Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo ……… Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối ……….. 70Bảng 3.6 Thành phần và

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG

VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM

THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM

Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ

SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI”

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – 2021

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo tận tình những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ về tinh thần, vật chất, động viên tôi vượt qua nhiều trở ngại và khó khăn để hoàn thành luận án trong suốt những năm qua.

Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng đào tạo của học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang công tác tại phòng Công nghệ Tảo: TS Hoàng Thị Minh Hiền, TS Ngô Thị Hoài Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Lưu Thị Tâm, TS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Thị Ngọc Mai

… đã cho tôi những lời khuyên chân thành, đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận án này.

Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, TS Đoàn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng các axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng của dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm

Novaco - bao viên, đóng gói và hoàn thiện sản phẩm.

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 do PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với cáccộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đãđược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phépcủa các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…… ………

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… ………

1 4 1.1 Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo……… ……… 4

1.1.1 Giới thiệu chung về axit béo …… ……… ……… ………. 4

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFAs……….……… 6

1.1.3 1.1.4. 1.2. Nguồn cung cấp PUFAs

Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo ………

Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối ……….

9 14 18 1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium ……… 18

1.2.2 1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới…………

Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác 20 nhau và sản xuất thương mại DHA……… 22

1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium 24

1.3. 1.3.1 1.3.2. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu…………

Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs……….……….

Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô ……….………

26 26 29 1.3.3 1.3.4. 1.4. Các phương pháp tinh sạch PUFAs, DHA, EPA, DPA ……… 30

Bảo quản axit béo……… ……….……… ………… 33

Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của dầu tách chiết từ Schizochutrium đối với người và động vật …. 35 1.5 2.1. 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4. 2.2 2.2.1 2.2.2. Tình hình sản xuất và tách chiết PUFAs từ VTBDD ở Việt Nam ……

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….

Vật liệu………

Chủng tảo và điều kiện nhân nuôi sinh khối ………

Động vật thí nghiệm

Sinh khối tảo và cặp mồi đặc hiệu

Địa điểm nghiên cứu

Hóa chất và thiết bị sử dụng………

Hóa chất………

Các dụng cụ và thiết bị sử dụng……….

36 38 38 38 38 38 39 39 39 39 2.3 Môi trường……… 40

2.4.1.

Phương pháp nghiên cứu ……… 41

Sàng lọc và nhân nuôi sinh khối chủng tiềm năng trong các hệ thống lên men khác nhau cho tích lũy các axit béo ω 3 - 6 cao ……… 41

2.4.2 Phương pháp tách chiết lipit và làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω 3 - 6 44

2.4.3 2.4.4 Xác định các chỉ tiêu chất lượng của dầu……… 47

Tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên Algal oil omega 3 (AOO-3-6) 50

2.5. 2.5.1 2.5.2 2.5.3. Bố trí thí nghiệm

Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6………

Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng tiềm năng… Nhân nuôi sinh khối chủng S mangrovei TB17 trong các hệ thống lên men 51 51 52 khác nhau (1, 5, 10, 30 và 150 Lít)……… 52

2.5.4 2.5.5 2.5.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện đến quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 54

Nghiên cứu khả năng bảo quản của các chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 và omega-6 57

Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 57

2.6 3.1. 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6. Xử lý số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………

Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau ………

Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega 3 - 6……….

Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 ở quy mô bình tam giác lên sinh trưởng và tích lũy axit béo………

Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 5 và 10 Lít ………

Nhân nuôi sinh khối ở hệ thống lên men 30 Lít ……….

Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 150 Lít ……….

Các phương pháp nhân nuôi khác nhau để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω 3 – 6………

58 59 59 59 62 68 70 72 74 3.1.7. 3.2. Thu hoạch sinh khối chủng S mangrovei TB17 ……… 80

Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ SKK chủng TB17 …… 82

3.2.1 3.2.2 3.2.3 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng FFA ……

Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng methyl este …

So sánh 2 phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA và dạng methyl ester) từ

82 94

sinh khối tươi và SKK……… 100

3.2.4. 3.3. 3.3.1 Sản xuất và đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 ở quy mô 100g SKK/mẻ ……… 103

Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên nang mềm AOO-3-6……… 108

Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến quá trình bảo quản dầu giàu các axit béo ω 3 - 6……… 108

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega 3 - 6 từ dầu sinh học giàu axit béo ω 3 – 6 …… 113

3.3.3 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên dầu tảo AOO-3-6……… 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 124

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ………… 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 127

PHỤ LỤC………

Docosahexaenoic acidDocosapentaenoic aciddihomo-gamma-linoleic acidEthyl este

Eicosapentaenoic acidFree Fatty acid

Food and Drug Administration

Generally Recognized as SafeGama linoleic acid

Linoleic acid

Monounsaturated fatty acidMelting point

PhospholipidPolyunsaturated fatty acidPolyketide synthasePropyl GallateSaturated fatty acid

Transmission electron microscopy

Total fatty acidTriacylglycerolTriglycerideTertiary Butyl Hydroquinone

Omega 3Omega 6Omega 3 - 6

Tên tiếng Việt

Axit α-linolenicAlgal oil omega-3-6Axit ArachidonicButylated HydroxyanisoleButylated HydroxytolueneChuột cống trắng

Chuột nhắt trắngCao nấm men tinh khiếtCao nấm men công nghiệpAxit DocosahexaenoicAxit DocosapentaenoicAxit dihomo-gamma-linoleicEthyl este

Axit EicosapentaenoicAxit béo tự do

Cục Quản lý Thực phẩm và Dượcphẩm Hoa kỳ

Chứng nhận là an toànAxit Gama linoleicAxit LinoleicMật độ tế bàoAxit béo không bão hòa một nối đôiĐiểm nóng chảy

Nuôi trồng thủy sảnPhospholipidAxit béo không bão hòa đa nối đôiSinh tổng hợp kỵ khí

Propyl GallateAxit béo bão hòaSinh khối tươiSinh khối khôKính hiển vi điện tử truyền qua

Axit béo tổng sốTriacylglycerolTriglycerideTrọng lượng cơ thểTertiary Butyl Hydroquinone

Vi tảo biển

Vi tảo biển dị dưỡng

Vi khuẩn tía quang hợpOmega 3

Omega 6Omega 3 - 6

Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo….

Một số phương pháp tách chiết dầu và khả năng thu hồi của chúng………

Danh sách các chủng VTBDD Schizochytrium spp.………

Sự thay đổi MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của các chủng được nhân

nuôi sinh khối trong bình tam giác 250 mL sau 144 giờ ………

Thành phần axit béo của các chủng TG11(6), TB17 và PQ6

Thành phần axit béo trong sinh khối tươi của chủng TB17 nhân nuôi sinh

242938

6061

khối trong bình tam giác 1 Lit……… 67

Bảng 3.4

Bảng 3.5

Thành phần axít béo của sinh khối tươi chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 5 và 10 Lít 69

Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi

sinh khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 70Bảng 3.6 Thành phần và hàm lượng axít béo của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 71Bảng 3.7 Thay đổi mật độ tế bào, sinh khối khô và lipit của chủng TB17 khi nhân

nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít……… 72Bảng 3.8

Bảng 3.9

Thành phần và hàm lượng axít béo của sinh khối tảo S mangrovei TB17

sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít………… 73

Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo mẻ……… 75

Bảng 3.10 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch……… 75

Bảng 3.11 Thành phần axit béo trong sinh khối của chủng TB17 ở các phương pháp

nhân nuôi sinh khối khác nhau trong môi trường P1……… 77

Bảng 3.12 Tổng hợp thành phần và hàm lượng các axit béo chủ yếu trong quá trình

nhân nuôi sinh khối ở các quy mô khác nhau

Bảng 3.13 Thành phần axít béo trong lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối

theo mẻ ở hệ thống lên men 30 Lít………

Bảng 3.14 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng xà phòng hóa ………

Bảng 3.15 Thành phần axít béo trong hỗn hợp dầu sau phản ứng xà phòng hóa lipit

Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

axit béo ω 3 - 6 thu được sau quá trình làm giàu………

79

868889

92

Bảng 3.17 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với

urea

Bảng 3.18 Thành phần axít béo của TFA thu được từ SKK chủng TB17

9396Bảng 3.19 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

axit béo ω 3 - 6 (dạng methyl ester) thu được sau quá trình làm giàu……… 98

Bảng 3.20 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với

urea 99Bảng 3.21 Ảnh hưởng của các phương pháp tách chiết dầu khác nhau và các nguồn

sinh khối khác nhau đến hiệu suất tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6

Bảng 3.22 Thành phần axit béo của hỗn hợp PUFAs thu được ở dạng FFA và methyl

ester từ SKK và SKT………

Bảng 3.23 Thành phần axít béo của hỗn hợp axít béo ω 3 - 6 tách chiết lượng lớn……

Bảng 3.24 Các chỉ tiêu chất lượng của sản phầm dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6

(dạng methyl ester) tách chiết từ sinh khối chủng TB17………

Bảng 3.25 Tổng hợp thành phần và hàm lượngcác axit béo chủ yếu trong quá trình

tách chiết dầu

100

102106

107

108Bảng 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ vitamin E lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3- 6… 111Bảng 3.27 Các chỉ tiêu chất lượng của dầu giàu acid béo ω 3 - 6……… 112

Bảng 3.28 Các chỉ tiêu cảm quan của viên nang mềm AOO-3-6……… 113Bảng 3.29 Các chỉ tiêu chất lượng lý hóa, vi sinh vật, kim loại nặng……… 113

Bảng 3.30 Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của viên nang mềm thực phẩm chức năng

giàu axít béo 3 - 6 114

Bảng 3.31 Các chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng của của viên nang mềm thực

phẩm chức năng giàu axít béo 3 - 6

Bảng 3.32 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của viên nang dầu tảo AOO-3-6………

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 đối với trọng lượng cơ thể chuột (n =

Bảng 3.34 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên một số chỉ tiêu huyết học của

chuột (n = 08, x ± SD)………

115116

117

118Bảng 3.35 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên nồng độ creatinin huyết thanh

Bảng 3.36 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện, tốc độ dập tắt phản xạ có điều

kiện tìm thức ăn trong mê lộ của các lô chuột nghiên cứu (n = 8)………… 123

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1

Hình 1.2

Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA……… 5

Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA………… 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của ω-6 DPA (A) và ω-3 DPA (B)……… 6Hình 1.4

Hình 1.5

Sản xuất axit béo omega - 3 từ các nguồn khác nhau ……… 12

Sơ đồ tách chiết PUFAs từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người… 12

Hình 1.6

Hình 1.7

Hình 1.8

Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người…

Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid

(DHA) ở Thraustochytrids………

Sinh tổng hợp DHA theo con đường hiếu khí ở Thraustochytriidae…

15

1516Hình 1.9 Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS ở Thraustochytriidae…… 17

Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của

thraustochytrid và labyrinthulid……… 19

Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium

Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-batch,

liên tục và động học tăng trưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối

tương ứng………

Hình 1.13 Sơ đồ tổng quát hoạt động của các chất chống oxy hóa………

20

2134Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu dầu sinh học giàu ω 3 - 6 từ

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng TB17…………

Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của chủng TB17………

Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của chủng TB17……

626264Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng của chủng TB17… 64

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng TB17………… 65Hình 3.6

Hình 3.7

Hình 3.8

Hình 3.9

Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng của chủng TB17 65

Ảnh hưởng của pH môi trường môi trường lên sinh trưởng của chủng

TB17……… 66

Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của chủng TB17 66

MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của chủng TB17 trong bình tam giác

TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… ……… 68

Hình 3.13 Sinh trưởng của chủng TB17 trong các môi trường nhân nuôi sinh khối

Hình 3.14 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo mẻ…… 78

Hình 3.15 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối kiểu fed-batch 78Hình 3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp thu hoạch sinh khối đến sinh khối

tươi (A) và MĐTB tảo trong môi trường sau thu hoạch (B)……… 80

Hình 3.17 MĐTB tảo trong môi trường nuôi sau thu hoạch bằng chitosan ở các

nồng độ khác nhau………

Hình 3.18 Ảnh minh họa quá trình thu sinh khối bằng chitosan ở các nồng độ

khác nhau………

Hình 3.19 Ảnh hưởng của phương pháp tách chiết lên hiệu suất tách chiết lipit từ

sinh khối khô của chủng TB17………

Hình 3.20 Ảnh hưởng của các loại dung môi lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17……… …

Hình 3.21 Ảnh hưởng của phương pháp sấy sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipit

từ sinh khối khô của chủng TB17………

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17………

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17………

Hình 3.24 Ảnh hưởng của chế độ khuấy lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối

phản ứng (C) lên hiệu suất xà phòng hóa dầu tảo……… 87

Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ FFA: urea (A), tỉ lệ Urea: ethanol (B) và nhiệt độ

kết tinh (C) lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs của hỗn

hợp axit béo tự do………

Hình 3.27 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối

khô của chủng TB17………

Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ sinh khối lên hiệu suất tách chiết TFA

từ sinh khối khô của chủng TB17………

Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

khối khô của chủng TB17………

Hình 3.30 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

khối khô của chủng TB17………

Hình 3.31 Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urea lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách

Hình 3.32 Ảnh hưởng của tỷ lệ Urea: methanol lên hiệu suất tạo phức và hiệu

từ SKK chủng S mangrovei TB17 theo phương pháp tạo phức urea… 105

Hình 3.37 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHA lên chỉ số peroxide của

peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6……… 110

Hình 3.41 Ảnh hưởng của vitamin E nồng độ 0,0075% lên chỉ số peroxyt của dầu

sinh học ω 3 - 6 112Hình 3.42 Ảnh hưởng của viên AOO-3-6 đối với hoạt độ AST (A) và ALT (B),

hàm lượng Albumin huyết tương (C) và Chlesterol toàn phần (D)…… 120

Hình 3.43 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột lô đối chứng (A), lô TN1 (B) và

lô TN2 (C)……… 121

Hình 3.44 Hình ảnh mô bện học vi thể gan, thận, lách chuột sau 90 ngày uống

thuốc lô đối chứng (A, D, H), lô TN1 (B, E, D) và lô TN2 (C, G, K),

MỞ ĐẦU

Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trịdinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cảcác loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho món

ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người,dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạchcacbon ≤ 18 Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, canola và đậu tươngchứa các axit béo không bão hòa đa nối đôi dạng omega-3 (polyunsaturated fattyacid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu là axít α-linolenic (ALA) và các loại dầu khácnhư dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là PUFAs ω - 6 Đối vớicác loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn hơn 20 và 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cábiển Nguồn cung cấp chính các axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) và

eicosapentaenoic (EPA; C20:5) là các loài cá nhiều mỡ như cá trích, cá thu và cáhồi Tuy nhiên, chất lượng của dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa

vụ và vị trí đánh bắt Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá trong khẩu phầnthức ăn, kể cả cho trẻ nhỏ cũng như dược phẩm có thể gặp một số bất lợi bởi sự cómặt tạp nhiễm của polychlorinated biphenyls (PCBs) hoặc dioxin, kim loại nặng…cũng như mùi vị đặc trưng của cá gây ra Hơn nữa, dầu cá biển thực tế là một hỗnhợp phức tạp các axít béo có chiều dài mạch cacbon và mức độ chưa bão hoà rấtkhác nhau Do vậy, việc tinh sạch chúng rất khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kémtrước khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng như nâng cao giátrị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω 3

- 6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu vàdần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trongthị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm trên thế giới nóichung và Việt Nam nói riêng

Vi tảo biển (VTB) được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai tháccác chất có hoạt tính sinh học, để xử lý môi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinhhọc và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) với một số loàiVTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tựdưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo cógiá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn Để khắc phụcnhững nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài vi tảo

biển dị dưỡng (VTBDD) trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan

tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới

mẻ ở Việt Nam và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống conngười

Các loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả năng tích lũy hàm lượng

lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và hàm lượng-3 PUFAs nhưEPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA) Vai tròcủa-3 PUFAs nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triểntrí não của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh và trong nhiều liệupháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm

Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium được coi là một trong các ứng cử viên

tiềm năng thay thế nguồn sản xuất-3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam,những nghiên cứu về nhân nuôi sinh khối, tách chiết và ứng dụng của các axít béotrên từ VTBDD còn rất mới mẻ và có nhiều tiềm năng ứng dụng Chính vì vậy,

chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6

từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người”.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

1 Sàng lọc chủng/loài VTBDD và tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu đượcsinh khối giàu axít béo ω 3 - 6;

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω 3

- 6 từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được;

3 Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 có tính an toàn cao và đánhgiá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên nang trên động vật thựcnghiệm

Một số nội dung nghiên cứu chính của luận án

1 Sàng lọc chủng tiềm năng giàu axít béo ω 3 - 6 từ các loài VTBDD Việt Nam; tối

ưu các điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm năng ở quy mô bình tamgiác, ở các hệ thống khác nhau (5, 10, 30 và 150 Lít);

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω 3

- 6 nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo

vệ sức khỏe cho con người;

3 Sản xuất viên nang Algae oil omega 3 - 6 (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axítbéo ω 3 - 6 đảm bảo chất lượng, có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cảithiện trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 trên mô hình động vật thựcnghiệm

Những đóng góp mới của luận án

- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có

hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng

Schizochytrium mangrovei TB17 được phân lập ở tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm

lượng PUFAs ω 3 - 6 cao, trong đó DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA và axitdocosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn được các điều

kiện thích hợp cho tách chiết, tinh sạch axít béo ω 3 - 6 từ chủng TB17 có hàm

lượng axit béo ω 3 - 6 cao (đặc biệt là DHA, EPA và DPA đạt 86,33 ± 2,34% so vớiTFA); bao viên nang AOO-3-6 và đã đánh giá được tính an toàn, tác dụng dược lýcủa viên nang ở mô hình động vật thực nghiệm; viên nang đủ tiêu chuẩn làm

nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

- Lần đầu tiên ở Việt Nam đã chứng minh được viên nang AOO-3-6 có chứa

dầu ω 3 - 6 tách chiết từ S mangrovei TB17 an toàn và có khả năng cải thiện trí

nhớ, khả năng học tập trên mô hình động vật thực nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

- Có được các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của chủng S mangrovei

TB17 phân lập ở Diêm Điền, Thái Bình năm 2010 (nhân nuôi sinh khối theo mẻ ở

hệ thống lên men 30 Lít, môi trường M12 - sử dụng cao nấm men công nghiệp) đạtsinh trưởng với mật độ tế bào (128,420,27 x106 tế bào/mL), SKK (30,83 0,25g/L) và lipit (65,96 0,31% SKK) Tổng hàm lượng các axit béo ω 3 - 6 (47,35 ±1,39% so với TFA), sản lượng DHA (40,17 ± 1,75 mg/L/giờ);

- Có được quy trình tách chiết dầu sinh học giàu các axít béo ω 3 - 6 từ S mangrovei TB17 có độ tinh sạch cao (99,46 ± 2,66% so với TFA) đạt tiêu chuẩn

chất lượng để làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người;

- Có được bộ số liệu về tính an toàn và tác dụng dược lý của viên AOO-3-6trên động vật thực nghiệm, cung cấp cơ sở khoa học cho việc định hướng ứng dụnglàm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

Bố cục của luận án

Luận án gồm 148 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 34trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả và thảo luận 65 trang,kết luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu thamkhảo 22 trang gồm 241 tài liệu Trong luận án có 58 hình, 41 bảng và 48 trang phụlục

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo

Các axít béo ω 3 - 6 có nhiều chức năng sinh học như: cải thiện hiệu quảbệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu quả rõrệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thểdẫn đến đau tim và đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa độngmạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm Chínhnhững đặc điểm trên mà các axít béo ω 3 - 6 ngày càng được ứng dụng trong thựcphẩm bảo vệ sức khỏe cho con người Do vậy, những đặc điểm chính về axít béo ω

3 - 6 sẽ được trình bày khái quát dưới đây

1.1.1 Giới thiệu chung về axit béo

Axít béo có công thức tổng quát: CH3-(CH2)n-COOH PUFAs là các axít béomạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi.Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm

cacboxyl Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc

methyl hay gốc cacboxyl Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính

từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω” Các liên kết đôi trongPUFAs cũng có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ” Những nhóm” Những nhómω-3, ω-6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6hay 9 tính từ gốc methyl [1]

Mạch cacbon của axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dàikhông cong Các axít béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch cacbon bịuốn cong 30°, càng có nhiều liên kết đôi, mạch cacbon càng bị uốn cong nhiều hơn

Có giả thiết cho rằng mạch cacbon của axít béo không no dạng cis có ý nghĩa quantrọng đối với màng sinh học Theo nghiên cứu của Kelter và cộng sự (1999) [2] chothấy các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang dạng trans- hoặc ngược lại

trong trường hợp bình thường Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫnđến tính chất khác nhau của các axít béo

Vị trí của các nối đôi trong chuỗi cacbon của PUFAs tạo nên một sự khácbiệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng Các tế bào của cơ thể conngười chỉ có thể tạo nối đôi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ 9 trở đi Điềunày có nghĩa là con người không thể tự tổng hợp được axít béo ω - 3 và ω - 6 Do

đó hai loại axít béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3] Hoạt

tính sinh học của các axít béo phụ thuộc vào các dạng cấu trúc hóa học đặc trưngcủa chúng Axít béo có một số dạng cấu trúc chính như ethyl este (EE), axít béo tự

do (free fatty acid - FFA) và triacylglycerols (TAGs) Một số nghiên cứu đã chứngminh rằng các axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp hơn so với dạng FFA vàTAG [4] Sự hấp thụ EPA ở dạng triglycerid là 90% trong khi ở dạng ethyl ester chỉ

là 60% [5]

Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là ω - 3 và ω - 6 Các axítbéo ω - 3 quan trọng nhất là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA Các axít béo ω - 6chính là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic,dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6]

1.1.1.1 Axít docosahexaenoic (DHA)

DHA có công thức phân tử C22H32O2, là một axít béo ω - 3 không bão hòa đanối đôi Nó có 22 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 6 liên kết đôi ở các

vị trí cacbon số 4, 7, 10, 13, 16 và 19, có công thức tổng quát là: CH3(CH2CH =CH)6(CH2)2COOH và được kí hiệu là C22:6 ω-3 [7] DHA có thể được chuyểnthành docosanoids Các liên kết đôi (- C = C -) có cấu hình cis (- C/C = C\C -) đểhoạt động sinh lý Cấu trúc không bão hòa đa nối đôi (= CH - CH2 - CH =) xoayquanh là các liên kết đơn (C - C) liền kề Do đó, nó làm tăng khả năng liên kết hơn

so với phân tử không có liên kết đôi nào Điều này làm tăng tính linh hoạt của phân

tử rất nhiều [8] Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 g/mol Ở điều kiện chuẩn,DHA tồn tại dạng lỏng, không tan trong nước, tan trong dung môi không phân cực.Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của DHA được trình bày trên Hình 1.1 [7]

(CH2)3COOH và ký hiệu là C20:5 ω-3 Trọng lượng phân tử của EPA là 302,451g/mol EPA tồn tại dạng lỏng ở điều kiện chuẩn, bay hơi ở 439oC, khối lượng riêng

0,943g/cm3 Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của EPA được trình bày trênHình 1.2 [9].

A

B

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFAs

Hiện nay, PUFAs như ALA, EPA và DHA đang được quan tâm nghiên cứunhiều nhất bởi chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người và động vật.Đặc biệt là DHA rất đa dạng về chức năng cũng đã được chứng minh bởi

Hashimoto và cộng sự (2017) [11]

1.1.2.1 Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người

PUFAs có một số vai trò sinh học chủ yếu:

PUFAs tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipit, vận chuyển vàhướng tới các mô Ví dụ, các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợptriacylglycerol (TAG) ở gan bởi - 3 PUFAs Bên cạnh đó, PUFAs còn tham giavào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Sự có mặt của chúng trong thành phầnphospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng Điều này góp phần quantrọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng PUFAs là thành phầnquan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt đối với trẻ nhỏ từ 0 - 2 tuổi Axít béonày cũng có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động của hệ thốngthần kinh trung ương, cần thiết cho sự phát triển chức năng não bộ và thị giác ở trẻnhỏ, não bộ không thể duy trì hoạt động nếu như không có những axít béo quantrọng này [12] Để duy trì màng tế bào, chức năng não và truyền các xung thầnkinh, các axít béo ω 3 - 6 cũng tham gia vào việc chuyển oxy trong quá trình tổnghợp hemoglobin và phân chia tế bào [13]

PUFAs góp phần cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch: giảm nguy cơ loạn nhịptim; có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối utuyến tiền liệt; làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiệnchức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm [12]

So với các cơ quan khác hàm lượng DHA trong não và mắt cao hơn DHAđặc biệt tập trung vào chất xám của não và võng mạc Trong não, DHA có liênquan đến tín hiệu thần kinh, trong khi ở mắt nó có liên quan đến chất lượng thị lực.DHA được tích lũy trong não và mắt vào giai đoạn phôi thai sớm và cuối thai kỳ.Hàm lượng DHA thấp làm giảm sự phát triển nhận thức và chức năng thị giác [7]

Axít béo ω - 3 cũng đã được điều tra tính hiệu quả trong rất nhiều các nghiêncứu về sức khỏe con người bao gồm các loại ung thư khác nhau như: đại tràng, vú,

và tuyến tiền liệt Nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc sử dụng cácaxít béo ω - 3 để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường thai kỳ, có lợi trong việc điềuhòa chức năng trao đổi chất của mẹ và thai nhi [14]

Trong chế độ ăn chứa LA (ω - 6) và ALA (ω - 3) đóng vai trò quan trọngtrong việc duy trì hàm lượng PUFAs ω 3 - 6 của tế bào nội mô Việc chuyển ALAthành EPA và DHA phụ thuộc vào một số yếu tố di truyền, chế độ ăn uống (tỷ lệ

LA và ALA), giới tính và các enzyme desaturase và elongases [15] Các axit béo ω

- 6 như linoleic và DPA có tác dụng chống viêm dây thần kinh trong cơ thể người ởcác mô hình về bệnh Alzheimer Trong đó, axit linoleic ω - 6 có trong khẩu phần ăn

sẽ làm tăng chất chuyển hóa DPA ω - 6 trong não và có tác dụng thúc đẩy quá trình

chống viêm dây thần kinh dẫn đến làm giảm bệnh Alzheimer [16] Ngoài ra, DPA ω

- 6 đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm phù nề và tăng cường tácdụng khi kết hợp với DHA [17], giảm co thắt mạch máu và kết tụ tiểu cầu [15]

1.1.2.2 Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản (NTTS)

PUFAs như axít EPA, ARA và DHA cũng là thành phần rất quan trọng bởi

nó cần thiết cho sự phát triển và biến thái của ấu trùng Tuy nhiên, cần chú ý là tỷ lệgiữa DHA, EPA và ARA có thể còn quan trọng hơn rất nhiều so với hàm lượng củachúng Các loài vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng rất cao, đặc biệt là các axít béo [18]

Trong một số nghiên cứu về làm giàu luân trùng Brachionus plicatilis và ấu trùng Artemia salina trong trại sản xuất giống thủy sản ở Ai Cập đã cho thấy khi sử dụng tảo Tetraselmis chuii có PUFAs với hàm lượng ARA đạt 5,5%; EPA - 4,8%

và DHA - 5,0% so với TFA đã làm tăng tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót,tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, nâng cao giá trị

dinh dưỡng của luân trùng và Artemia Do đó đã làm tăng khả năng sống sót và giúp

cho ấu trùng nuôi phát triển tốt nhất [19] Hàm lượng axit béo ARA, ALA, DHA và

EPA trong thịt cá đã tăng lên đáng kể sau khi bổ sung Aurantiochytrium sp vào

thức ăn ARA tăng từ 0,97 đến 1,24%, ALA tăng từ 0,59 đến 0,81%, DHA tăng từ14,63 lên 14,82% và EPA tăng từ 4,58 - 5,19% [20] Thiếu DHA và EPA gây tỷ lệchết cao, tốc độ sinh trưởng chậm ở ấu trùng và giai đoạn non của cá, tôm [21]

Theo báo cáo của Sprague và cộng sự (2016) [22], việc sản xuất nguồn thức

ăn từ tảo dị dưỡng đơn bào như Crypthecodinium sp., Schizochytrium sp giàu

PUFAs (DHA, EPA, DPA) cho NTTS để làm tăng mức n-6 DPA trong thịt của cá

Vì vậy, thức ăn đã được thay thế lên đến 60% bằng sinh khối vi tảo giàu PUFAsnày Wang và cộng sự (2017) [23] đã nghiên cứu khả năng bổ sung sinh khối của

Schizochytrium sp để làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

Litopenaeus van namei Kết quả đã chỉ ra rằng Schizochytrium sp được dùng làm

thức ăn bổ sung có thể thay thế được dầu cá hay dầu thực vật vì chúng có chất

lượng đáp ứng được mọi yêu cầu, làm tăng đáng kể chức năng miễn dịch, trọnglượng cơ thề và chất lượng cá

1.1.2.3 Ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm

Trong trứng gà nuôi ngoài tự nhiên có tỷ lệ axít béo ω-6/ω-3 là 10:1 Chấtlượng trứng bị ảnh hưởng bởi các tỷ lệ ω-6/ω-3 của thức ăn và thức ăn có bổ sungaxít béo làm giảm độ dày vỏ trứng [24]

Theo Nyberg (2017) [25] gà ăn các axít béo ω-3 trong dầu tảo đã làm tăngcác axít béo ω-3 như EPA và DHA trong trứng Kết quả tương tự được Küçükersan

và cộng sự (2010) [26] chỉ ra rằng bổ sung 3% dầu đậu nành (rất giàu LA) đã làm

STT Axít béo Hạt cải dầu Hạt đậu nành Dầu hướng dương lanh Hạt lưu ly Cây

nghiệm trên gà mái đẻ ăn Schizochytrium sp với một lượng tương đương 165 mg

DHA/con/ngày đã làm tăng hàm lượng DHA trong trứng lên 5 lần (135 mg

DHA/trứng) so với đối chứng (ĐC) (28 mg DHA/trứng) Ngoài ra, hàm lượng DHAtăng lên đến 200 mg DHA/trứng khi cho gà ăn sinh khối tảo này ở mức 825

mg/con/ngày Theo nghiên cứu mới nhất của Castro và cộng sự (2019) [29] đã cho

thấy khi cho 198 con bò chưa mang thai ăn chế độ ăn có bổ sung 2,3% dầu đậu

nành hoặc 2,3% dầu hạt lanh thì cải thiện đáng kể thành phần dinh dưỡng của sữa

và số lượng bò mang thai cao hơn trong lần thụ tinh nhân tạo đầu tiên

1.1.3 Nguồn cung cấp PUFAs

1.1.3.1 PUFAs có n guồn gốc từ thực vật

Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa PUFAs có mạch cacbon ≤18 Trong đó cácloại dầu thực vật như dầu lanh, dầu cải … chứa ω-3 PUFAs chủ yếu là axít ALA

(18:3 ω-3) và các loại dầu khác như dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu lưu

ly…lại chứa chủ yếu là ω-6 PUFAs (18:2 ω-6) [22]

Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo ω 3 - 6 có trong một số loại dầu thực vật [22]

Ghi chú: MUFA - axít béo không no một nối đôi (monounsaturated fatty acid), SFA - axit

béo bão hòa (saturated fatty acid)

STT Loại cá EPA + DHA (mg/100g)

Ngoài ra còn một số nghiên cứu khác trên hạt tía tô đã cho thấy dầu hạt tía tô

có chứa PUFAs với tỷ lệ cao bao gồm chủ yếu là ω-3 GLA (C18: 3), ω-6 linoleic(C18: 2) và ω-9 oleic (C18: 1) [30] Hàm lượng lipit tổng số đạt 33,25 - 42,58%

SKK, trong đó, ω3 ALA chiếm 52,58 61,98% và ω6 linoleic chiếm 10,54 15,87% Tỷ lệ axít béo ω-6/ω-3 là thấp (0,2 - 0,26) trong hạt tía tô của Trung Quốc

-đã được công bố [31] Hàm lượng các axít béo ω 3-6 có trong một số loại dầu thực vậtđược thể hiện ở Bảng 1.1

1.1.3.2 PUFAs có nguồn gốc từ động vật

Trong các sinh vật biển như cá, PUFAs có từ 14 đến 22 nguyên tử cacbon.Các axít béo phổ biến nhất ở động vật, thực vật và vi sinh vật (VSV) là palmitic(16:0), stearic (18:0), oleic (18:1 ω-9) và palmitoleic (16:1) ARA (20:4 ω-6) là mộtthành phần chính của màng phospholipit động vật EPA và DHA là thành phần chủyếu trong vi sinh vật biển và cá biển [32] Một số các axít béo ω-3 cần thiết cho sứckhỏe con người có nguồn gốc từ các loại cá và động vật có vỏ ở Nam Thái BìnhDương được thể hiện trong Bảng 1.2 [33]

Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá và động vật [33]

Trong năm 2010, cá hồi được sản xuất tại Na Uy khoảng 1 triệu tấn, chiếm68% tổng sản lượng cá hồi Đại Tây Dương trên toàn thế giới Theo Tømmerås(2011) [34] cho thấy cá hồi Đại Tây Dương có tổng hàm lượng chất béo 6,05%,hàm lượng EPA và DHA là 0,19 g và 0,36 g/100 g cá phi lê, tỷ lệ ω-6/ω-3 là 0,07,hàm lượng oleic (18:1 ω-9), LA và ALA là 15,86; 1,38 và 0,85%, tương ứng CáNam Mỹ có chứa 16:0, 16:1 ω-7, 18:1 ω-9, EPA và DHA với hàm lượng cao lầnlượt là 18; 8,9; 7,7; 18,8 và 12,4% TFA, tương ứng Cá ở Bắc bán cầu cũng có hàmlượng các axít béo 16:0 chiếm 13,8%; oleic (18:1 ω-9) chiếm 9,7%; hàm lượngEPA và DHA chiếm lần lượt là 8,4 và 8,7% TFA [22]

Trong 10 năm trở lại đây, nhu cầu PUFAs ω-3 ngày càng tăng do sự gia tăng sửdụng chúng trong NTTS, làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người và dượcphẩm Do vậy, những nguồn nguyên liệu chính không đáp ứng đủ cho việc mở rộngkinh doanh sản xuất Việc sản xuất axít béo ω - 3 từ nguồn dầu cá và thực vật có một sốhạn chế, chẳng hạn như các quy trình làm sạch phức tạp, ô nhiễm không mong muốn

bởi các chất ô nhiễm biển, giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng một số loài cá và các khíacạnh liên quan đến tính bền vững của hệ sinh thái PUFAs được tìm thấy trong cá (ăn

vi tảo) ở đại dương nên theo một cách logic vi tảo được coi là nguồn tiềm năng đểsản xuất PUFAs Một số đối tương tiềm năng có thể thay thế đầy hứa hẹn cho việc sảnxuất axít béo ω - 3 là nấm men hoặc vi tảo để cung cấp nguồn PUFA ω-3 cho nhu cầuthực tế đang ngày càng nâng cao đã được chấp nhận rộng rãi [35]

1.1.3.3 PUFAs có n guồn gốc từ vi sinh vật

Một số loại vi khuẩn cũng có khả năng sản xuất axít béo như vi khuẩn tíaquang hợp (VKTQH) VKTQH có một số hạn chế về thành phần dinh dưỡng đó làhầu hết các VKTQH không chứa PUFAs như: LA (C18:2 ω-6), axít eicosadienoic(C20:2 ω-6), EPA, DHA Mặc dù chúng rất giàu các SFA như axít steric (C18:0),axít palmitic (C16:0) và MUFA như axít oleic (C18:1) [36] Các axít béo chính

trong Rhodopseudomonas sphaeroides là 16:0, 16:1 cis - ω-7, 18:0, 18:1 ω-9 và

18:1 ω-7 là các axít béo chiếm ưu thế Ngoài ra còn có một số các axít béo khác như16:1 trans - ω-7, 16:1 cis - ω-9 và hai đồng phân trans 18:1 [37] Hàm lượng lipitchiếm khoảng 20 - 40% sinh khối khô (SKK) thấp hơn so với vi tảo [38] Trong quá

trình nhân nuôi sinh khối R palustris dưới điều kiện ánh sáng, kỵ khí, hàm lượng

lipit đạt 22 - 39% SKK [39] Thành phần axit béo của một số vi khuẩn có chứa các

axít béo chính như C18:1 ω-7, C16:1, C16:0 Ở Chromatium salexigens, C18:1

chiếm hơn 50% so với TFA Axít béo C16:1 chiếm 16% so với TFA (Chromatium tepidum) và 36% so với TFA (Thiocystis gelatinosa), axít béo C16:0 dao động 10,4

- 25,8% so với TFA ở Chromatium sp [40].

1.1.3.4 PUFAs có nguồn gốc từ vi tảo

Sprague và cộng sự (2016) [22] cũng đã khảng định sự thiếu hụt toàn cầu vềEPA, DHA và các tác động của nó đối với người tiêu dùng, khẳng định tiềm năngcủa vi tảo và cây trồng biến đổi gen như nguồn cung cấp axít béo quan trọng trongtương lai

VTBDD có thể là nguồn cung cấp ω-3 PUFAs với một số ưu điểm như sau:nhân nuôi sinh khối VTBDD dễ dàng trong các hệ thống lên men nên có thể sảnxuất dầu quanh năm, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiệt độ vì không sử dụng ánhsáng mặt trời, có thể kiểm soát tốt mọi thông số cần thiết trong suốt quá trình nhânnuôi sinh khối, hàm lượng axít béo đơn giản và tốc độ tăng trưởng cao hơn; cònnhân nuôi sinh khối VTB quang tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có thể sử dụngđất phi nông nghiệp và nguồn nước thải không phù hợp cho sản xuất nông nghiệp[41] Tóm lại, việc sản xuất công nghệ sinh học sản xuất dầu vi tảo là một giải pháp

thay thế bền vững có khả năng bổ sung cho nhu cầu toàn cầu về ω-3, gây ít tác

động đến môi trường hơn được trình bày ở Hình 1.4 [35]

Vi tảo cung cấp một nguồn tài nguyên không ô nhiễm đầy hứa hẹn cho công nghệsinh học sản xuất LC-PUFAs (long chain - PUFAs) (Hình 1.5) để thay thế cho các loạidầu cá truyền thống [42]

Chất kháng viêm Chất kháng sinh C20:5 ω-3

PUFAs từ các VTB quang tự dưỡng

Nhiều công bố đã đưa ra hàm lượng PUFAs khác nhau trong một số loài tảo

quang tự dưỡng Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum sp và Porphyridium sp.

có chứa hàm lượng (%) EPA cao trong TFA lần lượt là 38 - 39%, 40 - 57% và 41%

Trong khi đó, EPA của Odontella aurita Agardh - 26% so với TFA, Pavlova lutheri

Green là 22 - 29% so với TFA, Cyclotella cryptica Lewin và Guillard là 17 và 23%

so với TFA, Cylindrotheca sp Rabenhorst là 24 - 25% so với TFA [43].

Điều kiện nhân nuôi sinh khối và giai đoạn tăng trưởng là yếu tố quyết địnhquan trọng cho quá trình sản xuất các axit béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi(Long Chain -LC - PUFAs) Để tăng việc sử dụng vi tảo cho sản xuất thương mại củacác loại dầu giàu LC - PUFAs, các nghiên cứu gần đây đang hướng đến việc sàng lọc

và lựa chọn các loài vi tảo có dầu với khả năng tích lũy LC - PUFAs trong TAG cao,điều này sẽ cho phép tiết kiệm chi phí sản xuất cũng như tách chiết lipit [44]

Như đã đề cập trước đây, nhân nuôi sinh khối hàng loạt của các loài tảo quang

tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có chi phí tương đối thấp so với các nhân nuôisinh khối trong các bể phản ứng quang sinh kín Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng trongcác hệ thống bể hở lại tương đối thấp, thu hoạch có thể tốn kém, và còn có nhiều rủi

ro do biến động độ mặn và ô nhiễm có thể dẫn đến làm giảm chất lượng và số lượngcủa sản phẩm cuối cùng Nhìn chung, ứng dụng của các loài VTB quang tự dưỡng đểsản xuất thương mại các loại dầu đòi hỏi những tiến bộ/đổi mới công nghệ trongnghiên cứu kỹ thuật sinh lý và di truyền để nâng cao tốc độ tăng trưởng và tích lũychất béo, tối ưu hóa các thành phần axít béo, cải tiến công nghệ sinh học liên quanđến phản ứng sáng trong quang hợp; giảm ô nhiễm và giảm các chi phí liên quan đếnviệc sản xuất sinh khối và thu hoạch

PUFAs từ các VTBDD

Một số VTBDD được coi là nguồn cung cấp DHA rất tốt Chúng bao gồm

thraustochytrids từ các chủng Thraustochytrium sp Sparrow và Schizochytrium sp Goldstein và Belsky và tảo Crypthecodinium cohnii Javornicky Các loài đại diện

này cung cấp các loại dầu giàu DHA ưu việt nhất cho các ngành công nghiệp, chúngđược sử dụng trong thực phẩm, đặc biệt là trong sữa bột công thức cho trẻ sơ sinh[45], kể từ khi chúng được xem là nguồn không gây bệnh và không gây độc [46]

Theo nghiên cứu của Ward và Singh đã cho thấy Schizochytrium sp có một

số đặc điểm thuận lợi cho sản xuất thương mại bao gồm hàm lượng lipit cao, sứcsản xuất DHA cao, tăng trưởng tốt trong nhân nuôi sinh khối với mật độ tế bào

(MĐTB) cao Một số chủng Schizochytrium nhất định có thể cung cấp DHA cao đạt

94% so với TFA [47] Nakahara và cộng sự (1996) [48] đã kết luận rằng trong

Schizochytrium sp hàm lượng lipit chiếm 50% SKK và DHA chiếm 34% so với TFA Schizochytrium sp tạo ra một lượng đáng kể DPA ω-6, thường ở mức khoảng

20% DHA được tạo ra, điều này có thể làm tăng hàm lượng ω-6 DPA trong thịt cá

khi cho ăn sinh khối tảo [49] Một số chủng Schizochytrium sp có hàm lượng các

axít béo 16:0 chiếm 16 - 38%; oleic (18:1 ω-9) chiếm 27%; hàm lượng EPA vàDHA chiếm lần lượt 16,5 và 27 - 44% so với TFA, tương ứng (Bảng 1.3) [22] Ởmột số loài thuộc thraustochytrids có chứa 52% DHA, 27% DPA, 12% EPA so vớiTFA, ngoài ra còn có chứa AA và axit palmitic [50]

Dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối, hàm lượng lipit và DHA thường bị ảnhhưởng bởi thành phần môi trường nhân nuôi sinh khối và các yếu tố khác như nhiệt

độ, độ mặn [51] Chủng Thraustochytrium sp T01 được phân lập ở vùng rừng ngập

mặn Nam Ấn Độ có tiềm năng sản suất sinh khối cao và lượng DHA thu được khoảng6,17 ± 0,04 g/L Trong quá trình nhân nuôi sinh khối, sử dụng riêng rẽ các muối hữu cơnhư sodium acetate, pyruvate, citrate and malate có thể làm hàm lượng lipit tổng sốtăng lên 28 - 33%, DHA tăng lên 40 - 46% [52]

Sản xuất DHA từ Schizochytrium sp B4D1 đã đạt được bằng cách cung cấp

liên tục malate trong giai đoạn tích lũy lipit Malate là tiền chất cung cấp cho quá

trình tổng hợp DHA ở Schizochytrium sp Vì vậy, khi nuôi lắc trong các bình tam

giác, bổ sung 4 g malate/L vào giai đoạn tích lũy lipit, DHA tăng 47% và đạt 5,51g/L Năng suất DHA có thể đạt tối đa 30,7 g/L Đây là cơ sở khoa học cho việc sử

dụng malate cho sản xuất DHA ở Schizochytrium sp trên quy mô công nghiệp [53].

Nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình nhân nuôi sinh khốithraustochytrids đã cho thấy có thể cải thiện đáng kể năng suất sinh khối và hàm

lượng DHA [54, 55] Sinh khối có thể đạt tới 171,5 g/L [56], hàm lượng TFA có thểchiếm 83,84% SKK [57] với hàm lượng PUFAs cao đến 76,5% [58]

Chủng S limacinum SR21 trong quá trình nhân nuôi sinh khối có bổ sung

đồng thời glucose và glycerol được sử dụng làm nguồn cacbon cũng dẫn đến tăngsinh tế bào tốt và tăng năng suất DHA đạt tối đa [59] Tối ưu các điều kiện nhân

nuôi sinh khối Schizochytrium sp trong các hệ thống lên men đã thu đươc sinh khối

đạt 128,3 g/L, DHA đạt 39,2 g/L và 326,5 mg/L/giờ [60]

1.1.4 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo

Sự tổng hợp PUFAs có thể được tiến hành theo hai con đường chính: (a) conđường hiếu khí - với phức hợp desaturases và elongases sử dụng axít palmitic làmtiền chất và (b) con đường kỵ khí - PKS (polyketide synthase) [61]

1.1.4.1 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người

Ở thực vật tạo ra axít linoleic (18:2 ω-6) và axít linolenic (18:3 ω-3) bằngcách sử dụng các enzyme ∆12 và Δ” Những nhóm15 desaturase Ở động vật có vú và con ngườithiếu sự có mặt của các enzyme ∆12 và Δ” Những nhóm15 desaturase Chính vì vậy, cần phải cungcấp các axít béo này qua chế độ ăn uống Động vật có vú chỉ có khả năng loại bỏhydro từ các nguyên tử cacbon có chứa liên kết đôi và nhóm carboxyl từ các axítbéo (Hình 1.6) Quá trình oxy hóa các axít béo có thể diễn ra trong ty thể hoặc

peroxisome [62]

Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và

con người [62]

1.1.4.2 Con đường tổng hợp PUFAs trong vi tảo

Theo kết quả nghiên cứu của Xie và cộng sự (2017) [63] đã cho thấy mốiliên hệ giữa quá trình sinh tổng hợp các axít béo và terpenoids ở thraustochytrids

(đặc biệt là Schizochytrium) thông qua chất trung gian Acetyl-CoA được trình bày ở

Hình 1.7 Cần phải hiểu rõ cơ chế tổng hợp axít béo cũng như terpenoids ở

thraustochytrids, đồng thời điều chỉnh các điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp

để thu được hàm lượng axít béo (DHA) cao nhất

Theo Qiu (2003), Meesapyodsuk và Qiu (2016); Zhu va cộng sự (2020) [64,

65, 66], quá trình sinh tổng hợp DHA ở Thraustochytriidae được tiến hành theo 2con đường khác nhau: (1) Quá trình kéo dài của các tiền chất C18, tiếp theo là khửbão hòa của Δ” Những nhóm4 - desaturase; (2) Con đường kỵ khí PKS Nhiều nghiên cứu về 2 conđường sinh tổng hợp DHA riêng biệt ở Thraustochytrids cũng đã được công bố.Quá trình tổng hợp DHA xảy ra ở tế bào vi mô [64, 65]

Quá trình kéo dài của các tiền chất C18, tiếp theo là khử bão hòa của Δ4 desaturase (phụ thuộc vào Δ4 - desaturase)

-Đã có nhiều tranh cãi về việc liệu Δ” Những nhóm4 - desaturase có tồn tại trong con đườngtổng hợp DHA hay không? Trong hai thập kỷ gần đây, nhiều nghiên cứu đã xác

định được cDNA của Thraustochytrium sp mã hóa một protein có chứa trong một

tên miền giống như cytochrome - b5 Biểu hiện của gen trong nấm men

(Saccharomyces cerevisiae) và thực vật (Brassica juncea) đã cho thấy cDNA mã

hóa cho một enzyme khử bão hòa một liên kết đôi Δ” Những nhóm4 trong 22: 5 (ω - 3) và kết quả

là tạo thành DHA [67] Điều này cung cấp bằng chứng rõ ràng cho sự tồn tại củamột chất béo không bão hòa đa nối đôi và Δ” Những nhóm4 - desaturase tham gia vào sự tổng hợp

DHA trong Thraustochytrium (Hình 1.8).

Trong vi tảo, DHA thu được thông qua EPA kéo dài thành axít DPA và tiếptheo khử độ bão hòa bằng Δ” Những nhóm4 - desaturase - đây là con đường tổng hợp DHA trongthraustochytrids [68, 69] Ngoài ra, Δ” Những nhóm4 - desaturase này, khi được biểu hiện trongnấm men và thực vật, cũng có thể sử dụng 22: 4 (ω - 6) làm cơ chất để tổng hợp một

axít béo bão hòa khác như axít DPA (22: 5 4,7,10,13, 16) Như vậy, Δ” Những nhóm4

-desaturate có thể sử dụng cả hai cơ chất (ω - 3) và (ω - 6) để tổng hợp axít béo [67]

Con đường kỵ khí PKS

Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS đã được nghiên cứu ở

Schizochytrium sp Con đường này khác với con đường kéo dài/khử bão hòa vì nó

không đòi hỏi quá trình khử bão hòa để đưa các liên kết đôi vào chuỗi acyl Thay

vào đó, các liên kết đôi được chèn vào trong quá trình tổng hợp axít béo và không

cần năng lượng ATP Vì vậy, nó còn được gọi là con đường kỵ khí để tổng hợp

DHA Mặc dù con đường này có tính chất "kỵ khí" nhưng nó cũng có thể diễn ra

dưới điều kiện hiếu khí Tên “kỵ khí” chỉ nói đến thực tế là các phản ứng trong con

đường này không đòi hỏi oxy phân tử [68] Polyketides là các chất chuyển hóa thứ

cấp chứa nhiều khối như các nhóm ketide (-CH2-CO) Chúng được tổng hợp bằng

PKS - một hệ thống enzym tương tự như tổng hợp axít béo trong vi khuẩn [70]

Quá trình tổng hợp axít béo sử dụng acyl carrier protein (ACP) như là một

chất đồng hoá cộng hóa trị cho chuỗi tổng hợp, tiến hành các chu kỳ lặp lại (Hình

1.9) Quá trình tổng hợp bao gồm: Ngưng tụ acyl-ACP và malonyl-ACP để tạo ra

ketoacyl - ACP nhờ enzym 3-ketoacyl-ACP synthase; ketoacyl-ACP khử thành

hydroxyacyl-ACP nhờ enzyme 3-hydroxyacyl-ACP reductase; hydroxyacyl-ACP

được khử nước tạo thành enoyl - ACP không bão hòa nhờ enzyme

dehydrase/isomerase hai chức năng; enoyl - ACP không bão hòa được khử nhờ

enoyl-ACP reductase thành acyl bão hòa [71] Ketosynthase là một enzyme chìa khóaquan trọng trong con đường tổng hợp, có thể xúc tác sự ngưng tụ của một loạt các chấtnền bao gồm các axít béo chưa no Do đó, chọn lọc ngưng tụ enoyl-ACP với malonyl-ACP sẽ dẫn đến một axít béo chứa các liên kết đôi [64]

ACP: Protein mang gốc acyl; KS: 3-ketoacyl-ACP synthase; KR: ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl-ACP reductase

3-hydroxyacyl-Trong quá trình tổng hợp axít béo ở Thraustochytrium và E coli đều có sự

tồn tại của phosphopantetheinyl transferase (PPTase) Điều đó cho thấy con đường

kỵ khí hoạt động mạnh trong quá trình sinh tổng hợp PUFAs ở cả 2 đối tượng này.Lượng ∆4 desaturase tạo ra đạt khoảng 18% tổng số axít béo trong các tế bào cảm

ứng biểu hiện Trong Thraustochytrium, mức biểu hiện của gen tổng hợp PUFAs

cao hơn nhiều so với gen ∆4 desaturase và cũng tương quan với việc sản sinh

PUFAs Những kết quả này chỉ ra rằng con đường kỵ khí hoàn toàn chịu trách

nhiệm chính về sinh tổng hợp PUFAs trong Thraustochytrium [65] Trong hệ gen của chủng Thraustochytrium sp 26185 có 10.797 gen mã hóa Trong đó có 451 gen

được xác định cho nhóm vận chuyển lipit và chuyển hóa axit béo Phân tích chi tiếtcác gen này cho thấy sự tồn tại của cả hai con đường hiếu khí và kỵ khí trong quátrình sinh tổng hợp DHA ở loài này Những kết quả này mang lại cái nhìn mới về

sinh tổng hợp và lắp ráp PUFAs ở Thraustochytrium [72].

Trong quá trình tổng hợp axít béo ở Thraustochytrium có thể sử dụng axít

axetic và axít propionic làm tiền chất để tổng hợp chuỗi SFA và PUFAs Ngoài ra,axít axetic được đánh dấu phóng xạ có mặt ở cả phospholipid (PL) và TAG đã chothấy PUFAs xuất hiện đầu tiên và phần lớn được tích lũy trong PL, trong khi TAGtích lũy nhiều SFA hơn PUFAs Nhìn chung, những kết quả này đã làm sáng tỏ các

cơ chế sinh hóa cho quá trình sinh tổng hợp của tất cả các axít béo ở

Thraustochytrium [73].

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium

Chi Schizochytrium là vi tảo biển nhân chuẩn với đặc điểm là thalli (tản) đơn

tâm, dạng hình cầu, có thể gắn kết các thể nền thông qua mạng lưới ngoại chất xuất

phát từ cơ quan tử gọi là sagenogenetosome [74] Chi Schizochytrium được đặc

trưng bởi sự phân đôi liên tiếp của một tế bào sinh dưỡng hình thành nên cụm tếbào, mỗi cụm tế bào sẽ phát triển thành túi động bào tử hoặc động bào tử Động bào

tử có một lông roi phía trước dài và một lông roi sau ngắn Phân tích phát sinh loài

dựa trên gen 18S rRNA đã chỉ ra rằng chi Schizochytrium có một mối quan hệ gần

gũi với thraustochytrid [75] Vòng đời và các giai đoạn phát triển khác nhau trongchu kỳ sống của một số loài thuộc thraustochytrid và labyrinthulid được minh họatrên Hình 1.10 [77]

Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của

thraustochytrid và labyrinthulid [77]

Thraustochytrids lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1934 và kể từ nhữngnăm 1960 chúng được nghiên cứu ngày càng nhiều về những tác dụng của chúng

[75] Năm 1934, Thraustochytrium proliferum được phân lập ở vùng ven biển Woods

Hole, Massachusetts Ban đầu, họ Thraustochytriaceae được xác định thuộc lớp nấmPhycomycetes, do khả năng giải phóng các động bào tử và hình thành mạng lướingoại chất Sau đó, thraustochytrids được được sếp vào Oomycetes [75]

Nhiều tác giả khác đã nghiên cứu các đặc điểm chung giữa thraustochytrids,labyrinthulids và aplanochytrids để xác định mối tương quan giữa chúng Kết quả lớpLabyrinthulea được thành lập, lớp này bao gồm cả ba nhóm thraustochytrids,

labyrinthulids, aplanochytrids [78] Cavalier-Smith và cộng sự (1994) [79] đã chỉ rarằng thraustochytrids chắc chắn không phải là nấm hoặc Oomycetes bằng cách phântích gen 5S và 18S rRNA của chúng Tuy nhiên, những khó khăn vẫn tồn tại trongviệc xác định Labyrinthulea trong cây phát sinh chủng loại và mối quan hệ củachúng Honda và cộng sự (1998) [80] xác đinh mối quan hệ của labyrinthulids vàthraustochytrids là nhóm đơn ngành trong stramenopiles nhờ sử dụng kỹ thuật phân

tử và chúng đã được phân chia thành hai nhóm: labyrinthulids và nhóm

thraustochytrids Một số chủng thuộc cùng một chi được phân chia giữa các nhómlabyrinthulids và nhóm thraustochytrids tạo ra nhiều nhầm lẫn hơn, đây là giới hạncủa việc phân loại dựa vào đặc điểm hình thái Các bằng chứng thực nghiệm cho thấyrằng: trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau, cùng một thraustochytrid có thểbiểu hiện hình thái rất khác nhau Điều này thể hiện tính mềm dẻo của các sinh vậtnày Theo Adl và cộng sự (2005) [81] thraustochytrids là một nhánh củaStramenopiles Chúng không phải là nấm, nhưng có đặc điểm giống như nấm Vìthraustochytrids không có khả năng quang hợp và thiếu plastid hoặc bất kỳ dấu tích

của một bộ máy quang hợp Giả thuyết Chromalveolates cho rằng tổ tiên của

Stramenopiles có plastid và các nhánh hiện nay không có plastid là do chúng đã mất

đi ở một thời điểm nào đó trong quá trình tiến hóa Tuy nhiên, nhiều tài liệu nghiên

cứu cho đến nay thraustochytrids vẫn được gọi là “vi tảo” Schizochytrium

mangrovei và Schizochytrium limacinum được biết đến với đặc điểm đặc trưng là

phân chia liên tiếp và cũng có một giai đoạn amip, đây là phương pháp truyền thống

sử dụng để phân biệt các chi thuộc thraustochytrid [82] Nhờ những tiến bộ trong kỹthuật phân tử và thiết kế mồi đặc biệt cho nhóm này, đơn vị phân loại của lớp

Labyrinthulea và sự phân chia nguồn gốc được rõ ràng hơn [83] Trong những nămgần đây, theo Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013), Beakes

và cộng sự (2014) [84, 85, 86] Labyrinthulea thuộc giới (Kingdom): Heterokonts,ngành (Phylum): Sagenista, lớp (class): Labyrinthulea (Hình 1.11) Họ

thraustochytrid gồm chín chi: Thraustochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, Aurantiochytrium, Sicyoidochytrium, Parietichytrium, Botryochytrium và Monorhizochytrium [77] Chi Schizochytrium bao gồm 5 loài: S mangrovei Raghuk (1988), S aggregatum S Goldst & Belsky (1964), S octosporum Raghuk (1988), S minutum A Gaertn (1981) và S limacinum D Honda & Yokochi (1998) [80].

Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium [84, 85, 86]

1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới

1.2.2.1 Nhân nuôi sinh khối theo mẻ

Nuôi theo mẻ là kĩ thuật phổ biến để tăng số lượng tế bào Cách thức nhânnuôi sinh khối này tương đối đơn giản, chi phí rẻ, thường được sử dụng trong cácnghiên cứu sơ bộ ban đầu để tìm hiểu tác dụng của các thành phần và yếu tố môitrường lên sinh khối tảo và năng suất sản phẩm được tạo ra [87] Patel và cộng sự(2021) [88] đã thu được hàm lượng DHA và DPA đạt 43,19 và 13.56 % TFA khi

nhân nuôi sinh khối Aurantiochytrium sp T66 bằng phương pháp lên men theo mẻ,

môi trường có tỷ lệ C: N là 10: 1 sau 48 giờ

1.2.2.2 Nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed batch

Nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed batch về bản chất là nhân nuôi sinh khốitheo mẻ có bổ sung cơ chất là một kĩ thuật phổ biến trong ngành công nghiệp nhânnuôi sinh khối Phương pháp nhân nuôi sinh khối này có thể có được MĐTB caobằng việc tránh được sự ức chế hoặc sự giới hạn của cơ chất, giảm được thời gian,chi phí cho việc nhân nuôi sinh khối và nhân giống giữa mỗi lần nhân nuôi sinhkhối Phương pháp này sử dụng nguồn C là glucose và nguồn N là cao nấm men.Trong giai đoạn đầu, các tế bào tích lũy lipit khoảng 20% SKK Khi cao nấm menbắt đầu cạn kiệt, các tế bào ngừng phân chia, glucose tiếp tục được bổ sung, các tếbào bước vào giai đoạn tích lũy lipit có chứa DHA Wen và cộng sự (2002) [89]khẳng định rằng trong số nhiều thành phần môi trường thì glucose, nitrate, tryptone

và cao nấm men được xác định như là các cơ chất giới hạn bởi chúng có thể thúcđẩy sự sinh trưởng của tế bào qua việc tăng tốc độ sinh trưởng đặc trưng Nhân nuôi

sinh khối Nitzschia laevis trong điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch thu

được 22,1 g SKK/L và năng suất EPA đạt 695 mg/L Cả hai thông số này đều đạt caohơn nhiều so với nhân nuôi sinh khối theo mẻ Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinhkhối theo mẻ, theo kiểu fed-batch, theo kiểu liên tục và động học tăng trưởng của cácquá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng được trình bày ở Hình 1.12 [90]

1.2.2.3 Nhân nuôi sinh khối theo kiểu liên tục

Nhân nuôi sinh khối liên tục dựa trên phương pháp kéo dài pha phát triển của

vi sinh vật trong nuôi theo mẻ, nhưng cần liên tục cung cấp các chất dinh dưỡngmới và đồng thời loại bỏ môi trường đã được sử dụng cùng với sinh khối tế bào tảo

từ hệ thống nuôi Trong nuôi liên tục, sự phát triển của tảo cũng như các yếu tố môitrường nuôi luôn được giữ ổn định Nhân nuôi sinh khối theo kiểu liên tục cho phépthu năng suất EPA cao hơn phương pháp nuôi theo mẻ và nhân nuôi sinh khối theo

mẻ có bổ sung cơ chất Nó cũng được sử dụng như là một công cụ quan trọng chonhững nghiên cứu sinh lý cơ bản của các tế bào tảo bởi vì các thông số động họcnhư tốc độ sinh trưởng đặc trưng, MĐTB và năng suất có thể được giữ ổn định ởpha cân bằng [91]

Guo và cộng sự (2018) [92] đã nhân nuôi sinh khối liên tục ba giai đoạn

chủng Schizochytrium sp HX-308, làm tăng lipid, hàm lượng DHA và năng suất

DHA lần lượt là 47,6, 64,3 và 97,1%, tương ứng so với nhân nuôi sinh khối theokiểu liên tục hai giai đoạn

1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA

Quá trình sản xuất DHA ở Schizochytrium sp bị ảnh hưởng bởi một số yếu

tố như thành phần môi trường [93], giới hạn nguồn nitơ [94], nhiệt độ [95] và cungcấp oxy [96] Nói chung, hàm lượng lipit của tế bào có thể được tăng lên trong điềukiện nhân nuôi sinh khối như nhiệt độ thấp [97], hàm lượng oxy thấp [98] và sự suygiảm nguồn nitơ [99] Tuy nhiên, trong các điều kiện bất lợi như vậy cũng làm giảmsản lượng sinh khối thu được ảnh hưởng đến năng suất tổng thể Để phá vỡ giới hạnnày, các nhà khoa học đã xác định được điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợpvừa cho năng suất cao, vừa thúc đẩy sản xuất DHA

1.2.3.1 Thay đổi quá trình nhân nuôi sinh khối

Nhân nuôi sinh khối 2 giai đoạn gồm: giai đoạn 1: tăng sinh tế bào và ít tích

tụ chất béo; giai đoạn 2: tế bào tăng kích thước do tích lũy lipit và tổng hợp DHA[100] Trong giai đoạn đầu, các tế bào phát triển nhanh với mức tiêu thụ glucosecao, cung cấp nitơ và oxy đầy đủ Vì vậy, hàm lượng oxy hòa tan (DO) tăng đượcduy trì ở mức 20% không khí trong khoảng từ 0 giờ đến 48 giờ, điều khiển tốc độkhuấy (200 - 465 vòng/phút) và nhiệt độ 28°C trong 96 giờ đầu Trong giai đoạnthứ hai, kích thước tế bào tăng dần khi tế bào tích lũy lipit nội bào, nhưng MĐTBtăng không đáng kể từ thời gian này đến kết thúc quá trình Trong giai đoạn này, tỷ

lệ C/N cao, oxy hòa tan thấp, nhiệt độ thấp là rất cần thiết cho sự tích lũy lipit vàsản xuất DHA trong các vi sinh vật có dầu [99] Sinh khối đạt được 23,9 g/L sau 96

giờ nhân nuôi sinh khối có sử dụng glucose ban đầu 30 g/L và nitơ 0,22 g/L Khi

đó, năng suất axít béo không bão hòa 3,6 g/L, DHA và DPA đạt 2,54 và 0,8 g/L,tương ứng [101]

1.2.3.2 Thay đổi nhiệt độ trong quá trình nhân nuôi

Zeng và cộng sự (2011) [97] đã thu được hàm lượng DHA cao nhất 51,98%

so với TFA và sản lượng DHA 6,05% SKK khi nuôi lắc Schizochytrium HX - 308,

sử dụng nhiệt độ nhân nuôi sinh khối trong 32 giờ đầu 30°C và 12 giờ tiếp theo20°C Điều này thể hiện tính mềm dẻo của màng tế bào thích nghi với nhiệt độ thấp[102]

1.2.3.3 Thay đổi tốc độ sục khí

Trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch trong hệ thống lên

men 1.500 Lít đối với Schizochytrium sp đã cho thấy tốc độ sục khí được kiểm soát

ở 0,4 L/L/phút trong 24 giờ đầu, sau đó chuyển sang 0,6 L/L/phút cho đến 96 giờtiếp theo và sau đó chuyển về 0,4 L/L/phút cho đến khi kết thúc quá trình Sinh khốitươi (SKT), năng suất lipit và DHA đạt 71 g/L; 35,75 g/L và 119 mg/L/h, tươngứng, cao hơn 11,21% so với không thay đổi tốc độ sục khí [98] Trong điều kiện

tương tự, sinh khối chủng S limacinum OUC88 đạt 81,84 g/L, năng suất lipit tổng

số (43,13 g/L) và DHA (19,2 g/L), hàm lượng DHA chiếm 44,54% so với TFA[103]

1.2.3.4 Thay đổi phương pháp nhân nuôi sinh khối

Chủng Schizochytrium sp sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối theo mẻ có SKK,

lipit và năng suất DHA đạt 55,32 g/L, 22,5 g/L và 8,34 g/L, tương ứng Trong khi

đó, nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-bacth ở chủng này sau 96 giờ nhân nuôi sinhkhối và có tiến hành bổ sung glucose thì SKK, lipit và năng suất DHA cao hơn đạt60,16 g/L, 30,44 g/L và 10,77 g/L, tương ứng [104] Vì vậy, phương pháp này cótriển vọng phát triển trên quy mô công nghiệp cho việc sản xuất DHA từ vi tảo

1.2.3.5 Thay đổi hỗn hợp các điều kiện

Quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch sản xuất nhiều DHA ở

Schizochytrium sp FJU-512 được thực hiện trong hệ thống lên men 15 Lít Các điều

kiện nhân nuôi sinh khối như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và tốc độ khuấy được điềukhiển tự động Sau đó, 10 g/L nitơ hữu cơ, 20 g/L muối biển và glucose được thêmliên tục khi glucose còn lại dưới 2% sau 24 giờ Nhiệt độ được duy trì 28°C ở phalog, sau đó, hạ xuống dưới 25°C để tăng cường sự tích lũy chất béo Tốc độ sục khí

1 L/L/phút, oxy hòa tan khoảng 5% pH được duy trì ở mức 5,7 ± 0,1 bằng cách tựđộng bổ sung thêm amoniac công nghiệp 28% Kết quả năng suất DHA tăng lên từ1,09 ± 0,05 g/L (sau 36 giờ) lên 16,04 ± 0,80 g/L (sau 120 giờ) [105]

Tên sản phẩm EPA+DHA (% dầu thương

Quang tựdưỡng, bể hởDSM-NP life’s

DHA™

40% - 45%

DHA

Crypthecodinium cohnii Javornicky

Nhân nuôi sinhkhối dị dưỡngDSM-NP life’s DHA

plus EPA™

10% EPA;

22,5% DHA

Schizochytrium sp.

Goldstein and Belsky

Nhân nuôi sinhkhối dị dưỡngLonza DHAid™ 35% - 40%

DHA

Ulkenia sp Gaertner Nhân nuôi sinh

khối dị dưỡngSource-Omega

Source Oil™

35% - 40%

DHA

Schizochytrium sp.

Goldstein and Belsky

Nhân nuôi sinhkhối dị dưỡngGCI Nutrients DHA

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi

tảo [43]

1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium

1.2.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ

Taoka và cộng sự (2009) [106] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự

tăng trưởng và cấu trúc axít béo của Aurantiochytrium sp mh0186 Kết quả nhiệt độ

từ 15°C đến 30°C không làm thay đổi hàm lượng DHA và năng suất sinh khối Tuynhiên, nhiệt độ có thể làm thay đổi cấu hình axít béo ở ngoài vùng nhiệt độ từ 10°C

đến 35°C Ở giá trị nhiệt độ 5°C và 40°C thì Aurantiochytrium sp không sinh

trưởng Kết quả tương tự cũng được xác định ở chủng A limacinum OUC88, với

nhiệt độ tối ưu trong khoảng từ 16°C đến 23°C [107], Schizochytrium sp KF-1, A mangrovei KF-2, KF-7, KF-12, Thraustochytrium striatum KF-9 và Ulkenia sp.

KF-13 với nhiệt độ tối ưu từ 15°C đến 30°C [108]

1.2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nhiều nguồn cacbon khác nhau đã được sử dụng cho sinh trưởng của

Thraustochytrids, phổ biến nhất là glucose và glycerol Nồng độ của nguồn cacboncũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và hiệu suất

DHA của một số Thraustochytrids Ví dụ, Chủng Aurantiochytrium sp TC 20 thay

đổi hàm lượng lipit từ 33 đến 52% dưới các điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểufed-batch với thành phần môi trường và nguồn cacbon khác nhau [109] Sahin và

cộng sự (2018) [110] đã cho thấy chủng Schizochytrium sp S31 có khả năng sử dụng

nguồn cacbon là glucose và glycerol Chủng này có năng suất sinh khối và DHA đạt5,15 g/L và 0,33 g/L khi nồng độ glucose là 40 g/L hoặc nồng độ glycerol là 40 g/L

Tương tự, Thraustochytrium sp ONC-T18, khi được nhân nuôi sinh khối ở nồng độ glucose 100 g/L thì năng suất DHA đạt 4 g/L [111], trong khi Schizochytrium sp sử

dụng gycerol trong lên men fed-bacth, sinh khối khô đạt 103,44 ± 1,50 g/L, lipit đạt47,22 ± 0,54 % SKK và DHA 61,76 ± 3,77 g/L [112]

1.2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cũng là một tham số quan trọng cho sự sinh trưởng của thraustochytrid.Một số tác giả đã sử dụng peptone và cao nấm men [113], hoặc cao nấm men (10g/L) và mì chính (10 g/L) thì sinh khối, hàm lượng lipit và DHA đạt 55,83 g/L,34,97% SKK và 35,68% TFA, tương ứng sau 96 giờ nhân nuôi sinh khối [55]

Yokochi và cộng sự (1998) [114] đã nghiên cứu các nguồn nitơ khác nhau với mục

tiêu làm tăng năng suất sinh khối và hiệu suất DHA trong A limacinum SR21 Khi

sử dụng cao ngô hay cao nấm men thì sinh khối thu được đạt 15 g/L nhưng năngsuất DHA ở cao ngô tăng gấp 3 lần (1,5 g/L)

Tỷ lệ C/N cao đã được chứng minh là cải thiện quá trình tổng hợp lipit và tíchlũy DHA trong quá trình nhân nuôi sinh khối với thraustochytrid chủng G13 [115]

Jakobsen và cộng sự (2008) [116] đã cho thấy hàm lượng TFA của Aurantiochytrium

sp T66 tăng trong điều kiện đói nitơ - tức là giảm hàm lượng nitơ dẫn đến tích lũylipit Huang và cộng sự (2012) [113] đã nghiên cứu trong quá trình nhân nuôi sinhkhối theo kiểu fed-batch với các tỷ lệ C/N khác nhau là 0,5; 1,25 và 1,875 với chủng

A limacinum SR21 Kết quả thu được hàm lượng DHA tăng từ 50% đến 67% so với

TFA, năng suất sinh khối đạt 62 g/L và DHA đạt 20 g/L

1.2.4.4 Ảnh hưởng của độ mặn

Chi Schizochytrium được phân lập từ các vùng rừng ngập mặn nên độ mặn là

yêu cầu bắt buộc cho sinh trưởng của các chi này Các chủng có độ mặn dao độnglớn thì sẽ có khả năng chịu đựng độ mặn rộng (thậm chí tới 0%) [45] Chi

Schizochytrium sinh trưởng tốt trong khoảng 15 - 30‰ cũng đã quan sát được ở rất nhiều chủng thuộc loài S mangrovei, S limacinum [108, 114], độ mặn tối ưu dao động trong khoảng 15 - 22,5‰ ở một số chủng thuộc chi Schizochytrium and

Thraustochytrium [117] Một số chủng có thể phát triển tốt trên một phạm vi độ

mặn rộng từ 0 đến 12‰, đồng thời hàm lượng DHA của chúng dao động trongkhoảng 0,08 - 0,10 g/g SKK [118]

1.2.4.5 Ảnh hưởng của oxy hòa tan

Thraustochytrids là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc [74], nghĩa là oxy cần thiếtcho sự phát triển của chúng Tuy nhiên, sự dư thừa oxi có thể dẫn đến quá trình oxyhóa các axít béo chưa bão hòa do sự hình thành các phản ứng oxy hóa Tuy nhiên,

dưới các điều kiện giới hạn oxy, hàm lượng DHA cao cũng đã được ghi nhận (51%

so với TFA) và SKK đạt 26 g/L Do đó, để có được năng suất sinh khối cao và hàmlượng lipit cao, Huang và cộng sự (2012) [113] đã cung cấp oxy liên tục trong quá

trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch A limacinum SR21, mức oxy hòa tan

là 50%, tỷ lệ C/N là 1,25, nồng độ glycerol 100 g/L, cao nấm men 40 g/L, peptone

40 g/L thì sinh khối tươi đạt 62 g/L, hàm lượng DHA là 73% so với TFA, năng suấtDHA đạt 20 g/L Do đó, mặc dù vẫn chưa rõ liệu mức oxy liên tục hay không liên

tục có lợi cho sản xuất DHA cao, nhưng nó đã được chứng minh qua các nghiên

cứu rằng oxy là một tham số quan trọng đối với sự tăng trưởng của

Thraustochytrids [119]

1.3 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu

1.3.1 Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs

Vi tảo là một nhóm các sinh vật không đồng nhất với một loạt các đặc điểmkhác nhau như kích thước tế bào, màu sắc, môi trường sinh sống, phương thức sinhsống, có thể là cơ thể đơn bào hay đa bào Sự đa dạng này đã tạo cho vi tảo nhiều

các sản phẩm khác nhau như bổ sung vào thực phẩm, thức ăn cho động vật, các

ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và nhiên liệu [120] Chính vì vậy, các

phương pháp tách chiết các sản phẩm dầu từ vi tảo cũng rất đa dạng

1.3.1.1 Phương pháp ép cơ học

Ép là phương pháp liên quan đến việc sử dụng tác động của lực nén cơ học

để phá vỡ thành tế bào và thu hồi dầu từ bên trong các tế bào Đây là phương phápphổ biến để phá vỡ tế bào Tuy nhiên, hiệu suất ép dầu phụ thuộc vào các yếu tố

chính như: loại thiết bị ép (ép thủ công, ép thủy lực hay máy ép vít liên tục), số lầnép: (ép kiệt 1 lần hay nhiều lần), đặc tính cơ học của nguyên liệu ép (kích thướchạt, nhiệt độ, độ ẩm, tính dẻo, tính đàn hồi) Phương pháp này có thể được sửdụng kết hợp với một số loại chiết dung môi như n-hexane để nâng cao hiệu quảtách chiết [121]

1.3.1.2 Phương pháp enzyme

Enzyme cũng có thể được sử dụng để thủy phân thành tế bào giải phóng dầu.Việc sử dụng các enzyme đơn lẻ hoặc kết hợp với một phương pháp phá vỡ vật lý có thểlàm tăng khả năng tách chiết và năng suất thu được cao hơn Một số enzyme thương mạithường được sử dụng như: alcalase, neutrase, flavourzyme, amylase, glucanase, protease,

pectinase Ví dụ khả năng thu hồi dầu cá đạt cao nhất 17,4% (sau 2 giờ) sử dụng alcalase.

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý enzyme để tách dầu ra khỏi nguyênliệu như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, thời gian Tuy nhiên, phương phápnày rất tốn kém nên triển khai quy mô lớn bị hạn chế [122]

1.3.1.3 Phương pháp hóa học

Phương pháp này sử dụng các dung môi hòa tan dầu để tách dầu ra khỏi

nguyên liệu Các dung môi như benzen, cyclohexan, n-hexane, acetone và

chloroform đã cho thấy có hiệu quả khi được sử dụng trên vi tảo; chúng làm phá vỡthành tế bào vi tảo và chiết xuất dầu vì dầu tảo có độ hòa tan cao trong dung môi

này [123] Ngoài ra, một dung môi thích hợp thường không tan trong nước, có điểmsôi thấp để dễ dàng loại bỏ nó sau khi tách chiết, có thể tái sử dụng và tiết kiệm chiphí Vì vậy, n-hexane (một dung môi không phân cực) thường được sử dụng ở quy

mô lớn [124] Vấn đề lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết dầu củamột loại nguyên liệu nhất định là rất cần thiết Tính chất cơ bản và không thể thiếuđược của dung môi tách chiết là tính chất hoà tan chọn lọc, nghĩa là dung môi phảihoà tan tốt chất cần tách mà không hoà tan hoặc hoà tan rất ít các chất khác không

mong muốn [125]

1.3.1.4 Phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Sóng siêu âm tạo ra bong bóng trong dung môi, bong bóng vỡ ra và ở gần

thành tế bào của vi tảo, tạo ra sóng xung kích, làm cho các chất béo được giải phóngvào dung môi Phương pháp này cải thiện đáng kể việc tách chiết dầu vi tảo, hiệu

quả cao hơn, giảm thời gian tách chiết, tăng năng suất, chi phí trung bình và ít độc

Ví dụ: Sóng siêu âm rất hiệu quả trong việc phá vỡ thành tế bào vi tảo

Crypthecodinium cohnii, tăng hiệu suất tách dầu từ 4,8% (bằng cách chiết bằng

soxhlet với n-hexane) lên 25,9% [122] Tuy nhiên, phương pháp này không thích

hợp cho sự ổn định của các loại dầu giàu axít béo không bão hòa đa nối đôi và nó

khó có thể được thực hiện ở quy mô rộng

1.3.1.5 Phương pháp chuyển este hóa trực tiếp từ sinh khối

Phương pháp để chuyển hóa dầu, mỡ động thực vật thành axít béo este chủyếu dựa trên phản ứng este hóa với xúc tác hóa học, xúc tác sinh học hoặc nhiệt

phân (pyrolysis) Xúc tác hóa học trong phản ứng este hóa có thể là axít (HCl,

H2SO4) hoặc kiềm (KOH, NaOH) tùy theo trạng thái tự nhiên của nguyên liệu

(lượng axít béo tự do trong nguyên liệu) [126] Hiệu suất của quá trình este hóa phụthuộc vào nhiều yếu tố như lượng nước có trong nguyên liệu thô (sẽ tạo thành xà

phòng thay vì methyl este), lượng axít béo tự do trong nguyên liệu, nhiệt độ, áp suất