Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ và cơ chế liên quan đến tác dụng chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng (ilex kudingcha c j tseng)

Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh chè đắng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu não cục bộ tạm thời [24]..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LÝ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ VÀ CƠ CHẾ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA

CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG

(ILEX KUDINGCHA C.J.TSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LÝ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ VÀ CƠ CHẾ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA

CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG

(ILEX KUDINGCHA C.J.TSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Phạm Thị Nguyệt Hằng

PGS.TS Nguyễn Thị Lập

HÀ NỘI - 2021

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS Nguyễn Thị Lập, người thầy, người cô luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên của Khoa Dược lý – Sinh hoá Viện Dược liệu, các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa sinh Dược – trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ cũng như tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo cùng cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học và các phòng ban khác trong trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là PGS.TS Nguyễn Thị Song

Hà, ThS Chu Lê Mai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sỹ đúng thời hạn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè

đã luôn bên tôi, ủng hộ tôi và là chỗ dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2021

Học viên cao học

Nguyễn Thị Lý

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN 3

1.1 Hội chứng tự kỷ 3

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tự kỷ 3

1.1.2 Triệu chứng và dấu hiệu chẩn đoán 3

1.1.3 Dịch tễ học 4

1.1.4 Các yếu tố nguy cơ và sinh lý bệnh 4

1.1.5 Tác động của stress oxy hoá đến ASD 9

1.1.6 Điều trị 12

1.1.7 Các mô hình thực nghiệm nghiên cứu và đánh giá hội chứng tự kỷ 15

1.2 Cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 18

1.2.1 Tên gọi và vị trí phân loại 18

1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 18

1.2.3 Thành phần hoá học 19

1.2.4 Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng 20

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Động vật thí nghiệm 24

2.1.3 Hoá chất và trang thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Gây mô hình chuột tự kỷ bằng muối natri valproat (VPA) 27

2.3.2 Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 29

2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng 32

2.3.4 Xử lý số liệu 37

KẾT QUẢ 39

3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết lá chè đắng 39

3.1.1 Đánh giá tác dụng tăng tương tác cộng đồng 39

3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện lo âu 45

3.1.3 Đánh giá tác dụng cải thiện nhận thức 46

3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng 47

3.2.1 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) 47

3.2.2 Hoạt tính dọn gốc tự do superoxide 48

3.2.3 Hoạt tính ức chế sự giảm glutathion trong não chuột 48

BÀN LUẬN 50

4.1 Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ trên mô hình động vật thực nghiệm 50

4.1.1 Về mô hình gây bệnh tự kỷ cho chuột 50

4.1.2 Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết lá chè đắng 52

4.2 Về cơ chế chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1 ASD Autism spectrum disorder Chứng rối loạn phổ tự kỷ

2-picrylhydrazyl

1,1-Diphenyl – picrylhydrazyl

2-3 DTNB 5,5’-dithiobis acid 2 –

nitrobenzoic

5,5’-dithiobis acid 2 – nitrobenzoic

5 GPx Glutathione peroxidase Glutathion peroxidase

6 GR Glutathione reductase Glutathion reductase

12 NTB Nitroblue tetrazolium Nitroblue tetrazolium

13 ROS Reactive oxygen species Các gốc phản ứng oxy

hoá

14 ORT Object Recognition Test Thử nghiệm nhận biết đồ

vật

15 USV Ultrasonic vocalizations Sóng siêu âm

16 SEM Standard error of the

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 25Bảng 2.2: Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 26Bảng 2.3: Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 26Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm trong thử nghiệm dọn gốc DPPH của cao chiết lá chè đắng 33Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm trong thử nghiệm dọn gốc Superoxide của cao chiết

lá chè đắng 35Bảng 2.6: Thành phần trong đĩa ELISA khi làm phản ứng định lượng glutathion trong não chuột 37Bảng 3.1: Tỷ lệ chuột phát âm theo nhóm, ngày 39Bảng 3.2: Kết quả nồng độ glutathion trong não chuột 49

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các phản ứng khử độc loại ROS trong đó các enzym xúc tác các phản ứng giải độc gồm Fenton (phản ứng Fenton), GPx (glutathion peroxidase), GR

(glutathion reductase), MIT (ty thể) và SOD (superoxide dismutase) [13] 10

Hình 1.2 Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô 19

Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu 27

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thực nghiệm 28

Hình 2.3: Mô hình thí nghiệm ba buồng trên chuột nhắt trắng 30

Hình 2.4: Mô hình thí nghiệm mê lộ chữ thập trên chuột nhắt trắng 31

Hình 2.5Sơ đồ phản ứng của gốc DPPH với các gốc khác (•R= •H, gốc alkyl) 32 Hình 2.6: Sơ đồ tính khử của NBT khi phản ứng với gốc anion superoxide tạo ra bởi phản ứng của PMS-NADH 34

Hình 3.1: Thời lượng cuộc gọi của các lô chuột theo ngày 40

Hình 3.2: Tần số cuộc gọi của các lô theo ngày 41

Hình 3.3: Entropy cuộc gọi của các lô theo ngày 42

Hình 3.4: Năng lượng cuộc gọi của các lô theo ngày 43

Hình 3.5: Kết quả đánh giá khả năng tương tác cộng đồng của cao chiết chè đắng trên thử nghiệm ba buồng 44

Hình 3.6: Tác dụng trên thử nghiệm mê lộ chữ thập 45

Hình 3.7: Kết quả đánh giá khả năng nhận thức trên thử nghiệm nhận diện đồ vật chuyển vị trí 46

Hình 3.8: Hoạt tính dọn gốc DPPH của cao chiết lá chè đắng 47

Hình 3.9: Hoạt tính dọn gốc Superoxide của mẫu cao chiết lá chè đắng 48

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng tự kỷ (Autism spectrum disorder – ASD) là một bệnh lý thần kinh phức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu đời được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng hoà nhập xã hội, suy giảm khả năng giao tiếp, kết hợp với những hành vi rập khuôn, lặp lại Các triệu chứng này sẽ không suy giảm theo thời gian, ảnh hưởng đến tương lai của trẻ theo nhiều hướng Một số người có thể sống độc lập nhưng khó khăn về giao tiếp, học tập trong khi một số khác bị khuyết tật nặng cần được hỗ trợ chăm sóc suốt đời Thuốc điều trị dứt điểm hội chứng tự kỷ hiện tại chưa có và các liệu pháp điều trị thường dựa trên phương pháp giáo dục và tâm lý Các thuốc hoá dược mặc dù giúp giảm các triệu chứng liên quan đến

tự kỷ như hung hăng, lầm lì, kém tập trung nhưng có hại với hệ thần kinh Do

đó, nhiều nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước đã tập trung sàng lọc các dược liệu có khả năng cải thiện nhận thức để điều trị hội chứng tự kỷ

Qua tham khảo tài liệu, chè đắng với tên khoa học Ilex kudingcha

C.J.Tseng (IK), họ Aquifoliaceae có thể có tiềm năng trong điều trị tự kỷ Dược liệu phân bố ở các tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam như Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Cạn, Hoà Bình Trong y học cổ truyền Việt Nam, chè đắng đã được

sử dụng để thải độc tố kháng khuẩn, giảm cơn khát và ho, mắt ngứa, mắt đỏ, đặc biệt là để cải thiện trí nhớ Triterpenoid, acid phenolic, flavonoid và tinh dầu là những thành phần chính của chè đắng, các thành phần này có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hoà chuyển hoá lipid, chống oxy hoá, hạ đường huyết và chống khối u Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh chè đắng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu não cục bộ tạm thời [24] Đồng thời, kết quả bước đầu khi đánh giá trên mô hình ruồi giấm tự kỷ - nghiên cứu hợp tác giữa Khoa Dược lý – Sinh hoá Viện Dược liệu với Viện công nghệ Kyoto cho thấy saponin chè đắng có tác dụng cải thiện triệu chứng tự kỷ thể hiện

chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)” với hai mục tiêu:

- Đánh giá được tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết lá

chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình chuột nhắt trắng

- Đánh giá được khả năng chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng

(Ilex kudingcha C.J.Tseng)

3

TỔNG QUAN 1.1 Hội chứng tự kỷ

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tự kỷ

Hội chứng tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder - ASD) là một số rối loạn về phát triển thần kinh đặc trưng bởi sự thiếu hụt về những hành vi tương tác cộng đồng, giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ trong

3 năm đầu đời của trẻ [29] Trẻ mắc ASD thường né tránh cái nhìn trực tiếp, gặp vấn đề trong khả năng kiểm soát cảm xúc hoặc nhận thức thái độ của người khác, chỉ thực hiện được một số hành vi giới hạn và thiếu tập trung ASD sẽ kéo dài trong suốt cuộc đời của trẻ sau này Các nghiên cứu cho thấy

tỷ lệ bé trai mắc hội chứng tự kỷ cao hơn các bé gái từ 2-3 lần Chính vì vậy các chẩn đoán về hội chứng tự kỷ thiên về các bé trai hơn là cho các bé gái [10]

1.1.2 Triệu chứng và dấu hiệu chẩn đoán

ASD có thể ảnh hưởng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh Tuy nhiên, vì không có dấu ấn sinh học đáng tin cậy, chẩn đoán phải được thực hiện trên cơ sở hành vi Cẩm nang thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa kỳ (DSM-5), được xuất bản năm 2013, nhằm mục đích giúp chẩn đoán ASD một cách đơn giản hơn Trẻ mắc hội chứng này thường biển hiện sự thiếu hụt và bất thường ở 3 yếu tố chẩn đoán cốt lõi là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành vi có tính rập khuôn, lặp lại Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện ít nhất 3 dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp lại các hành

vi rập khuôn, máy móc Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể Trẻ không hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụt trong khả năng

4

học tập và nhận thức, thường mắc động kinh, rối loạn vận động, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hoá, đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học Ngoài ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm với các rối loạn khác bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X), và các bệnh tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý – Attention deficit hyperactivity disorder – ADHD) [29]

1.1.3 Dịch tễ học

Theo một đánh giá năm 2010 do WHO uỷ quyền, ước tính tỷ lệ ASD trên toàn cầu khoảng 1% Hơn một nửa số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ ASD ở các nước phát triển là 5% [29] Trong vài thập kỷ gần đây, tỷ lệ mắc ASD ở Hoa Kỳ gia tăng trong vài thập kỷ, lý giải có thể do nâng cao nhận thức, dịch

vụ Tại Việt Nam, thông tin liên quan đến tỷ lệ mắc ASD bị hạn chế Theo thống kê sơ bộ của Bộ Lao động – Thương Binh Xã Hội, Việt Nam có khoảng

200000 người mắc hội chứng tự kỷ và số lượng trẻ em được chẩn đoán và điều trị ngày càng gia tăng Theo nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm 2019, tỷ lệ mắc ASD ở miền bắc Việt Nam là 75,2/10000 trẻ [27] Cũng trong nghiên cứu này tác giả còn chỉ ra rằng tỷ lệ mắc ASD cao hơn ở những trẻ em sống trong môi trường đô thị Mức độ đô thị hoá càng tăng dẫn đến trẻ

có nguy cơ mắc bệnh càng cao hơn

1.1.4 Các yếu tố nguy cơ và sinh lý bệnh

1.1.4.1 Các yếu tố rủi ro môi trường

Nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ giữa ASD và tuổi của mẹ khi mang thai Các bà mẹ ≥ 40 tuổi cho thấy tỷ lệ con sinh ra mắc ASD cao hơn Các yếu tố không đặc hiệu trong thai kỳ bao gồm điều kiện trao đổi chất, tăng cân, huyết áp cao, nhiễm khuẩn, nhiễm virus tại bệnh viện hoặc tiền sử gia đình có người mắc bệnh tự miễn có liên quan tới nguy cơ mắc ASD và chậm phát triển ở trẻ sơ sinh Một số nghiên cứu điều tra thuốc mà người mẹ sử

5

dụng trong thời kỳ mang thai cho thấy mẹ tiếp xúc với valproat trước khi sinh tăng nguy cơ trẻ mắc ASD Các thuốc chống trầm cảm, bao gồm tái hấp thu serotonin có chọn lọc không cho thấy những rủi ro rõ ràng, bất chấp những lo ngại trước đó [29]

Trẻ sinh non (<32 tuần), nhẹ cân (<1500 g), nhỏ hơn hoặc lớn hơn so với tuổi có liên quan độc lập tới việc gia tăng nguy cơ mắc ASD mặc dù dấu hiệu của rủi ro là không rõ ràng Tuy nhiên, những đứa trẻ này nên được theo dõi ASD trong giai đoạn sơ sinh và vài năm sau đó [29]

1.1.4.2 Yếu tố di truyền học

Một phân tích tổng hợp được xuất bản vào năm 2016 báo cáo rằng 93% nguy cơ ASD là do di truyền, mặc dù các yếu tố phi di truyền cũng rất quan trọng Nghiên cứu chỉ ra rằng 7-20% trẻ mắc ASD sau khi anh chị em của chúng được chẩn đoán mắc ASD

74 Các hội chứng di truyền liên quan đến ASD

ASD có liên quan đến các hội chứng di truyền hiếm gặp như hội chứng Fragile X, xơ cứng củ, u xơ thần kinh, phenylketon niệu và hội chứng Rett Các rối loạn gen đơn lẻ phổ biến nhất được coi như nguyên nhân của ASD là hội chứng Fragile X và xơ cứng củ

Hội chứng Fragile X được gây ra bởi sự đột biến của bộ ba nucleotid CGG lặp lại ở vùng chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation

1 (FMR1) dẫn đến sự tăng cường quá trình sao chép của nó và đi kèm với sự

ức chế phiên mã Trong khi 1-3% trẻ em được chẩn đoán tự kỷ có hội chứng Fragile X, ít nhất một nửa số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành vi tự kỷ

Tương tự với bệnh xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC), đây là một rối loạn di truyền đặc trưng bởi các khối u lành tính trong não và các cơ quan khác, động kinh và các suy giảm nhận thức TSC được gây ra bởi đột biến gen hemarrtin và tuberin mã hoá TSC1 và TSC2 tương ứng Khoảng 25-50% người khuyết tật trí tuệ mắc TSC đáp ứng các tiêu chuẩn chẩn đoán

6

tự kỷ nhưng chỉ có 1,1-1,3% số người được chẩn đoán mắc ASD ban đầu có TSC [20]

- Nghiên cứu gen trong toàn bộ gen

Kết quả nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen và phân tích toàn bộ vùng

mã hoá đã xác định được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷ Những gen này có chức năng và vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã và tái cấu trúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân giải protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào và hình thành các synap thần kinh

Các nghiên cứu di truyền đã xác định Neurobeachin (NBEA) là gen liên quan đến ASD trên nhiễm sắc thể 13q sau các báo cáo ban đầu rằng đột biến chuyển đoạn nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến tự kỷ vô căn ở trẻ nam Đột biến xoá đoạn gen này cũng được công bố có liên quan đến bệnh NBEA mã hoá protein neo A-kinase (AKAP) liên kết nhiều tiểu đơn vị điều hoà của protein kinase A (PKA), được xác định

là protein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của não Các nghiên cứu trên mô hình động vật chỉ ra vai trò của NBEA trong nhiều quá trình của tế bào như cấu tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh qua màng tế bào, củng cố trí nhớ ngắn hạn [20]

1.1.4.3 Sinh học thần kinh

Trong sinh học thần kinh, ASD không còn được xem như sự suy giảm chức năng một vùng não hoặc hệ thống cụ thể, thay vào đó là sự tái tổ hợp chức năng tổng thể của não giai đoạn đầu phát triển Nhiều nghiên cứu đề cập đến hệ thống các hợp chất dẫn truyền thần kinh bao gồm monoamin, neuropeptid, hormon, oxytocin, cortisol có vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh ASD [8]

Hệ thống serotonergic: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ thống

serotonin là nguyên nhân gây ra bệnh tự kỷ ở quá trình phát triển sớm của não

7

bộ Serotonin tham gia vào một số quá trình phát triển như: phân chia tế bào, tăng sinh vỏ não, biệt hoá, tính bền của vỏ não và hình thành khớp thần kinh Serotonin tham gia vào các chức năng khác của não như trí nhớ, khả năng học tập, điều hoà giấc ngủ và tâm trạng Trong quá trình phát triển của não bộ, nồng độ serotonin tăng cao có thể gây mất điểm cuối của hệ serotonergic và tăng sinh dây thần kinh thứ cấp Trẻ em tự kỷ tiếp xúc với thuốc làm tăng serotonic thì mức độ rối loạn tự kỷ ngày càng nặng hơn Các thuốc chống trầm cảm ba vòng ức chế tái hấp thu serotonin có tác dụng tốt trong điều trị hành vi rập khuôn, lặp lại ở ASD [8]

Hệ adrenergic: Hoạt động của hệ adrenergic đóng vai trò quan trọng

đối với sự tập trung, chú ý, loại bỏ các chất kích thích không liên quan, phản ứng lại căng thẳng Một số chức năng trên có thể bị xáo trộn ở bệnh nhân tự

kỷ Các cơ quan thần kinh phó giao cảm nằm ở vị trí nhân lục và hoạt động của hệ liên quan đến sự chú ý, lo âu và ký ức Nhiều chức năng trong số này

bị suy giảm ở bệnh nhân tự kỷ Hoạt động phó giao cảm ở bệnh nhân tự kỷ được đánh giá bằng nồng độ noradrenalin và chất chuyển hoá của nó trong dịch não tuỷ, máu và nước tiểu Nghiên cứu cho thấy nồng độ noradrenalin trong máu ở nhóm tự kỷ cao hơn so với nhóm chứng Thuốc clonidin giảm hoạt tính của noradrenalin đôi khi có hiệu quả trong việc kiểm soát chứng tăng động ở người tự kỷ nhưng lại không có tác dụng đối với các triệu chứng cốt lõi như: giảm tương tác xã hội hay hành vi rập khuôn lặp đi lặp lại [8]

Hệ cholinergic: Vai trò của hệ thống cholinergic trong ASD gần đây

đã được chứng minh Hệ cholinergic được coi là “hệ thống hành động” giúp phát triển khả năng tập trung và hành vi nhất quán Tuy nhiên, rối loạn hệ thống cholinergic ở bệnh tự kỷ vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Một báo cáo cho thấy bất thường trong tế bào thần kinh cholinergic ở não trước bệnh nhân mắc chứng tự kỷ liên quan đến acetylcholin Vì hệ thống cholinergic ảnh hưởng đến việc hoàn thiện và khả năng nhân thức nên nó có thể liên quan đến

8

sự suy giảm nhận thức ở bệnh nhân tự kỷ bao gồm sự tập trung và học tập Các nhà nghiên cứu đã bắt đầu sử dụng các chất ức chế cholinesterase như rivas tigmin, galantamin và donepezil điều trị tự kỷ và đã đem lại những dấu hiệu tích cực [8]

Hệ thống dopaminergic: Hệ thống dopaminergic liên quan đến chức

năng vận động, nhận thức, điều hoà thần kinh nội tiết và tình dục Nghiên cứu

về vai trò của dopamin trong hội chứng tự kỷ bằng việc dùng một số loại thuốc chẹn dopamin như thuốc chống loạn thần có tác dụng cải thiện một số triệu chứng tự kỷ Những loại thuốc này giảm tăng động, tính rập khuôn, hung hăng Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng kích thích hệ dopaminergic gây tăng động và rập khuôn ở ASD [8]

Hệ thống opioid: Một số nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ opioid tăng

cao ở những bệnh nhân tự kỷ Trong thử nghiệm lâm sàng, các thuốc đối kháng opioid như naloxon và naltrexon sử dụng điều trị làm giảm tăng động ở trẻ tự kỷ [8]

Hệ glucocorticoid: Các hành vi liên quan đến ASD như hoạt động và

kích thích quá mức trong thời gian dài làm tăng nồng độ cortisol Một số nghiên cứu báo cáo không có sự khác biệt về nồng độ ACTH hoặc cortisol trong máu của nhóm mắc ASD so với nhóm chứng được kiểm soát Tuy nhiên, một nghiên cứu trên 48 bệnh nhân tự kỷ cho thấy nồng độ cortisol và ACTH cao [8]

Chất dẫn truyền thần kinh acid amin: Glutamat và acid

gamma-aminobutyric (GABA) là hai chất dẫn truyền thần kinh liên quan đến ASD Glutamat là một chất dẫn truyền thần kinh kích thích trong tuỷ sống, trong khi GABA chịu trách nhiệm về tác dụng ức chế Một số nghiên cứu cho rằng trong hội chứng tự kỷ, hệ thống GABAergic bị triệt tiêu dẫn đến sự kích thích quá mức hệ glutamat Ở trẻ em hai tuổi, đây là giai đoạn phát triển quan trọng

và cũng là thời điểm các triệu chứng tự kỷ thường xuất hiện, glutamat hoạt

9

động quá mức có thể gây tổn thương não, co giật Glutamic acid decarboxylase là enzym ức chế tổng hợp GABA được chứng minh là giảm 48-61% ở vùng tiểu não và vùng đỉnh ở não bệnh nhân tự kỷ so với những người bình thường [8]

1.1.5 Tác động của stress oxy hoá đến ASD

Sự mất cân bằng giữa việc tổng hợp các gốc oxy hoá (ROS), nitrogen hoá (ROS) và khả năng ngăn chặn tác động có hại của cơ thể sống bằng cách

sử dụng các hệ thống chống oxy hoá là nguyên nhân gây ra stress oxy hoá Bất thường ở ty thể và stress oxy hoá đóng vai trò quan trọng gây ra quá trình lão hoá và bệnh tật Để chống lại tình trạng này, cơ thể cần một số cơ chế giải độc để loại bỏ các hợp chất độc hại và trung hoà các gốc oxy, nitơ có trong mọi tế bào Superoxide (O2-) có thể được hình thành như một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hoá oxy bình thường Tuy nhiên sự tích tụ superoxide có thể gây hại cho cấu trúc tế bào, do thúc đẩy quá trình oxy hoá Superoxide ngay lập tức được chuyển thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi enzym superoxide dismutases (SODs) Sự hiện diện của H2O2 gây độc cho tế bào vì

nó đi qua màng tế bào và làm hỏng DNA Một số con đường trung hoà đã được phát triển để loại bỏ hydrogen peroxide Trong đó, enzym quan trọng nhất là catalase và glutathion peroxidase (GPx), cả hai đều chuyển hoá H2O2

thành H2O Tripeptid glutathion là một trong những chất giải độc quan trọng nhất, đóng vai trò cơ bản trong việc loại bỏ ROS Ở dạng khử (GSH), glutathion cho H2O2 một điện tử trong phản ứng được xúc tác bởi GPx và chuyển thành dạng oxy hoá GSH có thể được tái tạo lại bởi glutathion reductase, men này sử dụng NAD(P)H làm chất cho điện tử Glutathion cũng

có thể hoạt động như một cơ chất của các enzym khác như GSH transferase, giúp loại bỏ các phân tử độc hại khỏi tế bào Não là một trong những cơ quan chuyển hoá chính của oxy, dó đó một lượng lớn ROS tích tụ ở một số vùng não Vì vậy, não có thể rất nhạy cảm với các gốc ROS [13], [42]

10

Hình 1.1 Các phản ứng khử độc loại ROS trong đó các enzym xúc tác các phản ứng giải độc gồm Fenton (phản ứng Fenton), GPx (glutathion peroxidase), GR (glutathion reductase), MIT (ty thể) và SOD (superoxide dismutase) [13]

Việc sản xuất ROS là đặc điểm chính của rối loạn thần kinh Các gốc oxy hoá đã được chứng minh đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh,

sự tiến triển và mức độ nghiêm trọng của bệnh Alzheimer, Parkinson và Huntington, ASD và chứng xơ cứng teo cơ Ngoài ra, bệnh nhân ASD rất dễ

bị stress oxy hoá và rất dễ bị tổn thương qua trung gian ROS và nhiễm độc tế bào thần kinh Vì vậy, một số nghiên cứu hiện nay đã liên kết ASD với việc tăng nồng độ ROS và giảm khả năng chống oxy hoá, không chỉ ở não mà còn

ở toàn cơ thể Một số báo cáo đã nghiên cứu các phân tử liên quan đến stress oxy hoá trong não của những người bị ASD Đặc biệt nồng độ glutathion bị oxy hoá tăng lên, glutathion giảm thấp, và tỷ lệ oxy hoá khử glutathion giảm dần ở thái dương và tiểu não của bệnh nhân ASD [13], [42]

Các thông số liên quan đến stress oxy hoá ở ngoại vi là những dấu ấn sinh học tiềm năng để chẩn đoán sớm ASD Hoạt động SOD trong hồng cầu ở trẻ ASD cao hơn nhóm chứng Gonzales-Fraguela và các đồng nghiệp đã

11

chứng minh được ở bệnh nhân tự kỷ, nồng độ malonyldialdehyd (MDA), hydroxy-2-deoxyguanosin (8OHdG), GSH giảm Gần đây, vai trò sinh lý bệnh của ROS trong ASD đã được đánh giá trong một nghiên cứu thuần tập ở

8-Ai Cập Mô hình phiên mã của 84 gen liên quan đến stress oxy hoá được đo trong các tế bào máu đơn nhân ở ngoại vi (PBMC) được phân lập từ bệnh nhân tự kỷ và nhóm chứng khoẻ mạnh Tám gen mã hoá cho các protein quan trọng liên quan đến quá trình chuyển hoá ROS (GCLM, SOD2, NCF2, PRNP, PTGS2, TXN và FTH1) giảm ở người tự kỷ Các phân tử này là dấu ấn sinh học hữu ích để chẩn đoán và điều trị bệnh sớm Ngoài ra, rối loạn chức năng

ty thể mãn tính liên quan đến chuỗi vận chuyển điện tử (ETC), phức hợp I và III đã được xác định ở bệnh nhân ASD [13], [42]

Stress oxy hoá là một đặc điểm quan trọng ở bệnh nhân ASD Nhiều nghiên cứu được tiến hành để xem xét liệu các triệu chứng của ASD có được cải thiện sau khi dùng các chất chống oxy hoá hay không Sự biểu hiện của các enzym chống oxy hoá bị giảm trong ASD Ngoài ra, nồng độ các phân tử chống oxy hoá nội sinh giảm ở những người mắc ASD so với những người khoẻ mạnh Vì những lý do này, việc sử dụng các chất chống oxy hoá đưa vào trong cơ thể có thể thúc đẩy hệ thống dọn dẹp các ROS, chống stress oxy hoá

Để việc điều trị ASD hiệu quả, chất chống oxy hoá phải qua được hàng rào máu não và đi được vào nhu mô não, tại đó chúng phải đạt được nồng độ điều trị tối ưu Coenzym Q10 (CoQ10) (ubiquinon) là một đồng yếu tố chống oxy hoá ty thể vượt qua hàng rào máu não Ở trẻ em ASD, việc sử dụng ubiquinol (dạng giảm hoạt tính của coenzym Q10) đã dẫn đến sự cải thiện giao tiếp bằng lời Một phân tử đầy hứa hẹn khác là N-acetylcystein (NAC), một chất chống oxy hoá mạnh giúp tăng nồng độ glutathion NAC được coi là một nguồn cystein quan trọng Tác dụng của NAC đối với các triệu chứng ASD đã được nghiên cứu ở chuột trong mô hình tự kỷ gây ra bởi acid valproic Các nghiên cứu chỉ ra rằng, ở những động vật này, NAC cải thiện hoạt động lặp đi

12

lặp lại theo khuôn mẫu, đồng thời làm giảm mức độ stress oxy hoá bằng cách tăng glutathion và giảm malonidialdehyd so với nhóm đối chứng Các lợi ích khi sử dụng NAC cho trẻ em bị ASD cũng được ghi nhận Đặc biệt, một nghiên cứu cho thấy thuốc được dung nạp tốt và có thể làm giảm đáng kể tình trạng cáu gắt, hành vi rập khuôn, lặp lại Một chất chống oxy hoá khác được thử nghiệm điều trị ASD là vitamin C Khi bổ sung vitamin C cho trẻ em ASD trong 30 tuần, quan sát thấy sự cải thiện đáng kể các hành vi vận động Nhiều thử nghiệm lâm sàng mù đôi, có đối chứng với giả dược sử dụng kết hợp các chất chống oxy hoá như vitamin C, carnosin, kẽm, vitamin B6 và magie đã được thực hiện Điều trị ASD bằng vitamin C liều cao hoặc carnosin hoặc kết hợp vitamin B6 và magie đã cải thiện hành vi của những người bị ASD Ở những bệnh nhân ASD, hàm lượng magie trong máu thấp Việc bổ sung magie làm cải thiện các triệu chứng như kém tập trung và tăng động Ngoài ra, nghiên cứu chỉ ra rằng ở chuột mẹ mang thai tiếp xúc với valproat (VPA bao gồm acid valproic, natri valproat, dinatri valproat), điều trị bằng acid folic liều cao, vitamin E và methionin (nguồn cung cấp methyl) có thể cải thiện hoặc ngăn ngừa hầu hết các tác hại do VPA gây ra ở chuột con Trong não, acid valproic ức chế quá trình peroxyd hoá lipid và glutathion Hormon melatonin cũng được chứng minh hoạt động như một chất chống oxy hoá mạnh Melatonin có thể tìm thấy ở nồng độ cao trong các loại thực vật, trái cây và thực phẩm Vì vậy, trong vài năm gần đây, nhiều liệu pháp dinh dưỡng đã được sử dụng để cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân ASD Do

đó, các chất chống oxy hoá và vitamin được dùng dưới dạng thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm giúp bệnh nhân ASD giảm bớt các triệu chứng bệnh một cách rõ ràng [13], [42]

1.1.6 Điều trị

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu hội chứng tự kỷ Vấn đề phục hồi chức năng cho trẻ tự kỷ chủ yếu vẫn là sự kết hợp giữa bác sỹ Nhi,

13

chuyên viên tâm lý và giáo viên đặc biệt để tiến hành chương trình phát hiện

và can thiệp sớm cho trẻ, đặc biệt là chương trình huấn luyện dành cho phụ huynh, bởi yếu tố gia đình vẫn là quyết định tới kết quả can thiệp [29] Dưới đây là một số thuốc và dược liệu thường được dùng trong điều trị hỗ trợ ASD

1.1.6.1 Điều trị hỗ trợ bằng thuốc hoá dược

Hiện nay chưa có thuốc nào được công nhận để điều trị ASD Các thuốc hoá dược được sử dụng để làm giảm bớt các triệu chứng như khiếm khuyết trong giao tiếp xã hội, các sở thích hoặc hành vi quá mức, tăng động

và rối loạn giấc ngủ Các loại thuốc được thử nghiệm điều trị ASD là thuốc chống loạn thần, thuốc ức chế tái hấp thu serotonin, thuốc chẹn β, naltrexon, lithium, clonidin, hormon tuyến giáp Risperidon và aripiprazol cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD trong nhóm đối chứng thử nghiệm ngẫu nhiên Tuy nhiên, thuốc cũng có thể gây ra tác dụng phụ như an thần, tăng cân, tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khoẻ sau này Methyl phenidat là một loại thuốc kích thích thân não và vỏ não thông qua cơ chế ức chế tái hấp thu norepinephrin và đã có hiệu quả trong việc điều trị chứng tăng động kèm theo giảm chú ý ở bệnh nhân tự kỷ Người

ta cho rằng ASD là một rối loạn chuyển hoá glutamat, do đó hệ thống glutamat cũng là mục tiêu điều trị chiến lược Các loại thuốc như piracetam (cơ chế kích thích tế bào tái tạo AMPA) đã có tác dụng hữu ích trong điều trị ASD Các loại thuốc khác bao gồm lamotrigin (cơ chế ức chế receptor glutamat), dextromethorphan, amantadin (thuốc đối kháng thụ thể NMDA) cũng có hiệu quả điều trị tự kỷ [8]

1.1.6.2 Sử dụng dược liệu trong hỗ trợ điều trị ASD

Kết quả sàng lọc sơ bộ dược liệu để điều trị ASD cho nhiều kết quả đáng hứa hẹn Dưới đây là các loại dược liệu hỗ trợ ASD hiệu quả nhất đã được biết đến trong các nghiên cứu:

14

Bạch quả: Dịch chiết lá bạch quả cho kết quả tốt khi dùng điều trị các

bệnh về tuần hoàn máu não, thần kinh, cải thiện trí nhớ, Alzheimer, rối loạn nhận thức, chống oxy hoá Một nghiên cứu đánh giá tác dụng của cao chiết lá bạch quả thực hiện trên 40 trẻ em bị ảnh hưởng bởi ASD so sánh với nhóm chứng dương được điều trị bằng risperidon trong 10 tuần Liều risperidon từ 1-3,5 mg mỗi ngày (xấp xỉ 0,08 mg/kg), bạch quả liều 80 mg/ngày cho bệnh nhân dưới 30 kg và 120 mg/ngày cho bệnh nhân nặng trên 30 kg Liều bạch quả không đổi trong suốt thời gian điều trị Bạch quả cho thấy tác dụng rõ rệt cải thiện các triệu chứng rối loạn trong ASD so với risperidon [8]

Gừng: Gừng là một loại thảo dược được sử dụng để điều trị co thắt,

đau bụng, say tàu xe, buồn nôn và nôn mửa Gừng có thể hỗ trợ tiêu hoá bằng cách đẩy nhanh thời gian rỗng dạ dày và tăng nhu động thức ăn qua ruột, tạo cảm giác dễ chịu đầy hơi và chướng bụng Sử dụng tối đa 3 gam hoặc nhiều hơn cũng rất an toàn Gừng làm tăng lưu lượng máu não và gần đây được nghiên cứu và đề xuất để điều trị ASD [8]

Rau má: Rau má chứa nhiều vitamin B gồm B1, B2 và B6 có tác dụng

quan trọng với hệ thần kinh Rau má có hoạt tính chống viêm và chống oxy hoá cao Rau má được sử dụng để tăng cường hệ tuần hoàn, hỗ trợ mạch máu

và niêm mạc Rau má được sử dụng để tăng cường trí nhớ, sự tập trung, chức năng não, trí lực, rối loạn thần kinh cơ, mô thần kinh bị chấn thương, động kinh, rụng tóc, vẩy nến Dược liệu cho thầy tiềm năng điều trị bệnh Alzheimer, ASD [8]

Thạch xương bồ: Theo y học cổ truyền, thạch xương bồ sử dụng điều

trị các bệnh liên quan đến trí nhớ Rễ cây tăng tuần hoàn máu lên não, tăng cường trí nhớ, nhận thức đồng thời tăng khả năng giao tiếp Nó có hiệu quả trong việc làm giảm các triệu chứng tự kỷ Thạch xương bồ kết hợp với rau

má làm tăng khả năng tập trung, chú ý và cải thiện trí nhớ Ngoài ra, hai dược liệu này kết hợp với nhau giúp điều trị chứng động kinh [8]

và suy giảm nhận thức, tương đồng với các triệu chứng ASD ở người NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, trí nhớ học tập ở chuột Chuột knockout gen UBE3A cũng cho thấy các tương tác xã hội bị suy giảm, hành vi lặp đi lặp lại…[20]

Bên cạnh đó, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Các mô hình động vật không di truyền của ASD được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hoá học như valproat (VPA), thalidomid và ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA trong khi mang thai làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở trẻ em Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các rủi ro liên quan đến việc sử dụng VPA bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ ASD do VPA có khả năng gây ra bởi các khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ thống limbic, thân não để gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap Mô hình này có thể đại diện tố hơn cho nhiều trường hợp tự kỷ vô căn có nguồn gốc môi trường/biểu sinh so với các mô hình đột biến gen trong các gen liên quan đến tự kỷ [23], [30]

16

1.1.7.2 Các thử nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của thuốc

Để nghiên cứu có hiệu quả tác dụng cải thiện hội chứng rối loạn phổ tự

kỷ trên động vật, người ta thường xây dựng các thử nghiệm tương ứng với các triệu chứng của ASD như sau: Khả năng tương tác cộng đồng, suy giảm trí nhớ, hành động rập khuôn, lặp lại Dưới đây là một số các thử nghiệm điển hình:

- Đánh giá hành vi rập khuôn, lặp lại bằng thử nghiệm tự chải chuốt (Repetitive self-grooming behavior):

Tự chải chuốt hay còn được gọi là tự chải lông, đề cập đến bất kỳ hành vi nào mà chuột thực hiện trên chính nó như gãi đầu, tai, lông Chải chuốt là hành vi chủ yếu của chuột trong các hoạt động hàng ngày của chuột Số lần chải chuốt cao hay thấp bất thường có nguyên nhân từ rối loạn tâm thần kinh Thử nghiệm tự chải chuốt đã được sử dụng để nghiên cứu hành vi của chuột

tự kỷ gây bởi VPA [21], [39]

- Đánh giá hành vi lo âu, sợ hãi bằng thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao (Elevated Plus Maze) và mô hình không gian mở (Open fiels):

Thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao là thử nghiệm kinh điển để sử dụng

trong sàng lọc các thuốc có tác dụng giải lo âu với tiêu chí đánh giá thời gian lưu tại cánh tay hở Nguyên tắc của thử nghiệm dựa trên tâm lý căng thẳng, sợ hãi với những khu vực hở và cao, thái độ thăm dò, khám phá của động vật thí nghiệm với môi trường lạ và mới Thử nghiệm được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu bởi sự thích hợp để đánh giá nhiều hợp chất tác dụng thông qua nhiều hệ receptor như GABA, serotonin, dopamine với độ lặp lại cao [26], [36]

Thử nghiệm không gian mở (Open field) là một phép đo phổ biến để đánh

giá hành vi khám phá và hoạt động ở cả chuột nhắt và chuột cống Về cơ bản, môi trường mở trong thử nghiệm là một khu vực hình chữ nhật được bao

Thử nghiệm sóng siêu âm: Chuột luôn phát ra các sóng siêu âm trong suốt

quá trình phát triển và trưởng thành Những tín hiệu âm thanh này là cơ sở để đánh giá khả năng giao tiếp xã hội ở chuột Các rối loạn về tín hiệu âm thanh

ở chuột thường liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ Số lượng cuộc gọi và các thông số âm thanh phát ra ở chuột con mới sinh mắc tự kỷ bị cô lập khỏi chuột mẹ và các chuột con khác là cơ sở để đánh giá mức độ giao tiếp của chuột con bị tự kỷ [22], [40]

Thử nghiệm ba buồng (three chamber): Thử nghiệm ba buồng đánh giá

khả năng tương tác cộng đồng, quan tâm đến cái mới trong môi trường của loài gặm nhắm trong mô hình rối loạn thần kinh trung ương ở loài gặm nhấm Loài gặm nhấm thường thích dành nhiều thời gian hơn để tương tác với một loài gặm nhấm khác (tính hoà đồng) và khám phá thứ mới lạ hơn là những thứ quen thuộc Dựa theo những khuynh hướng này, thử nghiệm ba buồng có thế xác định xem các loại gặm nhấm có thiếu sót trong tính hoà đồng hoặc khả năng khám phá cái mới hay không [41]

- Đánh giá khả năng nhận thức bằng thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT)

Thử nghiệm nhận diện đồ vật: Thử nghiệm này dùng để đánh giá khả năng

nhận thức, đặc biệt là trí nhớ không gian và khả năng phân biệt đồ vật trong các mô hình động vật gặm nhấm về chứng rối loạn thần kinh trung ương Thử nghiệm này dựa trên xu hướng tự phát của loài gặm nhấm là dành nhiều thời

gian để khám phá đối tướng mới hơn là một đối tượng quen thuộc [9]

18

1.2 Cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)

1.2.1 Tên gọi và vị trí phân loại

Ở Việt Nam, tên khoa học của cây Chè đắng (CĐ) mọc ở vùng núi đá

vôi thuộc tỉnh Cao Bằng và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C J Tseng (với tên đồng nghĩa là Ilex kaushue S Y Hu) Tên Việt Nam là Chè

đắng ( tiếng Tày-Nùng gọi là “Ché khôm”, khổ đinh trà ) [1] Chi Ilex thuộc

họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên khác là Ilicaceae),

bộ Celetrales, phân lớp Rosidae (phân lớp Hoa hồng), ngành Ngọc Lan [1]

độ phát triển của cây chè đắng cao, chiếm 32% diện tích toàn tỉnh [1]

phần hóa học chính trong các loài chè đắng [2]

20

1.2.4 Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng

1.2.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây chè đắng làm thuốc

Cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J Tseng) đã được sử dụng làm thuốc

và nước uống ở miền nam Trung Quốc từ cách đây 2000 năm Theo kinh nghiệm, lá chè đắng được sử dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ; thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, ké[4]o dài tuổi thọ Ngoài ra, lá chè đắng còn được sử dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản,

Trong vài năm qua, chè đắng đã được coi là một loại đồ uống dành cho người ăn kiêng và đang trở nên phổ biến với những cái tên như trà làm đẹp giảm béo, trà lâu năm, trà xanh, trà thanh đạm và đã được báo cáo về chất chống oxy hóa rõ ràng, chống viêm, chuyển hóa lipid, bảo vệ gan và chống ung thư Uống chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trò tích cực trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt, mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực

do các bệnh tim mạch Chè đắng có hoạt tính sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh [3]

1.2.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Dung đã phân lập và xác định được cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid [2] Đây là những hợp chất saponin và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học

từ lá chè đắng thu hái tại Cao Bằng Saponin chè đắng và cao nước chè đắng

có độc tính cấp thấp và được xếp vào loại chế phẩm không xác định được LD50 Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm saponin và cao nước chè đắng đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của thỏ, tế bào

21

gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường Saponin chè đắng không ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống trắng đực Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin chè đắng có tác dụng rút ngắn 8,57% số ngày học tập phản

xạ có điều kiện và kéo dài 69,14% thời gian duy trì phản xạ đã học được so

với lô chuột đối chứng

Tác dụng chống oxy hoá, ức chế cơ gan, chống viêm cấp và mạn tính của chế phẩm saponin toàn phần Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm saponin toàn phần chiết xuất từ là chè đắng có các tác dụng sau: Saponin chè đắng có tác dụng ức chế xơ gan trên mô hình gây tổn thương gan và xơ gan bằng CCl4, tác dụng chống oxy hóa, lợi mật, chống viêm cấp và mạn Nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Mai Huy (2003) cho thấy flavonoid trong lá chè đắng có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan và não chuột do ức chế quá trình POL rất rõ [3] Hoạt tính này tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid Flavonoid toàn phần trong lá chè đắng cũng có hoạt tính thu dọn gốc tự do anion superoxide trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase, khả năng thu dọn gốc tự

do cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid toàn phần

Các tác giả trường Đại học Y Thái Nguyên đã thử tác dụng của dịch chiết lá chè đắng trên chuột bị gây độc bằng dioxin (2,4D) Kết quả cho thấy dịch chiết chè đắng có tác dụng giảm 20-40% sự tác động của 2,4D tới dòng bạch cầu, đồng thời giảm 36% tác hại của 2,4D tới enzym ASAT; ngăn chặn ảnh hưởng của 2,4D tới NST ở mô tủy xương và mô tinh hoàn và dịch chiết lá chè đắng không gây rối loạn NST chuột Saponin chè đắng có thể dùng phòng độc hại cho người làm việc trong môi trường độc hại kéo dài do nghề nghiệp hoặc môi trường [5]

Một số nghiên cứu trên lâm sàng: Tác dụng giải độc và bảo vệ gan của

chè đắng cũng đã được khẳng định khi thử nghiệm trên một số chỉ số sinh học của dân cư sống quanh vùng khai thác thiếc Sơn Dương của Đại học Y Thái

22

Nguyên Đã xác nhận rằng những người sống trong vùng có nguy cơ nhiễm độc kim loại, chất độc, thuốc trừ sâu, có biểu hiện mất ngủ, đau đầu, chóng mặt, tê đầu chi, nhức khớp, da tái nhợt, xét nghiệm thấy rối loạn công thức máu, tăng enzym gan, Sau một thời gian uống nước sắc lá chè đắng đã làm giảm ASAT, ALAT trong huyết thanh, làm ổn định về số lượng và tỷ lệ thành phần bạch cầu Nếu sử dụng thường xuyên có khả năng làm giảm một số triệu chứng cơ năng ở những người có biểu hiện nhiễm độc mạn tính, nâng cao sức

đề kháng [4]

Trong thí nghiệm trên bệnh nhân tăng huyết áp vô căn điều dưỡng tại bệnh viện điều dưỡng và phục hồi chức năng tỉnh Thái Nguyên, Nông Thị Nga và cộng sự đã chứng minh lá chè đắng có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường giấc ngủ sâu và dài, cải thiện một số chỉ tiêu chủ quan như: đau đầu, chóng mặt, choáng váng, tê mỏi chân tay, đau tức ngực trái Lá chè đắng cũng được nghiên cứu có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol máu [4] Nghiên cứu gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Dược lý – Sinh hoá, Viện Dược liệu cũng đã chứng minh saponin trong chè đắng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ/ nhận thức trên mô hình bệnh cảnh Alzheimer thực nghiệm do cắt bỏ thuỳ khứu giác hai bên ( OBX) [12]

1.2.4.3 Các nghiên cứu trên thế giới

- Tác dụng trên lipid và lipoprotein huyết tương

Những kết quả nghiên cứu trên chó thực nghiệm cho thấy dịch chiết lá cây chè đắng có tác dụng hạ huyết áp (HA) rõ rệt Mức độ hạ HA từ từ, thời gian và mức độ hạ HA phụ thuộc vào liều lượng, liều càng cao tác dụng càng mạnh Dịch chiết lá chè đắng có tác dụng làm hạ cholesterol máu, mức độ hạ cholesterol phụ thuộc vào liều lượng thuốc [33]

- Tác dụng bảo vệ hệ mạch

Nhiều loài Ilex đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị các bệnh về động mạch vành Cao nước của Ilex kudingcha làm tăng

23

sự chảy của dòng máu trong động mạch vành trên tim lợn cô lập và làm tăng dòng máu động mạch não trên thỏ được gây mê, kéo dài thời gian sống sót của chuột trong tình trạng thiếu oxy và bảo vệ chuột do thiếu máu cơ tim gây bởi pituitrin Các tác dụng này có lợi trong phòng ngừa và điều trị các bệnh mạch vành và đau thắt ngực [44]

- Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

Kim và cộng sự đã báo cáo rằng chè đắng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt Chè đắng làm giảm đáng kể MCAO/tái tưới máu gây ra do phù nề, thiếu máu thần kinh

và chết tế bào não Sự suy giảm glutathion và quá trình peroxy hóa lipid gây

ra bởi MCAO/tái tưới máu đã được ức chế khi dùng chè đắng Chè đắng làm

ức chế đáng kể sự tăng phosphoryl hóa MAPKs, COX-2 và protein gây chết

tế bào theo chương trình ở chuột Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột của chè đắng có thể do tác dụng ngăn chặn sự chết tế bào, là kết quả của tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm của nó [24]

24

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao ethanol chiết từ toàn lá cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)

2.1.1.1 Nguồn gốc

Chè đắng (ký hiệu mẫu là IK) được thu hái tại Cao Bằng (tháng 6/2018) Dược liệu được PGS.TS Phạm Thị Thanh Huyền (Trưởng khoa Tài Nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu) giám định mẫu và lưu mẫu tại Viện Dược liệu Dược liệu thu hái được sấy khô ở 50oC, đóng gói bảo quản nơi khô ráo để phục vụ nghiên cứu

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Mẫu cao chiết sử dụng trong nghiên cứu là sản phẩm của tiểu dự án First: “Hợp tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng”, do ngân hàng thế giới tài trợ, được nhóm nghiên cứu thuộc khoa Hoá Thực vật – Viện Dược liệu điều chế Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như sau: Lá chè đắng được sấy khô, xay thô, ngâm với cồn 80% theo tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/10 trong

48 giờ Lọc rút lấy dịch trong Bã dược liệu được ngâm tiếp với cồn thêm 2 lần, mỗi lần 24 giờ Dịch chiết của 3 lần được cô đến cao lỏng 1:2; sau đó thêm nước theo tỷ lệ 4/1, để qua đêm, lọc lấy phần tủa, sấy chân không ở nhiệt độ 60˚C cho đến đạt hàm ẩm < 5% Hàm lượng saponin trong cao là 7,41%

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng mang thai 12 - 13 ngày, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Chuột được nuôi ổn định trong chuồng riêng, trong điều kiện phòng thí nghiệm nhiệt độ 25˚ ± 1˚C, chu kỳ sáng và tối là 12/12, thức ăn và nước uống được cung cấp đầy đủ Chuột mẹ được đánh dấu theo lô Chuột con sinh ra

Bảng 2.1: Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

1 Dimethyl sulfoxit (DMSO) Trung Quốc

2-picrylhydrazyl (DPPH)

Mỹ

5 Natri chlorid (NaCl) 0,9% Việt Nam

6 Natri valproat Sigma - Aldrich, Mỹ

7 Nicotinamid adenin dinucleotid

26

Trang thiết bị

Bảng 2.2: Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

1 Cân phân tích, cân kỹ thuật Mettler Toledo, Mỹ

2 Hệ thống phân tích hành vi Stoelting Co., Wood Dale, IL

3 Máy đọc ELISA (elx808) Bio Teck Instrument, Mỹ

4 Máy đo cường độ ánh sáng Đức

6 Máy nghiền đồng thể Velp - Italia

Dụng cụ phục vụ nghiên cứu:

Bảng 2.3: Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

4 Đồ vật sử dụng trong thử

nghiệm

Việt Nam

9 Ống falcon,đầu côn các loại

eppendoff

Trung Quốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

27

Thiết kế nghiên cứu

Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu 2.3.1 Gây mô hình chuột tự kỷ bằng muối natri valproat (VPA)

Phương pháp tiến hành

Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ và cơ chế liên quan đến tác dụng

chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)

Đánh giá tác dụng cải thiện

hội chứng tự kỷ của cao chiết

nghiệm thử nghiệm sóng siêu

âm và thử nghiệm ba buồng

1 Đánh giá hoạt tính dọn gốc DPPH

2 Đánh giá tác dụng giải lo

âu bằng thử nghiệm mê lộ chữ

thập

2 Đánh giá hoạt tính dọn gốc superoxide

28

Qua tham khảo tài liệu [23], [31] gây mô hình chuột nhắt trắng tự kỷ thực nghiệm bằng natri valproat và điều trị cao chiết lá chè đắng Chuột mang thai 12 – 13 ngày được tiêm natri valproat (liều 500 mg/kg; đường tiêm phúc mạc) Chuột con sau khi sinh được chia làm 4 lô nghiên cứu:

Lô 1 (n=22): chứng sinh lý, chuột con được sinh bởi chuột mẹ khoẻ mạnh,

được uống nước cất từ 14 ngày tuổi cho đến khi hết quá trình thí nghiệm

Lô 2 (n=18): chứng bệnh lý, chuột con được sinh ra bởi chuột mẹ mang thai

12 – 13 ngày tuổi bị tiêm natri valproat (500 mg/kg) và được uống nước cất từ

14 ngày tuổi cho đến hết quá trình thí nghiệm

Lô 3 (n=18) và lô 4 (n=16): lô chuột tự kỷ được điều trị cao chiết lá chè đắng,

chuột con được sinh ra bởi chuột mẹ mang thai 12 – 13 ngày tuổi bị tiêm natri valproat (500 mg/kg) và được uống cao chiết lá chè đắng liều 270 mg/kg và

540 mg/kg, bắt đầu từ 14 ngày tuổi (13 ngày đầu, điều trị cho chuột con bằng cách cho chuột mẹ uống cao chiết lá chè đắng liều 270 mg/kg và 540 mg/kg)

Sơ đồ thiết kế thực nghiệm như sau:

Chuột con

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thực nghiệm