Bài ôn thi Phân tích vi sinh thực phẩm HUFI

Hướng dẫn ôn thi học phần phân tích vi sinh. tóm tắt các phản ứng sinh hóa dễ hiểu nhất bao gồm: lên men, citrate, Decarboxylase, urease, gelatinase,.. với nguyên tắt, cơ chế, màu phản ứng chi tiết. môi trường phân lập các phản ứng phát hiện âm tính dương tính thí nghiệm.

ÔN TẬP

CHƯƠNG 3:

- Thành phần môi trường:

1 Nước

2 Thạch

3 Peptone

4 Cao thịt

5 Cao nấm men

6 Một số tác nhân tạo môi trường kị khí.

7 Các chế phẩm từ mật bò

8 Các chất ức chế chon lọc

9 Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa

10 Các chất chỉ thị màu

- Yêu cầu cơ bản:

 Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

 Có độ pH thích hợp

 Có độ nhớt nhất định

 Không chứa các yếu tố độc hại

 Tuyệt đối vô trùng

- Các bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng:

1 Pha chế

2 Làm trong môi trường

3 Điều chỉnh pH

4 Phân phối môi trường vào dụng cụ

5 Khử trùng môi trường

6 Làm thạch nghiêng, thạch đứng và đổ vào đĩa petri

7 Bảo quản và kiểm tra môi trường

- PP khử trùng môi trường:

 PP Pasteur

 PP Tyndal

 PP lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn

 PP hấp bằng hơi nước bao hòa ở áp suất cao

CHƯƠNG 4:

ST

Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men (phân giải) một carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản tạo acid (hoặc acid và hơi)

Môi trường: môi trường phenol red base

- Sinh aicd

(+): đỏ sang vàng (-): đỏ

- Sinh hơi

(+): Khi có bọt khí trong ống

(-): Ko có

Cần phải thực hiện lại thử nghiệm với ống nghi ngờ.

1 số vsv có khả năng lên men các loại CHO đặc hiệu tạo ra acid làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu chỉ thị phenol red trong môi trường acid có màu vàng Đồng thời CO2 được tạo thành trong quá trình lên men sẽ được giữ lại tạo bọt khí làm nổi ống Dulham(mt lỏng), vỡ thạch (mt rắn)

2 OXH – Lên men

Xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate làm nguồn năng lượng thông qua phương thức lên men hoặc

hô hấp

Môi trường: môi trường Hugh-Leifson

(+): Bị acid hóa cả trên mặt và phần sâu

(-): Kỵ khí: bị acid hóa khắp thạch sâu

Hiếu khí: ko bị trên bề mặt, chỉ bị phần đáy

 vi sinh vật biến dưỡng

carbohydrate theo phương thức oxi hóa.

3 Bile Esculin

Thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculi thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật

Môi trường: môi trường Aesculin hay Edwards (+): Môi trường chuyển

thành đen hay nâu đen.

(-): Môi trường không đổi màu

Esculetin+muối sắt

 tạo thành phức hợp màu đen hay màu nâu đen

4 Citrate Nhằm xác định khả

năng của một vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm

Môi trường: môi trường Simmon citrate

(+): Môi trường chuyển từ

xanh lục sang xanh dương (mt kiềm)

(-): xanh lục (màu ban

Sự thay đổi pH của môi trường được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue

hóa môi trường đầu)

Vsv sử dụng citrate trong mt có natri nitrate ion Na+ Hoặc sd muối amonium vô cơ NH3

Làm tăng pH từ đó đổi màu chỉ thị bromothymol blue

Nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường

Môi trường: môi trường lỏng malonate

(+):Môi trường chuyển từ

xanh lục sang xanh dương

(-): Xanh lục

Thủy phân đc Malonate  có khả năng sử dụng muối amonium NH3

kiềm hóa mt  tăng pH  đổi màu chỉ thị bromthymol blue

6 Catalase

Nhằm xác định sự

có mặt của enzyme catalase

Môi trường: dd H2O2 30%

(+): Sủi bọt khí xung quanh sinh khối (-): Không sủi bọt

Catalase cắt H2O2  H2O2 + O2 (bọt khí)

7

Decarboxyla

se

Đánh giá hoạt tính enzyme của vi sinh vật khử nhóm carboxyl của acid amin sinh một amin tạo tính kiềm

Môi trường: môi trường decarboxylase basal chứa chỉ thị bromocresol tím

(+): Đục, tím

(-): Trong, vàng

Vsv có khả năng khử carboxyl của â tạo amin có tính kiềm sinh CO2  Tăng pH

 đổi màu chỉ thị

8 Coagulase

Kiểm tra khả năng của một vi sinh vật làm đông huyết tương thỏ hoặc người do tác dụng của enzyme coagulase

Môi trường: huyết tương thỏ hay người đông khô dạng thương phẩm (+): Huyết tương đông (sau 4h, 8h, 12h, 24h) (-): Lỏng (sau 24h)

Vsv đặc biệt là Staphylococcus có enzyme coagulase làm kết tụ các thành phần của huyết tương tạo khối đông làm đông tụ huyết tương

Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo hai phân tử ammonia do tác dụng của

enzyme urease làm kiềm hóa môi trường

Môi trường urea lỏng(rắn), chứa chỉ thị phenol đỏ

(+): Vàng  Đỏ cánh sen (-): Vàng

Urea bị phân giải bởi enzyme urease thành

2 phân tử ammonia làm kiềm hóa mt đổi màu chỉ thị

10 Gelatinase Xác định khả năng phân giải gelatin

của vi sinh vật

Môi trường: môi trường canh NB bổ sung 10%

gelatin (+): Hóa lỏng (-): Đông đặc

Thủy phân Gelatin bởi enzyme

gelatinase

polypeptid +aa

Mất tính đông  Hóa lỏng

11 Sinh H2S

Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme

desulfohydrase xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methione và phóng thích H2S

Môi trường: các loại môi trường có thể được sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S là KIA, TSI, BSA

(+): Đen

(-): Không chuyển màu

Vsv có enzyme desulfohydrase trong điều kiện kị khí chuyển protein thành

aa chứa lưu huỳnh và phóng thích H2S H2S tạo tủa màu đen

vs chỉ thị sulfide

Xác định khả năng sinh indol từ tryptophan

(Kiểm tra xem vsv

có enzyme tryptophanase hay ko).

Môi trường và thuốc thử:

môi trường Trypton water, thuốc thử Kowac’s (thuốc thử chứa

p-Dimethylaminobenzaldeh yde (p-DMABA))

(+):Bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh

sen

(-): Màu vàng chanh

Tryptophan bị oxh bởi tryptiphanase thành sp chứa indol Phyrol của indol chứa nhóm CH2 +nhân benzen của p_DMABA phức chất dạng quinone có màu đỏ

13 KIA / TSI

(có chứa cả

glu và lac;

chỉ thị

phenol red

và có thành

phần muối

sắt)

Xác định khả năng

sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật

vi sinh vật sẽ sử dụng Glucose để lên men nên khiến toàn

bộ môi trường trở nên axit (màu vàng) trong khoảng 8-12 giờ Phần gốc vẫn giữ trạng thái axit thậm chí sau khi ủ khoảng 18-24 giờ bởi vì sự có mặt axit hữu cơ từ việc lên men glucose dưới

Môi trường: môi trường KIA hoặc TSI

Đáy ống nghiệm

Glucose (+): Màu vàng (lên men glucose)

Glucose (-): Màu

đỏ/không đổi màu (không

lên men glucose) màu ban đầu của chỉ thị

- Màu đen: sinh H

2S

- Vỡ thạch: sinh hơi từ glucose

Mặt nghiêng:

Lactose và/hoặc Sucrose (+): Màu vàng (lactose

Lên men glucose tạo acid giảm pH chỉ thị phenol red màu vàng H2S sinh ra tạo tủa màu đen vs chỉ thị sulfide

Sinh hơi do tạo CO2 Nếu sinh vật lên men glucose nhưng lại không lên men lactose và/hoặc sucrose, sau đó mặt nghiêng sẽ trở thành màu đỏ và phần gốc vẫn màu vàng (K/A) trong khoảng 18 đến 24 giờ

điều kiện kỵ khí trong phần đáy ống

Mặt nghiêng của môi trường trở về trạng thái kiềm, được chỉ thị bằng màu đỏ vì các sản phẩm lên men

bị oxy hóa thành CO2 và H2O và peptone trong điều kiện hiếu khí, phần mặt nghiêng trải qua oxy hóa giải phóng các amine kiềm

và/hoặc sucrose được sử dụng)

Lactose và Sucrose (-):

Màu đỏ/không đổi màu

(lactose và sucrose không được sử dụng)

Nếu bên cạnh việc lên men glucose sinh vật còn lên men lactose và/ hoặc sucrose, sản phẩm lên men được hình thành trên mặt nghiêng sẽ trung hòa hơn amine kiềm chuyển mặt nghiêng thành axit (màu vàng) (A/A), hiện tượng này sẽ xuất hiện sau khoảng 18 tới 24 giờ

Nếu sinh vật không phải dạng lên men, thay vì sử dụng đường, nó sẽ sử dụng pepton như một nguồn năng lượng thay thế dưới điều kiện hiếu khí trên mặt nghiêng, việc này khiến trở nên kiềm được chỉ thị bởi

mà đỏ trong khi không có sự thay đổi màu sắc của gốc

14 Nitratase Xác định khả năng

sử dụng nitrat (khử NO3-) của vi sinh vật

Môi trường và thuốc thử:

môi trường nitrat và thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) và Gress B (α-naphthylamin)

(+): có màu hồng đỏ

Nếu ko có màu: tt thêm bột Zn

(+): Ko chuyển màu (-): Màu hồng đỏ

Lần 1: định tính nitrite

Có enzyme nitratreductase khử NO3- thành NO2- phản ứng vs 2 loại thuốc thử tạo hc màu đỏ

Lần 2: định tính nitrate (bổ sung ít Zn)

Nếu khống màu hoặc

k có kn khử NO3- hoặ xảy ra nhưng NO2- bị khử thành N2

Nếu đỏ có nghĩa là còn NO3- tác dụng

vs Zn tạo NO2- sau

đó pứ vs nitrate tạo màu đỏ không có

sự khử NO3-Không đổi màu nghĩa là hết NO3- trong mt có sự khử NO3-

15 Oxidase

Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase (A) ở vi sinh vật

Thuốc thử: Giấy tẩm N-dimethyl-para

phenylenediamine hoặc dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine (màu hồng)(B)

(+): Xanh dương đậm (-): Hồng

A + B  indolphenol (màu xanh dương)

Xác định sự hiện diện của enzyme β-galactosidase (A) ở

vi sinh vật

Môi trường: môi trường lỏng ONPG (B)

(+): Vàng (-): ko đổi

A + B  o-nitrophenyl (có màu vàng)

Có khả năng lên men lactose

17 (Methyl MR

Red)

Kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid

Môi trường và thuốc thử:

môi trường lỏng MR-VP, thuốc thử methyl red (+): Đỏ

(-): Đỏ  Vàng

Lên men glu thành acid pyruvic sau đó chuyển hóa thành ethanol, acid acetic, acid lactic,… giảm

pH (4~4,5) nên MR

có màu đỏ

pH cao hơn (mt kiềm) có màu vàng

18 (Voges - VP

Proskauer)

Xác định khả năng của một số vi sinh vật tạo sản phẩm cuối mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbin ol-AMC) do lên men glucose

Môi trường và thuốc thử:

MR (chỉ thị) - VP (+): Đỏ cam pH acid????

(-): Vàng or Nâu đất

Vsv chuyển hóa glu thành acid pyruvic

 acetoin (AMC) trong mt kiềm  diacetyl kết hợp vs α -naphtol tạo hợp chất màu đỏ cam

19 CAMP

- Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật tạo ra nhân tố CAMP có khả năng phối hợp với β-hemolysin (yếu tố tan huyết) của Staphylococcus tác động lên hồng cầu

bò hoặc cừu sinh ra hiện tượng tan huyết tại vùng tiếp giáp của hai vi sinh vật

- Nhằm xác định cũng hiện tượng tan huyết do phối hợp như trên giữa nhân

tố CAMP và α-hemolysin của Clostridium perfringens

Môi trường: môi trường thạch máu

Cơ chất β-lysine: Dùng S

aureus hoặc bất kỳ chủng

nào tạo nhiều β-lysine

Vi sinh vật chứng:

Streptococcus spp đã định

danh (+): Có vùng tan huyết hình mũi tên

(-): ko có

Đối với nhóm đối chứng + Streptococcus

agalactiae

- Streptococcus faecalis

20 Tính di động Xác định khả năng di động của vi sinh

vật

Môi trường: môi trường bán lỏng NA, để đứng

(+): Lan ra khỏi đường cấy

(-): Chỉ mọc theo đường cấy

Mức độ lan xa hay gần tùy theo loài

Có tiêm mao

So sánh các phương pháp Elisa

Khái niệm Xét nghiệm ELISA

trực tiếp chỉ sử dụng kháng thể chính để phát hiện kháng nguyên trong khi ELISA gián tiếp sử dụng cả kháng thể chính và phụ

ELISA có thể được thực hiện bằng hai loại kháng thể là;

kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp

Công cụ ELISA gián tiếp sử dụng cả hai loại kháng thể

để khuếch đại tín hiệu để phát hiện tốt hơn

Các bước thực

hiện kháng nguyên (Antigen- Ag) được

hấp phụ lên một tấm

1 Các đĩa giếng được ủ với kháng nguyên, rửa và khóa

nhựa, sau đó một lượng lớn của một loại protein (thường

là albumin huyết thanh bò- BSA) được thêm vào để khóa tất cả các vị trí liên kết khác Trong lúc đó, một loại enzyme sẽ liên kết với một kháng thể trong một phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể này được sử dụng

để hấp phụ các kháng nguyên Sau khi phức enzyme- kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên

sẽ còn lại trên giếng Bằng cách thêm vào cơ chất của enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng kháng nguyên trong mẫu

bằng BSA

2 Thêm mẫu và kháng thể vào và rửa

3 Enzyme gắn với kháng thể thứ cấp được thêm vào và rửa

4 Thêm cơ chất, enzyme trên kháng thể tạo ra tín hiệu màu hoặc huỳnh quang

trực tiếp chỉ sử dụng kháng thể chính để phát hiện kháng nguyên trong khi ELISA gián tiếp sử dụng cả kháng thể chính và phụ

Nhạy hơn trực tiếp

Thời gian Nhanh chóng Tốn nhiều thời gian

Sử dụng kháng thể Chỉ một loại kháng

thể (Kháng thể chính) được sử dụng trong ELISA trực tiếp

Các kháng thể sơ cấp và thứ cấp được

sử dụng cho ELISA gián tiếp

Liên kết với

enzyme Các kháng thể sơ cấp được liên kết

với các enzym

Các kháng thể thứ cấp được liên kết với các enzym

Phản ứng chéo của loại bỏ phản ứng bị ảnh hưởng với

các kháng thể thứ

hai

chéo của kháng thể thứ hai

phản ứng chéo của các kháng thể thứ hai

Tín hiệu Yếu hơn gián tiếp được khuếch đại

nên dễ phát hiện

Nguyên lý của kỹ thuật Elisa

Kỹ thuật Elisa là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu; Elisa là một công cụ chẩn đoán y học, bệnh lý học thực vật, kiểm soát chất lượng các ngành công nghiệp khác nhau

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:

Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt

Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với ezyme

Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

Các phương pháp ELISA

Có ba phương pháp:

1 Phương pháp ELISA trực tiếp:

Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt đĩa phản ứng

Ưu điểm

Nhanh, vì chỉ sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất à hạn chế tối đa các thao tác khi thực hiện phản ứng

Loại bỏ được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp

Nhược điểm

Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể bị ảnh hưởng xấu bởi enzyme hoặc cơ chất gắn, Khó khăn và tốn kém trong việc lựa chọn kháng thể cho phản ứng

Không linh hoạt trong việc lựa chọn các cơ chất gắn

Tín hiệu khuếch đại thu được thấp

2 Phương pháp ELISA gián tiếp

Trong phương pháp này, một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên Kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu

Ưu điểm

Linh hoạt trong việc sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất

Linh hoạt và dễ dàng trong việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng

Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể phát huy tối đa vì không bị ảnh hưởng bởi cơ chất đánh dấu

Độ nhạy cao

Linh hoạt trong việc sử dụng cơ chất

Nhược điểm

Có thể xảy ra phản ứng chéo với các kháng thể thứ cấp à độ đặc hiệu của phản ứng bị ảnh hưởng Thời gian thực hiện phản ứng lâu hơn

Phương pháp ELISA “Sandwwich”

Một kháng thể gắn sẽ được sử dụng để gắn với kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứ cấp có gắn

cơ chất enzyme được bổ sung để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phản ứng Tín hiệu khuếch đại thu được khi có sự bắt cặp kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu

Ưu điểm

Mẫu không cần tinh sạch trước khi phân tích

Độ đặc hiệu cao

Thích hợp cho các mẫu phức tạp

Linh hoạt và độ nhạy cao

Ứng dụng

Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt trong các quy trình kiểm tra chất lượng các sản phẩm sinh học

Trong thực phẩm

Kỹ thuật ELISA có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh

Phát hiện độc tố trong tảo

Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonell, Staphylococcus aureus, sán lá gan, trong thực phẩm

Phát hiện chất chloramphenicol trong tôm, cá và cá sản phẩm thuỷ sản

Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu,…

Trong y học