Chiết xuất, phân lập và đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro của một số hợp chất từ phần trên mặt đất cây cỏ mật gấu ( isodon lophanthoides (buch ham ex d don) h hara), họ bạc hà lamiaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HÀ THÙY TRANG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ THÙY TRANG

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ THÙY TRANG

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA

MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT

CÂY CỎ MẬT GẤU (Isodon lophanthoides Ham ex D.Don) H.Hara), HỌ BẠC HÀ - Lamiaceae

(Buch.-LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Nơi thực hiện đề tài : Trường Đại học Dược Hà Nội

Viện Dược liệu

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Đỗ Thị Hà

2 PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các Thầy Cô, các nhà khoa học của Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn

bè

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Đỗ Thị Hà và PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn, những người thầy đã luôn dành

thời gian, tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật và Khoa Hoá Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu và nhà trường Trường Cao đẳng Y tế Hưng Yên đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia học tập

Luận văn này được hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài Nghị định thư Việt

Nam-Hàn Quốc “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam”, hợp đồng NCKH số 09/2020/HĐ-NĐT ký

ngày 09/9/2020”, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Bộ KHCN đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn này

Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 4 năm 2021

Học viên

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1:TỔNG QUAN 3

1.1 Thực vật 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Sinh thái và phân bố 5

1.2 Thành phần hóa học 5

1.2.1 Diterpenoid 5

1.2.2 Phenolic đơn giản 12

1.2.3 Triterpenoid và steroid 13

1.2.4 Flavonoid 14

1.2.5 Dihydrobenzofuran lignan 16

1.3 Tác dụng sinh học 17

1.3.1 Tác dụng chống ung thư 17

1.3.2 Tác dụng chống virus 18

1.3.3 Tác dụng bảo vệ gan 19

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn 20

1.3.5 Tác dụng chống viêm 20

1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa 21

1.3.7 Tác dụng khác 21

1.4 Tính vị và công dụng 22

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Dung môi, hóa chất và dòng tế bào 24

2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 24

2.5.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp

chất phân lập 25

2.4.2 Đánh giá tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư in vitro 27

2.6 Thiết kế nghiên cứu 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Chiết xuất 32

3.2 Phân lập các hợp chất 32

3.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất 35

3.3.1 Hợp chất IL1 35

3.3.2 Hợp chất IL2 37

3.3.3 Hợp chất IL3 38

3.3.4 Hợp chất IL4 40

3.3.5 Hợp chất IL5 41

3.4 Tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư của cao chiết và hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu 43

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46

4.1 Về đối tượng nghiên cứu 46

4.2 Về các hợp chất phân lập được 48

4.3 Về hoạt tính kháng ung thư in vitro của các phân đoạn và các chất phân lập được 51

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Tên viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

1H-NMR Proton magnetic resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhânproton

13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Môi trường nuôi cấy tế bào

DMSO Dimethyl sulfoxide

EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid Acid ethylendiamin

tetraacetic EtOAc Ethyl acetate

HbsAg Hepatitis B surface antigen Kháng nguyên bề mặt của

virus viêm gan B HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan siêu vi B HPLC High-performance liquid

IC50 Inhibitory concentration of 50% Nồng độ ức chế 50%

IFN-γ Gamma interferon

MeOH Methanol

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

SOD Superoxid dismutase

SGPT Serum glutamic-pyruvic

transaminase TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Tế bào ung thư vú

A549 Human alveolar epithelial cells Tế bào ung thư phổi

HepG2 Human liver cancer cell line Tế bào ung thư gan

HL60 Human leukaemia 60 Tế bào ung thư máu ở

người

Tên hình Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của các diterpenoid (1-73) phân lập từ Cỏ mật gấu 11

Hình 1.2 Cấu trúc của các acid phenolic phân lập từ Cỏ mật gấu (74 – 89) 13

Hình 1.3 Cấu trúc của các triterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu (90 – 99) 14

Hình 1.4 Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ Cỏ mật gấu (100 – 108) 15

Hình 1.5 Cấu trúc của các dihydrobenzofuran lignan phân lập từ Cỏ mật gấu (109 – 114) 17

Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu (Cỏ mật gấu - Isodon lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara var lophanthoides) 23

Hình 2.2 Phản ứng nhuộm màu tế bào sống bằng phương pháp MTT 28

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 31

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ Cỏ mật gấu 34

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao EtOAc của Cỏ mật gấu 35

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất IL1 36

Hình 3.4 Cấu trúc của hợp chất IL2 37

Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất IL3 39

Hình 3.6 Cấu trúc của hợp chất IL4 41

Hình 3.7 Cấu trúc của hợp chất IL5 43

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Đặc điểm một số thứ của loài Isodon lophanthoides

(Buchanan-Hamilton ex D.Don) H Hara 4

Bảng 1.2 Các hợp chất diterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu 5

Bảng 1.3 Các hợp chất phenolic phân lập từ Cỏ mật gấu 12

Bảng 1.4 Các hợp chất triterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu 13

Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid phân lập từ Cỏ mật gấu 15

Bảng 1.6 Các hợpchất dihydrobenzofuran lignan phân lập từ Cỏ mật gấu 16

Bảng 3.1 Dữliệu phổ của hợp chất IL1 và acid protocatechuic 36

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất IL2 và acid 4-hydroxybenzoic 37

Bảng 3 3 Dữ liệu phổ của hợp chất IL3 và coetsoidin B 38

Bảng 3 4 Dữ liệu phổ của hợp chất IL4 và coetsoidin A 40

Bảng 3 5 Dữ liệu phổ của hợp chất IL5 và acid rosmarinic 42

Bảng 3.6 Hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư của các cao chiết từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu thể hiện qua giá trị IC50 (μg/ml) 44

Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu thể hiện qua giá trị IC50 (μM) 44

Bảng 4.1 Đặc điểm thực vật của 2 loài I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara và I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara var lophanthoides 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, bệnh ung thư đã trở thành vấn đề sức khỏe hàng đầu của con người trên toàn thế giới Ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau bệnh tim mạch và tỷ lệ mắc có xu hướng tăng nhanh ở hầu hết các nước Các bệnh ung thư rất đa dạng và nguy hiểm nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời Trong khi đó, các thuốc điều trị ung thư hiện nay trên thị trường còn nhiều tác dụng phụ và giá thành tương đối cao tạo ra những gánh nặng về tâm

lý và vật chất cho người bệnh và xã hội Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển thuốc mới có tác dụng kháng ung thư với giá thành hợp lý, ít tác dụng không mong muốn là vấn đề rất cấp thiết hiện nay

Việt Nam có nền y học cổ truyền lâu đời với nguồn dược liệu vô cùng phong phú hứa hẹn sẽ là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc nghiên cứu phát triển thuốc mới nói chung và thuốc điều trị ung thư nói riêng Cỏ mật gấu

(Isodon lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara) hay còn gọi là Hùng

đởm thảo, Nhị rối vằn, Đằng nha sọc Cây phân bố rải rác ở một số tỉnh miền núi như Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên và Bắc Kạn [1] Phần trên mặt đất của cây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị vàng da cấp tính, viêm túi mật, viêm ruột, kiết lỵ và chấn thương; chúng cũng được sử dụng làm đồ uống hàng ngày giúp tăng cường sức khỏe Cao chiết

nước phần trên mặt đất của I lophanthoides var graciliflorus có tác dụng gây

độc tế bào ung thư biểu mô tế bào ở người [28] Diterpenoid là thành phần

chính của I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara có tác dụng kháng

khuẩn [29], [30], [72], kháng ung thư [72], tác dụng chống lao [72], chống sốt rét [72], chống oxy hóa [30], [72]

Mặc dù cây Cỏ mật gấu đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, tuy nhiên, theo tra cứu các tài liệu khoa học, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư của cây Cỏ mật gấu tại Việt Nam hiện chưa

có Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Chiết xuất, phân lập và đánh

giá hoạt tính kháng ung thư in vitro của một số hợp chất từ phần trên mặt đất cây Cỏ mật gấu Isodon lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don)

H.Hara), họ Bạc hà – Lamiaceae” với 2 mục tiêu chính như sau:

1 Chiết xuất, phân lập 5 hợp chất và xác định cấu trúc của các hợp chất từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu

2 Đánh giá hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư in vitro của cao

chiết ethanol 70%, các cao phân đoạn và một số hợp chất từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu

PHẦN 1:TỔNG QUAN 1.1 Thực vật

Cỏ mật gấu còn có tên gọi khác là Nhị rối vằn, Đằng nha sọc, có tên

khoa học là Isodon lophanthoides (Buchanan-Hamilton ex D.Don) H Hara, tên đồng nghĩa Hyssopus lophanthoides D.Don, Isodon striatus (Benth) Kudo, Plectranthus striatus Benth [1]

Theo y học dân gian Trung Quốc dược liệu có tên gọi là “Xihuangcao”

để chỉ 5 thứ dưới loài gồm: I lophanthoides var lophanthoides; I

lophanthoides var gerardianus; I lophanthoides var graciliflorus; I lophanthoides var micranthus và I serra (Maxim.) Hara [29], [30]

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009) [62], loài

Isodon lophanthoides (Buchanan-Hamilton ex D.Don) H Hara thuộc:

Giới: Thực vật bậc cao (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae) Bộ: Hoa môi (Lamiales) Họ: Bạc hà (Lamiaceae)

Chi: Isodon (D.Don) Hara

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, cao 0,15 – 1m, phân nhánh ít hay nhiều Thân mọc đứng hoặc mọc bò, có 4 cạnh rõ có lông nhất là ở phần non Lá mọc đối, không cuống hoặc có cuống, hình trứng rộng, dài 1,5 – 8 cm, rộng 0,5 – 5 cm, gốc bằng hoặc hình nêm, đầu nhọn hoặc tù, mép khía răng hoặc khía tai bèo, hai mặt có lông tơ, cuống lá dài 0,5 – 2 cm

Cụm hoa mọc ở ngọn hình chùy dài hơn 20 cm, lá bắc rất nhỏ, rụng sớm: hoa nhỏ có cuống dài, màu trắng đốm hồng: đài hình chuông, 5 răng gần

bằng nhau và nhọn, có lông tơ và hạch nhỏ màu vàng; tràng dài gấp đôi đài,

có ống hình trụ, có lông ở mặt ngoài, phiến chia hai môi, màu trắng có chấm hồng, môi trên chẻ 4 thùy ngắn bằng nhau, môi dưới nguyên dài hơn môi trên: nhị 4, thò ra ngoài tràng, 2 dài, 2 ngắn; bầu có vòi chẻ đôi

Quả bế tự thuôn hình bầu dục, nhẵn nâu

Mùa hoa: tháng 8-10; mùa quả tháng 11-12 [1]

Một số thứ dưới loài Isodon lophanthoides (Buchanan-Hamilton ex

D.Don) H Hara có đặc điểm riêng như sau (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Đặc điểm một số thứ của loài Isodon lophanthoides

(Buchanan-Hamilton ex D.Don) H Hara

[30]

1.1.3 Sinh thái và phân bố

Cỏ mật gấu là cây đặc biệt ưa ẩm, có thể chịu bóng và hơi ưa sáng Cây thường mọc nơi đất ẩm, có nhiều mùn ở ven rừng núi đá vôi, gần bờ suối, ven đường đi trong rừng và đôi khi thấy ở cả các hốc mùn và kẽ đá Là cây sống 1 năm (cá biệt là 2 năm), nên cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân hay đầu mùa hè Cây sinh trưởng nhanh trong mùa hè, sau khi quả già sẽ tàn lụi vào giữa mùa đông Cây gieo trồng được bằng hạt [1]

1.2 Thành phần hóa học

Theo các nghiên cứu trên thế giới, Cỏ mật gấu có thành phần chính là diterpenoid ngoài ra còn có các hợp chất sterol, triterpenoid, acid phenolic, glycosid, flavonoid, tinh dầu, acid béo,

1.2.1 Diterpenoid

Diterpenoid là thành phần chính của chi Isodon nói chung và loài I

lophanthoides nói riêng Hiện nay đã có khoảng 73 hợp chất diterpenoid được

báo cáo từ loài này Cấu trúc của các hợp chất này được trình bày qua bảng 1.2 và hình 1.1

Bảng 1.2 Các hợp chất diterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu

Hình 1.1 Cấu trúc của các diterpenoid (1-73) phân lập từ Cỏ mật gấu

1.2.2 Phenolic đơn giản

Phenolic là nhóm chất phổ biến và phân bố rộng rãi trong thực vật Từ loài

Cỏ mật gấu, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy sự có mặt của 16 hợp chất phenolic

có cấu trúc 1-2 vòng benzen Cấu trúc của các hợp chất này được chỉ ra ở bảng

Hình 1.2 Cấu trúc của các acid phenolic phân lập từ Cỏ mật gấu (74 – 89)

Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid phân lập từ Cỏ mật gấu

1.3.1 Tác dụng chống ung thư

Theo nghiên cứu của Herrera năm 2008, ferruginol có tác dụng gây độc tế

bào đối với các dạng trypomastigot và epimastigot của Trypanosoma cruzi và

chống lại các nguyên sợi bào Vero Ngoài ra, hợp chất này còn gây độc với tế bào ung thư biểu mô (KB) [71]

Năm diterpenoid: Isolophanthin C, 16-aceto-7α-methoxyroyleanon,

horminon, 3β-acetoxyabieta-8,11,13-trien-12-ol, 16-acetoxy-7α-hydroxyroyl anon phân lập từ I lophanthoides var gerardianus bởi Yang và cộng sự (2011) cho thấy các tác dụng chống lại một số dòng tế bào khối u ở người [72]

Năm 2011, 9 trong số 11 hợp chất diterpenoid phân lập từ I lophanthoides var gerardianus bởi Yang và cộng sự đã được đánh giá về khả năng gây độc tế

bào trên một số dòng tế bào ung thư ở người (HL-60, A-549, MOLT-4 và

BEL-7402) Kết quả cho thấy, hợp chất isolophanthin C và

16-acetoxy-7α-methoxyroyleanon thể hiện hoạt tính đáng kể chống lại các dòng tế bào trên và

sự ức chế các dòng tế bào A-549 và BEL-740 cao hơn so với đối chứng dương

(VP-16) Các hợp chất3β-acetoxyabieta-8,11,13-trien-12-ol, horminon và

16-acetoxy-7α-hydroxyroyleanon cũng thể hiện hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư là BEL-740, MOLT-4 và BEL-740 và MOLT-4 [72]

Năm 2013, Zhou và cộng sự phân lập mười diterpenoid abietan từ I

lophanthoides var graciliflorus và sáu chất trong đó gồm: 16-acetoxylsugiol,

graciliflrorin E, 15-hydroxy-20-deoxocarnosol, 3β-hydroxysempervirol,

6,12,15-trihydroxy-5,8,11,13-abietatetraen-7-on vàabieta-8,11,13-trien-14,19-diol cho thấy tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô phổi ở người (A549), ung thư biểu

mô tuyến vú (MCF-7) và ung thư cổ tử cung (HeLa) trên mô hình in vitro với

IC50 1,79 - 52,67 μM [73] Cũng trong năm 2013, Liang và cộng sự cũng phân

lập được 6 diterpenoid từ I lophanthoides var graciliflorus Tất cả các hợp chất

này được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư A549, MCF-7 và HeLa bằng phương pháp MTT Kết quả cho thấy, micranthin B thể hiện hoạt tính trung bình trên tất cả các dòng tế bào thử nghiệm với IC50 lần lượt là 16,29, 18,20 và 22,25

μM [73]

Theo nhóm nghiên cứu của Feng và cộng sự năm 2016, cao chiết nước

toàn cây của loài I lophanthoides var gerardianus gây độc trên tế bào ung thư

gan người (HepG2) [13]

1.3.2 Tác dụng chống virus

Năm 2005, nghiên cứu của Hu và cộng sự cho thấy acid ursolic và acid

2α-hydroxyursolic phân lập từ I lophanthoides var gerardianus có tác dụng kháng HBV trong thử nghiệm in vitro [20]

Theo nghiên cứu của Swarup và cộng sự (2007), việc điều trị virus viêm

não Nhật Bản bằng acid rosmarinic (p<0,001) làm giảm nồng độ IL-12, TNF-α,

IFN-γ (gamma interferon), MCP-1 (monocyte chemoattractantprotein-1) và IL-6

lần lượt là 13, 14, 12, 25 và 12,5 [71]

Nghiên cứu của Yang và cộng sự (2011) cho thấy, cao chiết aceton từ

phần trên mặt đất của I lophanthoides var graciliflorus có tác dụng chống lại virus viêm gan B Isolophanthin D và 7-O-methylhorminon phân lập từ loài này

thể hiện hoạt tính chống lại HBsAg cao với giá trị IC50 tương ứng lần lượt là < 0,02 và 0,04 mg/ml (SI > 3 và 1,5) [72]

1.3.3 Tác dụng bảo vệ gan

Nghiên cứu của Liao và Liao (1996) đã so sánh tác dụng chống viêm và

bảo vệ gan của cao chiết nước 3 loài I lophanthoides, I lophanthoides var gerardianus và I serra (Maxim.) Hara Kết quả cho thấy, cả ba loài này đều

có thể làm giảm lượng glutamic-pyruvic transaminase huyết thanh (SGPT) ở chuột bị tổn thương gan cấp tính và liều dung nạp tối đa của ba loại thảo dược là

60, 60 và 90 g/kg [29]

Nhóm nghiên cứu của Han và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng, dịch chiết nước của “Xihuangcao” có thể làm giảm hoạt độ enzym SGPT và làm giảm nồng

độ bilirubin của chuột bị tổn thương gan gây bởi hóa học [17]

Báo cáo của Hou và cộng sự năm 2010 cho thấy, cao chiết nước của I

lophanthoides var gerardianus có thể làm giảm tổn thương gan do rượu và cải

thiện bài tiết mật trong mô hình thực nghiệm [19]

Hợp chất isolophanthin D và 7-O-methylhorrminon được phân lập từ phần trên mặt đất của I lophanthoides var gerardianus có tác dụng chống HbsAg

[72]

Nghiên cứu của Xie (2008) chỉ ra rằng, “Xihuangcao” có thể ngăn ngừa tổn thương gan cấp tính bằng cách giảm nồng độ của aspartate transaminase và alanine transaminase [69]

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn

Nhóm nghiên cứu của Lin (2011) cho thấy, cao chiết methanol từ phần

trên mặt đất của I lophanthoides var graciliflorus có tác dụng kháng khuẩn Acid rosmarinic có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất trên chủng O stamineus Acid caffeic và acid ferulic ức chế sự phát triển của chủng Bacillus subtilis, Bacillus

cereus và Staphylococcus aureus Ngoài ra, acid caffeic còn chống lại chủng Legionella pneumophila Cũng theo nhóm nghiên cứu này, quercetin phân lập từ

loài I lophanthoides, liên kết với tiểu đơn vị GyrB của enzym DNA gyrase của

E coli và ức chế hoạt động ATPase Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

của quercetin đối với E coli có thể là do ức chế DNA gyrase [71]

Nghiên cứu của Zhou và cộng sự năm 2014 cho thấy, nepetoidin B thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn trên 3 chủng S aureus, B cereus và S dysenteriae với giá

trị IC50 lần lượt là 44,15 ± 1,20, 74,24 ± 1,78 và 62,29 ± 2,46 µM trong khi serrin

A có hoạt tính trên 2 chủng S aureus và S dysenteriae với giá trị IC50 là 70,83 ± 6,80 và 79,13 ± 2,92 µM [74]

Báo cáo của Liu và cộng sự (2017) cho thấy, effusanin F thể hiện tác dụng

ức chế tốt với Staphylococcus aureus, L monocytogenes và P aeruginosa với

giá trị IC50 là 16 µg mL-1 và tác dụng ức chế thấp hơn đối với Bacillus subtilis và

B cereus với các giá trị IC50 là 32 µg mL-1 [36]

1.3.5 Tác dụng chống viêm

Năm 2013, Kuang và cộng sự so sánh tác dụng chống viêm của các dịch

chiết từ loài I lophanthoides var graciliflora và I serra (Maxim.) Hara và cho thấy I lophanthoides var graciliflora thể hiện tác dụng mạnh hơn [25]

Hoạt tính chống viêm của quercetin đã được Valerio và cộng sự báo cáo năm 2009 Nghiên cứu cho rằng quercetin có tác dụng giảm đau bằng cách ức chế sản xuất cytokin và làm mất cân bằng oxy hóa của cơn đau do viêm Ngoài

ra, quercetin thể hiện tính chất chống viêm rõ rệt trong một thử nghiệm trên mô hình chuột bị viêm dị ứng đường thở [66]

1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2007, Duan và Liang nhận thấy rằng, flavon trong “Xihuangcao” và sản phẩm lên men của nó có tác dụng ức chế tốt đối với các gốc tự do [10] Theo báo cáo của Kabouche và cộng sự (2007), một số abietan có hoạt tính chống oxy hóa, do đó có khả năng dọn gốc anion superoxid, DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) và ức chế peroxid hóa lipid trong hệ thống β-caroten – acid linoleic Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng abietan có sự kết hợp với O-dihydroxy

phenol hoặc hydroxyl/methoxyl có hoạt tính thu dọn gốc DPPH mạnh hơn so với abietan có vòng mono-hydroxy abietan Ngoài ra, khả năng dọn gốc anion

superoxid 4 của abietan mang vòng p-quinoid C cũng mạnh hơn so với abietan

mang cấu trúc hydroquinon [23]

Năm 2008,nghiên cứu của Duan và Huang cho thấy, cả dịch chiết nước và ethanol của “Xihuangcao” đều thể hiện tác dụng chống oxy hóa lipid trên mô homogenat của chuột [11]

Khả năng chống oxy hóa của acid rosmarinic phân lập từ Cỏ mật gấu đã được chứng minh bởi nhiều nhà khoa học Sự có mặt của hai gốc catechol kết hợp với nhóm acid cacboxylic làm tăng hoạt tính chống oxy hóa [8]

1.3.7 Tác dụng khác

Phytosterol (β-sitosterol, daucosterol và stigmasterol) có khả năng giảm

cholesterol, có liên quan trực tiếp với sự phát triển của các bệnh tim mạch, làm giảm chỉ số xơ vữa LDL/HDL cholesterol [34]

Acid scopariusic và isoscoparin P có hoạt tính ức chế miễn dịch, ức chế

tăng sinh tế bào T của chuột trong thử nghiệm in vitro [36]

Năm 2006, Liu và cộng sự cho thấy, cao chiết nước “Xihuangcao” có thể làm tăng sức căng cơ của túi mật lợn và tăng tốc độ co bóp [39] Năm 2009 Liu, chen và cộng sự cũng cho thấy dịch chiết nước “Xihuangcao” làm tăng đáng kể lượng mật trong chuột và giảm mức cholesterol trong mật [55]

Phần trên mặt đất của I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara

được sử dụng theo kinh nghiệm để điều trị viêm ruột, vàng da, dùng để chống viêm, viêm túi mật [7] Ngoài ra, loài này còn được được sử dụng để điều trị viêm gan động mạch cấp tính, viêm túi mật cấp tính, viêm thực quản, phụ khoa,…[12]

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là phần trên mặt đất cây Cỏ mật gấu (Isodon

lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara) var lophanthoides, Lamiaceae

(Hình 2.1, Phụ lục I) được thu hái vào tháng 10 và 11 năm 2020 tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai Mẫu nghiên cứu được lưu tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu và Bảo tàng Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024653, HNU 024654)

Dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo

a Toàn cây b Dược liệu khô

Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu (Cỏ mật gấu - Isodon lophanthoides (Buch.-Ham

ex D.Don) H.Hara var lophanthoides)

Mẫu sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 3.6) là cao

chiết tổng ethanol 70% (ILT), các cao phân đoạn của cao tổng: n-hexan (ILH),

ethyl acetat (ILE) và cắn nước (ILW) được chiết xuất theo phương pháp mục

2.4.1 Bên cạnh đó, một số hợp chất tinh khiết phân lập được từ Cỏ mật gấu cũng được đánh giá

2.2 Dung môi, hóa chất và dòng tế bào

 Các dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập là các dung môi công nghiệp

được cất lại trước khi dùng như: Ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat

(EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM) và aceton

 Dung môi Trung Quốc: Methanol (MeOH), n-butanol (BuOH), DCM

 Dung môi đo phổ: CD3OD, DMSO-d6

 Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96%

 MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (Sigma,

St Louis, MO, Mỹ)

 Chất đối chứng dương Doxorubicin

 Môi trường nuôi cấy tế bào: Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI-1640 medium, fetal bovine serum (FBS), trypsin (Grand Island, NY, Mỹ)

 Các dòng tế bào ung thư do trung tâm lưu trữ tế bào Mỹ cung cấp (ATCC, Rockville, MD): A549, MCF-7, HepG2 và HL60

2.3 Trang thiết bị nghiên cứu

 Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy Sỹ)

 Tủ sấy UFB 500 (Memmert, Đức), FD115 (Binder, Đức)

 Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 366 nm

 Máy siêu âm Power sonic 405 (Hàn Quốc)

 Máy cất quay Rotary evaporator WEV-1020 Daihan Scientific (Hàn Quốc)

 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)

 Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (30

- 35 μm, FuJisilisa Chemical Ltd), MCI gel (CHP20P, 75 - 150 μm)

 Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

 Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm như: Cột sắc ký, bình gạn, bình nón, bộ sinh hàn hồi lưu, bình cầu, bếp bảo ôn, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm…

 Máy Elisa Plate Reader (Muclecular Devices Co., Menlo Park, CA, Mỹ)

 Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippett (eppendorf)

2.4 Địa điểm thực hiện

 Chiết xuất, phân lập được thực hiện tại Khoa Hóa phân tích - Viện Dược liệu

 Xác định cấu trúc thực hiện tại: Khoa Hóa phân tích - Viện Dược liệu và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Thừ độc tính tế bào thực hiện tại: Khoa Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa

Y, Đại học Lund, Thụy Điển

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập

2.5.2.1 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi là EtOH 70%,,sau đó sử dụng máy cô quay chân không 20L thu được cao tổng

Phân đoạn cao tổng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan

và EtOAc sử dụng phễu chiết thủy tinh 2L

2.5.2.2 Phương pháp phân lập chất

- Phân lập các chất bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silica gel pha thường, pha đảo và MCI gel

- Theo dõi các phân đoạn bằng TLC pha thường và pha đảo

- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại hoặc bằng thuốc thử, sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu

- Tiến hành:

 Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: Khảo sát cao tổng bằng sắc

ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải

 Chuẩn bị cột: Cột sắc ký rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định; lót một lớp bông xuống đáy cột; cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch; mở khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột hoàn toàn ổn định

 Nạp mẫu lên cột:

 Nạp mẫu khô: Trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột

 Nạp mẫu ướt: Dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ nhàng dọc quanh thành cột

Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để tránh xáo trộn bề mặt cột

 Rửa giải: Sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Dịch rửa giải được hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống

nhau

2.5.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố

2.4.2 Đánh giá tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư in vitro

Tác dụng gây độc của các mẫu đối với các tế bào ung thư thử được đánh giá theo phương pháp MTT và theo mô hình của Mosmann (1983) [44]

 Nguyên tắc

Sử dụng phương pháp nhuộm màu với MTT để đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử lên sự sống sót của tế bào ung thư Trong ty thể của tế bào sống có enzym dehydrogenase có khả năng chuyển MTT (màu vàng) thành formazan có màu tím và chất này hấp thụ tại bước sóng λ = 570 nm (Hình 2.2)

Hình 2.2 Phản ứng nhuộm màu tế bào sống bằng phương pháp MTT

 Chuẩn bị mẫu

Mẫu được pha trong dung môi DMSO và vortex ở tốc độ 300 - 500 rpm trong 1-2 phút cho đến khi dịch chiết đồng đều trong DMSO, nồng độ dịch chiết

là 20 μM với thể tích là 500 μl cho mỗi mẫu thử

 Nuôi cấy tế bào

Các tế bào ung thư được nuôi cấy trong phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1x104 tế bào/giếng) với các nồng độ khác nhau của hợp chất thử và cao phân đoạn (3, 10 và 30 µg/ml) ở 37°C trong 5% CO2/95% không khí trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh bò FBS 10%, 100 đơn vị /ml penicillin và streptomycin 100 μg/ml Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, các tế bào được nuôi đến mật độ phát triển tới 80 - 90%

Cao tổng ethanol 70% (ILT), các cao phân đoạn của cao tổng: n-hexan

(ILH), ethyl acetat (ILE) và cắn nước (ILW) và 5 hợp chất tinh khiết (IL1 -

IL5) phân lập từ phần trên mặt đất Cỏ mật gấu được tiến hành thử nghiệm hoạt

tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm: A549 (tế bào ung thư phổi), MCF-7 (tế bào ung thư vú), HepG2 (tế bào ung thư gan) và HL60 (tế bào ung thư máu ở người) Các cao chiết và hợp chất tinh khiết được thử nghiệm ở nồng độ 3, 10 và 30 µg/ml và 0,3, 1,0, 3,0 và 10 µM đối với chất đối chứng dương doxorubicin

 Đánh giá

Khả năng sống sót của tế bào được tính toán theo công thức:

Trong đó: OD: mật độ quang; σ: độ lệch tiêu chuẩn, được tính theo công thức:

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i

x ̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

Sử dụng chương trình Graph Pad Prism 5 để tính giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% tế bào ung thư) theo công thức:

Y = 100/(1+10^((X-LogIC50)) Trong đó: X là nồng độ mẫu thử; Y là % tế bào sống sót; Doxorubicin được

sử dụng như là hợp chất đối chứng dương

Thí nghiệm được đo trên máy ELISA Plate Reader (Muclecular Devices Co., Menlo Park, CA, USA) và sử dụng phần mềm chuyên dụng là graphpad

prism 5.0 để xác định giá trị IC50 Số liệu định lượng được trình bày dưới dạng ±

SE

2.6 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế như sơ đồ hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Cao chiết nước

1 Ngâm với EtOH 70% 3 lần, 3 ngày/lần, tỉ

lệ dm/dl: 8/1 (tt/kl)

2 Gộp dịch chiết, thu hồi dung môi

1 Phân tán cao vào nước

2 Chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexan,

EtOAc

3 Thu hồi các dung môi dưới áp suất giảm

Sàng lọc tác dụng kháng ung thư in vitro của cao

chiết tổng và các cao chiết phân đoạn

Phân đoạn tiềm năng

5 hợp chất tinh khiết

Đánh giá tác dụng kháng ung thư in vitro trên một số dòng tế bào

ung thư như A549; MCF-7; HepG2; HL-60 của các hợp chất