 4 COONa + 2NaI + 2H 2 0

Trong điều kiện này, fructose không bị oxi hóa Sau đó xác định fructose bằng phương pháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng

đỏ và trung hòa hỗn hợp bằng NaOH 5%

Thể tích dung dịch thu được là Vđo Dịch thu được chỉ chứa fructose Phân tích fructose theo phương pháp Bertrand hoặc theo phương pháp vi lượng

4 Tính kết quả

16

Nếu fructose được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường được xác định theo công thức sau:

Trong đó:

a – số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng,

b – hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,

f – hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N

3,3 – hệ số chuyển thành đường

V – tổng thể tích dịch chiết từ m gam nguyên liệu (ml)

20 – lượng dung dịch thí nghiệm loại các đường khử khác (trừ fructose)

V1 – thể tích thí nghiệm (ml)

W – khối lượng nguyên liệu (g)

100 – hệ số chuyển thành %

Bài 4: Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng axit

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xác định tinh bột: các phương pháp hóa học, phương pháp cực phổ, phương pháp khúc xạ kế, phương pháp hóa sinh Các phương pháp hóa học xác định bằng cách đo cường độ màu của tinh bột với iot hoặc bằng cách định lượng glucozo tạo thành sau khi thủy phân tinh bột bằng axit hoặc bằng enzim amylaza Phương pháp này không chính xác vì amylozo và amylopectin tạo màu với iot rất khác nhau mà hàm lường của chúng trong từng loại tinh bột lại khác nhau

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng axit cũng không cho kết quả thật đáng tin cậy vì khi thủy phân tinh bột bằng axit, không những chỉ có tinh bột mà cả hemixenlulozo và các polysacarit phân tử thấp cũng bị phân giải Do đó khi dùng phương pháp thủy phân bằng axit, trước tiên tách tinh bột ra khỏi nguyên liệu thực vật, sau đó mới thủy phân và xác định hàm lượng glucozo

Phương pháp thủy phân bằng enzim cho kết quả chính xác hơn cả, vì khi dùng chế phẩm enzim đặc hiệu thì chỉ có tinh bột bị phân giải

Dưới đây là phương pháp thủy phân bằng axit

1 Nguyên tắc

Dưới tác dụng của axit, tinh bột bị thủy phân tạo thành đường glucozo Xác định hàm lượng glucozo tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột

(C 6 H 10 O 5 ) n + nH 2 O → nC 6 H 12 O 6

162,1 18,02 180,12

Dung dịch Pb(CH3COO)2 10% hoặc Pb(NO3)2 10%

Dung dịch Na2SO4 hoặc NaHPO4 bão hòa

Định lượng đường glucozo trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương pháp Bertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột

4 Tính kết quả

Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức sau:

X =

Trong đó: X – hàm lượng tinh bột tính bằng %

a – số mg glucozo tra bảng tính được (ứng với số ml KMnO4 dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm trừ đi số ml KMnO4 dùng chuẩn độ mẫu đối chứng

V1 – thể tích dung dịch đường (sau khi thủy phân) lấy để xác định đường glucozo (ml)

V – dung tích bình định mức

18

W – khối lượng mẫu thí nghiệm (mg)

100 – hệ số chuyển thành %;

0,9 – hệ số quy chuyển glucozo thành tinh bột

19

ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN TÍCH LIPIT Bài 1: Định lượng lipit bằng máy Soxhlet

1 Nguyên tắc

Trong tế bào, lipit ở dạng tự do và liên kết Lipit tự do tập trung chủ yếu ở các

cơ quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật) Trong thực tế,

sự xác định lipit dựa vào hàm lượng lipit được rút ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ Có hai phương pháp để xác đinh:

Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp

Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu

Các dung môi chiết xuất lipit thường dùng là

ete etylic (ete dầu hỏa, ete petrol, benzen, xăng,

cloroform, tetraclorua cacbon ) Trong phòng thí

nghiệm thường dùng ete etylic, vì nó có độ bay

hơi cao, nhiệt độ sôi thấp Tốc độ của quá trình

chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ

nguyên liệu Ngoài lipit ra còn có một số hợp

chất khác như: vitamin hòa tan trong lipit

photphatil, steroit, các sắc tố cũng được chiết

ra Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hàm lượng

các chất này rất ít, nên các phương pháp này

vẫn được chấp nhận trong các thí nghiệm thông

thường Vì vậy các lipit xác định được bằng một

trong hai phương pháp trên được gọi là lipit

“thô”

Quá trình chiết xuất lipit được thực hiện trên

máy Soxhlet, gồm có: bình cầu (a) dung tích 100