Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

67Bảng 3.4 Thành phần axít béo của sinh khối tươi chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 5 và 10 Lít 69Bảng 3.5 Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit của chủng TB17 khi

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NCS Lê Thị Thơm

Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT

NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM

BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI”

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – 2021

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo tận tình những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ về tinh thần, vật chất, động viên tôi vượt qua nhiều trở ngại và khó khăn để hoàn thành luận án trong suốt những năm qua.

Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng đào tạo của học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang công tác tại phòng Công nghệ Tảo: TS Hoàng Thị Minh Hiền, TS Ngô Thị Hoài Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Lưu Thị Tâm, TS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Thị Ngọc Mai

chỉnh số liệu trong luận án này.

Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, TS Đoàn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng các axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng của dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói và hoàn thiện sản phẩm.

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 do PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Thơm

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với cáccộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đãđược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phépcủa các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Lê Thị Thơm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…… ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… ……… 4

1.1.Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo……… ……… 4

1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 Giới thiệu chung về axit béo …… ……… ……… ……… 4

Vai trò và ứng dụng của PUFAs……….……… 6

Nguồn cung cấp PUFAs 9

Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo ……… 14

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối ……… 18

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium ……… 18

1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới………… 20

1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA……… 22

1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium 24

1.3 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu………… 26

1.3.1 Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs……….………. 26

1.3.2 Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô ……….……… 29

1.3.3 Các phương pháp tinh sạch PUFAs, DHA, EPA, DPA ……… 30

1.3.4 Bảo quản axit béo……… ……….……… ………… 33

1.4 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của dầu tách chiết từ Schizochutrium đối với người và động vật … 35 1.5 Tình hình sản xuất và tách chiết PUFAs từ VTBDD ở Việt Nam …… 36

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 38

2.1 Vật liệu……… 38

2.1.1 Chủng tảo và điều kiện nhân nuôi sinh khối ……… 38

2.1.2 Động vật thí nghiệm 38

2.1.3 Sinh khối tảo và cặp mồi đặc hiệu 38

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 39

2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng……… 39

2.2.1 Hóa chất……… 39

2.2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng………. 39

2.3 Môi trường……… 40

2.4 Phương pháp nghiên cứu ……… 41

2.4.1 Sàng lọc và nhân nuôi sinh khối chủng tiềm năng trong các hệ thống lên men khác nhau cho tích lũy các axit béo ω 3 - 6 cao ……… 41

2.4.2 Phương pháp tách chiết lipit và làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω 3 - 6 44

2.4.3 Xác định các chỉ tiêu chất lượng của dầu……… 47

2.4.4 Tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên Algal oil omega 3 (AOO-3-6) 50

2.5 Bố trí thí nghiệm 51

2.5.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6……… 51

2.5.2 Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng tiềm năng… 52 2.5.3 Nhân nuôi sinh khối chủng S mangrovei TB17 trong các hệ thống lên men khác nhau (1, 5, 10, 30 và 150 Lít)……… 52

2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện đến quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 54

2.5.5 Nghiên cứu khả năng bảo quản của các chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 và omega-657 2.5.6 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 57

2.6 Xử lý số liệu 58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 59

3.1 Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau ……… 59

3.1.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega 3 - 6……… 59

3.1.2 Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 ở quy mô bình tam giác lên sinh trưởng và tích lũy axit béo……… 62

3.1.3 Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 5 và 10 Lít ……… 68

3.1.4 Nhân nuôi sinh khối ở hệ thống lên men 30 Lít ………. 70

3.1.5 Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 150 Lít ……… 72

3.1.6 Các phương pháp nhân nuôi khác nhau để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω 3 – 6……… 74

3.1.7 Thu hoạch sinh khối chủng S mangrovei TB17 ……… 80

3.2 Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ SKK chủng TB17 …… 82

3.2.1 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng FFA …… 82

3.2.2 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng methyl este … 94

sinh khối tươi và SKK……… 100

3.2.4 Sản xuất và đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 ở quy mô 100g SKK/mẻ ……… 103

3.3 Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên nang mềm AOO-3-6……… 108

3.3.1 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến quá trình bảo quản dầu giàu các axit béo ω 3 - 6……… 108

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega 3 - 6 từ dầu sinh học giàu axit béo ω 3 – 6 …… 113

3.3.3 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên dầu tảo AOO-3-6……… 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 124

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ………… 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 127

PHỤ LỤC………

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ALA α-linolenic acidlinolenic acid Axit α-linolenic acidlinolenic

AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 Algal oil omega-linolenic acid3-linolenic acid6

DGLA dihomo-linolenic acidgamma-linolenic acidlinoleic acid Axit dihomo-linolenic acidgamma-linolenic acidlinoleic

phẩm Hoa kỳGRAS Generally Recognized as Safe Chứng nhận là an toàn

MUFA Monounsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa một nối đôi

PUFA Polyunsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa đa nối đôi

microscopy

TBHQ Tertiary Butyl Hydroquinone Tertiary Butyl Hydroquinone

ω3-linolenic acid6 Omega 3 -linolenic acid 6 Omega 3 -linolenic acid 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 có trong một số loại dầu thực vật 9Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá và động vật 10Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo… 24Bảng 1.4 Một số phương pháp tách chiết dầu và khả năng thu hồi của chúng……… 29

Bảng 3.1 Sự thay đổi MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của các chủng được nhân

nuôi sinh khối trong bình tam giác 250 mL sau 144 giờ ……… 60Bảng 3.2 Thành phần axit béo của các chủng TG11(6), TB17 và PQ6 61Bảng 3.3 Thành phần axit béo trong sinh khối tươi của chủng TB17 nhân nuôi sinh

khối trong bình tam giác 1 Lit……… 67Bảng 3.4 Thành phần axít béo của sinh khối tươi chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 5 và 10 Lít 69Bảng 3.5 Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi

sinh khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 70Bảng 3.6 Thành phần và hàm lượng axít béo của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 71Bảng 3.7 Thay đổi mật độ tế bào, sinh khối khô và lipit của chủng TB17 khi nhân

nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít……… 72Bảng 3.8 Thành phần và hàm lượng axít béo của sinh khối tảo S mangrovei TB17

sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít………… 73Bảng 3.9 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo mẻ……… 75Bảng 3.10 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-linolenic acidbatch……… 75Bảng 3.11 Thành phần axit béo trong sinh khối của chủng TB17 ở các phương pháp

nhân nuôi sinh khối khác nhau trong môi trường P1……… 77Bảng 3.12 Tổng hợp thành phần và hàm lượng các axit béo chủ yếu trong quá trình

nhân nuôi sinh khối ở các quy mô khác nhau 79Bảng 3.13 Thành phần axít béo trong lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối

theo mẻ ở hệ thống lên men 30 Lít……… 86Bảng 3.14 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng xà phòng hóa ……… 88Bảng 3.15 Thành phần axít béo trong hỗn hợp dầu sau phản ứng xà phòng hóa lipit 89Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

axit béo ω 3 -linolenic acid 6 thu được sau quá trình làm giàu……… 92

Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức vớiurea

Thành phần axít béo của TFA thu được từ SKK chủng TB17

Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàuaxit béo ω 3 -linolenic acid 6 (dạng methyl ester) thu được sau quá trình làm

giàu………

Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức vớiurea

Ảnh hưởng của các phương pháp tách chiết dầu khác nhau và các nguồnsinh khối khác nhau đến hiệu suất tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 -linolenic acid 6

Thành phần axit béo của hỗn hợp PUFAs thu được ở dạng FFA và methylester từ SKK và

Bảng 3.32 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của viên nang dầu tảo AOO-linolenic acid3-linolenic acid6………

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của viên nang AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 đối với trọng lượng cơ thể chuột (n =

………

Bảng3.34

h hưởn

g củ

a viê

n nan

g AOO-linolenic acid3-linolenic acid

6 lê

n mộts

ố chỉtiê

u huyếthọ

c củachuột

x±

S D )

chuột (n = 08, x ± SD)

………

Bảng 3.36 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện, tốc độ dập tắt phản xạ có điều

kiện tìm thức ăn trong mê lộ của các lô chuột nghiên cứu (n = 8)

…………

93969899

100

102106

107

108111112113113

114

115116

117

123

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA……… 5

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA………… 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của ω-linolenic acid6 DPA (A) và ω-linolenic acid3 DPA (B)……… 6

Hình 1.4 Sản xuất axit béo omega -linolenic acid 3 từ các nguồn khác nhau ……… 12

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết PUFAs từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người… 12 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người… 15 Hình 1.7 Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid (DHA) ở Thraustochytrids……… 15

Hình 1.8 Sinh tổng hợp DHA theo con đường hiếu khí ở Thraustochytriidae… 16

Hình 1.9 Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS ở Thraustochytriidae…… 17

Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của thraustochytrid và labyrinthulid……… 19

Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium 20

Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-linolenic acidbatch, liên tục và động học tăng trưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng……… 21

Hình 1.13 Sơ đồ tổng quát hoạt động của các chất chống oxy hóa……… 34

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu dầu sinh học giàu ω 3 -linolenic acid 6 từ Schizochytrium mangrovei TB17 58 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng TB17………… 62

Hình 3.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của chủng TB17……… 62

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của chủng TB17…… 64

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng của chủng TB17… 64

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng TB17………… 65

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng của chủng TB17 65 Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường môi trường lên sinh trưởng của chủng TB17……… 66

Hình 3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của chủng TB17 66 Hình 3.9 MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của chủng TB17 trong bình tam giác 1 Lit……… 67

Hình 3.10 Ảnh hình thái tế bào chủng TB17 nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 1 Lit……… 68

Hình 3.11 MĐTB và SKK của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… 68 Hình 3.12 Hàm lượng glucose còn dư trong môi trường nuôi và lipit của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… ……… 68

Hình 3.13 Sinh trưởng của chủng TB17 trong các môi trường nhân nuôi sinh khối

Hình 3.14 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo mẻ…… 78Hình 3.15 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối kiểu fed-linolenic acidbatch 78Hình 3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp thu hoạch sinh khối đến sinh khối

tươi (A) và MĐTB tảo trong môi trường sau thu hoạch (B)……… 80Hình 3.17 MĐTB tảo trong môi trường nuôi sau thu hoạch bằng chitosan ở các

Hình 3.18 Ảnh minh họa quá trình thu sinh khối bằng chitosan ở các nồng độ

Hình 3.19 Ảnh hưởng của phương pháp tách chiết lên hiệu suất tách chiết lipit từ

Hình 3.20 Ảnh hưởng của các loại dung môi lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

Hình 3.21 Ảnh hưởng của phương pháp sấy sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipit

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17……… 85Hình 3.24 Ảnh hưởng của chế độ khuấy lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối

khô của chủng TB17……… 85Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH (A), thời gian phản ứng (B) và nhiệt độ

phản ứng (C) lên hiệu suất xà phòng hóa dầu tảo……… 87Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ FFA: urea (A), tỉ lệ Urea: ethanol (B) và nhiệt độ

kết tinh (C) lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs của hỗn

Hình 3.27 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối

Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ sinh khối lên hiệu suất tách chiết TFA

Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

Hình 3.30 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

Hình 3.31 Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urea lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách

Hình 3.32 Ảnh hưởng của tỷ lệ Urea: methanol lên hiệu suất tạo phức và hiệu

thu được……… 104Hình 3.36 Quy trình tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 -linolenic acid 6 PUFAs dạng methyl este

từ SKK chủng S mangrovei TB17 theo phương pháp tạo phức urea… 105Hình 3.37 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHA lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 -linolenic acid 6……… 109Hình 3.38 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHT lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 -linolenic acid 6……… 109Hình 3.39 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa TBHQ lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 -linolenic acid 6……… 110Hình 3.40 Ảnh hưởng của hỗn hợp 3 chất bảo quản theo tỷ lệ 1:1:1 (B) lên chỉ số

peroxide của dầu sinh học ω 3 -linolenic acid 6……… 110Hình 3.41 Ảnh hưởng của vitamin E nồng độ 0,0075% lên chỉ số peroxyt của dầu

sinh học ω 3 -linolenic acid 6 112Hình 3.42 Ảnh hưởng của viên AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 đối với hoạt độ AST (A) và ALT (B),

hàm lượng Albumin huyết tương (C) và Chlesterol toàn phần (D)…… 120Hình 3.43 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột lô đối chứng (A), lô TN1 (B) và

Hình 3.44 Hình ảnh mô bện học vi thể gan, thận, lách chuột sau 90 ngày uống

thuốc lô đối chứng (A, D, H), lô TN1 (B, E, D) và lô TN2 (C, G, K),

MỞ ĐẦU

Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trịdinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cảcác loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho món

ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người,dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạchcacbon ≤ 18 Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, canola và đậu tương chứacác axit béo không bão hòa đa nối đôi dạng omega-linolenic acid3 (polyunsaturated fatty acidomega 3; PUFAs ω-linolenic acid3) chủ yếu là axít α-linolenic acidlinolenic (ALA) và các loại dầu khác nhưdầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là PUFAs ω -linolenic acid 6 Đối với cácloại axít béo ω-linolenic acid3 có số cacbon lớn hơn 20 và 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển.Nguồn cung cấp chính các axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) vàeicosapentaenoic (EPA; C20:5) là các loài cá nhiều mỡ như cá trích, cá thu và cáhồi Tuy nhiên, chất lượng của dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa

vụ và vị trí đánh bắt Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá trong khẩu phầnthức ăn, kể cả cho trẻ nhỏ cũng như dược phẩm có thể gặp một số bất lợi bởi sự cómặt tạp nhiễm của polychlorinated biphenyls (PCBs) hoặc dioxin, kim loại nặng…cũng như mùi vị đặc trưng của cá gây ra Hơn nữa, dầu cá biển thực tế là một hỗnhợp phức tạp các axít béo có chiều dài mạch cacbon và mức độ chưa bão hoà rấtkhác nhau Do vậy, việc tinh sạch chúng rất khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kémtrước khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng như nâng cao giátrị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω 3-linolenic acid 6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu vàdần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trong thịtrường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm trên thế giới nói chung vàViệt Nam nói riêng

Vi tảo biển (VTB) được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai tháccác chất có hoạt tính sinh học, để xử lý môi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinhhọc và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) với một số loàiVTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tựdưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo cógiá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn Để khắc phụcnhững nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài vi tảo

biển dị dưỡng (VTBDD) trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan

tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới

mẻ ở Việt Nam và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống conngười

Các loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả năng tích lũy hàm lượng

lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và hàm lượng -linolenic acid3 PUFAs nhưEPA, DHA chiếm 30-linolenic acid50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid -linolenic acid TFA) Vai tròcủa -linolenic acid3 PUFAs nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triểntrí não của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh và trong nhiều liệupháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm

Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium được coi là một trong các ứng cử viên

tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -linolenic acid3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam,những nghiên cứu về nhân nuôi sinh khối, tách chiết và ứng dụng của các axít béotrên từ VTBDD còn rất mới mẻ và có nhiều tiềm năng ứng dụng Chính vì vậy,

chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6

từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người”.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

1 Sàng lọc chủng/loài VTBDD và tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu đượcsinh khối giàu axít béo ω 3 -linolenic acid 6;

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω 3 -linolenic acid 6 từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được;

3 Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω 3 -linolenic acid 6 có tính an toàn cao và đánhgiá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên nang trên động vật thực nghiệm

1 Sàng lọc chủng tiềm năng giàu axít béo ω 3 -linolenic acid 6 từ các loài VTBDD Việt Nam; tối

ưu các điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm năng ở quy mô bình tam giác, ở các

hệ thống khác nhau (5, 10, 30 và 150 Lít);

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω 3-linolenic acid 6 nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sứckhỏe cho con người;

3 Sản xuất viên nang Algae oil omega 3 -linolenic acid 6 (AOO-linolenic acid3-linolenic acid6) từ dầu sinh học giàu axítbéo ω 3 -linolenic acid 6 đảm bảo chất lượng, có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trínhớ, khả năng học tập của viên AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 trên mô hình động vật thực nghiệm

Những đóng góp mới của luận án

-linolenic acid Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có

hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng

Schizochytrium mangrovei TB17 được phân lập ở tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm

lượng PUFAs ω 3 -linolenic acid 6 cao, trong đó DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA và axitdocosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn được các điều

kiện thích hợp cho tách chiết, tinh sạch axít béo ω 3 -linolenic acid 6 từ chủng TB17 có hàmlượng axit béo ω 3 -linolenic acid 6 cao (đặc biệt là DHA, EPA và DPA đạt 86,33 ± 2,34% so vớiTFA); bao viên nang AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 và đã đánh giá được tính an toàn, tác dụng dược lýcủa viên nang ở mô hình động vật thực nghiệm; viên nang đủ tiêu chuẩn làmnguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người.

-linolenic acid Lần đầu tiên ở Việt Nam đã chứng minh được viên nang AOO-linolenic acid3-linolenic acid6 có chứa

dầu ω 3 -linolenic acid 6 tách chiết từ S mangrovei TB17 an toàn và có khả năng cải thiện trí nhớ, khả

năng học tập trên mô hình động vật thực nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

-linolenic acid Có được các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của chủng S mangrovei

TB17 phân lập ở Diêm Điền, Thái Bình năm 2010 (nhân nuôi sinh khối theo mẻ ở hệthống lên men 30 Lít, môi trường M12 -linolenic acid sử dụng cao nấm men công nghiệp) đạt

sinh trưởng với mật độ tế bào (128,42 0,27 x106 tế bào/mL), SKK (30,83  0,25g/L) và lipit (65,96  0,31% SKK) Tổng hàm lượng các axit béo ω 3 -linolenic acid 6 (47,35 ±1,39% so với TFA), sản lượng DHA (40,17 ± 1,75 mg/L/giờ);

-linolenic acid Có được quy trình tách chiết dầu sinh học giàu các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 từ S.

lượng để làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người;

-linolenic acid Có được bộ số liệu về tính an toàn và tác dụng dược lý của viên AOO-linolenic acid3-linolenic acid6trên động vật thực nghiệm, cung cấp cơ sở khoa học cho việc định hướng ứng dụng làmthực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

Bố cục của luận án

Luận án gồm 148 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 34trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả và thảo luận 65 trang,kết luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu thamkhảo 22 trang gồm 241 tài liệu Trong luận án có 58 hình, 41 bảng và 48 trang phụ lục

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng

hợp axít béo

Các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 có nhiều chức năng sinh học như: cải thiện hiệu quảbệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu quả rõrệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thểdẫn đến đau tim và đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa độngmạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm Chínhnhững đặc điểm trên mà các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 ngày càng được ứng dụng trong thựcphẩm bảo vệ sức khỏe cho con người Do vậy, những đặc điểm chính về axít béo ω

3 -linolenic acid 6 sẽ được trình bày khái quát dưới đây

1.1.1 Giới thiệu chung về axit béo

Axít béo có công thức tổng quát: CH3-linolenic acid(CH2)n-linolenic acidCOOH PUFAs là các axít béomạch dài (18 -linolenic acid 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi.Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl.Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốccacboxyl Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methylngười ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω” Các liên kết đôi trong PUFAs cũng

có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay” Những nhóm ω-linolenic acid3, ω-linolenic acid6 hayω-linolenic acid9 PUFAs có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9 tính từgốc methyl [1]

Mạch cacbon của axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dàikhông cong Các axít béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch cacbon bịuốn cong 30°, càng có nhiều liên kết đôi, mạch cacbon càng bị uốn cong nhiều hơn

Có giả thiết cho rằng mạch cacbon của axít béo không no dạng cis có ý nghĩa quantrọng đối với màng sinh học Theo nghiên cứu của Kelter và cộng sự (1999) [2] chothấy các phân tử không thể chuyển từ dạng cis-linolenic acid sang dạng trans-linolenic acid hoặc ngược lạitrong trường hợp bình thường Kiểu đồng phân cis-linolenic acid hoặc trans-linolenic acid là nguyên nhân dẫnđến tính chất khác nhau của các axít béo

Vị trí của các nối đôi trong chuỗi cacbon của PUFAs tạo nên một sự khácbiệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng Các tế bào của cơ thể conngười chỉ có thể tạo nối đôi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ 9 trở đi Điềunày có nghĩa là con người không thể tự tổng hợp được axít béo ω -linolenic acid 3 và ω -linolenic acid 6 Do đóhai loại axít béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3] Hoạt

tính sinh học của các axít béo phụ thuộc vào các dạng cấu trúc hóa học đặc trưngcủa chúng Axít béo có một số dạng cấu trúc chính như ethyl este (EE), axít béo tự

do (free fatty acid -linolenic acid FFA) và triacylglycerols (TAGs) Một số nghiên cứu đã chứngminh rằng các axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp hơn so với dạng FFA vàTAG [4] Sự hấp thụ EPA ở dạng triglycerid là 90% trong khi ở dạng ethyl ester chỉ

là 60% [5]

Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là ω -linolenic acid 3 và ω -linolenic acid 6 Các axítbéo ω -linolenic acid 3 quan trọng nhất là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA Các axít béo ω -linolenic acid 6chính là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-linolenic acid6), gama linoleic (GLA -linolenic acid C18:3), eicosadienoic,dihomo-linolenic acidgamma-linolenic acidlinoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6]

1.1.1.1 Axít docosahexaenoic (DHA)

DHA có công thức phân tử C22H32O2, là một axít béo ω -linolenic acid 3 không bão hòa đanối đôi Nó có 22 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 6 liên kết đôi ở các

vị trí cacbon số 4, 7, 10, 13, 16 và 19, có công thức tổng quát là: CH3(CH2CH =CH)6(CH2)2COOH và được kí hiệu là C22:6 ω-linolenic acid3 [7] DHA có thể được chuyểnthành docosanoids Các liên kết đôi (-linolenic acid C = C -linolenic acid) có cấu hình cis (-linolenic acid C/C = C\C -linolenic acid) đểhoạt động sinh lý Cấu trúc không bão hòa đa nối đôi (= CH -linolenic acid CH2 -linolenic acid CH =) xoayquanh là các liên kết đơn (C -linolenic acid C) liền kề Do đó, nó làm tăng khả năng liên kết hơn

so với phân tử không có liên kết đôi nào Điều này làm tăng tính linh hoạt của phân

tử rất nhiều [8] Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 g/mol Ở điều kiện chuẩn,DHA tồn tại dạng lỏng, không tan trong nước, tan trong dung môi không phân cực.Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của DHA được trình bày trên Hình 1.1 [7]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA

[7] 1.1.1.2 Axít eicosapentaenoic (EPA)

EPA có công thức phân tử C20H30O2, là một axít béo ω-linolenic acid3 không bão hòa đa nốiđôi Nó có 20 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 5 liên kết đôi ở các vịtrí cacbon số 5, 8, 11, 14 và 17, có công thức tổng quát là: CH3(CH=CH=CH)5(CH2)3COOH và ký hiệu là C20:5 ω-linolenic acid3 Trọng lượng phân tử của EPA là 302,451 g/mol EPA tồn tại dạng lỏng ở điều kiện chuẩn, bay hơi ở 439oC, khối lượng riêng

0,943g/cm3 Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của EPA được trình bày trênHình 1.2 [9].

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA [9]

1.1.1.3 Axít docosapentaenoic (DPA)

DPA có công thức phân tử C22H34O2 Trọng lượng phân tử của DPA là 330,5g/mol DPA là một axít béo không bão hòa đa nối đôi Nó có 22 nguyên tử cacbontrong chuỗi hydrocarbon, có 5 liên kết đôi DPA có hai dạng đồng phân: all -linolenic acid cis -linolenic acid4,7,10,13,16 -linolenic acid docosapentaenoic axít và all -linolenic acid cis -linolenic acid 7,10,13,16,19 -linolenic acid docosapentaenoicaxít (Hình 1.3) Chúng thường được gọi là ω-linolenic acid6 DPA và ω-linolenic acid3 DPA, tương ứng; chỉ vịtrí của liên kết đôi là 6 hoặc 3 nguyên tử cacbon gần nhất với cacbon ở đầu methylcủa phân tử Động vật có vú, kể cả con người, không thể tổng hợp được hai axít béonày và do đó phải thu nhận qua con đường thức ăn để duy trì sức khỏe bình thường.Cấu trúc hóa học của ω -linolenic acid 6 DPA và ω -linolenic acid 3 DPA được trình bày trên Hình 1.3

A

B

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFAs

Hiện nay, PUFAs như ALA, EPA và DHA đang được quan tâm nghiên cứunhiều nhất bởi chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người và động vật.Đặc biệt là DHA rất đa dạng về chức năng cũng đã được chứng minh bởiHashimoto và cộng sự (2017) [11]

1.1.2.1 Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người

PUFAs có một số vai trò sinh học chủ yếu:

PUFAs tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipit, vận chuyển vàhướng tới các mô Ví dụ, các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợptriacylglycerol (TAG) ở gan bởi  -linolenic acid 3 PUFAs Bên cạnh đó, PUFAs còn tham giavào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Sự có mặt của chúng trong thành phầnphospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng Điều này góp phần quantrọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng PUFAs là thành phầnquan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt đối với trẻ nhỏ từ 0 -linolenic acid 2 tuổi Axít béonày cũng có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động của hệ thốngthần kinh trung ương, cần thiết cho sự phát triển chức năng não bộ và thị giác ở trẻnhỏ, não bộ không thể duy trì hoạt động nếu như không có những axít béo quantrọng này [12] Để duy trì màng tế bào, chức năng não và truyền các xung thầnkinh, các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 cũng tham gia vào việc chuyển oxy trong quá trình tổnghợp hemoglobin và phân chia tế bào [13]

PUFAs góp phần cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch: giảm nguy cơ loạn nhịptim; có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối utuyến tiền liệt; làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiệnchức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm [12]

So với các cơ quan khác hàm lượng DHA trong não và mắt cao hơn DHAđặc biệt tập trung vào chất xám của não và võng mạc Trong não, DHA có liênquan đến tín hiệu thần kinh, trong khi ở mắt nó có liên quan đến chất lượng thị lực.DHA được tích lũy trong não và mắt vào giai đoạn phôi thai sớm và cuối thai kỳ.Hàm lượng DHA thấp làm giảm sự phát triển nhận thức và chức năng thị giác [7]

Axít béo ω -linolenic acid 3 cũng đã được điều tra tính hiệu quả trong rất nhiều các nghiêncứu về sức khỏe con người bao gồm các loại ung thư khác nhau như: đại tràng, vú,

và tuyến tiền liệt Nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc sử dụng cácaxít béo ω -linolenic acid 3 để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường thai kỳ, có lợi trong việc điềuhòa chức năng trao đổi chất của mẹ và thai nhi [14]

Trong chế độ ăn chứa LA (ω -linolenic acid 6) và ALA (ω -linolenic acid 3) đóng vai trò quan trọngtrong việc duy trì hàm lượng PUFAs ω 3 -linolenic acid 6 của tế bào nội mô Việc chuyển ALAthành EPA và DHA phụ thuộc vào một số yếu tố di truyền, chế độ ăn uống (tỷ lệ

LA và ALA), giới tính và các enzyme desaturase và elongases [15] Các axit béo ω-linolenic acid 6 như linoleic và DPA có tác dụng chống viêm dây thần kinh trong cơ thể người ởcác mô hình về bệnh Alzheimer Trong đó, axit linoleic ω -linolenic acid 6 có trong khẩu phần ăn sẽlàm tăng chất chuyển hóa DPA ω -linolenic acid 6 trong não và có tác dụng thúc đẩy quá trình

chống viêm dây thần kinh dẫn đến làm giảm bệnh Alzheimer [16] Ngoài ra, DPA ω-linolenic acid 6 đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm phù nề và tăng cường tác dụng khi kết hợp với DHA [17], giảm co thắt mạch máu và kết tụ tiểu cầu [15].

1.1.2.2 Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản (NTTS)

PUFAs như axít EPA, ARA và DHA cũng là thành phần rất quan trọng bởi nócần thiết cho sự phát triển và biến thái của ấu trùng Tuy nhiên, cần chú ý là tỷ lệ giữaDHA, EPA và ARA có thể còn quan trọng hơn rất nhiều so với hàm lượng của chúng.Các loài vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng rất cao, đặc biệt là các axít béo [18]

Trong một số nghiên cứu về làm giàu luân trùng Brachionus plicatilis và ấu trùng Artemia salina trong trại sản xuất giống thủy sản ở Ai Cập đã cho thấy khi sử dụng tảo Tetraselmis chuii có PUFAs với hàm lượng ARA đạt 5,5%; EPA -linolenic acid 4,8%

và DHA -linolenic acid 5,0% so với TFA đã làm tăng tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót,tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, nâng cao giá trị

dinh dưỡng của luân trùng và Artemia Do đó đã làm tăng khả năng sống sót và giúp

cho ấu trùng nuôi phát triển tốt nhất [19] Hàm lượng axit béo ARA, ALA, DHA và

EPA trong thịt cá đã tăng lên đáng kể sau khi bổ sung Aurantiochytrium sp vào

thức ăn ARA tăng từ 0,97 đến 1,24%, ALA tăng từ 0,59 đến 0,81%, DHA tăng từ14,63 lên 14,82% và EPA tăng từ 4,58 -linolenic acid 5,19% [20] Thiếu DHA và EPA gây tỷ lệchết cao, tốc độ sinh trưởng chậm ở ấu trùng và giai đoạn non của cá, tôm [21]

Theo báo cáo của Sprague và cộng sự (2016) [22], việc sản xuất nguồn thức

ăn từ tảo dị dưỡng đơn bào như Crypthecodinium sp., Schizochytrium sp giàu

PUFAs (DHA, EPA, DPA) cho NTTS để làm tăng mức n-linolenic acid6 DPA trong thịt của cá

Vì vậy, thức ăn đã được thay thế lên đến 60% bằng sinh khối vi tảo giàu PUFAsnày Wang và cộng sự (2017) [23] đã nghiên cứu khả năng bổ sung sinh khối của

Schizochytrium sp để làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

Litopenaeus van namei Kết quả đã chỉ ra rằng Schizochytrium sp được dùng làm

thức ăn bổ sung có thể thay thế được dầu cá hay dầu thực vật vì chúng có chấtlượng đáp ứng được mọi yêu cầu, làm tăng đáng kể chức năng miễn dịch, trọnglượng cơ thề và chất lượng cá

1.1.2.3 Ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm

Trong trứng gà nuôi ngoài tự nhiên có tỷ lệ axít béo ω-linolenic acid6/ω-linolenic acid3 là 10:1 Chấtlượng trứng bị ảnh hưởng bởi các tỷ lệ ω-linolenic acid6/ω-linolenic acid3 của thức ăn và thức ăn có bổ sungaxít béo làm giảm độ dày vỏ trứng [24]

Theo Nyberg (2017) [25] gà ăn các axít béo ω-linolenic acid3 trong dầu tảo đã làm tăngcác axít béo ω-linolenic acid3 như EPA và DHA trong trứng Kết quả tương tự được Küçükersan

và cộng sự (2010) [26] chỉ ra rằng bổ sung 3% dầu đậu nành (rất giàu LA) đã làm

tăng khối lượng trứng gà so với không bổ sung Khi bổ sung 3 -linolenic acid 3,5% dầu cá sẽ làmgiảm 14,5 -linolenic acid 15% chlesterol trong lòng đỏ trứng [27] Abril (2000) [28] đã thử

nghiệm trên gà mái đẻ ăn Schizochytrium sp với một lượng tương đương 165 mg

DHA/con/ngày đã làm tăng hàm lượng DHA trong trứng lên 5 lần (135 mgDHA/trứng) so với đối chứng (ĐC) (28 mg DHA/trứng) Ngoài ra, hàm lượng DHAtăng lên đến 200 mg DHA/trứng khi cho gà ăn sinh khối tảo này ở mức 825 mg/con/ngày Theo nghiên cứu mới nhất của Castro và cộng sự (2019) [29] đã cho thấy khicho 198 con bò chưa mang thai ăn chế độ ăn có bổ sung 2,3% dầu đậu nành hoặc2,3% dầu hạt lanh thì cải thiện đáng kể thành phần dinh dưỡng của sữa và số lượng

bò mang thai cao hơn trong lần thụ tinh nhân tạo đầu tiên

1.1.3 Nguồn cung cấp PUFAs

1.1.3.1 PUFAs có nguồn gốc từ thực vật

Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa PUFAs có mạch cacbon ≤18 Trong đó cácloại dầu thực vật như dầu lanh, dầu cải … chứa ω-linolenic acid3 PUFAs chủ yếu là axít ALA(18:3 ω-linolenic acid3) và các loại dầu khác như dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu lưu ly…lại chứa chủ yếu là ω-linolenic acid6 PUFAs (18:2 ω-linolenic acid6) [22]

Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo ω 3 -linolenic acid 6 có trong một số loại dầu thực vật [22]

5 22:1 ω-linolenic acid9 0,1 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 2,5

6 24:1 ω-linolenic acid9 0,4 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 1,6

8 18:3 ω-linolenic acid6 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 21,7

9 20:2 ω-linolenic acid6 0,1 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 0,2

11 18:4 ω-linolenic acid3 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 0,1

12 20:3 ω-linolenic acid3 -linolenic acid -linolenic acid -linolenic acid 0,1 -linolenic acid

Ghi chú: MUFA - axít béo không no một nối đôi (monounsaturated fatty acid), SFA - axit

béo bão hòa (saturated fatty acid)

Ngoài ra còn một số nghiên cứu khác trên hạt tía tô đã cho thấy dầu hạt tía tô

có chứa PUFAs với tỷ lệ cao bao gồm chủ yếu là ω-linolenic acid3 GLA (C18: 3), ω-linolenic acid6 linoleic(C18: 2) và ω-linolenic acid9 oleic (C18: 1) [30] Hàm lượng lipit tổng số đạt 33,25 -linolenic acid 42,58%SKK, trong đó, ω-linolenic acid3 ALA chiếm 52,58 -linolenic acid 61,98% và ω-linolenic acid6 linoleic chiếm 10,54 -linolenic acid15,87% Tỷ lệ axít béo ω-linolenic acid6/ω-linolenic acid3 là thấp (0,2 -linolenic acid 0,26) trong hạt tía tô của Trung Quốc

đã được công bố [31] Hàm lượng các axít béo ω 3-linolenic acid6 có trong một số loại dầu thực vậtđược thể hiện ở Bảng 1.1

1.1.3.2 PUFAs có nguồn gốc từ động vật

Trong các sinh vật biển như cá, PUFAs có từ 14 đến 22 nguyên tử cacbon.Các axít béo phổ biến nhất ở động vật, thực vật và vi sinh vật (VSV) là palmitic(16:0), stearic (18:0), oleic (18:1 ω-linolenic acid9) và palmitoleic (16:1) ARA (20:4 ω-linolenic acid6) là mộtthành phần chính của màng phospholipit động vật EPA và DHA là thành phần chủyếu trong vi sinh vật biển và cá biển [32] Một số các axít béo ω-linolenic acid3 cần thiết cho sứckhỏe con người có nguồn gốc từ các loại cá và động vật có vỏ ở Nam Thái BìnhDương được thể hiện trong Bảng 1.2 [33]

Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá và động vật [33]

Trong 10 năm trở lại đây, nhu cầu PUFAs ω-linolenic acid3 ngày càng tăng do sự gia tăng sửdụng chúng trong NTTS, làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người và dược phẩm

Do vậy, những nguồn nguyên liệu chính không đáp ứng đủ cho việc mở rộng kinhdoanh sản xuất Việc sản xuất axít béo ω -linolenic acid 3 từ nguồn dầu cá và thực vật có một số hạnchế, chẳng hạn như các quy trình làm sạch phức tạp, ô nhiễm không mong muốn

bởi các chất ô nhiễm biển, giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng một số loài cá và các khía cạnh liên quan đến tính bền vững của hệ sinh thái PUFAs được tìm thấy trong cá (ăn

vi tảo) ở đại dương nên theo một cách logic vi tảo được coi là nguồn tiềm năng đểsản xuất PUFAs Một số đối tương tiềm năng có thể thay thế đầy hứa hẹn cho việc sảnxuất axít béo ω -linolenic acid 3 là nấm men hoặc vi tảo để cung cấp nguồn PUFA ω-linolenic acid3 cho nhu cầuthực tế đang ngày càng nâng cao đã được chấp nhận rộng rãi [35]

1.1.3.3 PUFAs có nguồn gốc từ vi sinh vật

Một số loại vi khuẩn cũng có khả năng sản xuất axít béo như vi khuẩn tíaquang hợp (VKTQH) VKTQH có một số hạn chế về thành phần dinh dưỡng đó làhầu hết các VKTQH không chứa PUFAs như: LA (C18:2 ω-linolenic acid6), axít eicosadienoic(C20:2 ω-linolenic acid6), EPA, DHA Mặc dù chúng rất giàu các SFA như axít steric (C18:0),axít palmitic (C16:0) và MUFA như axít oleic (C18:1) [36] Các axít béo chính

trong Rhodopseudomonas sphaeroides là 16:0, 16:1 cis -linolenic acid ω-linolenic acid7, 18:0, 18:1 ω-linolenic acid9 và

18:1 ω-linolenic acid7 là các axít béo chiếm ưu thế Ngoài ra còn có một số các axít béo khác như16:1 trans -linolenic acid ω-linolenic acid7, 16:1 cis -linolenic acid ω-linolenic acid9 và hai đồng phân trans 18:1 [37] Hàm lượng lipitchiếm khoảng 20 -linolenic acid 40% sinh khối khô (SKK) thấp hơn so với vi tảo [38] Trong quá

trình nhân nuôi sinh khối R palustris dưới điều kiện ánh sáng, kỵ khí, hàm lượng

lipit đạt 22 -linolenic acid 39% SKK [39] Thành phần axit béo của một số vi khuẩn có chứa các

axít béo chính như C18:1 ω-linolenic acid7, C16:1, C16:0 Ở Chromatium salexigens, C18:1 chiếm hơn 50% so với TFA Axít béo C16:1 chiếm 16% so với TFA (Chromatium tepidum) và 36% so với TFA (Thiocystis gelatinosa), axít béo C16:0 dao động 10,4 -linolenic acid 25,8% so với TFA ở Chromatium sp [40].

1.1.3.4 PUFAs có nguồn gốc từ vi tảo

Sprague và cộng sự (2016) [22] cũng đã khảng định sự thiếu hụt toàn cầu vềEPA, DHA và các tác động của nó đối với người tiêu dùng, khẳng định tiềm năngcủa vi tảo và cây trồng biến đổi gen như nguồn cung cấp axít béo quan trọng trongtương lai

VTBDD có thể là nguồn cung cấp ω-linolenic acid3 PUFAs với một số ưu điểm như sau:nhân nuôi sinh khối VTBDD dễ dàng trong các hệ thống lên men nên có thể sảnxuất dầu quanh năm, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiệt độ vì không sử dụng ánhsáng mặt trời, có thể kiểm soát tốt mọi thông số cần thiết trong suốt quá trình nhânnuôi sinh khối, hàm lượng axít béo đơn giản và tốc độ tăng trưởng cao hơn; cònnhân nuôi sinh khối VTB quang tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có thể sử dụngđất phi nông nghiệp và nguồn nước thải không phù hợp cho sản xuất nông nghiệp[41] Tóm lại, việc sản xuất công nghệ sinh học sản xuất dầu vi tảo là một giải pháp

thay thế bền vững có khả năng bổ sung cho nhu cầu toàn cầu về ω-linolenic acid3, gây ít tác động đến môi trường hơn được trình bày ở Hình 1.4 [35].

Vi tảo cung cấp một nguồn tài nguyên không ô nhiễm đầy hứa hẹn cho côngnghệ sinh học sản xuất LC-linolenic acidPUFAs (long chain -linolenic acid PUFAs) (Hình 1.5) để thay thế chocác loại dầu cá truyền thống [42]

Vi tảo Tách chiết Dầu/ω-linolenic acid3LC-linolenic acidPUFA Thức ăn

C20:5 ω-linolenic acid3 C22:6 ω-linolenic acid3

Đặc tính Chất kháng viêm Chất kháng sinh Giảm ung thư Giảm rối loạn nhịp tim Giảm xơ vữa động mạch Giảm khối huyết

PUFAs từ các VTB quang tự dưỡng

Nhiều công bố đã đưa ra hàm lượng PUFAs khác nhau trong một số loài tảo

quang tự dưỡng Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum sp và Porphyridium sp.

có chứa hàm lượng (%) EPA cao trong TFA lần lượt là 38 -linolenic acid 39%, 40 -linolenic acid 57% và 41%

Trong khi đó, EPA của Odontella aurita Agardh -linolenic acid 26% so với TFA, Pavlova lutheri Green là 22 -linolenic acid 29% so với TFA, Cyclotella cryptica Lewin và Guillard là 17 và 23%

so với TFA, Cylindrotheca sp Rabenhorst là 24 -linolenic acid 25% so với TFA [43].

Điều kiện nhân nuôi sinh khối và giai đoạn tăng trưởng là yếu tố quyết địnhquan trọng cho quá trình sản xuất các axit béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi(Long Chain -linolenic acidLC -linolenic acid PUFAs) Để tăng việc sử dụng vi tảo cho sản xuất thương mại củacác loại dầu giàu LC -linolenic acid PUFAs, các nghiên cứu gần đây đang hướng đến việc sàng lọc vàlựa chọn các loài vi tảo có dầu với khả năng tích lũy LC -linolenic acid PUFAs trong TAG cao, điều này

sẽ cho phép tiết kiệm chi phí sản xuất cũng như tách chiết lipit [44]

Như đã đề cập trước đây, nhân nuôi sinh khối hàng loạt của các loài tảoquang tự dưỡng trong các hệ thống bể hở có chi phí tương đối thấp so với các nhânnuôi sinh khối trong các bể phản ứng quang sinh kín Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởngtrong các hệ thống bể hở lại tương đối thấp, thu hoạch có thể tốn kém, và còn cónhiều rủi ro do biến động độ mặn và ô nhiễm có thể dẫn đến làm giảm chất lượng và

số lượng của sản phẩm cuối cùng Nhìn chung, ứng dụng của các loài VTB quang tựdưỡng để sản xuất thương mại các loại dầu đòi hỏi những tiến bộ/đổi mới công nghệtrong nghiên cứu kỹ thuật sinh lý và di truyền để nâng cao tốc độ tăng trưởng vàtích lũy chất béo, tối ưu hóa các thành phần axít béo, cải tiến công nghệ sinh họcliên quan đến phản ứng sáng trong quang hợp; giảm ô nhiễm và giảm các chi phíliên quan đến việc sản xuất sinh khối và thu hoạch

PUFAs từ các VTBDD

Một số VTBDD được coi là nguồn cung cấp DHA rất tốt Chúng bao gồm

thraustochytrids từ các chủng Thraustochytrium sp Sparrow và Schizochytrium sp Goldstein và Belsky và tảo Crypthecodinium cohnii Javornicky Các loài đại diện

này cung cấp các loại dầu giàu DHA ưu việt nhất cho các ngành công nghiệp, chúngđược sử dụng trong thực phẩm, đặc biệt là trong sữa bột công thức cho trẻ sơ sinh[45], kể từ khi chúng được xem là nguồn không gây bệnh và không gây độc [46]

Theo nghiên cứu của Ward và Singh đã cho thấy Schizochytrium sp có một

số đặc điểm thuận lợi cho sản xuất thương mại bao gồm hàm lượng lipit cao, sứcsản xuất DHA cao, tăng trưởng tốt trong nhân nuôi sinh khối với mật độ tế bào

(MĐTB) cao Một số chủng Schizochytrium nhất định có thể cung cấp DHA cao đạt

94% so với TFA [47] Nakahara và cộng sự (1996) [48] đã kết luận rằng trong

Schizochytrium sp hàm lượng lipit chiếm 50% SKK và DHA chiếm 34% so với TFA Schizochytrium sp tạo ra một lượng đáng kể DPA ω-linolenic acid6, thường ở mức khoảng

20% DHA được tạo ra, điều này có thể làm tăng hàm lượng ω-linolenic acid6 DPA trong thịt cá

khi cho ăn sinh khối tảo [49] Một số chủng Schizochytrium sp có hàm lượng các

axít béo 16:0 chiếm 16 -linolenic acid 38%; oleic (18:1 ω-linolenic acid9) chiếm 27%; hàm lượng EPA vàDHA chiếm lần lượt 16,5 và 27 -linolenic acid 44% so với TFA, tương ứng (Bảng 1.3) [22] Ởmột số loài thuộc thraustochytrids có chứa 52% DHA, 27% DPA, 12% EPA so vớiTFA, ngoài ra còn có chứa AA và axit palmitic [50]

Dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối, hàm lượng lipit và DHA thường bị ảnhhưởng bởi thành phần môi trường nhân nuôi sinh khối và các yếu tố khác như nhiệt

độ, độ mặn [51] Chủng Thraustochytrium sp T01 được phân lập ở vùng rừng ngập

mặn Nam Ấn Độ có tiềm năng sản suất sinh khối cao và lượng DHA thu đượckhoảng 6,17 ± 0,04 g/L Trong quá trình nhân nuôi sinh khối, sử dụng riêng rẽ cácmuối hữu cơ như sodium acetate, pyruvate, citrate and malate có thể làm hàm lượnglipit tổng số tăng lên 28 -linolenic acid 33%, DHA tăng lên 40 -linolenic acid 46% [52]

Sản xuất DHA từ Schizochytrium sp B4D1 đã đạt được bằng cách cung cấp

liên tục malate trong giai đoạn tích lũy lipit Malate là tiền chất cung cấp cho quá

trình tổng hợp DHA ở Schizochytrium sp Vì vậy, khi nuôi lắc trong các bình tam

giác, bổ sung 4 g malate/L vào giai đoạn tích lũy lipit, DHA tăng 47% và đạt 5,51 g/

L Năng suất DHA có thể đạt tối đa 30,7 g/L Đây là cơ sở khoa học cho việc sử

dụng malate cho sản xuất DHA ở Schizochytrium sp. trên quy mô công nghiệp [53]

Nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình nhân nuôi sinh khốithraustochytrids đã cho thấy có thể cải thiện đáng kể năng suất sinh khối và hàmlượng DHA [54, 55] Sinh khối có thể đạt tới 171,5 g/L [56], hàm lượng TFA có thểchiếm 83,84% SKK [57] với hàm lượng PUFAs cao đến 76,5% [58]

Chủng S limacinum SR21 trong quá trình nhân nuôi sinh khối có bổ sung

đồng thời glucose và glycerol được sử dụng làm nguồn cacbon cũng dẫn đến tăngsinh tế bào tốt và tăng năng suất DHA đạt tối đa [59] Tối ưu các điều kiện nhân

nuôi sinh khối Schizochytrium sp trong các hệ thống lên men đã thu đươc sinh khối

đạt 128,3 g/L, DHA đạt 39,2 g/L và 326,5 mg/L/giờ [60]

1.1.4 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo

Sự tổng hợp PUFAs có thể được tiến hành theo hai con đường chính: (a) conđường hiếu khí -linolenic acid với phức hợp desaturases và elongases sử dụng axít palmitic làmtiền chất và (b) con đường kỵ khí -linolenic acid PKS (polyketide synthase) [61]

1.1.4.1 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người

Ở thực vật tạo ra axít linoleic (18:2 ω-linolenic acid6) và axít linolenic (18:3 ω-linolenic acid3) bằngcách sử dụng các enzyme ∆12 và Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay15 desaturase Ở động vật có vú và con người thiếu sự

có mặt của các enzyme ∆12 và Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay15 desaturase Chính vì vậy, cần phải cung cấp các axítbéo này qua chế độ ăn uống Động vật có vú chỉ có khả năng loại bỏ hydro từ các nguyên

tử cacbon có chứa liên kết đôi và nhóm carboxyl từ các axít béo (Hình 1.6) Quá trình oxyhóa các axít béo có thể diễn ra trong ty thể hoặc peroxisome [62]

Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và

con người [62]

1.1.4.2 Con đường tổng hợp PUFAs trong vi tảo

Theo kết quả nghiên cứu của Xie và cộng sự (2017) [63] đã cho thấy mối liên

hệ giữa quá trình sinh tổng hợp các axít béo và terpenoids ở thraustochytrids (đặc

biệt là Schizochytrium) thông qua chất trung gian Acetyl-linolenic acidCoA được trình bày ở

Hình 1.7 Cần phải hiểu rõ cơ chế tổng hợp axít béo cũng như terpenoids ở

thraustochytrids, đồng thời điều chỉnh các điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp

để thu được hàm lượng axít béo (DHA) cao nhất

Theo Qiu (2003), Meesapyodsuk và Qiu (2016); Zhu va cộng sự (2020) [64,

65, 66], quá trình sinh tổng hợp DHA ở Thraustochytriidae được tiến hành theo 2con đường khác nhau: (1) Quá trình kéo dài của các tiền chất C18, tiếp theo là khửbão hòa của Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic acid desaturase; (2) Con đường kỵ khí PKS Nhiều nghiên cứu về 2 conđường sinh tổng hợp DHA riêng biệt ở Thraustochytrids cũng đã được công bố Quátrình tổng hợp DHA xảy ra ở tế bào vi mô [64, 65]

Quá trình kéo dài của các tiền chất C18, tiếp theo là khử bão hòa của Δ4 desaturase (phụ thuộc vào Δ4 - desaturase)

-Đã có nhiều tranh cãi về việc liệu Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic acid desaturase có tồn tại trong con đườngtổng hợp DHA hay không? Trong hai thập kỷ gần đây, nhiều nghiên cứu đã xác

định được cDNA của Thraustochytrium sp mã hóa một protein có chứa trong một

tên miền giống như cytochrome -linolenic acid b5 Biểu hiện của gen trong nấm men

(Saccharomyces cerevisiae) và thực vật (Brassica juncea) đã cho thấy cDNA mã

hóa cho một enzyme khử bão hòa một liên kết đôi Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 trong 22: 5 (ω -linolenic acid 3) và kết quả

là tạo thành DHA [67] Điều này cung cấp bằng chứng rõ ràng cho sự tồn tại củamột chất béo không bão hòa đa nối đôi và Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic acid desaturase tham gia vào sự tổng hợp

DHA trong Thraustochytrium (Hình 1.8).

Trong vi tảo, DHA thu được thông qua EPA kéo dài thành axít DPA và tiếptheo khử độ bão hòa bằng Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic acid desaturase -linolenic acid đây là con đường tổng hợp DHA trongthraustochytrids [68, 69] Ngoài ra, Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic acid desaturase này, khi được biểu hiện trongnấm men và thực vật, cũng có thể sử dụng 22: 4 (ω -linolenic acid 6) làm cơ chất để tổng hợp một

axít béo bão hòa khác như axít DPA (22: 5 -linolenic acid 4,7,10,13, 16) Như vậy, Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay4 -linolenic aciddesaturate có thể sử dụng cả hai cơ chất (ω -linolenic acid 3) và (ω -linolenic acid 6) để tổng hợp axít béo [67].

Con đường kỵ khí PKS

Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS đã được nghiên cứu ở

Schizochytrium sp Con đường này khác với con đường kéo dài/khử bão hòa vì nó

không đòi hỏi quá trình khử bão hòa để đưa các liên kết đôi vào chuỗi acyl Thayvào đó, các liên kết đôi được chèn vào trong quá trình tổng hợp axít béo và khôngcần năng lượng ATP Vì vậy, nó còn được gọi là con đường kỵ khí để tổng hợpDHA Mặc dù con đường này có tính chất "kỵ khí" nhưng nó cũng có thể diễn radưới điều kiện hiếu khí Tên “kỵ khí” chỉ nói đến thực tế là các phản ứng trong conđường này không đòi hỏi oxy phân tử [68] Polyketides là các chất chuyển hóa thứcấp chứa nhiều khối như các nhóm ketide (-linolenic acidCH2-linolenic acidCO) Chúng được tổng hợp bằngPKS -linolenic acid một hệ thống enzym tương tự như tổng hợp axít béo trong vi khuẩn [70]

Quá trình tổng hợp axít béo sử dụng acyl carrier protein (ACP) như là mộtchất đồng hoá cộng hóa trị cho chuỗi tổng hợp, tiến hành các chu kỳ lặp lại (Hình1.9) Quá trình tổng hợp bao gồm: Ngưng tụ acyl-linolenic acidACP và malonyl-linolenic acidACP để tạo raketoacyl -linolenic acid ACP nhờ enzym 3-linolenic acidketoacyl-linolenic acidACP synthase; ketoacyl-linolenic acidACP khử thànhhydroxyacyl-linolenic acidACP nhờ enzyme 3-linolenic acidhydroxyacyl-linolenic acidACP reductase; hydroxyacyl-linolenic acidACPđược khử nước tạo thành enoyl -linolenic acid ACP không bão hòa nhờ enzymedehydrase/isomerase hai chức năng; enoyl -linolenic acid ACP không bão hòa được khử nhờenoyl-linolenic acidACP reductase thành acyl bão hòa [71] Ketosynthase là một enzyme chìa khóaquan trọng trong con đường tổng hợp, có thể xúc tác sự ngưng tụ của một loạt các chất nềnbao gồm các axít béo chưa no Do đó, chọn lọc ngưng tụ enoyl-linolenic acidACP với malonyl-linolenic acidACP sẽdẫn đến một axít béo chứa các liên kết đôi [64]

ACP: Protein mang gốc acyl; KS: 3-ketoacyl-ACP synthase; KR:

3-hydroxyacyl-ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl-3-hydroxyacyl-ACP reductase

Trong quá trình tổng hợp axít béo ở Thraustochytrium và E coli đều có sự

tồn tại của phosphopantetheinyl transferase (PPTase) Điều đó cho thấy con đường

kỵ khí hoạt động mạnh trong quá trình sinh tổng hợp PUFAs ở cả 2 đối tượng này.Lượng ∆4 desaturase tạo ra đạt khoảng 18% tổng số axít béo trong các tế bào cảm

ứng biểu hiện Trong Thraustochytrium, mức biểu hiện của gen tổng hợp PUFAs

cao hơn nhiều so với gen ∆4 desaturase và cũng tương quan với việc sản sinhPUFAs Những kết quả này chỉ ra rằng con đường kỵ khí hoàn toàn chịu trách

nhiệm chính về sinh tổng hợp PUFAs trong Thraustochytrium [65] Trong hệ gen của chủng Thraustochytrium sp 26185 có 10.797 gen mã hóa Trong đó có 451 gen

được xác định cho nhóm vận chuyển lipit và chuyển hóa axit béo Phân tích chi tiếtcác gen này cho thấy sự tồn tại của cả hai con đường hiếu khí và kỵ khí trong quátrình sinh tổng hợp DHA ở loài này Những kết quả này mang lại cái nhìn mới về

sinh tổng hợp và lắp ráp PUFAs ở Thraustochytrium [72].

Trong quá trình tổng hợp axít béo ở Thraustochytrium có thể sử dụng axít

axetic và axít propionic làm tiền chất để tổng hợp chuỗi SFA và PUFAs Ngoài ra,axít axetic được đánh dấu phóng xạ có mặt ở cả phospholipid (PL) và TAG đã chothấy PUFAs xuất hiện đầu tiên và phần lớn được tích lũy trong PL, trong khi TAGtích lũy nhiều SFA hơn PUFAs Nhìn chung, những kết quả này đã làm sáng tỏ các

cơ chế sinh hóa cho quá trình sinh tổng hợp của tất cả các axít béo ở

Thraustochytrium [73].

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium

Chi Schizochytrium là vi tảo biển nhân chuẩn với đặc điểm là thalli (tản) đơn

tâm, dạng hình cầu, có thể gắn kết các thể nền thông qua mạng lưới ngoại chất xuất

phát từ cơ quan tử gọi là sagenogenetosome [74] Chi Schizochytrium được đặc

trưng bởi sự phân đôi liên tiếp của một tế bào sinh dưỡng hình thành nên cụm tếbào, mỗi cụm tế bào sẽ phát triển thành túi động bào tử hoặc động bào tử Động bào

tử có một lông roi phía trước dài và một lông roi sau ngắn Phân tích phát sinh loài

dựa trên gen 18S rRNA đã chỉ ra rằng chi Schizochytrium có một mối quan hệ gần

gũi với thraustochytrid [75] Vòng đời và các giai đoạn phát triển khác nhau trongchu kỳ sống của một số loài thuộc thraustochytrid và labyrinthulid được minh họatrên Hình 1.10 [77]

Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của

thraustochytrid và labyrinthulid [77]

Thraustochytrids lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1934 và kể từ những năm 1960 chúng được nghiên cứu ngày càng nhiều về những tác dụng của chúng[75] Năm 1934, Thraustochytrium proliferum được phân lập ở vùng ven biển

Woods Hole, Massachusetts Ban đầu, họ Thraustochytriaceae được xác định thuộc lớpnấm Phycomycetes, do khả năng giải phóng các động bào tử và hình thành mạng lướingoại chất Sau đó, thraustochytrids được được sếp vào Oomycetes [75]

Nhiều tác giả khác đã nghiên cứu các đặc điểm chung giữa thraustochytrids,labyrinthulids và aplanochytrids để xác định mối tương quan giữa chúng Kết quảlớp Labyrinthulea được thành lập, lớp này bao gồm cả ba nhóm thraustochytrids,labyrinthulids, aplanochytrids [78] Cavalier-linolenic acidSmith và cộng sự (1994) [79] đã chỉ rarằng thraustochytrids chắc chắn không phải là nấm hoặc Oomycetes bằng cách phântích gen 5S và 18S rRNA của chúng Tuy nhiên, những khó khăn vẫn tồn tại trongviệc xác định Labyrinthulea trong cây phát sinh chủng loại và mối quan hệ củachúng Honda và cộng sự (1998) [80] xác đinh mối quan hệ của labyrinthulids vàthraustochytrids là nhóm đơn ngành trong stramenopiles nhờ sử dụng kỹ thuật phân

tử và chúng đã được phân chia thành hai nhóm: labyrinthulids và nhómthraustochytrids Một số chủng thuộc cùng một chi được phân chia giữa các nhómlabyrinthulids và nhóm thraustochytrids tạo ra nhiều nhầm lẫn hơn, đây là giới hạncủa việc phân loại dựa vào đặc điểm hình thái Các bằng chứng thực nghiệm chothấy rằng: trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau, cùng một thraustochytrid cóthể biểu hiện hình thái rất khác nhau Điều này thể hiện tính mềm dẻo của các sinhvật này Theo Adl và cộng sự (2005) [81] thraustochytrids là một nhánh củaStramenopiles Chúng không phải là nấm, nhưng có đặc điểm giống như nấm Vìthraustochytrids không có khả năng quang hợp và thiếu plastid hoặc bất kỳ dấu tích

của một bộ máy quang hợp Giả thuyết Chromalveolates cho rằng tổ tiên của

Stramenopiles có plastid và các nhánh hiện nay không có plastid là do chúng đã mất

đi ở một thời điểm nào đó trong quá trình tiến hóa Tuy nhiên, nhiều tài liệu nghiên

cứu cho đến nay thraustochytrids vẫn được gọi là “vi tảo” Schizochytrium mangrovei và Schizochytrium limacinum được biết đến với đặc điểm đặc trưng là

phân chia liên tiếp và cũng có một giai đoạn amip, đây là phương pháp truyền thống

sử dụng để phân biệt các chi thuộc thraustochytrid [82] Nhờ những tiến bộ trong kỹthuật phân tử và thiết kế mồi đặc biệt cho nhóm này, đơn vị phân loại của lớpLabyrinthulea và sự phân chia nguồn gốc được rõ ràng hơn [83] Trong những nămgần đây, theo Anderson và Cavalier-linolenic acidSmith (2012), Gomaa và cộng sự (2013),Beakes và cộng sự (2014) [84, 85, 86] Labyrinthulea thuộc giới (Kingdom):Heterokonts, ngành (Phylum): Sagenista, lớp (class): Labyrinthulea (Hình 1.11) Họ

thraustochytrid gồm chín chi: Thraustochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, Aurantiochytrium, Sicyoidochytrium, Parietichytrium, Botryochytrium và Monorhizochytrium [77] Chi Schizochytrium bao gồm 5 loài: S mangrovei Raghuk (1988), S aggregatum S Goldst & Belsky (1964), S octosporum Raghuk (1988), S minutum A Gaertn (1981) và S limacinum D Honda & Yokochi (1998) [80].

Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium [84, 85, 86]

1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới

1.2.2.1 Nhân nuôi sinh khối theo mẻ

Nuôi theo mẻ là kĩ thuật phổ biến để tăng số lượng tế bào Cách thức nhânnuôi sinh khối này tương đối đơn giản, chi phí rẻ, thường được sử dụng trong cácnghiên cứu sơ bộ ban đầu để tìm hiểu tác dụng của các thành phần và yếu tố môitrường lên sinh khối tảo và năng suất sản phẩm được tạo ra [87] Patel và cộng sự(2021) [88] đã thu được hàm lượng DHA và DPA đạt 43,19 và 13.56 % TFA khi

nhân nuôi sinh khối Aurantiochytrium sp T66 bằng phương pháp lên men theo mẻ,

môi trường có tỷ lệ C: N là 10: 1 sau 48 giờ

1.2.2.2 Nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed batch

Nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed batch về bản chất là nhân nuôi sinh khốitheo mẻ có bổ sung cơ chất là một kĩ thuật phổ biến trong ngành công nghiệp nhânnuôi sinh khối Phương pháp nhân nuôi sinh khối này có thể có được MĐTB caobằng việc tránh được sự ức chế hoặc sự giới hạn của cơ chất, giảm được thời gian,chi phí cho việc nhân nuôi sinh khối và nhân giống giữa mỗi lần nhân nuôi sinhkhối Phương pháp này sử dụng nguồn C là glucose và nguồn N là cao nấm men.Trong giai đoạn đầu, các tế bào tích lũy lipit khoảng 20% SKK Khi cao nấm menbắt đầu cạn kiệt, các tế bào ngừng phân chia, glucose tiếp tục được bổ sung, các tếbào bước vào giai đoạn tích lũy lipit có chứa DHA Wen và cộng sự (2002) [89]khẳng định rằng trong số nhiều thành phần môi trường thì glucose, nitrate, tryptone

và cao nấm men được xác định như là các cơ chất giới hạn bởi chúng có thể thúcđẩy sự sinh trưởng của tế bào qua việc tăng tốc độ sinh trưởng đặc trưng Nhân nuôi

sinh khối Nitzschia laevis trong điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-linolenic acidbatch

thu được 22,1 g SKK/L và năng suất EPA đạt 695 mg/L Cả hai thông số này đềuđạt cao hơn nhiều so với nhân nuôi sinh khối theo mẻ Sơ đồ tổng quát của nhânnuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-linolenic acidbatch, theo kiểu liên tục và động học tăngtrưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng được trình bày ở Hình 1.12 [90]

1.2.2.3 Nhân nuôi sinh khối theo kiểu liên tục

Nhân nuôi sinh khối liên tục dựa trên phương pháp kéo dài pha phát triển của

vi sinh vật trong nuôi theo mẻ, nhưng cần liên tục cung cấp các chất dinh dưỡngmới và đồng thời loại bỏ môi trường đã được sử dụng cùng với sinh khối tế bào tảo từ hệthống nuôi Trong nuôi liên tục, sự phát triển của tảo cũng như các yếu tố môi trườngnuôi luôn được giữ ổn định Nhân nuôi sinh khối theo kiểu liên tục cho phép thu năngsuất EPA cao hơn phương pháp nuôi theo mẻ và nhân nuôi sinh khối theo mẻ có bổ sung

cơ chất Nó cũng được sử dụng như là một công cụ quan trọng cho những nghiên cứusinh lý cơ bản của các tế bào tảo bởi vì các thông số động học như tốc độ sinh trưởng đặctrưng, MĐTB và năng suất có thể được giữ ổn định ở pha cân bằng [91]

Guo và cộng sự (2018) [92] đã nhân nuôi sinh khối liên tục ba giai đoạn

chủng Schizochytrium sp HX-linolenic acid308, làm tăng lipid, hàm lượng DHA và năng suất

DHA lần lượt là 47,6, 64,3 và 97,1%, tương ứng so với nhân nuôi sinh khối theokiểu liên tục hai giai đoạn

1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA

Quá trình sản xuất DHA ở Schizochytrium sp bị ảnh hưởng bởi một số yếu

tố như thành phần môi trường [93], giới hạn nguồn nitơ [94], nhiệt độ [95] và cungcấp oxy [96] Nói chung, hàm lượng lipit của tế bào có thể được tăng lên trong điềukiện nhân nuôi sinh khối như nhiệt độ thấp [97], hàm lượng oxy thấp [98] và sự suygiảm nguồn nitơ [99] Tuy nhiên, trong các điều kiện bất lợi như vậy cũng làm giảmsản lượng sinh khối thu được ảnh hưởng đến năng suất tổng thể Để phá vỡ giới hạnnày, các nhà khoa học đã xác định được điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợpvừa cho năng suất cao, vừa thúc đẩy sản xuất DHA

1.2.3.1 Thay đổi quá trình nhân nuôi sinh khối

Nhân nuôi sinh khối 2 giai đoạn gồm: giai đoạn 1: tăng sinh tế bào và ít tích

tụ chất béo; giai đoạn 2: tế bào tăng kích thước do tích lũy lipit và tổng hợp DHA[100] Trong giai đoạn đầu, các tế bào phát triển nhanh với mức tiêu thụ glucosecao, cung cấp nitơ và oxy đầy đủ Vì vậy, hàm lượng oxy hòa tan (DO) tăng đượcduy trì ở mức 20% không khí trong khoảng từ 0 giờ đến 48 giờ, điều khiển tốc độkhuấy (200 -linolenic acid 465 vòng/phút) và nhiệt độ 28°C trong 96 giờ đầu Trong giai đoạn thứhai, kích thước tế bào tăng dần khi tế bào tích lũy lipit nội bào, nhưng MĐTB tăngkhông đáng kể từ thời gian này đến kết thúc quá trình Trong giai đoạn này, tỷ lệ C/

N cao, oxy hòa tan thấp, nhiệt độ thấp là rất cần thiết cho sự tích lũy lipit và sảnxuất DHA trong các vi sinh vật có dầu [99] Sinh khối đạt được 23,9 g/L sau 96

giờ nhân nuôi sinh khối có sử dụng glucose ban đầu 30 g/L và nitơ 0,22 g/L Khi

đó, năng suất axít béo không bão hòa 3,6 g/L, DHA và DPA đạt 2,54 và 0,8 g/L,tương ứng [101]

1.2.3.2 Thay đổi nhiệt độ trong quá trình nhân nuôi

Zeng và cộng sự (2011) [97] đã thu được hàm lượng DHA cao nhất 51,98%

so với TFA và sản lượng DHA 6,05% SKK khi nuôi lắc Schizochytrium HX -linolenic acid 308,

sử dụng nhiệt độ nhân nuôi sinh khối trong 32 giờ đầu 30°C và 12 giờ tiếp theo20°C Điều này thể hiện tính mềm dẻo của màng tế bào thích nghi với nhiệt độ thấp[102]

1.2.3.3 Thay đổi tốc độ sục khí

Trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-linolenic acidbatch trong hệ thống lên

men 1.500 Lít đối với Schizochytrium sp đã cho thấy tốc độ sục khí được kiểm soát

ở 0,4 L/L/phút trong 24 giờ đầu, sau đó chuyển sang 0,6 L/L/phút cho đến 96 giờtiếp theo và sau đó chuyển về 0,4 L/L/phút cho đến khi kết thúc quá trình Sinh khối tươi(SKT), năng suất lipit và DHA đạt 71 g/L; 35,75 g/L và 119 mg/L/h, tương ứng, cao hơn11,21% so với không thay đổi tốc độ sục khí [98] Trong điều kiện tương tự, sinh khối

chủng S limacinum OUC88 đạt 81,84 g/L, năng suất lipit tổng số (43,13 g/L) và DHA

(19,2 g/L), hàm lượng DHA chiếm 44,54% so với TFA [103]

1.2.3.4 Thay đổi phương pháp nhân nuôi sinh khối

Chủng Schizochytrium sp sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối theo mẻ có SKK,

lipit và năng suất DHA đạt 55,32 g/L, 22,5 g/L và 8,34 g/L, tương ứng Trong khi

đó, nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-linolenic acidbacth ở chủng này sau 96 giờ nhân nuôi sinhkhối và có tiến hành bổ sung glucose thì SKK, lipit và năng suất DHA cao hơn đạt60,16 g/L, 30,44 g/L và 10,77 g/L, tương ứng [104] Vì vậy, phương pháp này cótriển vọng phát triển trên quy mô công nghiệp cho việc sản xuất DHA từ vi tảo

1.2.3.5 Thay đổi hỗn hợp các điều kiện

Quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-linolenic acidbatch sản xuất nhiều DHA ở

Schizochytrium sp FJU-linolenic acid512 được thực hiện trong hệ thống lên men 15 Lít Các điều

kiện nhân nuôi sinh khối như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và tốc độ khuấy được điềukhiển tự động Sau đó, 10 g/L nitơ hữu cơ, 20 g/L muối biển và glucose được thêmliên tục khi glucose còn lại dưới 2% sau 24 giờ Nhiệt độ được duy trì 28°C ở phalog, sau đó, hạ xuống dưới 25°C để tăng cường sự tích lũy chất béo Tốc độ sục khí

1 L/L/phút, oxy hòa tan khoảng 5% pH được duy trì ở mức 5,7 ± 0,1 bằng cách tựđộng bổ sung thêm amoniac công nghiệp 28% Kết quả năng suất DHA tăng lên từ1,09 ± 0,05 g/L (sau 36 giờ) lên 16,04 ± 0,80 g/L (sau 120 giờ) [105]

Các hướng nghiên cứu nêu trên đã được mở rộng đáng kể trong những nămgần đây với các sản phẩm rất đa dạng, đặc biệt là các sản phẩm từ dầu tảo có hàmlượng EPA và DHA cao được thể hiện ở Bảng 1.3.

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi

tảo [43]

EPA+DHA (%

mại)

Qualitas Health 25% -linolenic acid 30% Nannochloropsis Quang tự

DSM-linolenic acidNP life’s 40% -linolenic acid 45% Crypthecodinium Nhân nuôi sinh

DSM-linolenic acidNP life’s DHA 10% EPA; Schizochytrium sp Nhân nuôi sinhplus EPA™ 22,5% DHA Goldstein and Belsky khối dị dưỡngLonza DHAid™ 35% -linolenic acid 40% Ulkenia sp Gaertner Nhân nuôi sinh

Source-linolenic acidOmega 35% -linolenic acid 40% Schizochytrium sp. Nhân nuôi sinhSource Oil™ DHA Goldstein and Belsky khối dị dưỡngGCI Nutrients DHA 35% DHA Crypthecodinium Nhân nuôi sinh

1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium 1.2.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện

nhiệt độ

Taoka và cộng sự (2009) [106] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự

tăng trưởng và cấu trúc axít béo của Aurantiochytrium sp mh0186 Kết quả nhiệt độ

từ 15°C đến 30°C không làm thay đổi hàm lượng DHA và năng suất sinh khối Tuynhiên, nhiệt độ có thể làm thay đổi cấu hình axít béo ở ngoài vùng nhiệt độ từ 10°C

đến 35°C Ở giá trị nhiệt độ 5°C và 40°C thì Aurantiochytrium sp không sinh trưởng Kết quả tương tự cũng được xác định ở chủng A limacinum OUC88, với nhiệt độ tối ưu trong khoảng từ 16°C đến 23°C [107], Schizochytrium sp KF-linolenic acid1, A mangrovei KF-linolenic acid2, KF-linolenic acid7, KF-linolenic acid12, Thraustochytrium striatum KF-linolenic acid9 và Ulkenia sp KF-linolenic acid

13 với nhiệt độ tối ưu từ 15°C đến 30°C [108]

1.2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nhiều nguồn cacbon khác nhau đã được sử dụng cho sinh trưởng củaThraustochytrids, phổ biến nhất là glucose và glycerol Nồng độ của nguồn cacboncũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và hiệu suất

DHA của một số Thraustochytrids Ví dụ, Chủng Aurantiochytrium sp TC 20 thay

đổi hàm lượng lipit từ 33 đến 52% dưới các điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểufed-linolenic acidbatch với thành phần môi trường và nguồn cacbon khác nhau [109] Sahin và