Nghien cu cac yu t nh hng den qua

Khóa luận tốt nghiệpDANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh tính chất vật lý của biodiesel so với dầu diesel...6 Bảng 1.2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác...7 Bả

Khóa luận tốt nghiệp

Chúng tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học CôngNghiệpThực Phẩm TP.HCM cùng quý thầy cô Khoa công nghệ sinh học và Kỹthuật môi trường nói đã truyền đạt những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt thờigian học tập và nghiên cứu tại trường

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô tại trung tâm thí nghiệmthựciệp thực Phẩm Thành Phố hồ Chí Minh đặc biệt là thầy Bùi Văn Hoài đã hỗ trợtrang thiết bị, dụng cụ và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tuy nhiên, do thời gian có hạn và chúng tôi chưa có nhiều kinh nghiệm nênbài báo cáo còn nhiều thiếu sót, kính mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy

cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn !

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU viii

CHƯƠNG 1 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan các nguồn năng lượng 2

1.1.1 Hiện trạng nguồn năng lượng trên Thế giới 2

1.1.2 Hiện trạng nguồn năng lượng ở Việt Nam 2

1.1.3 Các nguồn năng lượng tái sinh 3

1.2 Khái quát về Biodiesel 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Tầm quan trọng của dầu biodiesel và khả năng thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch 4

1.2.3 Nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel và tiềm năng của vi tảo 7

1.3 Tổng quan về Tảo 11

1.3.1 Khái niệm 11

1.3.2 Phân loại 11

1.3.3 Vai trò của vi tảo trong tự nhiên và trong đời sống nhân loại 13

1.3.4 Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid 13

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự tích lũy lipid ở vi tảo cholorella sp 15

1.4.1 Yếu tố nhiệt độ 15

1.4.2 Yếu tố ánh sáng 15

1.4.3 Nồng độ Nitrogen 16

1.4.4 Yếu tố độ mặn 16

1.4.5 Ảnh hưởng của pH 16

CHƯƠNG 2: 16

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Vật liệu 17

Khóa luận tốt nghiệp

2.1.1 Tảo Chlorella Sp 17

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Các quá trình nghiên cứu đề tài 19

2.2.2 Quan sát hình tháiChlorella sp 21

2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đối với sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp 21

a) Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng 21

b) Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Nitrogen 22

c) Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ N : P 22

2.2.4 Nuôi vi tảo Chlorella sp thu sinh khối và trích li lipid 23

a) Thí nghiệm 2.1: Thay đổi thời gian chiếu sáng 23

b) Thí nghiệm 2.2: Thay đổi nhiệt độ nuôi 24

c) Thí nghiệm 2.3: Thay đổi hàm lượng Nitrogen 24

d)Thí nghiệm 2.4: Bổ sung NaCl vào môi trường nuôi 25

2.2.5 Xác định đường cong tăng trưởng 25

2.2.6 Đo chỉ số OD 25

2.2.7 Hàm lượng sinh khối 25

2.2.8 Phương pháp thu sinh khối 26

2.2.9 Xác định hàm lượng lipid 26

2.2.10 Phân tích thống kê số liệu 27

CHƯƠNG 3 28

KẾT QUẢ THẢO LUẬN 28

3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng, nồng độ nitrogen, tỉ lệ nitơ : phospho trong môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo Chlorella sp 29

3.1.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 29

3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen 31

3.1.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ Nitơ : phospho 33

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, hàm lượng NaNO3, độ mặn lên sự tích lũy lipid trong tế bào vi tảo 36

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến quá trình tạo lipit từ vi tảo Cholorella sp 36

Khóa luận tốt nghiệp

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tạo lipid từ loài tảo cholorella sp.

39

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen đến sự tích lũy lipid trong tế bào vi tảo

Chlorella sp 42

3.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng muối NaCl đến quá trình tạo lipid trong tế bào cholorella sp 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ TĂNG TRƯỞNG SINH KHỐI VI TẢO CHLORELLA SP 55

PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 65

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: So sánh tính chất vật lý của biodiesel so với dầu diesel 6

Bảng 1.2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác 7

Bảng 1.3: So sánh các thuộc tính giữa dầu từ vi tảo, diesel thông thường và tiêu chuẩn ASTM biodiesel 10

Bảng 1.4: Hàm lượng và năng suất lipid của các loài tảo khác nhau [3] 14

Bảng 2.1: Công thức và cách pha môi trường BG 11 (Blue Green Medium) 18

Bảng 2.2: Điều chỉnh cường độ ánh sáng 22

Bảng 2.2: Hàm lượng Nitrogen bổ sung trong môi trường BG11 22

Bảng 2.3: Tỉ lệ N : P và khối lượng phân hóa học bổ sung 22

Bảng 2.4: Thời gian chiếu sáng cho thí nghiệm 1 23

Bảng 2.5: Nhiệt độ môi trường nuôi vi tảo [19.20] 24

Bảng 2.6: Nồng độ nitrogen trong các thực nghiệm [19.20] 24

Bảng 2.7: Thể tích môi trường BG11* bổ sung 25

Bảng 2.8: Hàm lượng muối cho vào các bình nuôi [19.20] 25

Bảng 3.1: Kết quả trung bình đo độ hấp thu mẫu tảo khi nuôi khảo sát ảnh hưởng cường độ ánh sáng 29

Bảng 3.2: Kết quả đo TSS (mg/ml) của các mẫu tảo Chlorella sp nuôi trong điều kiện cường độ ánh sáng khác nhau 30

Bảng 3.3: Kết quả trung bình đo độ hấp thu các mẫu tảo nuôi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 31

Bảng 3.4: Kết quả đo hàm lượng sinh khối (mg/ml) của các mẫu vi tảo nuôi khảo sát ảnh hưởng hàm lượng NaNO3 32

Bảng 3.5: Kết quả đo độ hấp thu các mẫu tảo trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ N : P 34

Bảng 3.6: Kết quả đo hàm lượng sinh khối (mg/l) các mẫu tảo trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ N : P 35

Bảng 3.7: Khối lượng sinh khối và phần trăm lipid trong tế bào Chlorella sp 36

Bảng 3.8: Thời gian chiếu sáng ở các thí nghiệm 36

Bảng 3.9: Kết quả đo độ hấp thu các mẫu tảo trước vào sau khi tạo stress về thời gian chiếu sáng 36

Bảng 3.10: Hàm lượng chất rắn lơ lửng (mg/ml) các mẫu tảo trước khi tạo stress về thời gian chiếu sáng 37

Bảng 3.11: Hàm lượng sinh khối (mg/ml) các mẫu tảo sau khi tạo stress về thời gian chiếu sáng 38

Bảng 3.12: Khối lượng sinh khối tảo và hàm lượng lipid sau khi tạo stress về thời gian chiếu sáng 39

Bảng 3.13: Nhiệt độ điều chỉnh ở các thí nghiệm 40

Khóa luận tốt nghiệp

Bảng 3.14: Kết quả đo độ hấp thu các mẫu vi tảo trước và sau khi tạo stress về nhiệt

độ 40

Bảng 3.15: Hàm lượng chất lắng lửng (mg/ml) trước khi tạo stress nhiệt độ 40

Bảng 3.16: Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng lipid ở các mẫu tảo 41

Bảng 3.17: Nồng độ nitrogen trong các thí nghiệm 42

Bảng 3.18: Kết quả đo độ hấp thu ở các mẫu vi tảo trước và sau khi thay đổi nồng độ nitrogen 43

Bảng 3.19: Hàm lượng sinh khối các mẫu vi tảo trước và sau khi thay đổi nồng độ nitrogen 43

Bảng 3.20: Khối lượng sinh khối và hàm lượng lipid trong các mẫu vi tảo sau khi thay đổi nồng độ nitrogen 44

Bảng 3.21: Hàm lượng NaCl bổ sung vào môi trường nuôi ở các thí nghiệm 45

Bảng 3.22: Kết quả đo độ hấp thu các mẫu vi tảo trước và sau khi bổ sung NaCl 45

Bảng 3.23: Hàm lượng sinh khối mẫu vi tảo trước và sau khi bị stress do NaCl 46

Bảng 3.24: Khối lượng sinh khối (g) và hàm lượng lipid trong các mẫu vi tảo sau khi chịu stress về độ mặn 47

Bảng A1: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 lên độ hấp thu theo thời gian 55

Bảng A2: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 đến hàm lượng sinh khối tảo (mg/ml) theo thời gian 56

Bảng A3: Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến độ hấp thu theo thời gian 58

Bảng A4: Kết quả hàm lượng sinh khối vi tảo (mg/ml) theo thời gian 60

Bảng A5: Kết quả đo độ hấp thu các mẫu tảo nuôi trong môi trường có N:P khác nhau 61

Bảng A6: kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ N:P đến quá trình tạo sinh khối theo thời gian 62

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Phần trăm các nguồn năng lượng trên thế giới 2

Hình1.2: Các dạng năng lượng tái sinh 3

Hình 2.1: Vi tảo Chlorella sp 17

Hình 2.2: Sơ đồ quá trình nuôi khảo sát các yếu tố môi trường đối với sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp 19

Hình 2.3: Sơ đồ quá trình nuôi vi tảo thu sinh khối và trích li lipid 20

Hình 3.1: Sự phát triển của vi tảo Chlorella sp theo thời gian 29

Hình 3.2: Sự biến thiên sinh khối vi tảo Chlorella sp trong thời gian nuôi khảo sát cường độ áng sáng theo thời gian 30

Hình 3.3: Sự thay đổi về kết quả đo độ hấp thu theo thời gian 32

Hình 3.4: Sự biến thiên hàm lượng sinh khối vi tảo Chlorella sp trong thời gian nuôi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 33

Hình 3.5: Sự thay đổi của kết quả đo độ hấp thu trên các mẫu vi tảo 34

Hình 3.6: Sự biến thiên sinh khối tế bào vi tảo so ảnh hưởng của tỉ lệ N : P 35

Hình 3.8: Hàm lượng chất rắn lơ lửng trong mẫu tảo trước và sau khi tạo stress 39

Hình 3.9: Phần trăm lipid trong các mẫu sinh khối vi tảo sau khi tạo tress về thời gian chiếu sáng 39

Hình 3.10: Độ hấp thu các mẫu vi tảo trước và sau khi tạo stress về nhiệt độ 40

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tạo sinh khối của loài vi tảo cholorella sp 41

Hình 3.12: Hàm lượng lipid ở các mẫu vi tảo sau khi bị stress 42

Hình 3.13: Hàm lượng sinh khối vi tảo ở các thí nghiệm trước và sau khi thay đổi nồng độ nitrogen 44

Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen đến sự tích lũy lipid trong tế bào vi tảo chlorella sp 45

Hình 3.15: So sánh độ hấp thu các mẫu vi tảo trước và sau khi bổ sung muối 46

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến đến quá trình tạo sinh khối từ loài tảo cholorella sp 47

Hình B2: Mẫu trước khi thu sinh khối 66

Hình B3: Mẫu sau khi nâng pH lên 13 và bổ sung 2ml polymer anion để thu sinh khối 66

Hình B4: Mẫu sinh khối trong quá trình lắng đông tụ trên mô hình Jartest 66

Hình B5: Quá trình thu sinh khối tảo 67

Hình B6: Kết quả thí nghiệm khảo sát hàm lượng phân Urê: Lân 67

Hình B7: Kết quả thí nghiệm yếu tố ảnh hưởng của Nito đến quá trình tạo lipit 67

Hình B8: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tạo lipid 67

Hình B9: Mẫu trước và sau chạy soxlet xác định phần trăm lipid 68

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU

Sự cạn kiệt của các nguồn năng lượng hóa thạch cùng với sự gia tăng nhữnghậu quả của ô nhiễm môi trường là động lực thúc đẩy thế giới tìm ra các giải pháphiệu quả cho vấn đề năng lượng và môi trường Một trong những nguồn nhiên liệumới và thân thiện với môi trường đó là biodiesel hay còn gọi là dầu sinh học

Hiện nay, biodiesel được sản xuất từ nhiều nguồn sinh khối truyền thống (dầu

ăn phế thải, mỡ cá basa,…) Các nguồn nguyên liệu này có nhược điểm là thu hoạchkhó khăn, hàm lượng dầu thấp và đặc biệt ảnh hưởng đến an ninh lương thực, chiếmnhiều diện tích đất canh tác, đất rừng và cần nhiều nước tưới Để khắc phục cácnhược điểm đó, sinh khối vi tảo đã ra đời Quá trình nuôi tảo có thể sử dụng nguồnnước thải và khí CO2 nên một phần nào cũng góp phần xử lý môi trườngvà nguồnsinh khối thu được dùng để sản xuất biodiesel

Là một nước nhiệt đới, Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi phát triển môhình nuôi tảo thu sinh khối để sản xuất biodiesel Điều này giúp chủ động đượcnguồn năng lượng đáp ứng cho nhu cầu trong và ngoài nước Ngoài ra, đây còn làhướng đi mới nhiều triển vọng cho các vùng nông thôn, những khu vực đất đai cằncỗi không thích hợp cho nông nghiệp Để thu được lượng biodiesel với số lượng lớn

mà tiết kiệm kinh phí, thời gian và công sức thì cần có những điều kiện tối ưu nhấtgiúp vi tảo sinh trưởng và phát triển và tạo được sinh khối cao nhất Các yếu tố đóbao gồm ánh sáng nhiệt độ, pH, hàm lượng Nitơ trong môi trường… Chính vì thếnhóm chúng tôi đã lựa chọn đề tài " Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng

tạo lipid từ vi tảo Chlorella sp để ứng dụng trong sản xuất biodiesel" để nghiên cứu Mục tiêu đề tài:

- Tính được phần trăm lipid trong tế bào vi tảo Chlorella sp.

- Đưa ra được các yếu tố thích hợp nhất làm tăng sinh khối và hàm lượng lipidtrong vi tảo

Mục đích đề tài:

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tích lũy lipid trong vi tảo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan các nguồn năng lượng

1.1.1 Hiện trạng nguồn năng lượng trên Thế giới

Hiện nay, nguồn năng lượng hóa thạch đã và đang được sử dụng rộng rãi trêntoàn thế giới Theo thống kê năm 2010, hàng năm con người tiêu thụ 32,4% dầu

mỏ, 21,4% than, 5,7% ga, 5,7% năng lượng nguyên tử, 2,3 thủy điện và 10% nănglượng sinh học và năng lượng gió, tuy nhiên, năng lượng mặt trời, địa nhiệt, nănglượng sinh học, thủy triều, vv… chỉ chiếm khoảng gần 1% lượng tiêu thụ của conngười.[1]

Hình 1.1: Phần trăm các nguồn năng lượng trên thế giới

(Nguồn: [1])

Theo dự báo của Cơ quan năng lượng quốc tế, nếu lượng tiêu thụ năng lượngcủa thế giới tiếp tục giữ mức như hiện nay, nhu cầu năng lượng sẽ tăng hơn 30%vào năm 2030, riêng về nhu cầu của dầu lửa có thể tăng đến 41%.[1]

1.1.2 Hiện trạng nguồn năng lượng ở Việt Nam

Theo Tập đoàn Công nghiệp Than Khoáng sản Việt Nam – VINACOMIN, trữlượng than Việt Nam rất lớn: Quảng Ninh có khoảng 10,5 tỷ tấn than, trong đó đãtìm kiếm thăm dò 3,5 tỉ tấn, chủ yếu là than antraxit Đồng bằng sông Hồng dự báotổng trữ lượng 210 tỉ tấn than Asbitum, các mỏ than ở các tỉnh khác khoảng 400triệu tấn

Dầu khí là nguồn tài nguyên quan trọng đã được chú ý nghiên cứu rất sớm.Trữ lượng dầu khí tính đến năm 2004 là 4.300 triệu tấn dầu quy đổi, đã phát hiện1.208,89 triệu tấn dầu quy đổi chiếm 28% tổng tài nguyên dầu khí Việt Nam, trong

đó tổng trữ lượng dầu khí có khả năng thương mại là 814,7 triệu tấn dầu qui đổi,chiếm 67% tổng tài nguyên dầu khí đã phát hiện

Thủy điện chiếm tỉ trọng lớn trong cơ cấu sản xuất điện Việt Nam Trong giaiđoạn 2000-2009, tổng tiêu thụ năng lượng sơ cấp của Việt Nam tăng trưởng trungbình 6,54%/năm và đạt 57 triệu TOE vào năm 2009.[2]

1.1.3 Các nguồn năng lượng tái sinh

Giữ gìn những nguồn năng lượng hiện có và sử dụng chúng một cách hiệu quả

là giải pháp kết hợp để giải quyết triệt để vấn đề năng lượng, một vấn đề mang tínhcấp thiết của thời đại ngày nay

Năng lượng tái sinh là dạng năng lượng thu được từ các nguồn mà con ngườixem là vô hạn Sự vô hạn ởđây ngoài ý nghĩa nhiều đến mức không thể cạn kiệt,nên được hiểu theo nghĩa rộng hơn đó là có khả năng tái tạo trong một thời gianngắn và liên tục

Dạng năng lượng này bao gồm:

- Năng lượng mặt trời

- Năng lượng gió

- Năng lượng thủy triều

- Năng lượng địa nhiệt

- Năng lượng sinh khối

Hình1.2: Các dạng năng lượng tái sinh

(Nguồn:[2])

Nguồn năng lượng tái sinh đang được sử dụng nhiều nhất là thủy năng Tuynhiên, nguồn năng lượng sinh khối cũng là một trong những nguồn được con người

khai thác và sử dụng hiệu quả Sinh khối được xem là nguồn năng lượng lớn thứ tư,ước tính chiếm khoảng 14-15% tổng lượng năng lượng tiêu thụ trên thế giới Ở cácnước đang phát triển, sinh khối thường là nguồn năng lượng lớn nhất, trung bìnhđóng góp khoảng 35% trong tổng cung cấp năng lượng.[3]

Hiện nay, theo thuật ngữ về nhiên liệu, thì sinh khối (biomass) được xem lànhiên liệu ở dạng rắn, nhiên liệu sinh học (biofuel) là những nhiên liệu dưới dạnglỏng thu nhận từ sinh khối và cuối cùng khí sinh học (biogas) là sản phẩm của quátrình phân giải yếm khí các chất hữu cơ.[3]

Hai dạng nhiên liệu sinh học phổ biến nhất đó là biodiesel và bio-ethanol, làhai dạng nhiên liệu tương ứng có thể thay thếđược cho diesel và gasoline mà khôngcần cải tiến nhiều hoặc không cần cải tiến động cơ các phương tiện giao thông cũngnhư máy móc sản xuất Chúng được sản xuất chủ yếu từ sinh khối hay các nguồnnăng lượng tái sinh khác và góp phần giảm thiểu khí thải từ việc đốt cháy nhiên liệu

so với nhiên liệu hóa thạch tính trên cùng một đơn vị hiệu suất.[3]

1.2 Khái quát về Biodiesel

1.2.1 Khái niệm

Biodiesel còn được gọi là Diesel sinh học là một loại nguyên liệu có tính chấtgiống với dầu diesel nhưng không phải được sản xuất từ dầu mỏ mà từ dầu thực vậthay mỡ động vật Biodiesel hay nhiên liệu sinh học nói chung là một loại nănglượng sạch Mặt khác chúng không độc và dễ phân giải trong tự nhiên

1.2.2 Tầm quan trọng của dầu biodiesel và khả năng thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch

Gần đây, con người đang quan tâm đến hai vấn đề quan trọng, đó là môi trường và

sự khủng hoảng năng lượng Đối với môi trường, sự nóng dần lên của trái đất chính

là tâm điểm Mọi người đều biết rằng sử dụng nhiên liệu hóa thạch chính là nguyênnhân gây ra sự nóng dần lên của toàn cầu Ngoài ra, sự khủng hoảng năng lượngkhiến cho giá dầu thô trên thế giới ngày càng tăng cao, ảnh hưởng đến tình hìnhnăng lượng sử dụng trong hộ gia đình cũng như trong khu vực Vì vậy, nguồn nănglượng sạch và được sản xuất từ sinh khối nhằm thay thế cho nhiên liệu hóa thạchđang rất cấp thiết Ngoài ra, sự khủng hoảng năng lượng khiến cho giá dầu thô trênthế giới ngày càng tăng, ảnh hưởng đến tình hình năng lượng sửdụng trong gia đìnhcũng như trong khu vực.[4]

Xét trên lĩnh vực môi trường, giao thông vận tải và sản xuất công nghiệp lànhững nguồn thải chủ yếu của con người Khảo sát tại liên minh Châu Âu, người tanhận thấy có đến 20% khí thải nhà kính là do giao thông vận tải và 60% khí thảinhà kính xuất phát từ các khu công nghiệp.[5] Nông nghiệp là nguồn thải lớn thứ

ba, tương ứng khoảng 9% khí thải nhà kính, trong đó quan trọng nhất là các khí

nitrous oxide N2O và khí methane CH4.[6] Theo dự đoán, sự phát triển của các nềnkinh tế mới đang tăng trưởng như Ấn Độ và Trung Quốc sẽ làm gia tăng sự tiêu thụnăng lượng trên toàn cầu, dẫn đến thêm nhiều mối nguy hại cho môi trường

Khí nhà kính không chỉ góp phần gây ra hiện tượng nóng dần lên của trái đất

mà còn gây ra nhiều ảnh hướng khác tới môi trường và đời sống nhân loại Chính sựnóng dần lên của trái đất đã, đang và sẽ tiếp tục ảnh hưởng đến nhiều khía cạnhkhác nhau của đời sống nhân loại và môi trường trên toàn cầu, chúng ta cần khôngphải chỉ riêng lẻ một mà là một loạt các giải pháp để có thể cải thiện và khắc phụcvấn đề bức bách này

Trái đất nóng dần lên, do sự gia tăng nồng độ của khí nhà kính trong khôngkhí, đã và đang là mối lo ngại quan trọng nhất về môi trường Giảm bớt sự hìnhthành CO2 trong khí quyển, nhiệm vụ hàng đầu của việc làm giảm hiệu ứng nhàkính, có thể thực hiện bởi ba phương pháp sau [3]:

- Giảm bớt sử dụng nhiên liệu hóa thạch

- Loại bỏ CO2 trong khí quyển

- Thu hồi và cô lập hoặc tận dụng CO2 từ việc đốt nhiên liệu hóa thạch trướckhi nó được thải ra môi trường

Xét trên lĩnh vực khủng hoảng năng lượng, sự sụt giảm nguồn nguyên liệu dầuthô dự trữ và những khó khăn trong việc trích ly và tinh luyện chúng dẫn đến sự giatăng về giá thành Đây thực sự là những trở ngại lớn đối với vấn đề giao thông vậntải, vì cho tới hiện nay vẫn chưa tìm ra được nguồn nguyên liệu nào có thể thay thếcho nguồn nguyên liệu hóa thạch với giá thành tương đương

Sản xuất nhiên liệu sinh học có thể đem lại những cơ hội mới góp phần giatăng sự đa dạng về các nguồn thu nhập cũng như các nguồn cung cấp năng lượng

Cụ thể là đẩy mạnh việc làm ở các vùng nông thôn, phát triển sự thay thế dài hạnđối với nguồn nhiên liệu hóa thạch, và giảm bớt lượng khí thải nhà kính, đẩy mạnhviệc loại bỏ Carbon từ các nhiên liệu vận tải và nâng cao sự an toàn trong việc cungcấp nguồn nhiên liệu [3]

Tìm kiếm những nguồn nguyên liệu thay thế đang là vấn đề nóng bỏng đối vớinhiều nước, đặc biệt là những nước thiếu các nguồn tài nguyên năng lượng thôngthường Trong những năm gần đây, khi nền công nghiệp hiện đại phát triển ngàymột rộng rãi và quy mô, nhu cầu về năng lượng đã gia tăng đột biến, vì vậy nhữngnguồn năng lượng thay thế đang được thăm dò và nghiên cứu ráo riết Trong tổng sốcác động cơ phương tiện hiện nay, tỷ lệ phương tiện sử dụng nhiên liệu diesel ngàycàng phổ biến và được sử dụng nhiều hơn Thêm vào đó, động cơ diesel cũng được

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp Vì vậy, nhiên liệu diesel là nguồn sử dụng lớnnhất trong số các nhiên liệu dầu mỏ sử dụng cho động cơ, và tỷ lệ này tăng lên liêntục ngày qua ngày Từ đó, nhu cầu đối với biodiesel càng trở nên cấp thiết, và thuậtngữ “biodiesel” xuất hiện một cách thường xuyên trong các bài báo cáo gần đây Biodiesel được sản xuất từ sinh khối dầu (biomass oils), chủ yếu là từ dầu thựcvật Biodiesel trở thành nguồn năng lượng đáng được chú ý vì những lý do như sau:Thứ nhất, biodiesel là nguồn năng lượng tái sinh có thể đáp ứng cung và cầu.Người ta đã ước tính được rằng lượng dầu mỏ dự trữ sẽ hoàn toàn cạn kiệt trongvòng 50 năm trở lại tính theo mức tiêu thụ hiện nay

Thứ hai, biodiesel cho thấy thân thiện với môi trường hơn các loại nhiên liệuhóa thạch Sử dụng biodiesel không làm gia tăng lượng khí thải carbon dioxide vàhàm lượng các khí sulfur thấp hơn hẳn Thành phần khí thải sulfur và carbonmonoxide giảm thiểu lần lượt là 30% và 10% khi sử dụng biodiesel Lượng khí tạothành trong quá trình đốt cháy nhiên liệu ít hơn, carbon monoxide giảm bớt là nhờvào hàm lượng oxygen cao có trong biodiesel Hơn nữa, biodiesel không chứa cáchợp chất dễ bay hơi và các hợp chất hóa học khác gây hại cho môi trường Gần đây,các cuộc điều tra cho thấy rằng sử dụng biodiesel giảm thiểu được 90% chất độc hạitrong không khí và 95% các bệnh ung thư khi so sánh với diesel thông thường.Thứ ba, biodiesel đem lại tiềm năng kinh tế đáng kể bởi vì trong tương lai, cácdạng năng lượng không tái sinh như nhiên liệu hóa thạch sẽ ngày một gia tăng giáthành là một điều không thể tránh khỏi

Cuối cùng, biodiesel tốt hơn diesel thông thường ở nhiệt độ phát cháy và khảnăng phân hủy sinh học

Vi tảo, thu nhận dưới dạng sinh khối, là một nguồn năng lượng tái sinh rất tiềmnăng, và chúng có thể được chuyển hóa thành năng lượng dưới dạng nhiên liệu sinhhọc bao gồm dầu và gas Vì vi tảo có hàm lượng nước nhiều, do đó không phải toàn

bộ lượng sinh khối có thể áp dụng thành năng lượng Sử dụng phương pháp nhiệthóa học có thể sản xuất ra dầu và gas, và bằng các phương pháp hóa sinh để sảnxuất ra ethanol và biodiesel Sản phẩm từ vi tảo có các đặc tính tương tự như cácsản phẩm từ dầu thực vật và dầu cá, vì vậy, nó có thể thay thế được cho dầu mỏ [4].Bảng 1.1: So sánh tính chất vật lý của biodiesel so với dầu diesel

Nguồn sinh khối không những sẽ trở thành nguồn cung cấp năng lượng bềnvững mà còn góp phần vào cuộc sống xã hội trong khu vực nhờ giúp gia tăng cáchoạt động thương mại và tạo nhiều cơ hội việc làm cho nông dân

Vi tảo được thu dưới dạng sinh khối, là một nguồn năng lượng tái sinh rất tiềmnăng, và chúng có thể được chuyển hóa thành năng lượng dưới dạng nhiên liệu sinhhọc bao gồm dầu và gas Vì vi tảo có hàm lượng nước nhiều, do đó không phải toàn

bộ lượng sinh khối có thể áp dụng thành năng lượng Sử dụng phương pháp nhiệthóa học có thể sản xuất ra dầu và gas, và bằng các phương pháp hóa sinh để sảnxuất ra ethanol và biodiesel Sản phẩm từ vi tảo có các đặc tính tương tự như cácsản phẩm từ dầu thực vật và dầu cá, vì vậy, nó có thể thay thế được cho dầu mỏ

1.2.3 Nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel và tiềm năng của vi tảo

So với dầu thực vật thì tảo cho hiệu suất thu hồi biodiesel lớn hơn và một ưuđiểm nữa là nó hấp thụ cacbon đioxit nhiều hơn so với các loại thực vật khác

Thông thường, biodiesel chủ yếu được sản xuất từ dầu của đậu nành và cácloại rau quả, cọ, hoa hướng dương, hạt cây cải dầu cũng như dầu phế thải tuynhiên, các nguồn nguyên liệu này có nhược điểm là cạnh tranh đất canh tác với cácloài cây nông nghiệp, ảnh hưởng đến an ninh lượng thực và làm giá dầu thực vậttăng Hơn nữa, khối lượng dầu thải và mỡ động vật sẵn có thì không đủ để đáp ứngnhu cầu biodiesel hiện nay Vì những lí do này, công nghệ sản xuất biodiesel chuyểntiếp qua một thế hệ mới, thế hệ thứ ba, lấy nguồn nguyên liệu là sinh khối vi tảo, cóthể góp phần giảm bớt được những đòi hỏi bức thiết về mặt bằng nhờ có hiệu suấtnăng lượng cao hơn trên mỗi đơn vị diện tích đất cũng như không cạnh tranh ảnhhưởng tới đất nông nghiệp

Thực tế, vi tảo có hiệu suất dầu cao nhất trong số các cây trồng lấy dầu đadạng khác Có thể so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo với việc khai thác các nguồnsinh khối khác qua bảng số liệu sau [3]:

Năng suất lipid

(L dầu/ha.năm)

Đất sử dụng (m 2 nă m/kg biodies el)

Năng suất biodiesel (kg biodiesel/ ha.năm)

Bắp/Ngô (Zea mays L.) 44 172 66 152

Gai dầu (Cannabis

Vi tảo (lượng dầu thấp) 30 58700 0.2 51927

Vi tảo (lượng dầu trung

bình)

Vi tảo (lượng dầu cao) 70 136900 0.1 121104

Hình 1.5: Sinh khối của các loại cây phổ biến trong sản xuất biodiesel.

(Nguồn: [3])

Vài loài vi tảo được liệt vào nhóm vi sinh vật giàu chất dầu phù hợp với nhucầu sản xuất lipid Vi tảo được xem là đối tượng tiềm năng để sản xuất nhiên liệubởi rất nhiều ưu điểm như là hiệu suất quang hợp cao, sinh khối lớn và mức độ sinhtrưởng cao hơn khi so sánh với các loại cây trồng sản xuất năng lượng

Trong số các nguồn sinh khối, vi tảo được xem là một nguồn sinh khối hiệnđại và có nhiều tiềm năng nhất hiện nay bởi vì vi tảo có khả năng quang hợp hiệuquả hơn bất kỳ loại sinh khối thực vật nào khác, mà theo Hall in Ref, quá trìnhquang hợp của vi sinh vật là quá trình sử dụng năng lượng mặt trời để chuyển hóathành một dạng năng lượng dự trữ mới dưới dạng các liên kết hóa học, ngoài ra conngười hoàn toàn có thể chủ động sản xuất sinh khối vi tảo với số lượng lớn Vì vậynếu có thể thu hồi năng lượng với năng suất cao từ chúng thì sinh khối vi tảo đượcxem là một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn để sản xuất nhiên liệu Hơn nữa, theo tiêuchuẩn biodiesel của American Society for Testing Materials (ASTM), biodiesel từdầu vi tảo có các thuộc tính tương tự với biodiesel tiêu chuẩn, và nó cũng an toànhơn vì có nhiệt độ phát cháy cao

-Những ưu điểm khi nuôi cấy vi tảo như nguồn tài nguyên sinh khối:

- Tảo được xem là các cơ thể sống có khả năng thu nhận năng lượng mặt trời

để tạo ra các hợp chất hữu cơ rất hiệu quả

- Tảo được xếp vào loài thực vật không có hệ mạch dẫn, đa phần đều thiếu cơquan sinh sản phức tạp

- Vi tảo dễ dàng nuôi cấy để sản xuất một số hợp chất đặc thù chọn lọc, có giátrị kinh tế với nồng độ cao như protein, carbohydrate, lipid và các sắc tố dựa vàocác điều kiện sinh trưởng đa dạng Từ đó có thể tối ưu hóa môi trường để thu đượcsinh khối với hàm lượng lipid cao

- Vi tảo thuộc vào nhóm vi sinh vật sinh sản theo chu kỳ phân đôi tế bào

- Vi tảo có thể sống được ở môi trường nước biển, nước lợ hoặc nước ngọt.Mặc dù vi tảo sống trong môi trường nước, nhưng không đòi hỏi cần nhiều nướcnhư các loại cây trồng khác Mặt khác, vi tảo cũng có thể thích nghi với môi trườngnước thải, do đó không cần thiết phải tốn chi phí sử dụng nước sạch

- Sinh khối tảo dễ dàng thích nghi ở các hệ thống sản xuất có quy mô và kỹthuật khác nhau [8]

- Việc nuôi thu sinh khối vi tảo không đòi hỏi nhiều diện tích như khi trồngcác loại cây lấy dầu khác Biodiesel sản xuất từ vi tảo không làm ảnh hưởng đếnviệc sản xuất thực phẩm và các sản phẩm khác từ thực vật

- Vi tảo có mức độ sinh trưởng rất nhanh, chu kỳ sinh trưởng hoàn tất chỉtrong vài ngày, và có rất nhiều loài tảo chứa nhiều dầu, năng suất dầu trên mỗi đơn

vị nuôi cấy vi tảo có thể cao vượt trội hơn so với năng suất dầu của cây có hạt chứahàm lượng dầu nhiều nhất [8] Thông thường các loài vi tảo có hàm lượng dầu vàokhoảng 20-50%

Sản xuất sinh khối vi tảo có thể được xem là một phương pháp cố định trực tiếp khíthải CO2 vì vi tảo sử dụng CO2 như nguồn Carbon nhờ khả năng quang hợp (1kgsinh khối khô đòi hỏi cần có 1.8kg CO2)

Nuôi cấy vi tảo không cần dùng các loại thuốc bảo vệ thực vật

Các phần sinh khối vi tảo còn dư lại sau quá trình trích ly dầu có thể được dùng nhưnguồn thức ăn cho gia súc, hoặc làm phân bón, hoặc qua quá trình lên men tạo cácsản phẩm ethanol hay methane [8]

Ở điều kiện phòng thí nghiệm, hàm lượng lipid lý tưởng có thể đạt tới 56.60% trêntổng sinh khối khô nhờ vào kỹ thuật di truyền hoặc kỹ thuật nuôi dị dưỡng [8]

1.3 Tổng quan về Tảo.

1.3.1 Khái niệm

Tảo (Algae) là những thực vật bậc thấp gồm một hay nhiều tế bào có cấu tạođơn giản, có màu khác nhau, luôn luôn có chất diệp lục nhưng chưa có rễ, thân, lá.Hầu hết tảo sống trong nước Đây là những thực vật mà vách thân chứa xenluloze,

là những sinh vật tự dưỡng vì chứa diệp lục a, quang hợp nhờ ánh sáng và CO2 [9].Tảo có nhiều dạng: đơn bào, sợi xiên, sợi phân nhánh, hình ống, hình phiến

Vi tảo (Microalgae) là tất cả các tảo có kích thước hiển vi Muốn quan sátchúng phải sử dụng tới kính hiển vi Trong số khoảng 50000 loài tảo trên thế giớithì vi tảo chiếm đến khoảng 2/3 [9]

a) Tảo Khuê (Bacillariophyta)

Tảo Khuê là những đơn bào tròn hay dài hoặc các tế bào dính với nhau thànhsợi hay các tập đoàn phân nhánh Vách của tế bào tảo khuê gồm hai mảnh vỏ gắnkhớp vào nhau Khi tế bào phân chia, mỗi nửa tế bào tạo ra một nửa mới gắn khítvào mép trong của nửa tế bào mẹ Do đó, tảo Khuê nhỏ dần ở mỗi lần sinh sản vôtính Sự sinh sản hữu tính phục hồi lại kích thước ban đầu của nó Vách tế bào đượccấu tạo bởi những tinh thể silic với các kiểu chạm trổ tinh vi không những dùng đểphân loại mà còn được dùng để kiểm tra độ phân giải của kính hiển vi [9]

b) Tảo lục (Chlorophyta)

Giống như thực vật bậc cao, tảo lục có diệp lục tố a và b, chất dự trữ là tinhbột Nhiều tế bào có vách celuloze như thực vật bậc cao Các chi Closterium,Coelastrum, Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella,Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella, [9]

Tảo lục gồm cả tảo đơn bào và đa bào Các loài đa bào có hình bản, hình sợi

có phân nhánh hoặc không Tảo lục được tìm thấy trong nước ngọt và nước mặn,trong đất, trên cơ thể sinh vật khác và cộng sinh trong cơ thể thực vật khác [9]

Có nhiều hình thức sinh sản hữu tính ở Tảo lục, đôi khi ngay cả trong mộtgiống Sự đồng giao (hai giao tử giống nhau về hình dạng và bằng nhau về kíchthước), sự dị giao (hai giao tử khác biệt về kích thước) và sự noãn giao (một hìnhthức dị giao mà trong đó tế bào trứng rất lớn và thường bất động, ngược lại tinhtrùng thì rất nhỏ và di động); ngoài ra Tảo lục còn có thể sinh sản bằng cách tiếphợp tế bào

c) Tảo mắt (Euglenophyta)

Gồm những đại diện nguyên sinh vật với khoảng 40 giống đơn bào hay tậpđoàn, không có vách celuloze Là những tảo phiêu sinh và thường làm thành lớp

váng trên mặt nước ao tù, thường gặp là Euglena và Phacus Mỗi tế bào có vài lục

lạp, chứa diệp lục tố a và b như tảo lục nhưng chất dự trử là paramylon, một loại

đường đa chỉ có ở Euglenophyta [9].

d) Tảo Lam (Cyanophyta)

Tảo Lam làngành tảo nhân sơ Là thực vật bậc thấp còn nhiều nét giống với

vi khuẩn quang hợp Không có lục lạp và ti thể nên cơ chế quang hợp và hô hấpnằm ở hệ thống lamen bên trong Chất dự trữ là glycogen và cyanophixin Sinh

sản vô tính Các loài tảo thuộc chi Nostoc, Oscillatoria có khả năng cố định nitơ,

còn các loài tảo lam khác là thành viên của tổ hợp địa y Một số tảo lam có khảnăng cố định nitơ tự do, năng suất cố định nitơ của tảo lam cao nhất trong điềukiện đầy đủ ánh sáng [9]

e) Tảo giáp (Pyrrophyta)

Giống như tảo Khuê, tảo Giáp là một nhóm tảo đơn bào và là thành phần quantrọng của phiêu sinh nước ngọt và nước mặn Một số loài ở biển tạo ra toxin và sự

nở hoa của các loài này có thể làm chết cá và sò ốc và gây ngộ độc cho người ănphải các hải sản này

Ở một số giống tảo Giáp, trên tế bào có hai rãnh, một rãnh ngang và một rãnhdọc Trong mỗi rãnh có một chiên mao, chiên mao trong rãnh dọc hướng về phíasau, hoạt động như một bánh lái Chiên mao trong rãnh ngang xoắn theo hình xoắn

ốc, chiên mao này đẩy tế bào đi về phía trước, cùng lúc làm tế bào xoay tròn [9]

1.3.3 Vai trò của vi tảo trong tự nhiên và trong đời sống nhân loại

Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên vàtrong đời sống nhân loại Chúng ta biết rằng đại dương chiếm 71% diện tích bề mặtTrái đất Một số tác giả Hoa Kỳ cho rằng hàng năm tảo có thể tổng hợp ra trong đạidương 70-280 tỷ tấn chất hữu cơ Trong các thủy vực nước ngọt tảo cung cấp ôxy

và hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá và các động vật thủy sinh khác

Tảo góp phần bảo vệ môi trường nuôi thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượngmuối khoáng dư thừa Nhiều tảo biển còn khai thác để sản xuất thạch (agar),alginate, sản phẩm giàu iod, Nhiều tảo đơn bào được nuôi trồng công nghiệp đểtạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi tôm hay thuốc bổ trợ giàu protein,vitamin và vi khoáng dùng cho người Một số vi tảo được dùng để sản xuấtcarotenoid, astaxanthin, các acid béo không bão hòa

Dạng tảo cộng sinh với nấm thành Địa y cũng là dạng phân bố rất rộng rãi vànhiều loài đã được khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa, phẩm nhuộm và cácmục đích kinh tế khác

Hiện nay, vi tảo còn được dùng để sản xuất ra nhiên liệu diesel sinh học, mở ratriển vọng mới cho ngành công nghệ sinh học bởi khả năng có thể thay thế hoàntoàn cho nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt [9]

1.3.4 Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid

Một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid đạt đến 75% (w/w) sinh khối khô nhưng

năng suất thấp, như là Botryococcus braunii Một số loài vi tảo khác rất phổ biến cho việc sản xuất lipid đó là Chlorella, Crypthecodinium, Cylindrotheca,

Sinh khối khô (g/L/ngày)

Năng suất lipid

Theo số liệu trên, ta thấy trong số các loài vi tảo có hàm lượng lipid cao,

Chlorella sp là một tiềm năng sáng giá Mặc dù hàm lượng lipid tính theo phần

trăm sinh khối khô nằm ở khoảng rộng từ 10 – 48% cao hơn một số loài như

Spirulina maxima, Tetraselmis suecica, Tetraselmis sp., Scenedesmus sp.,…, Chlorella sp nuôi theo phương pháp tự dưỡng có sức sinh sản cao, lượng sinh khối

trong ngày lớn, năng suất lipid của loài này có giá trị cao đáng kể Vì vậy có thể

xemChlorella sp là một loài vi tảo rất có tiềm năng trong việc sản xuất biodiesel

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự tích lũy lipid ở

vi tảo cholorella sp

Năng suất dầu của vi tảo là khối lượng dầu được sản xuất trên mỗi đơn vị thểtích canh trường vi tảo mỗi ngày Năng suất dầu phụ thuộc vào mức độ sinh trưởng

của tảo và hàm lượng lipid có trong sinh khối Xem xét qua một vài kết quả nghiêncứu, ta có thể thấy rằng hàm lượng và đặc tính của lipid trong tế bào vi tảo rất đadạng, tùy thuộc vào sự thay đổi của điều kiện sinh trưởng (như nhiệt độ và cường

độ chiếu sáng) hay thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy (như nồng độnitrogen, phosphate).[10]

1.4.1 Yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và sự tích lũy các thành phầnhóa sinh trong tế bào vi tảo, đặc biệt là sự tích lũy lipid và sự thay đổi thành phầnlipid nội bào

Hầu hết các loài vi tảo đều sống được ở điều kiện nhiệt độ từ 16 – 30oC Ởđiều kiện nhiệt độ lớn hơn 30oC, vi tảo bị ức chế khả năng sinh trường Ở nhiệt độ

38oC, sự sinh trưởng các loài tảo hầu hết bị ngừng lại, sau đó các tế bào vi tảo chết.Điều này được nhận biết qua sự thay đổi màu sắc từ màu xanh sang màu vàng nâucủa các tế bào vi tảo

Ở nhiệu độ 25  1oC, hàm lượng lipid trong tế bào vi tảo Chlorella sp tăng, tuy

nhiên, điều kiện nhiệt độ này không làm ảnh hưởng xấu đến mức độ sinh trường của

tế bào [11,10]

1.4.2 Yếu tố ánh sáng

Tốc độ sinh trưởng của tảo tự dưỡng là một hàm không tuyến tính theo mức

độ chiếu sáng Tại mật độ dòng photon thấp, tốc độ sinh trưởng gần như tuyến tínhtheo mức độ chiếu sáng Tuy nhiên, tại cường độ sáng cao, tốc độ sinh trưởng trởnên bão hòa (cân bằng) so với mức độ chiếu sáng Các tế bào sinh trưởng tại cácmức độ chiếu sáng khác nhau có các đặc điểm sinh trưởng khác nhau và cho thấy có

sự thay đổi đáng kể trong thành phần hóa học tổng quát, hàm lượng sắc tố và hoạtđộng quang hợp

1.4.3 Nồng độ Nitrogen

Nitrogen là một yếu tố ảnh hưởng sâu sắc đến sự chuyển hóa và tích lũy lipidtrong nhiều loài vi tảo Thêm vào đó, điều chỉnh nồng độ nitrogen khá dễ dàng vàkhông tốn nhiều chi phí Vì vậy, thành phần và hàm lượng nitrogen bổ sung vàomôi trường nuôi cấy vi tảo để tăng năng suất lipid đã được nhiều nhà khoa họcnghiên cứu

Hàm lượng nitrogen cao sẽ làm vi tảo sinh trưởng rất nhanh, lượng sinh khốithu được nhiều Tuy nhiên, điều này làm giảm phần trăm lipid có trong vi tảo.Ngược lại, ở điều kiện môi trường thiếu hụt nitrogen, vi tảo lại tích lũy một lượng

tế bào dễ bị chết.Đối với Chlorella sp, hàm lượng muối cao nhất có thể chịu được là5g/l, ngoài giới hạn này tảo sẽ bị ức chế sinh trưởng và có thể chết nếu hàm lượngmuối quá cao Tuy nhiên, hàm lượng muối cao hơn, trong khoảng 5 – 10 g/l làmtăng khả năng tích lũy lipid trong vi tảo.

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

Chlorella sp để tiến hành nghiên cứu [12, 13,14,15,16].

Chủng Chlorella sp với kích thước tế bào từ 5-10 µm, là một trong các chủng vi

tảo được nghiên cứu nhiều nhất cho mục tiêu sản xuất biodiesel được lấy từ phòngthực vật, trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM

Tảo Chlorella Sp.được xếp vào nhóm thực vật, thuộc [9] :

Ngành (divisio): Chlorophyta

Lớp (class): Trebouxiophyceae

Bộ (ordo): Chlorellales

Họ (familia): Chlorellaceae

Chi (genus): Chlorella

Loài (species): Chlorella Sp

Hình 2.1: Vi tảo Chlorella sp.

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

Mỗi loại tảo có một môi trường nuôi thích hợp, đó là môi trường phù hợp nhất

để tảo duy trì sự sinh trưởng và phát triển Đối với Chlorella Sp, nhóm chọn môi

trường BG11, đây là môi trường đã được nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm vàthành công [13,15]

Bảng 2.1: Công thức và cách pha môi trường BG 11 (Blue Green Medium)

(Nguồn : [13,15].)

Tên hóa chất Đơn vị tính Thể tích dung dịch Ghi chú

Dung dịch 1 Pha 100 ml dung

dịch 1, 10 ml dungdịch 2 và 1 ml dungdịch 3 với 1000 mlnước cất, Chỉnh môitrường về pH = 7

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các quá trình nghiên cứu đề tài

Toàn bộ quá trình nghiên cứu về khả năng tích lũy lipid trong vi tảo chlorella sp

được thể hiện qua hình 2.2 và 2.3

lươ

ng

Nitơ

TN 1.2

Kha

o sat

ham sưanh

hươ

ng

cuacươ

ng đ

anh

sang

TN 1.3

han

h

phâ

n tch

TSS, đ

o OD

Đưa ra

Hinh

2.2: S

trương đôi

vơ

i nh sư si

trương cua

vi tao

Chlore

l sp. la

TN 2.4 B

ô uôi m sung

NaCl va

o môi

trương nuôi

Trich

ly id lip

Tachdâu Bio

TN 2.2 ôi y đ Tha

TN 2.3 ôi y đ Tha

ham lương nitơ

2.2.2 Quan sát hình tháiChlorella sp.

Hình thái vi tảo được quan sát và chụp hình dưới kính hiển vi quang học.Quansát đặc điểm tế bào ở các pha tăng trưởng về màu sắc tế bào, kích thước tế bào, sựphân chia tế bào, các loại bào tử,…

Sự thay đổi hình thái tế bào vi tảo được quan sát và chụp ảnh mỗi ngày dưới kínhhiển vi quang học ở độ bội giác x40 và bội giác x100

2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đối với sự sinh trưởng

của vi tảo Chlorella sp.

- Tiến hành nuôi tảo trong 3 thí nghiệm để phân tích Mỗi thí nghiệm gồm 3 thựcnghiệm với 3 điều kiện nuôi khác nhau Các thực nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần, lấygiá trị trung bình để so sánh

- Vi tảo được nuôi trong mỗi bình với thể tích môi trường BG11 là 1l Điều chỉnh

pH môi trường về 7 trước khi cho tảo giống vào [13,15]

- Cho vào mỗi bình nuôi 1 ml kháng khuẩn amplicylin 20 ppm để ức chế các loài

vi khuẩn, nấm sinh trưởng, phát triển

- Dùng pipet hút 10ml mẫu tảo bổ sung vào môi trường nuôi

- Tiến hành nuôi trong 10 ngày, 2 ngày đầu không sục khí, tạo điều kiện cho tảothích nghi với môi trường nuôi 7 ngày sau sục không khí với lưu lượng 20ml/phúttrong 8 tiếng (10h – 18h)

a) Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng.

Tiến hành nuôi vi tảo trong 9 bình, thể tích mỗi bình nuôi là 1l Điều chỉnh cường

độ ánh sáng ở mỗi thực nghiệm như bảng sau:

Bảng 2.2: Điều chỉnh cường độ ánh sáng

Thí nghiệm Nghiệm thức 1.1.1 Nghiệm thức 1.1.2 Nghiệm thức 1.1.3Cường độ ánh

sáng 4500 100 lux 3500 100 lux 2500100 lux

Mỗi thí nghiệm thực hiện 3 lần, nhiệt độ 28  10C, điều chỉnh cường độ ánh sáng

ở 3500  100 lux

b) Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Nitrogen.

Pha môi trường dựa vào môi trường BG11 với hàm lượng Nitrogen lần lượt nhưbảng sau [12, 14, 15, 16]:

Bảng 2.2: Hàm lượng Nitrogen bổ sung trong môi trường BG11

Nghiệm thức 1.2.2 0.75 g/l NaNO3;Nghiệm thức 1.2.3 0,325 g/lNaNO3;Điều chỉnh cường độ ánh sáng cho các bình nuôi ở 3500  100 lux

c) Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ N : P

- Tiến hành nuôi tảo trong 9 bình, thể tích các bình nuôi là 1l.

- Bổ sung vào mỗi bình 300 ml tảo Chlorella sp giống.[17].

Bảng 2.3: Tỉ lệ N : P và khối lượng phân hóa học bổ sung

Thí nghiệm Tỉ lệ N : P Khối lượng phân

2.2.4 Nuôi vi tảo Chlorella sp thu sinh khối và trích li lipid.

Sau khi nghiên cứu khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của tảo, ta xác địnhđược thời điểm nào thì tảo phát triển nhanh nhất , đạt được sinh khối nhiều nhất Vàchọn ra được các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc tạo sinh khối của tảo thì tiếnhành nuôi đại trà để thu sinh khối

Trong thời gian nuôi thu sinh khối ta cũng phải lấy mẫu đem phân tích như trongquá trình nuôi thích nghi, cần phải theo dõi và kết hợp với phần thông tin số liệu đãnghiên cứu ở phần nuôi thích nghi để lựa chọn thời điểm thu sinh khối phù hợp và pháthiện các sự cố để có hướng giải quyết kịp thời tránh ảnh hưởng tới hiệu quả tạo sinhkhối của tảo

Tiến hành 4 thí nghiệm nuôi tảo trong vòng 7 ngày, 5 ngày đầu nuôi ở điều kiệnmôi trường tối ưu đã tìm ra ở thử nghiệm các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

của vi tảo Chlorella sp, 2 ngày tiếp sau chuyển sang điều kiện môi trường mới nhằm

tạo sock cho vi tảo để nâng cao khả năng tích lũy lipid trong tế bào

Bổ sung cho mỗi bình nuôi 1 ml kháng khuẩn amplicilin 20ppm để ức chế cácloài vi khuẩn, nấm sinh trưởng, phát triển

Kiểm soát pH của các bình nuôi bằng máy đo pH Qua các ngày nuôi, pH luôn có

xu hướng tăng do CO2 hòa tan vào nước Sử dụng axid HCl 5% để nâng pH hoặcNaOH 1N để giảm pH sao cho pH ở các bình nuôi nằm trong khoảng 7 – 8

Để đảm bảo tính chính xác, mẫu tảo ở tất cả các thí nghiệm đều được thu sinhkhối vào 14h của ngày thứ 2, sau khi thay đổi điều kiện nuôi Sinh khối tảo thu được,một phần để trích li lipid, một phần để tách dầu

a) Thí nghiệm 2.1: Thay đổi thời gian chiếu sáng.

- Tiến hành nuôi vi tảo trong 9 bình, thể tích mỗi bình 1 lít, cho vào mỗi bình 330

ml tảo giống [19.20]

Bảng 2.4: Thời gian chiếu sáng cho thí nghiệm 1

- Tiến hành chiếu sáng liên tục 12 tiếng/ngày bằng đèn huỳnh quang không tỏanhiệt cho các bình nuôi ở cường độ 3500  100 lux

- Trong 2 ngày sau:

+ Để các bình nuôi của thực nghiệm 2.1.1 trong tối hoàn toàn, chỉ chiếu sáng 4tiếng/ngày, từ 12h – 16h

+ Chiếu sáng các bình nuôi của thực nghiệm 2.1.2 12 tiếng/ngày từ 6h – 18h.+ Đối với thực nghiệm 2.1.3, tiến hành chiếu sáng liên tục từ 6h – 22h

b) Thí nghiệm 2.2: Thay đổi nhiệt độ nuôi.

Tiến hành nuôi tảo trong 7 ngày 5 ngày đầu nuôi ở điều kiện môi trường tối ưu,2ngày tiếp theo thay đổi nhiệt độ nuôi như bảng 2.6

Bảng 2.5: Nhiệt độ môi trường nuôi vi tảo [19.20]

Thí nghiệm Thí nghiệm 2.2.1 Thí nghiệm 2.2.2 Thí nghiệm 2.2.3Nhiệt độ (oC) 23 1oC 281oC 331oC

Đối với thực nghiệm 2.2.3, sử dụng đèn dây tóc 100 w, tỏa nhiệt mạnh để chiếusáng các bình nuôi Điều chỉnh vị trí các bình nuôi để giữ nhiệt độ nằm trong khoảng33 1oC

Các bình nuôi ở thực nghiệm 2.2.1 được cho vào thùng xốp giữ nhiệt, và ngâmnước được làm lạnh và điểu chỉnh ở nhiệt độ 23  1oC

c) Thí nghiệm 2.3: Thay đổi hàm lượng Nitrogen

Tiến hành nuôi vi tảo trong 9 bình, thể tích mỗi bình 0,5 lít, cho vào mỗi bình

330 ml tảo giống

Tiến hành nuôi trong 7 ngày, 5 ngày đầu để ở điều kiện nuôi tối ưu, 2 ngày sau

đó điều chỉnh hàm lượng Nitrogen như bảng sau

Bảng 2.6: Nồng độ nitrogen trong các thực nghiệm [19.20]

Bảng 2.7: Thể tích môi trường BG11* bổ sung

Thí nghiệm Thể tích môi trường BG11* (lít)

d)Thí nghiệm 2.4: Bổ sung NaCl vào môi trường nuôi

Tiến hành nuôi vi tảo trong 9 bình, thể tích mỗi bình 1 lít, cho vào mỗi bình 330

ml tảo giống

Bảng 2.8: Hàm lượng muối cho vào các bình nuôi [19.20]

Nghiệm thức Nghiệm thức 2.4.1 Nghiệm thức 2.4.2 Nghiệm thức 2.4.3

2.2.5 Xác định đường cong tăng trưởng

Đường cong tăng trưởng được xây dựng dựa trên mật độ tế bào xác định mỗingày, được biểu diễn bằng đồ thị dạng đường với trục tung là mật độ tế bào (tế bào/ml)

và trục hoành là thời gian tăng trưởng (ngày)

2.2.6 Đo chỉ số OD

Hằng ngày lấy 5ml mẫu nuôi đem do chỉ số OD ở bước sóng 660 nm Thời gianlấy mẫu phân tích cố định vào 7h hàng ngày Nếu lấy mẫu ở những khoảng thời giankhác nhau sẽ dẫn đến sai số kết quả, ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu [14, 17, 18]

2.2.7 Hàm lượng sinh khối

Hàm lượng sinh khối chlorella sp được xác định bằng phương pháp xác định cặn

lơ lửng [21]

Các bước thực hiện như sau:

- Sấy giấy lọc nhiệt độ ở 105oC

- Cân khối lượng giấy lọc sau sấy

- tiếp tục sấy và cân đến khi khối lượng giấy lọc không đổi (m0)

- Dùng pipet hút 10ml mẫu (V) lọc qua giấy lọc đã xác định khối lượng

- Sấy mẫu giấy lọc ở 105oC đến khối lượng không đổi, cân lại mẫu giấy lọc (m1).Quá trình này được thực hiện lặp lại 3 lần

- Kết quả được tính theo công thức:

M (mg/ml) = (m1- m0)*1000/V

Với M: hàm lượng tế bào vi tảo (mg/ml)

2.2.8 Phương pháp thu sinh khối.

Sử dụng phương pháp nâng pH kết hợp polime anion để keo tụ bông cặn của ôngMorain và cộng sự (1980)

- Dùng NaOH 1N nâng pH môi trường lên 13

- Bổ sung vào mỗi lít môi trường 2 ml polime

- Cho vào hệ thống Jatrest chỉnh khuấy nhanh 2 phút, khuấy chậm 3 phút

- Lấy các bình ra, đợi lắng Gạn bớt phần nước trong phía trên Lọc phần bôngtảo lắng phía dưới

- Tiến hành sấy khô sinh khối tảo ở 80oC trong tủ sấy

2.2.9 Xác định hàm lượng lipid

- Cân m(g) sinh khối vi tảo đã được sấy khô tuyệt đối cho vào bao giấy đã xácđịnh khối lượng Gấp miệng bao lại để tránh rơi vãi

- Cân khối lượng bao giấy và sinh khối tảo (mo)

- Cho bao giấy chứa tảo vào bình tách chiết

- Cho hexan vào 2/3 thể tích bình đun, bật bếp đun ở nhiệt độ 50 – 60oC

- Chạy hệ thống soxhlet trong vòng 3 giờ

- Lấy mẫu tảo ra, sấy khô, chuyển vào bình hút ẩm trong 30 phút rồi cân