Báo cáo thực hành ứng dụng CNSH trong nuôi trồng thủy sản

BÁO CÁO THỰC HÀNH ỨNG DỤNG CNSH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thành Luân Lớp : 16DSHA2 Nhóm 2 Sinh viên thực hiện : Trần Trung Cương 161110078 Trần Quang 1611100041 Nguyễn Thị Mỹ Huyền 1611100096 Lê Ngọc Quân 161110065 Tp.Hồ Chí Minh, 6/12/2019 BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VIBRIO TRONG TÔM ẤU TRÙNG VÀ TÔM THƯƠNG PHẨM 1.MỤC ĐÍCH,YÊU CẦU _ Mục đích: Giúp sinh viên tiếp cận phương pháp phân lập, mô tả , đánh giá sự hiện diện của các loài Vibrio spp trong tôm ấu trùng thông qua phương pháp pha loãng mẫu rồi đếm trực tiếp. Xác định được số lượng Vibrio spp trong tôm ấu trùng và phân lập được chủng vi sinh vật mình mong muốn , tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu. _ Yêu cầu:  Định lượng số vi khuẩn tồn tại trong mẫu tôm ấu trùng  Đánh giá sự nhiễm Vibrio ở mẫu khảo sát  Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS 2. KHÁI NIỆM, NGUYÊN TẮC _ Khái niệm: - Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio : Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh, tất cả chúng đều yếm khí tùy tiện và hầu hết là oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7 diisopropyl pteridine phosphat (O/129). Cơ bản chúng sống trong môi trường nước biển và cửa sông (vùng nước lợ.Tôm có sự thay đổi màu sắc và chuyển sang màu hồng nhợt nhạt khi cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio gây bệnh phát. - Phương pháp định lượng là các phương pháp để xác định sô lượng vi sinh vật trong mẫu - Các phương pháp định lượng: + Phương pháp đếm trực tiếp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH ỨNG DỤNG CNSH TRONG NUÔI

Lê Ngọc Quân 161110065

Tp.Hồ Chí Minh, 6/12/2019

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VIBRIO TRONG TÔM ẤU

TRÙNG VÀ TÔM THƯƠNG PHẨM

1.MỤC ĐÍCH,YÊU CẦU

_ Mục đích:

Giúp sinh viên tiếp cận phương pháp phân lập, mô tả , đánh giá sự hiện diện

của các loài Vibrio spp trong tôm ấu trùng thông qua phương pháp pha loãng

mẫu rồi đếm trực tiếp

Xác định được số lượng Vibrio spp trong tôm ấu trùng và phân lập được chủng

vi sinh vật mình mong muốn , tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu

_ Yêu cầu:

 Định lượng số vi khuẩn tồn tại trong mẫu tôm ấu trùng

 Đánh giá sự nhiễm Vibrio ở mẫu khảo sát

 Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS

2 KHÁI NIỆM, NGUYÊN TẮC

và chuyển sang màu hồng nhợt nhạt khi cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio gâybệnh phát

- Phương pháp định lượng là các phương pháp để xác định sô lượng vi sinhvật trong mẫu

- Các phương pháp định lượng:

+ Phương pháp đếm trực tiếp

+ Phương pháp đếm khuẩn lạc

+ Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc

+ Phương pháp đo độ đục

+ Phương pháp MPN ( most probable number

- Đơn vị tính: tế bào /ml ( CFU/ML hay MPN/ML), tê bào /g ( CFU/G hayMPN/G)

Tên bệnh Giai đoạn tôm Vi khuẩn gây bệnh Tác hại

Bệnh phát sáng ấu trùng, giống V.parahaemolyticus

V.harveyi Gây chết hàng loạtBệnh đỏ dọc thân Ấu trùng, giống V.alginolyticus Gây chết rải rácBệnh đỏ thân Tôm thịt Vibrio spp Gây chết rải rácBệnh vỏ hay ăn

mòn

kitin, đen mang

ở các giai đoạn của

tôm cua

Vibrio spp., Pseudomonas spp., Proteus sp.

chết rải rác, hàng loạt

Nhiễm khuẩn ở cá Cá nuôi ao, lồng Vibrio spp chết rải rác

Bảng : Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm

3 NGUYÊN TẮC

_ Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau,thể hiện qua sự lên men của sucrose Ví dụ: V.cholerae và V.alginolyticus sinh ra các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose ,acid được hình thành.Ngược lại V.parahaemolyticus và V.vulniticus luôn sinh ra khuẩn lạc màu xanh

do thiếu lên men sucrose Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfide _ Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS

Nồng độ thiosulfate và citrate cao và độ kiềm mạnh của môi trường này có thể

ức chế sự phát triển của Enterobacteriaceae Muối mật và cholate ức chế chủ yếuenterococci Các chủng dương tính với sucrose có thể phát triển để hình thành

các khuẩn lạc màu vàng do sự hiện diện của chất chỉ thị

thymolblue-bromothymol màu xanh thay đổi thành màu vàng, khi axit được hình thành, ngay cả trong môi trường kiềm mạnh này

Khuẩn lạc mộc trên môi trường TCBS agar

_ Thành phần môi trường thạch TCBS (g / lít)

Peptone from casein 5.0; peptone from meat 5.0; yeast extract 5.0; sodium citrate 10.0; sodium thiosulfate 10.0; ox bile 5.0; sodium cholate 3.0; sucrose 20.0; sodium chloride 10.0; iron(III) citrate 1.0; thymol blue 0.04; bromothymol blue 0.04; agar-agar 14.0

- Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Sau đó, bỏ dịch và thu sinh khối

- Thực hiện đến khi nào sinh khối đạt 0,001g tướng ứng với 109 cfu/ml

- Tiến hành pha loãng xuống mật độ 108,107,106,105,…

- Tại các nồng độ pha loãng 107,106,105 tiến hành cấy trang cho đến khi

bề mặt đĩa khô

- Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

- Đọc kết quả sau 24 giờ

6.KẾT QUẢ

- Nếu vi sinh vật trong mẫu được pha loãng tốt, vi khuẩn sẽ hình thànhcác khuẩn lạc riêng rẽ Sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc vàtính toán số lượng trong mẫu

- Sau 48 giờ đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả

DILUTION

BOTTLE

mlPLATED DILUTION

DILUTIONFACTOR

NUMBER OFCONLONIESb(1:10,000) 1,0 1:10,000 10^-1 >300 

c(1:1,000,000) 1,0 1:1,000,000 10^-3 >300 c(1:1,000,000) 0,1 1:10,000,000 10^-4 7 

- Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy

- Các đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc được chọn để đếm Từ số đếm, số lượng trong 1 mL môi trường ban đầu được tính toán

7.KẾT LUẬN

- Vi khuẩn Vibrio sử dụng đường rất nhiều ở nồng độ 10-1,10-2,10-3,10-4

- Số lượng vi khuẩn hình thành trên đĩa chỉ đếm được nồng độ 10-2, 10-4,

10-5 nhưng ở nồng độ 10-3, 10-1 số lượng vi khuẩn lớn hơn 300 khuẩn lạc

BÀI 2 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN

VIBRIO

1 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

- Khảo sát các phản ứng sinh hóa của ba chủng : V.parahemolyticus (xanh),

V.fluvialis (vàng), V.vulnificus (xanh), thông qua các phản ứng:

- Bảng bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân biệt các loài

vi sinh vật gây bệnh thường gặp Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thịmột trị số là tỷ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tínhtheo thống kê ở một loài vi sinh vật

- Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động ở mức 50% không có giá trịtrong việc định danh

- Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị qui ước bằng các ký hiệu như:

- Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử cóđộc tính cao này trong tế bào.

- Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọtkhí

2.2.2 Thử nghiệm bằng phép thử oxidase

- Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn

- Hệ thống cytochrom có ở vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy tiện hệ thốngnày hoạt động như chất liên kết trong quá trình hô hấp, vận chuyển H+ →O2 tạo thành nước

- Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p – phenylenediaminedihydrochloride

2.2.3 Thử nghiệm ONPG

- Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp của 2 enzyme làgalactosidase có vai trò xúc tác thủy phân lactose và permease có vai tròvận chuyển lactose vào bên trong tế bào Hoạt tính của enzymegalactosidase có thể được xác định vào một cơ chất tổng hợp là O-nitrophenyl-D-galactopyranoside Sự thủy phân cơ chất đường này bỏigalactosidase sẽ phóng thích O-nitrophenol có màu vàng

2.2.4 Khả năng sử dụng Na+

- Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+

kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát

triển trong môi trường không muối NaCl, thử nghiệm giúp xem khả năngsông scuar Vibrio trong môi trường bổ sung 0%, 6% Nacl

2.2.5 Thử nghiệm MR-VP

- Thử nghiệm Methyl red: Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất

và duy trì các sản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên menglucose Thử nghiệm phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định

sự khác nhau trong con đường chuyển hóa glucose Thử nghiệm này đươctiến hành trong thời gian nuôi 2-5 ngày ở 37oC

- Thử nghiệm Voges Proskauer: Nhằm phát hiện khả năng vi sinh vật tạothành sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetonin) trong quátrình lên men glucose Để phát hiện acetonin trong môi trường nuôi cấy visinh vật, α-naphtol được sử dụng như một thuốc thử trong môi trườngkiềm mạnh được tạo ra KOH 40% được co vào môi trường thử nghiệm.2.2.6 Thử nghiệm Lysine decarboxylase

- Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cácenzyme khử nhóm carboxyl từ lysin, qua đó chúng làm kiềm môi trườngnuôi cấy

3 NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ

3.1 Nguyên liệu

 Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus

(xanh) đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS

Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus

(xanh) đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS tại phòng thínghiệm của Viện Khoa học ứng dụng HUTECH

4.2 Thử nghiệm bằng phép thử oxidase

- Dùng que cấy vô trùng lấy 3 khuẩn lạc V.parahemolyticus, V.fluvialis và

V.vulnificus đặt lên giấy đã thấm với thuốc thử oxidase

(N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)

4.3 Thử nghiệm ONPG

- Khuẩn lạc (sau 24 giờ nuôi trong môi trường có lactose) được cấy vàoống nghiệm chứa nước muối sinh lý Sau đó, cho đĩa giấy ONPG vào ốngnghiệm trên và ủ ở 37 trong 24 giờ Phản ứng được cho là dương tính℃khi có chỉ thị màu vàng

Trong đó: V.flu : V.fluvialis  (+)

V.para: V.parahemolyticus(-) V.vu: V.vulnificus(-)

4.4 Khả năng sử dụng Na+

- Khảo sát nồng độ NaCl 0% và NaCl 6% Môi trường được cấy và ủ ở

37 trong 18 - 24 giờ trong bể ổn nhiệt lắc Kết quả dương tính được xác℃định bởi độ đục của mội trường

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (+)

V.para: V.parahemolyticus(+) V.vu: V.vulnificus(-)

Môi trường TSB+NaCl 6%

Môi trường TSB+Nacl 0%

Trong đó từ trái qua: V.flu : V.fluvialis (+)

(+): màu đỏ trên môi trường

(-): mặt môi trường không đổi màu

Thử nghiệm với Methyl red

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (+)

V.para: V.parahemolyticus(+) V.vu: V.vulnificus(-)

Thử nghiệm Voges Proskauer

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)

V.para: V.parahemolyticus(-) V.vu: V.vulnificus(+)

4.6 Thử nghiệm Lysine decarboxylase

- Khuẩn lạc (sau 24 giờ) được cấy vào môi trường LDC lỏng và ủ ở 37℃trong 24 - 48 giờ Phản ứng dương tính được chỉ định bởi một màu tímđậm trong suốt môi trường, trong khi đó phản ứng âm tính được chỉ ra bởimàu vàng trong suốt môi trường (Choopun et al., 2002)

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)

V.para: V.parahemolyticus(+) V.vu: V.vulnificus(+)

4.7 Acid from D.cellobiose

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)

V.para: V.parahemolyticus(-) V.vu: V.vulnificus(-)

1 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

1.1Mục đích

Khảo sát kháng sinh đồ để biết được độ nhạy của các chất kháng sinh đốivới các chủng gây bệnh Qua đó có thể biết cách sử dụng các loại kháng sinhnào tốt nhất để điều trị bệnh nhiễm khuẩn, cải thiện, nâng cao hiệu quả trongnuôi trồng thủy sản

1.2 Yêu cầu

Khảo sát kháng sinh đồ của ba chủng : V.parahemolyticus (xanh),

V.fluvialis (vàng), V.vulnificus (xanh) bằng 6 loại kháng sinh là: Ampicillin,

Clindamycin, Erythromycin, Florfenicol, Penicillin, Streptomycin trên môitrường Mueller-Hinton Agar ( MHA)

2 KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC

2.1 Khái niệm

- Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar ( MHA) là môi trườngtrong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật vớikháng sinh Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sựthuỷ phân tinh bột Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch độngvật, casamino acid và tinh bột giúp cho hầu hết các vi sinh vật pháttriển

 Florfenicol (FL) là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol,

là kháng sinh tổng hợp phổ rộng, có hiệu quả trong điều trị cácbệnh do vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

 Streptomycin (Str) là kháng sinh phổ rộng có tác dụng chủ yếu trên

vi khuẩn gram âm, còn trên vi khuẩn gram dương tác dụng kémhơn penicillin

 Penicillin (Pn) là một loại kháng sinh thuộc nhóm thuốc trị ký sinhtrùng, chống nhiễm khuẩn, kháng virus và kháng nấm

2.2 Nguyên tắc

- Thực hiện bằng cách trải đều một chủng sinh vi vật thử nghiệm đãđược chuẩn hóa trên môi trường MHA, sau đó các đĩa giấy có chứanồng độ cụ thể của một loại kháng sinh được đặt trên bề mặt đĩathạch Nếu có tác nhân ức chế hoặc giết chết sinh vật thử nghiệm,

sẽ có một khu vực xung quanh đĩa nơi không có sự tăng trưởng xảy

ra được gọi là vùng ức chế Dựa vào đường kính vùng ức chế, mức

độ nhạy cảm có thể phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạycảm), I (intermediate - kháng trung gian), R (resistant - kháng)

3 NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ

3.1 Nguyên liệu

- Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus

(xanh) đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS

- 6 loại đĩa kháng sinh gồm: Ampicillin, Clindamycin, Erythromycin,Florfenicol, Penicillin, Streptomycin

- Tăng sinh ba chủng V.parahemolyticus, V.fluvialis và V.vulnificus

→ đánh dấu nhãn tên của sinh vật khảo sát chuẩn bị mật độ huyềnph→ hút 1ml dung dịch tăng sinh vào eppendofl rồi ly tâm 4000vòng/10 phút → bỏ dịch thu sinh khối → hút 100μl nước muối sinh

lý → lắc đều

- Cấy chủng vi khuẩn lên bề mặt của môi trường MHA bằng tămbông Phủ đều bề mặt thạch bằng cách quét theo ba hướng → đểđĩa khô trước khi gắn đĩa kháng sinh

- Dùng kẹp được khử trùng gắp đĩa kháng sinh Đặt nhẹ từng đĩa trênmôi trường thạch đã được chấm sẵn Mỗi đĩa môi trường khảo sát 3loại đĩa kháng sinh → ủ đĩa trong 16-18giờ ở 37 → đọc kết quả.℃

- Dùng thước kẻ đặt lên mặt đáy của đĩa thạch, đo đường kính vùng

ức chế hoàn toàn, tính theo mm Sau đó so sánh kết quả với tiêuchuẩn quy định của CLSI

Hình 3.1 V.fluvialis và V.vulnificus sau khi đặt 6 loại kháng sinh

5 KẾT QUẢ

24-30 Erythromycin

22-30 Florfenicol

22-28 Penicillin

26-37 Streptomycin

23-25

BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN

LACTIC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH1.MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

Mục đích:

_ Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Vibrio spp.

_ Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic

_ Phân lập, tăng sinh các vi khuẩn hữu ích ứng dụng trong phòng bệnh thủy sản

từ nhiều nguồn khác nhau

Yêu cầu: Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn bằng phương pháp sọc chéo

2 KHÁI NIỆM

_ Khái niệm:

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương và lên men carbohydrate khi cóhoặc không có oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic Nhóm vi khuẩn

này còn sản xuất các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sảnphẩm được lên men Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa và gầnđây chúng được phân lập từ các sản phẩm lên men như: thịt, các sản phẩm từsữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men, hệ tiêu hóa các loài động vật thủysản.

Vi khuẩn lactic phát triển ở nhiệt độ khác nhau nhưng hầu hết chúng phát triển ởnhiệt độ tối ưu 20-30 độ C , một số loài ưa nhiệt phát triển ở nhệt độ cao hơn 50-

55 độ C, vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao,pH tối ưu cho hầuhết các vi khuẩn lactic (pH=7.0)

Hình 4.1 Hình thái của vi khuẩn lactic _ Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic

Tác động kháng lại vi sinh vật của vi khuẩn lactic chủ yếu là do acid lactic vàcác sản phẩm acid hữu cơ Chúng làm giảm pH của môi trường sinh sống của visinh vật khác Ở pH thấp thì các acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan vàkhuếch tán qua màng tế bào chất

Hầu hết các bacteriocins của vi khuẩn LAB là cation nhỏ (<10 kDa), ổn địnhnhiệt, lưỡng tính và peptide thấm qua màng Zacharof và Lovitt (2012) đã chiacác vi khuẩn LAB thành ba nhóm chính.

Nhóm I (Class I), lantibiotics, là nhóm của các chất peptide nhỏ (< 5 kDa) gồmpolycyclic thioether amino acids, lanthionine, hoặc methyl lanthionine, và cácamino acids không bão hòa như dehydroalanine và 2-aminoisobutyric acid.Nhóm II (Class II), non-lantibiotics, các chất có kích thước nhỏ (<10 kDa) tươngđối ổn định nhiệt, non-lanthionine chứa peptide hoạt động màng

Nhóm III (Class III) Large Bacteriocins, bao gồm các protein không bền nhiệt,

có trọng lượng phân tử lớn (> 30 kDa), ví dụ, helveticin I được sản xuất bởi

Lactobacillus helveticus và enterolysin do Enterococcus faecium sản xuất.

_ Các phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối

với vi khuẩn Vibrio spp.

Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar (MHA) được sử dụng để kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của vi khuẩn hữu ích Với mục đích này, tác dụng ức chế và

đối kháng của vi khuẩn hữu ích với 2 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus và V.

vulnificus được xác định theo các phương pháp: Phương pháp khuếch tán đĩa

thạch và phương pháp khuếch tán giếng Tất cả các xét nghiệm được lặp lại hai lần

 Phương pháp khuếch tán đĩa