Nghiên cứu phân tích cây sinh dòng dựa trên gen mã hóa p72 cho thấy các chủng duy nhất thuộc genotype II, nằm cùng phân nhánh và tương đồng rất cao với các chủng đã được công bố trước đây ở Phía Bắc nước ta (2019) và Trung Quốc (2018). Sự tương đồng cao khi so sánh giữa chủng thực địa với các chủng ứng viên vắc-xin hiện nay cho thấy sự hứa hẹn về khả năng hiệu quả. Mời các bạn tham khảo!
Trang 1ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VIRUS DỊCH TẢ HEO CHÂU PHI TỪ CÁC Ổ
DỊCH TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM TỪ 2019 ĐẾN 2020
Ngơ Thị Ngọc Trâm 1 , Nguyễn Thị Mỹ Duyên 1 , Nguyễn Quang Hợp 1 , Nguyễn Minh Nam 2 , Đỗ Tiến Duy 1* ,
*Email: duy.dotien@hcmuaf.edu.vn
TĨM TẮT
Dịch tả heo Châu Phi (ASF) là bệnh truyền nhiễm xuyên biên giới trên heo nhà và heo rừng, gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuơi heo, gây ra bởi vi-rút ASF (ASFV), DNA kép lớn với cấu trúc phức tạp Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định sự hiện diện và đặc điểm di truyền của ASFV ở 10 tỉnh phía Nam Việt Nam Tổng số 118/148 (79,2%) ca bệnh nghi ngờ được xét nghiệm dương tính ASFV bởi PCR trong khảo sát 10/118 chủng ASFV được giải trình tự và phân tích đoạn gen mã hĩa p72 Phân tích cây sinh dịng dựa trên gen mã hĩa p72 cho thấy các chủng duy nhất thuộc genotype II, nằm cùng phân nhánh và tương đồng rất cao với các chủng đã được cơng bố trước đây ở Phía Bắc nước ta (2019) và Trung Quốc (2018) Sự tương đồng cao khi so sánh giữa chủng thực địa với các chủng ứng viên vắc-xin hiện nay cho thấy
sự hứa hẹn về khả năng hiệu quả
Từ khóa: ASFV, đặc điểm di truyền, p72, heo
The genetic characteristics of African Swine Fever Virus from
outbreaks in Southern provinces of Vietnam from 2019 to 2020
Ngo Thi Ngoc Tram, Nguyen Thi My Duyen, Nguyen Quang Hop, Nguyen Minh Nam, Do Tien Duy
SUMMARY
African swine fever (ASF) is reported as a transboundary infectious disease of domestic and wild pigs, the most severe constraint to the pig industry, caused by ASF virus (ASFV) a large enveloped DNA virus with a complex structure There are 24 genotypes of ASFV described
to date; however, in Vietnam, only genotype II had been previously described This study was conducted to identify the presense and genetic characteristics of ASFV in the southern provinces of Vietnam A total of 148 cases with ASF-suspected clinical signs from outbreaks
in 10 provinces The presence of ASFV was detected by PCR assay 10/118 strains of ASFV were sequenced based on p72-encoded gene The prevalence of ASFV was determined to be 79.2% Analysis of the phylogenetic tree based on the gene encoding p72 showed that only genotype II strains, located in the same clade and highly similar to those previously published
in the North of Vietnam and China The genetic homology of field strains with current vaccine candidate isolates shows promise in terms of efficacy
Keywords: African Swine Fever virus (ASFV), genetic characteristics, p72, pig
1 Khoa Chăn nuơi Thú y, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh
TT Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe sinh sản, Khoa Y, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh dịch tả heo Châu Phi (African Swine
Fever, ASF) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm,
gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuơi
ở nhiều nước trên thế giới (OIE, 2019) Bệnh lây lan rộng và làm chết nhiều heo nhiễm bệnh Ngay sau khi xâm nhập vào nước ta, sự lây lan
Trang 2của ASF diễn ra khá nhanh, phức tạp, chỉ sau
3 - 4 tháng dịch bệnh đã đạt đỉnh và trong vòng
9 tháng sự lây truyền xảy ra hơn 8.200 xã thuộc
63 tỉnh thành Theo Cục chăn nuôi Việt Nam
(2020), sau 1 năm, thiệt hại do bệnh gây ra
được báo cáo chính thức là rất lớn, số heo mắc
bệnh và tiêu hủy khoảng hơn 6 triệu con (chiếm
21,5% tổng đàn), tương ứng tổng trọng lượng
thịt heo thiệt hại 342.091 tấn, chiếm 9% tổng
sản lượng thịt heo được sản xuất trong cả nước
Căn nguyên gây bệnh là một loại vi-rút
DNA sợi đôi (ASFV), thuộc chi Asfivirus,
họ Asfarviridae; ASFV có kích thước lớn
khoảng 170 - 193 kbp với 150 - 167 khung
đọc mở (ORFs) mã hóa 150 - 200 protein
(Dixon và ctv, 2013) Ba protein phổ biến
gồm protein capsid p72, p54 và p30 p72 và
p54 thường được sử dụng cho giải trình tự
gen, xét nghiệm và đánh giá khả năng gây
bệnh Trong đó, p72 là protein capsid kháng
nguyên chính chiếm khoảng 32% tổng
khối lượng protein của virion và có tính ổn
định kháng nguyên cao (Lopez-Otin và ctv,
1990) Protein p72 có trọng lượng phân tử
khoảng 73,2 kDa, là protein kháng nguyên
quan trọng được mã hóa bởi gen B646L
Kết quả giải trình tự gen B646L mã hóa
protein p72 xác định được 22 kiểu gen
(genotypes) của ASFV (Boshoff và ctv, 2007)
và gần đây 24 kiểu gen đã được công bố
(Achenbach và ctv, 2017) Do đó, nghiên cứu
xác định đặc trưng kiểu gen của các chủng ASFV tại Việt Nam dựa vào gen mã hóa p72
là cần thiết để xác định chủng lưu hành, nguồn gốc, và sự đa dạng gen tại các trang trại khảo sát Thực tế, các nghiên cứu về đặc trưng kiển gen của ASFV thu thập từ các ổ dịch ở phía Nam Việt Nam còn hạn chế Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định đặc trưng kiểu gen của ASFV gây bệnh để tìm hiểu nguồn gốc và so sánh tương đồng với các chủng ứng viên vắc-xin hiện nay.
II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nghiên cứu được thực hiện từ 03/2020 đến 03/2021 với hai nội dung chính là (1) Xác định tỷ
lệ nhiễm ASFV trên heo tại các ổ dịch ở các tỉnh thành khảo sát và (2) Phân tích đặc điểm di truyền các chủng ASFV thu thập được
2.1 Bố trí nghiên cứu và thu thập mẫu
Heo khảo sát có các dấu hiệu lâm sàng nghi ngờ nhiễm ASFV (sốt cao, bỏ ăn, suy sụp, xuất huyết da, ói ra máu, tiêu chảy có máu) từ 10 ổ dịch/trại thuộc 10 tỉnh phía Nam, Việt Nam (Hình 1)
Hình 1 Bản đồ vị trí các tỉnh khảo sát ổ dịch, thu mẫu trong nghiên cứu
Trang 3Tổng số 148 heo được thu thập mẫu máu và
mô Mẫu được sử dụng để tách chiết DNA và
xét nghiệm bằng phương pháp PCR tại Phòng
xét nghiệm sinh học phân tử, Bệnh Viện Thú
Y, Trường ĐHNL Tp.HCM Mẫu huyết thanh
dương tính ASFV từ 10 trại ở 10 tỉnh khác nhau
được chọn ngẫu nhiên để khuếch đại và giải
trình tự, phân tích đặc trưng gen mã hóa p72
2.2 Phát hiện ASFV bằng phương pháp PCR
Mồi (primers) sử dụng trong nghiên cứu
Hai cặp mồi công bố trước đây (Bastos và ctv, 2003; Aguero và ctv, 2004) được sử dụng trong nghiên cứu này, trình bày ở Bảng 1
Bảng 1 Thông tin trình tự mồi và kích thước sản phẩm
Cặp mồi đặc hiệu PPA1/PPA2 dùng để xét
nghiệm sự hiện diện của ASFV và P72U/P72D
dùng giải trình tự gen mã hóa p72 (478bp)
Xử lý mẫu
Mẫu mô được nghiền nhỏ, tạo huyễn dịch 10%
với PBS1x và ly tâm lấy dịch nổi; và Mẫu máu được
tách huyết thanh Tách chiết DNA tổng số theo
quy trình kỹ thuật của bộ kít thương mại Wizard®
Gienomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ)
DNA tách chiết được bảo quản ở -20oC
Quy trình PCR
Phản ứng khuếch đại PCR sử dụng master
mix MyTaq TM HS Mix, 2x (Bioline, Mỹ)
Thành phần của phản ứng PCR và chu trình
nhiệt được thực hiện theo mô tả của Aguero và
ctv (2004) 3μL sản phẩm PCR được trộn với
thuốc nhộm GelRed (Merck, Đức) và điện di
trên gel agarose 1% (Invitrogien, Thermo Fisher
Scientific, USA) Tiếp theo, sử dụng thang chuẩn
1Kb Plus (Invitrogien, Thermo Fisher Scientific,
USA) để xác định kích thước của các sản phẩm
PCR khuếch đại trên máy chiếu tia UV
2.3 Giải trình tự và phân tích gen mã hóa p72
Mười mẫu huyết thanh dương tính ASFV từ
10 trại/tỉnh được chọn để thực hiện Phản ứng
PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa p72, với tổng
thể tích 25μL bao gồm 12μL master mix, 5μL
DNA mẫu, 1μL mồi p72U 10μM, 1μL mồi P72D 10μM và 6μL nước tinh sạch (không chứa DNA) Chu trình nhiệt gồm bốn giai đoạn: (1) tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút, (2) lặp lại 35 chu kì gồm biến tính trong 1 phút ở 95°C, bắt cặp trong 30s ở 50°C, kéo dài trong 50s ở 72°C, (3) kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút Sản phẩm PCR được điện di như đã trình bày ở phần trên, để kiểm tra kích thước sản phẩm đặc hiệu 478bp, yêu cầu sản phẩm sáng, rõ nét và không có band phụ
Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng bộ
kít TopPURER PCR/GEL DNA PURIFICATION kit (ABT, Việt Nam) và được giải trình tự ở Phòng thí nghiệm Macrogen, Hàn Quốc Trình
tự của gen mã hóa protein p72 được phân tích đặc trưng, tương đồng và mối liên hệ phân tử với các chủng ASFV tham khảo từ Việt Nam
và các quốc gia khác (Genebank, NCBI) (Bảng 2); các chủng được sử dụng nghiên cứu vắc-xin
ở các nước hiện tại là HLJ/18 (Trung Quốc), Georgia_2007/1 (Georgia), OURT_88/3 (Bồ Đào Nha), và Benin97/1 (Benin) Trình tự nucleotide sản phẩm p72 được kiểm tra chất lượng trên phần mềm Chromas version 2.6.6 và được căn chỉnh bằng phần mềm CLUSTALW Cây sinh dòng được thiết lập theo phương pháp Neighbor Joining với giá trị bootstrap là 1.000 trong phần mềm MEGA X (https://www megasoftware.net/)
Trang 4Bảng 2 Các chủng ASFV giải trình tự và tham khảo
-Nghiên cứu này
NCBI
Trang 5III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tỷ lệ nhiễm ASFV trên heo khảo sát ca bệnh khảo sát (Bảng 3) Tỷ lệ nhiễm ASFV khá cao (79,2%), 118/148
Kết quả này phù hợp với báo cáo dịch bệnh
theo trích dẫn bởi OIE (2019), ASF đã xuất hiện
trên 63 tỉnh thành ở Việt Nam Mặc dù, ASFV
là một mầm bệnh có đặc tính lây lan chậm trong
điều kiện tự nhiên nhưng tốc độ lây lan bệnh
ASF tại nước ta là khá nhanh, rộng; chỉ sau 9
tháng công bố dịch, ASFV đã hiện diện trên
các đàn heo trên cả nước, trừ những trang trại
được áp dụng nghiêm ngặt về an toàn sinh học
(Nguyễn Tất Toàn và ctv, 2019; Đỗ Tiến Duy,
2020) Thực trạng chăn nuôi heo nhỏ lẻ, hạn
chế hoặc không áp dụng biện pháp an toàn sinh
học, tập quán sinh hoạt của người dân, nhiều địa
điểm giết mổ và tiêu thụ thịt tươi nằm gần khu
vực chăn nuôi cũng góp phần cản trở hiệu quả
phòng chống bệnh
3.2 Đặc điểm di truyền các chủng ASFV
khảo sát
3.2.1 Sự tương đồng và đặc trưng kiểu gen
Độ tương đồng (%) về trình tự nucleotide và
acid amin của gen mã hóa p72 giữa 10 chủng
trong nghiên cứu này là 100% Sự tương đồng
trình tự nucleotide và acid amin giữa các chủng
ASFV này so với các chủng tham khảo dao
động khoảng 83,44 - 100% và 74,05 - 100%, tương ứng Khi so sánh giữa chủng nghiên cứu với các chủng tham khảo thuộc genotype II, % tương đồng nucleotide và acid amin là 98,40 - 100% và 97,28-100%, tương ứng Đặc biệt, các chủng ASFV thực địa có sự tương đồng hoàn toàn (100%) với chủng đầu tiên được báo cáo ở Việt Nam (VN/Pig/Hanoi/2019; MT332151) và Trung Quốc (China/2018; MH722357)
Kết quả tương đồng gen chứng tỏ nguồn gốc ASFV từ một nguồn được lây nhiễm vào Miền Bắc, Việt Nam và từ đó lan rộng khắp cả nước ASFV có cấu trúc DNA với sự ổn định trong bộ gen; Tần suất đột biến thấp do khả năng tự chỉnh sửa sai sót của DNA polymerase trong nhân sợi đôi là đặc điểm cho sự ổn định của bộ gen di truyền (Mai Anh Tuấn và ctv, 2020; Dixon và ctv, 2020)
Đặc biệt, trình tự đoạn gen mã hóa p72 thu thập từ Nghệ An năm 2020 (MN711740), đã công bố ở nghiên cứu trước, xuất hiện một vài đột biến điểm ở cả nucleotide và acid amin so với các chủng của nghiên cứu này (Hình 2) Mặc dù vậy, giả thuyết cần được xem xét lại ở đây là (1) thực sự xuất hiện sự đa đạng di truyền
Bảng 3 Tỷ lệ nhiễm ASFV ở các tỉnh khảo sát]
Trang 6chủng ASFV tại Việt Nam, hoặc (2) sự nhẫm
lẫn phân tích trình tự nucleotide và acid amin do
chất lượng giải trình tự, cần có nghiên cứu sâu
hơn để chứng minh
Sự tương đồng (%) nucleotide và acid amin
(gen B646L mã hóa protein p72) giữa các chủng
thực địa so với các chủng đang được sử dụng nghiên cứu vắc-xin ở các nước như HLJ/18 (Trung Quốc), Georgia_2007/1 (Georgia), OURT_88/3 (Bồ Đào Nha), và Benin97/1 (Benin) được trình bày ở Bảng 4
Bảng 4 % tương đồng nucleotide và acid amin giữa các chủng thực địa với các chủng vắc-xin nghiên cứu
Trong đó, các chủng thực địa có (%) tương
đồng cao với chủng vắc-xin nghiên cứu thuộc
genotype II là Georgia 2007/1 (99,78%), HLJ/18
(99,78%) so với OURT-88/3 (98,87%), Benin
97/1 (98,87%) thuộc genotype I Mặc dù vậy, sự
tương đồng (%) trình tự acid amin giữa chúng
là như nhau (100%) Chủng Georgia 2007/1 là chủng được sử dụng để nghiên cứu phát triển vắc-xin nhược độc hiện nay, được cắt đi đoạn gen I177L (ASF-G-∆l177L) (Borca và ctv, 2020), bởi
do nó sự tương đồng cao với các chủng thuộc genotype II lưu hành rộng khắp Thế giới
Hình 2 Trình tự acid amin p72 ở một đoạn của các chủng
từ nghiên cứu này và các chủng tham khảo
Dấu mũi tên () chỉ vị trí khác biệt acid amin của chủng tham khảo VN/Pig/NA/1393 (MN711740)→
Trang 73.2.2 Mối liên hệ phân tử giữa chủng ASFV
Trình tự đầu 3’ đoạn gien B646L (p72) của
các chủng ASFV thực địa được xây dựng cây
sinh dòng cùng với 42 chủng tham khảo (Bảng
2) đại diện cho 24 kiểu gen (Hình 3) Cây sinh
dòng cho thấy tất cả 10 chủng ASFV trong khảo
sát này đều thuộc genotype II và có quan hệ gần
về mặt phân tử với các chủng của Trung Quốc
năm 2019 (China/2018, MH722357; China/
Wuhan/2019, MN393476), của Miền Bắc Việt Nam (VN/Pig/Hanoi/2019, MT332151; VN/Pig/NgheAn/2019, MT180393) và
các chủng châu Âu (Georgia 2007, NC
044959; Belgium/Etalle/2018, MK543947; Poland/2018, MT847621) Mặc dù Sự phân tách vào một nhánh nhỏ được ghi nhận trong khảo sát này của các chủng Việt Nam (VN/ Pig/NgheAn/2019, MT180393) và Trung Quốc (China/Wuhan/2019, MN393476)
Hình 3 Cây sinh dòng dựa trên đoạn gen B646L (p72) được xây dựng theo phương pháp
Neighbor Joining model trên phần mềm Mega X với giá trị bootstrap 1000
Trang 8Trung Quốc là quốc gia láng giềng có
đường biên giới tiếp giáp với 7 tỉnh phía Bắc
của Việt Nam Việc giao thương, trao đổi
hàng hóa động vật và các sản phẩm từ động
vật diễn ra thường xuyên (FAO, 2019), gây
ra khó khăn trong kiểm soát dịch bệnh Đặc
điểm dịch tễ học phức tạp của ASFV, sự lây
nhiễm xuyên quốc gia cũng như các vùng
địa lý thường qua con đường di chuyển của
heo rừng, đường vận chuyển heo sống, các
sản phẩm từ thịt heo, và sự di chuyển của
con người (Guinat và ctv, 2016) Trong đó,
nguồn truyền lây ASFV có khả năng cao,
và chính yếu giữa quốc gia được cho là các
sản phẩm thịt heo nhiễm vi-rút (Kolbasov
và ctv, 2017).
Dịch bùng phát đầu tiên ở hai tỉnh Phía
Bắc Việt Nam (Le và ctv, 2019), được dự
đoán có nguồn gốc ASFV lây truyền từ Trung
Quốc (FAO, 2019) Các chủng ASFV thu thập
ở Miền Bắc (Le và ctv., 2019; Mai và ctv.,
2021), Miền Nam (Nguyễn Chế Thanh và
ctv., 2021) và ở nghiên cứu này của Việt Nam
có sự tương đồng hoàn toàn với nhau khi so
sánh trên đoạn gen mã hóa p72 (B646L) Hơn
nữa, các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích trên
heo trùng khớp với các công bố trước đây, đặc
trưng gây bệnh bởi ASFV có độc lực cao nhất,
thuộc genotype II
IV KẾT LUẬN
Tỷ lệ nhiễm ASFV cao (79,2%) trên heo có
biểu hiện lâm sàng và bệnh tích nghi ngờ thu
thập từ các ổ dịch Các chủng ASFV thuộc
genotype II, tương đồng gen rất cao với chủng ở
Miền Bắc (Việt Nam) và Trung Quốc năm 2018
và 2019
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này là một
phần của nhiệm vụ khoa học và công nghệ
cấp cơ sở mã số CS-SV20-CNTY-01, được
cấp kinh phí bởi Trường Đại học Nông
Lâm TP HCM.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Aguero, M., Fernandez, J., Romero, L., Sanchez Mascaraque, C., Arias, M., & Sanchez-Vizcaino, J M (2003) Highly Sensitive PCR Assay for Routine Diagnosis
of African Swine Fever Virus in Clinical Samples Journal of Clinical Microbiology, 41(9), 4431–4434
2 Achenbach, J E., Gallardo, C., Nieto-Pelegrín, E., Rivera-Arroyo, B., Degefa-Negi, T., Arias, M., … & Sánchez-Vizcaíno,
J M (2016) Identification of a New Gienotype of African Swine Fever Virus in Domestic Pigs from Ethiopia Transboundary and Emerging Diseases, 64(5), 1393–1404
3 Borca, M V, Ramirez-Medina, E., Silva, E., Vuono, E., Pruitt, S., Lauren, G H., et al (2020) Development of a Highly Effective African Swine Fever Virus Vaccine by Deletion of the I177L Gene Results in Sterile Immunity against the Current Epidemic Eurasia Strain Journal of Virology, 94(7)
4 Bastos, A D S., Penrith, M.-L., Crucière, C., Edrich, J L., Hutchings, G., Roger, F., Couacy-Hymann E.,Thomson, R G (2003) Gienotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 giene characterisation Archives of Virology, 148(4), 693–706
5 Boshoff, C I., Bastos, A D S., Gerber,
L J., & Vosloo, W (2007) Gienetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973–1999) Veterinary Microbiology, 121(1-2), 45–55
6 Dixon, L K., Chapman, D A G., Netherton,
C L., & Upton, C (2013) African swine fever virus replication and gienomics,, Virus Research, 173(1), 3–14
7 Dixon, L K., Stahl, K., Jori, F., Vial, L., &
Trang 9Pfeiffer, D U (2020) African Swine Fever
Epidemiology and Control Annual Review
of Animal Biosciences, 8(1) doi:10.1146/
annurev-animal-021419-083741
8 Đỗ Tiến Duy và Nguyễn Phạm Huỳnh
(2018) Thực hành Chẩn đoán bệnh học
truyền nhiễm trên heo Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 164-178
9 FAO (2019) African Swine Fever threatens
People’s Republic of China – A rapid risk
assessment of ASF introduction
10 Kolbasov, D., Titov, I., Tsybanov, S., Gogin,
A., & Malogolovkin, A (2018) African
Swine Fever Virus, Siberia, Russia, 2017
Emerging Infectious Diseases, 24(4), 796–
798
11 Guinat, C., Gogin, A., Blome, S., Keil,
G., Pollin, R., Pfeiffer, D U., & Dixon,
L (2016) Transmission routes of African
swine fever virus to domestic pigs: current
knowledge and future research directions
Veterinary Record, 178(11), 262–267
12 Lopez-Otin C, Freije JMP, Parra F, Mendez
E, Vi˜ nuela E (1990) Mapping and
sequence of the giene coding for protein p72,
the major capsid protein of African swine
fever virus Virology, 175: 477–484
13 Le, V P., Jeong, D G., Yoon, S.-W., Kwon,
H.-M., Trinh, T B N., Nguyen, T L., Nga,
T T B., Oh, J., Joon, B K., Kwang, M C.,
Tuyen, N V., Eunhye, B., Hang, T T V.,
Minjoo, Y., Woonsung, N., Song, D (2019)
Outbreak of African Swine Fever, Vietnam,
2019 Emerging Infectious Diseases, 25(7), 1433-1435
14 Mai, N T A., Vu, X D., Huyen, N T T., Tam, V N., Bich, T T N., Yong, J K., HyunJoo, K., KiHyun C., Lan, N T., Nga,
B T T., Dae, G J., SunWoo, Y., Thang, T., Aruna, A., Daesub, S., Le, P V (2021) Molecular profile of African swine fever virus (ASFV) circulating in Vietnam during
2019 - 2020 outbreaks Archives of Virology,
166, 885–890
15 Nguyễn Chế Thanh, Nguyễn Quỳnh Như, Lại Công Danh và Đỗ Tiến Duy, 2021 Một
số đặc điểm của bệnh Dịch tả heo Châu Phi qua khảo sát diễn biến ở các ổ dịch Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XXVIII, số 2: 21-29
16 OIE (2019) African Swine Fever (ASF) situation https://www.oie.int/fileadmin/ Home/eng/Health_standards/tahm/3.08.01_ ASF.pdf?fbclid=IwAR0xd3mFl ultXzS- GmCqjLdJVzgV6a13SrJI-sWi84jwKuFRf-qHcnOsg
17 Nguyễn Tất Toàn, Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Thị Thu Năm và
Lê Thanh Hiền (2019) Tổng quan về bệnh heo trong những năm gần đây ở Việt Nam từ nghiên cứu đến lâm sàng Kỷ yếu hội nghị khoa học Chăn nuôi –Thú y toàn quốc 2019, 31-33
Ngày nhận 14-6-2021 Ngày phản biện 22-7-2021 Ngày đăng 15-8-2021