NGUYỄN THỊ lâm KHẢO sát dấu vân TAY hóa học của cốm PHƢƠNG THUỐC NHỊ ĐÔNG BẰNG sắc ký lớp MỎNG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông.. Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên hoa phấn trong cốm phương thuốc

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự giúp

đỡ quý báu của thầy cô, nhà trường, cùng bạn bè và gia đình

Trước hết em xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện cho chúng em trong suốt 5 năm học qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người đã tận

tình hướng dẫn, luôn quan tâm, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương và Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu và Công ty cổ phần thương mại dược phẩm quốc tế WINSACOM đã cung cấp mẫu cốm thuốc, dược liệu chuẩn và hỗ trợ kinh phí cho em thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2020

Nguyễn Thị Lâm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……… ……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh Đái tháo đường 2

1.1.1 Theo quan điểm y học hiện đại 2

1.1.2 Theo quan điểm y học cổ truyền 3

1.2 Phương thuốc Nhị Đông 3

1.2.1 Xuất xứ 3

1.2.2 Thành phần 4

1.2.3 Công năng, chủ trị của phương thuốc 4

1.2.4 Định tính phương thuốc 4

1.3 Tổng quan về các vị thuốc trong cốm phương thuốc Nhị đông 4

1.3.1 Thiên môn đông 4

1.3.2 Thiên hoa phấn 5

1.3.3 Tri mẫu 6

1.3.4 Nhân sâm 7

1.3.5 Mạch môn đông 9

1.3.6 Hoàng cầm 10

1.3.7 Hà diệp 12

1.3.8 Cam thảo 13

1.4 Tổng quan về sắc kí đồ dấu vân tay 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu, phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 16

2.2.2 Chiết xuất 17

2.2.3 Điều kiện triển khai sắc kí 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

3.1 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông 19

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết 19

3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 20

3.2 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên hoa phấn trong cốm phương thuốc Nhị đông 22

3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết 22

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 23

3.3 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Tri mẫu trong cốm phương thuốc Nhị đông 25

3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết 25

3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 26

3.4 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Nhân sâm trong cốm phương thuốc Nhị đông 28

3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết 28

3.4.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 29

3.5 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Mạch môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông 31

3.5.1 Khảo sát phương pháp chiết 31

3.5.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 32

3.6 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Hoàng cầm trong cốm phương thuốc Nhị đông 34

3.6.1 Khảo sát phương pháp chiết 34

3.6.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 35

3.7 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Hà diệp trong cốm phương thuốc Nhị đông 37

3.7.1 Khảo sát phương pháp chiết 37

3.7.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 38

3.8 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Cam thảo trong cốm phương thuốc Nhị đông 40

3.8.1 Khảo sát phương pháp chiết 40

3.8.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 41

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

DĐVN V Dược điển Việt Nam V

DL- HD Dược liệu Hà diệp

P-TMD Placebo Thiên môn

đông SKLM Sắc kí lớp mỏng

TT TLC

Thuốc thử Sắc kí lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2-1 Công thức bào chế của một gói cốm Nhị đông (3,75 g) 15Bảng 2-2 Tỷ lệ khối lượng cốm placebo 17Bảng 3-1 Khối lượng cốm và dược liệu Thiên môn đông 20Bảng 3-2 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Thiên môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông sau khi phun thuốc thử 21Bảng 3-3 Khối lượng cốm và dược liệu Thiên hoa phấn 23Bảng 3-4.Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Thiên hoa phấn trong cốm phương thuốc Nhị đông soi ở bước sóng 366 nm 24Bảng 3-5 Khối lượng cốm và dược liệu Tri mẫu 26Bảng 3-6 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Tri mẫu trong cốm phương thuốc Nhị đông sau khi phun thuốc thử 27Bảng 3-7 Khối lượng cốm và dược liệu Nhân sâm 29Bảng 3-8 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Nhân sâm trong cốm phương thuốc Nhị đông sau khi phun thuốc thử 30Bảng 3-9 Khối lượng cốm và dược liệu Mạch môn đông 32Bảng 3-10 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Mạch môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông sau khi phun thuốc thử 33Bảng 3-11 Khối lượng cốm và dược liệu Hoàng cầm 35Bảng 3-12 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Hoàng cầm trong cốm phương thuốc Nhị đông soi ở bước sóng 254 nm 36Bảng 3-13 Khối lượng cốm và dược liệu Hà diệp 38Bảng 3-14 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Hà diệp trong cốm phương thuốc Nhị đông soi ở bước sóng 366 nm 39Bảng 3-15: Khối lượng cốm và dược liệu Cam thảo 41Bảng 3-16 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Cam thảo trong cốm phương thuốc Nhị đông soi ở bước sóng 366 nm 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3-1 Khảo sát phương pháp chiết Thiên môn đông sau khi phun thuốc thử vanillin

2,0 % trong ethanol và acid sulfuric 20

Hình 3-2 Sắc kí đồ định tính Thiên môn đông sau khi phun thuốc thử 21

Hình 3-3 Khảo sát phương pháp chiết Thiên hoa phấn soi ở bước sóng 366 nm 23

Hình 3-4.Sắc kí đồ định tính Thiên hoa phấn soi ở bước sóng 366 nm 24

Hình 3-5 Khảo sát phương pháp chiết Tri mẫu sau khi phun thuốc thử vanillin 2,0% trong ethanol và acid sulfuric 26

Hình 3-6 Sắc kí đồ định tính Tri mẫu sau khi phun thuốc thử 27

Hình 3-7 Khảo sát phương pháp chiết Nhân sâm sau khi phun thuốc thử vanillin 2,0% trong ethanol và acid sulfuric 29

Hình 3-8 Sắc kí đồ định tính Nhân sâm sau khi phun thuốc thử 30

Hình 3-9 Khảo sát phương pháp chiết Mạch môn đông sau khi phun thuốc thử vanillin 2,0% trong ethanol và acid sulfuric 32

Hình 3-10 Sắc kí đồ định tính Mạch môn đông sau khi phun thuốc thử 33

Hình 3-11 Khảo sát phương pháp chiết Hoàng cầm soi ở bước sóng 254 nm 35

Hình 3-12 Sắc kí đồ định tính Hoàng cầm soi ở bước sóng 254 nm 36

Hình 3-13 Khảo sát phương pháp chiết Hà diệp soi ở bước sóng 366 nm 38

Hình 3-14 Sắc kí đồ định tính Hà diệp soi ở bước sóng 366 nm 39

Hình 3-15 Khảo sát phương pháp chiết Cam thảo soi ở bước sóng 366 nm 41

Hình 3-16 Sắc kí đồ định tính Hà diệp soi ở bước sóng 366 nm 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh nội tiết- chuyển hóa, gây nên nhiều biến chứng, đặc biệt là các biến chứng về tim mạch, đang là vấn đề sức khỏe toàn cầu của thế kỉ XXI Bệnh có chiều hướng gia tăng không chỉ ở các nước phát triển mà cả những nước đang phát triển Theo công bố của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm

2006 toàn thế giới có 246 triệu người mắc bệnh ĐTĐ Dự báo của Tổ chức Y tế thế giới, tới 2025 sẽ có 300-330 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, chiếm tỷ lệ 5,4% dân số toàn cầu [10] Bệnh ĐTĐ nếu không được chữa trị sẽ gây ra các biến chứng nghiêm trọng Biến chứng cấp tính như nhiễm toan ceton, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu, hạ đường huyết, hay các biến chứng mạn tính là biến chứng mạch máu lớn, mạch máu nhỏ, [4] Trong Y học cổ truyền thì bệnh đái tháo đường cũng được đề cập đến trong các sách y văn về nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh và cách chữa trị Phương thuốc Nhị đông với 8

vị dược liệu: Thiên môn đông, Thiên hoa phấn, Tri mẫu, Nhân sâm, Mạnh môn đông, Hoàng cầm, Cam thảo, Hà diệp là một trong các phương thuốc cổ được giới thiệu trong y văn dùng để điều trị bệnh Đái tháo đường thông qua cơ chế dưỡng âm thanh nhiệt, sinh tân chỉ khát [7], [10]

Tác dụng điều trị đái tháo đường của phương thuốc đã được đưa vào nghiên cứu Tuy nhiên ứng dụng phương thuốc để sản xuất các chế phẩm trên thực tế còn bị hạn chế, chưa được sử dụng rộng rãi Với mong muốn đem lại sự tiện lợi và tính ưu việt cho các phương thuốc cổ truyền thì việc nghiên cứu bào chế và tiêu chuẩn hóa phương thuốc cổ truyền với các dạng bào chế hiện đại là vô cùng cần thiết Cốm là một dạng thuốc dễ sử dụng và có thể sử dụng được cả trên bệnh nhân gặp vấn đề về nuốt Hiện nay, cốm Nhị đông đã được bào chế thành công nhưng bên cạnh đó chưa có nghiên cứu nào về tiêu chuẩn chuẩn hóa dạng bào chế thuốc cốm này nên việc xác định sự có mặt của các dược liệu trong cốm phương thuốc là rất cần thiết

Từ những lý do trên, đề tài “Khảo sát dấu vân tay hóa học của cốm phương thuốc Nhị đông bằng sắc kí lớp mỏng” thực hiện với mục tiêu: Định tính, xác định tính đặc hiệu của các vị thuốc trong phương thuốc Nhị đông bằng sắc kí lớp mỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh Đái tháo đường

1.1.1 Theo quan điểm y học hiện đại

1.1.1.1 Định nghĩa

Đái tháo đường là một bệnh mạn tính gây ra bởi sự thiếu hụt tuyệt đối hoặc tương đối insulin, dẫn đến các rối loạn chuyển hóa hydratcarbon Bệnh được đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết mạn tính và các rối loạn chuyển hóa [4]

1.1.1.2 Căn nguyên bệnh sinh

- Đái tháo đường type I:

 Yếu tố nguy cơ: Kháng nguyên HLA-DR3, HLA-DR4

 Yếu tố khởi phát: Nhiễm virus, stress chuyển hóa/ yêu cầu quá mức

 Yếu tố bệnh sinh: Phá hủy đảo tụy theo cơ chế tự miễn [4]

- Đái tháo đường type II:

 Yếu tố nguy cơ: Tiền sử gia đình, ăn nhiều, ít vận động thể lực, yếu tố chủng tộc, nhiễm độc

 Yếu tố khởi phát: Béo phì, stress chuyển hóa/ yêu cầu quá mức

 Yếu tố bệnh sinh: Các tế bào đảo tụy thoái hóa/ suy yếu dần dần; giảm receptor insulin ở ngoại biên [4]

1.1.1.3 Triệu chứng Lâm Sàng

Hậu quả của tăng glucose máu

- Đái nhiều, số lượng nước tiểu tăng, tiểu đêm và khát nhiều

- Rối loạn thị giác (thay đổi áp lực thẩm thấu trong nhãn cầu)

- Viêm âm hộ, âm đạo, viêm niệu đạo, bao quy đầu (nhiễm trùng tiết niệu) Hậu quả của rối loạn chuyển hóa glucose

- Ngủ lịm, yếu mệt, giảm cân (thiếu glucose trong tế bào)

- Nhiễm toan ceton (tăng chuyển hóa mỡ)

Một số biến chứng mạn tính của tăng glucose máu và tăng lipid máu: Bệnh lý mạch máu, tim, thận, thần kinh, mắt, nhiễm khuẩn, bệnh khớp [4]

 Liệu pháp insulin: Chỉ định bắt buộc đối với bệnh đái tháo đường type I

 Thuốc hạ đường huyết: Các sulfonylurea, các biguanid

1.1.2 Theo quan điểm y học cổ truyền

- Bệnh đái tháo đường thuộc phạm vi chứng tiêu khát của y học cổ truyền với 3 triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều, tiểu tiện nhiều [12], [15]

- Nguyên nhân: Do ăn uống nhiều đồ cay, béo, ngọt, do sang chấn tinh thần tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của các phủ tạng, vị, thận bị hao tổn Hỏa làm phế âm hư gây chứng khát, vị âm hư gây đói nhiều người gầy, thận âm hư không tàng trữ tinh hoa của ngũ cốc, gây tiểu tiện nhiều ra nhiều chất đường [12], [15]

- Điều trị: Lấy dưỡng âm thanh nhiệt, sinh tân dịch là cơ sở, nhưng trên lâm sàng, hội chứng của bệnh đái đường có khi thiên về khát nhiều, thiên về đói nhiều, thiên về tiểu tiện nhiều, nên cách chữa còn tùy theo chứng mà có trọng điểm gia giảm,

vì thận là nguồn gốc của âm dịch và nơi tàng trữ tinh vi của ngũ cốc, nên vẫn lấy bổ thận âm làm chính [15]

1.2 Phương thuốc Nhị Đông

1.2.1 Xuất xứ

Xuất xứ: Y học tâm ngộ [7]

Hà diệp 0,5 g Cam thảo 0,5 g

1.2.3 Công năng, chủ trị của phương thuốc

- Công năng: Dưỡng âm thanh nhiệt, sinh tân chỉ khát

- Chủ trị: Thượng tiêu, khát mà uống nhiều, nóng phổi ho, ít đờm

- Giải thích phương thuốc: Trong phương thuốc có Thiên môn đông, Mạch môn đông, Thiên hoa phấn, dưỡng âm thanh phế, sinh tân nhuận táo; Nhân sâm, Cam thảo

bổ ích phế khí; Hoàng cầm, Tri mẫu, Hà diệp thanh trừ phế nhiệt Toàn bài dùng đồng thời phù chính và khu tà, có công năng dưỡng âm thanh nhiệt, sinh tân chỉ khát [7]

1.2.4 Định tính phương thuốc

Chưa có chuyên luận về định tính phương thuốc Nhị đông [5], [20], [21]

1.3 Tổng quan về các vị thuốc trong cốm phương thuốc Nhị đông

1.3.1 Thiên môn đông

Tên khoa học: Radix Asparagi cochinchinensis [5]

Bộ phận dùng: Rễ đã chế biến phơi hay sấy khô của cây Thiên môn đông

[Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.], họ Thiên môn đông (Asparagaceae) [5]

1.3.1.1 Thành phần hóa học

- Saponin: ASP-IV’-ASP VII’ [3]

- Phytosterol: β-sitosterol [16]

- Carbonhydrat: 7 oligosaccharid (neokestose và 6 oligo- saccharid) [3]

- Acid amin tự do: Asparagin [3], [9], [16], citrulin, serin, threonine, prolin [3]

1.3.1.2 Tác dụng sinh học

- Tác dụng kháng khuẩn: Nước sắc Thiên môn đông có tác dụng ức chế sự phát

triển của các chủng Bacillus anthracis, Streptococcus helmolyticus A và B,

Staphylococcus areus, Staphylococcus cireus [16]

- Ảnh hưởng độc với tế bào ung thư: Thiên môn đông có tác dụng ức chế men dehydrogenase của tế bào bệnh bạch cầu lympho ác tính, tế bào bạch cầu hạt mạn tính

và tế bào bạch cầu đơn nhân Dịch chiết Thiên môn đông có tác dụng kích phát sự hoạt động của interferon [16]

- Tác dụng chống oxy hóa [18], [28] và có tác dụng hạ đường huyết [18]

- Các tác dụng khác: Hoạt chất asparagin trong Thiên môn đông có tác dụng lợi tiểu [3], [8] Theo tài liệu nước ngoài (Perry, M.Lily) Thiên môn đông còn có tác dụng lợi đờm, giảm ho, hạ nhiệt và bổ [16]

 Dưỡng vị sinh tân: Dùng cho các trường hợp sau khi ốm dậy, tân dịch hao tổn, dùng Thiên môn đông có thể tư âm nhuận táo [5], [6], [13], [16]

 Dưỡng tâm âm: Dùng để trị bệnh tâm trong trường hợp tâm huyết không đủ, tim đập loạn nhịp, hồi hộp, hắt hơi, vô lực, lưỡi miệng sinh mụn nhọt, mồ hôi nhiều có thể bổ tâm huyết, an thần [5], [13], [16]

Tên khoa học: Radix Trichosanthis [21]

Bộ phận dùng: Rễ được phơi sấy hoặc chế biến của cây Qua lâu (Trichosanthes

kirilowii Maxim.), hoặc cây Song biên qua lâu (Trichosanthes rosthornii Harms), họ

Bí (Cucurbitaceae) [21]

- Gây sảy thai [16]

- Có tác dụng ức chế yếu trên men aldose reductase [16]

1.3.2.3 Tác dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt chua, tính mát Quy vào 2 kinh phế và vị [6], [16]

- Công năng, chủ trị: Thanh nhiệt giáng hỏa, sinh tân dịch, lợi sữa [6], [16]

Tên khoa học: Rhizoma Anemarrhenae [5]

Bộ phận dùng: Thân rễ phơi hoặc sấy khô của cây Tri mẫu (Anemarrhena

asphodeloides Bunge), họ Hành (Liliaceae) [5]

1.3.3.1 Thành phần hóa học

- Saponin [9], [16], [32] và sapogenin steroid: Sarsasapogenin, sarsa-sapogenin glycoside [16]

- Flavonoid, phenylpropanoid, benzophenones, alkaloid [32]

- Norlignan: Hinokiresinol, oxyhinokiresinol [16]

 Thanh nhiệt giáng hỏa: Dùng khi sốt cao phiền khát [5], [6], [13]

 Tư âm thoái chưng: Dùng trong chứng âm hư hỏa vượng hoặc cốt chưng trào nhiệt, tự hãn [5], [6], [13]

 Sinh tân chỉ khát: Dùng khi tân dịch bị hư hao, vị táo miệng khát [5], [6], [13]

Tên khoa học: Rhizoma & Radix Ginseng [5]

Bộ phận dùng: Thân rễ và rễ đã phơi hay sấy khô của cây Nhân sâm (Panax

ginseng C.A.Mey), họ Nhân sâm (Araliaceae) Sâm trồng gọi là viên sâm, sâm mọc

hoang gọi là sơn sâm [5]

1.3.4.1 Thành phần hóa học

- Saponin: Thành phần chính trong Nhân sâm là các saponin triterpenoid nhóm dammaran gọi chung là ginsenosid [3], [9] Các saponin xem là quan trọng nhất trong Nhân sâm là ginsenosid Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rf, Rg1 và Rg2, những saponin có hàm lượng cao nhất là Rb1, Rb2, Rg2 [3]

- Các thành phần khác: Tinh dầu [9] (eremophyllen, β-gurjunen, dendren, alloaromadendren…) chiếm 0.05-0.25%, các hợp chất polyacetylen (panaxylnol, panaxidol, panaxitriol), các vitamin B1, B2 các phytosterol 0.029%, các hợp chất đường đơn, oligosid và các glycan Ngoài ra, còn có các peptidoglycan (các panxan A-L, Q-U) [3]

- Giảm lượng cholesterol của huyết thanh thí nghiệm trên chuột [2], [3]

- Làm giảm hoạt động nhưng lại làm thức tỉnh [3]

- Có tác dụng chống stress ở chuột làm thí nghiệm [2], [3]

- Tăng khả năng nhận biết và trí nhớ của chuột [3]

- Trên huyết áp có hai giai đoạn tăng và hạ [2], [3], [9]

- Tác dụng kích thích tổng hợp ARN trên gan của chuột cống nếu tiêm ginsenosid vào màng bụng 4 giờ trước khi tiêm các chất tiền sinh [2], [3]

- Tác dụng chuyển glucose thành glycogen, ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen, ATP hoặc creatinin phosphate và ngăn ngừa hiện tượng tăng acid lactic và acid pyruvic trong cơ thể của chuột cống thí nghiệm [2], [3]

- Tăng bài niệu kèm giảm ure [2], [3]

- Tăng tác dụng bảo vệ cơ thể đối với bức xạ tốt hơn ionol [2], [3]

- Tác dụng giảm sốt, giảm đau do thấp khớp [3]

- Tác dụng tăng kích dục, Ginsenosid Rc có tác dụng tăng tính linh động của tinh trùng [3]

Tên khoa học: Radix Ophiopogonis japonici [5]

Bộ phận dùng: Rễ củ đã phơi hay sấy khô cùa cây Mạch môn đông

[Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl], họ Mạch môn đông (Convallariaceae) [5]

1.3.5.1 Thành phần hóa học

- Saponin steroid: Ophiopogonin A, B, C, D [3], [16], [36]

- Các hợp chất sterol: β- stitosterol, stigmasterol và β-sitosterol- β-D- glucosid [3], [16]

- Carbohydrat: Glucofructosan và các đường như glucose, fructose và saccharose [3], [9], galactose [22]

1.3.5.2 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống viêm [16]

- Tác dụng bảo vệ tim mạch ở chuột bị tiểu đường [39]

- Tác dụng gây teo tuyến ức ở mức độ yếu [16]

- Tác dụng kháng khuẩn: Phế cầu, và một số chủng vi khuẩn khác như tụ cầu

vàng, Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, … [16]

- Tác dụng hạ đường huyết của Mạch môn đông đã được chứng minh trên các động vật thí nghiệm [3], [16]

- Tác dụng chống ung thư tuyến tụy [22]

Tên khoa học: Radix Scutellariae [5]

Bộ phận dùng: Rễ được phơi hoặc sấy khô và cạo vỏ của cây Hoàng cầm

(Scutellaria baicalensis Georgi), họ Bạc hà (Lamiaceae) [5]

1.3.6.1 Thành phần hóa học

- Flavonoid: Scutellarin, baicalin [3], [9], [13], [16], [34], baicalein, oroxylin A, skullcapflavon [3]

- Có 12 glycodsid được tìm thấy trong rễ Hoàng cầm: Wogonin-5-β-D glucoside, wogonosid, wogonin, 7-O-glucuronid, baicalein-7-O-glucosid, oroxylinA-7-O-glucuronid, apigenin-7-O-glucuronid [17]

- Ngoài ra trong rễ Hoàng cầm còn có tannin thuộc nhóm pyrocatechic (2-5%), nhựa [3], [9], [13], [17]

1.3.6.2 Tác dụng sinh học

- Tác dụng kháng khuẩn: Cao ether rễ Hoàng cầm có hoạt tính kháng khuẩn

trên các vi khuẩn Gr (+) Trong các flavon, wogonin có tác dụng ức chế Vibrio comma

và Staphylococcus aureus [17]

- Tác dụng hạ huyết áp [3], [9], [13]

- Tác dụng hạ đường huyết [24]

- Tác dụng hạ nhiệt, lợi niệu (wogonin, baicalin, baicalein), giảm co thắt cơ trơn

ở ruột, tác dụng an thần, chống oxy hóa, chống ung thư, chống kết tập tiểu cầu, giảm nồng độ cholesterol và triglycerid huyết thanh Baicalin, baicalein và wogonin ức chế

sự tăng độ thấm của mạch, làm giảm phù và ngăn chặn sự phát triển thương tổn thứ phát trong viêm khớp trên chuột thí nghiệm [3], [9], [13]

- Các flavon trong Hoàng cầm có tiềm năng trong điều trị các bệnh về viêm, ung thư và các bệnh liên quan đến virus [29]

1.3.6.3 Tác dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính hàn Quy vào 6 kinh tâm, phế, can, đởm, đại tràng, tiểu tràng [5], [6], [13], [17]

- Công năng, chủ trị [5], [6], [13], [17]:

 Thanh thấp nhiệt, trừ hỏa độc ở tạng phế: Dùng cho các bệnh phế ung, phế

có mủ, viêm phổi… gây sốt cao; hoặc trường hợp hàn nhiệt vãng lai, trị ho

do phế nhiệt

 Lương huyết an thai: Dùng trong các trường hợp thai động chảy máu

 Trừ thấp nhiệt ở vị tràng: Dùng trong các bệnh tả, lỵ, đau bụng

 Chỉ huyết: Dùng trong bệnh thổ huyết, chảy máu cam, đại tiểu tiện ra máu, băng huyết hoặc bí tiểu tiện

 Thanh can nhiệt: Dùng chữa đau mắt đỏ

Tên khoa học: Folium Nelumbinis nuciferae [5]

Bộ phận dùng: Lá bánh tẻ đã bỏ cuống, phơi hoặc sấy khô của cây Sen

(Nelumbo nucifera Gaertn.), họ Sen (Nelumbonaceae) [5]

1.3.7.1 Thành phần hóa học:

- Alkaloid 0.77- 0.84%, trong đó có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, pronuciferin, O- nornuciferin, armepavin, N-noramepavin, methylcoclaurin, nepherin, N-methylisococlaurin [6], [16]

- Flavonoid: Isorhamnetin, keampferol,… [33]

- Lá sen chứa leucocyanidin, leucodelphinidin, nelumbosid [16]

- Vitamin C, acid citric, acid tartric, acid oxalic [9]

- Tác dụng kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn Gr (-) và Gr (+) [16]

- An thần, tăng trương lực và co bóp cơ tử cung nhỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi histamine và acetylcholine Ngoài ra còn có tác dụng chống choáng phản

vệ [16]

- Tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim gây nên do calci clorid, bari clorid [16]

1.3.7.3 Tác dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính mát Quy vào 3 kinh tâm, tỳ, thận [5], [16]

- Công năng, chủ trị: Thanh thử, lợi thấp, lương huyết, chỉ huyết Chủ trị: trúng thử, háo khát, ỉa chảy do thử thấp, nôn máu, chảy máu cam, tiểu tiện ra máu do huyết nhiệt [5]

- Liều dùng 3-9 g dược liệu khô, dược liệu tươi từ 15-30 g [5]

1.3.7.4 Định tính:

Định tính bằng sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Hà diệp chuẩn [1], [5] (phụ lục 3)

1.3.8 Cam thảo

Tên khoa học: Radix Glycyrrhizae

Bộ phận dùng: Rễ còn vỏ hoặc đã cạo lớp bần, được phơi hay sấy khô của ba

loài Cam thảo Glycyrrhizae uralensis Fisch., Glycyrrhiza inflata Bat hoặc Glycyrrhiza

glabra L., họ Đậu (Fabaceae) [5]

1.3.8.1 Thành phần hóa học

- Saponin: Saponin quan trọng nhất là acid glycyrrhizic [2] Các dẫn chất triterpenoid khác như acid liquiritic; acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic; acid 24-hydroxyglycyrrhetic; glabrolid; desoxyglabrolid; isoglabrolid; acid liquiridiolic… [3]

- Các flavonoid: Điển hình là 2 flavonoid liquiritin và isoliquiritin[2] Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: Isoflavan (glabridin) [38], isoflavon (glabron); isoflaven (glabren) [3] Các dẫn chất coumarin: Umbelliferon; herniarin; liqcoumarin

- Ngoài ra trong rễ Cam thảo còn có 20-25% tinh bột [2], 3-10% glucose và saccharose [3], các hợp chất có nhân estrogen, có nhân sterol với hàm lượng thấp [17]

1.3.8.2 Tác dụng sinh học

- Các flavonoid có trong Cam thảo có tác dụng chống oxy hóa [35], ngăn ngừa

xơ vữa động mạch, giảm tích lũy mỡ bụng, hạ đường huyết [3], bảo vệ tim mạch [37]

- Tác dụng kháng khuẩn: Cao chiết ethanol Cam thảo có tác dụng ức chế các

loại tụ cầu vàng, trực khuẩn E.Coli và trùng roi, còn có tác dụng chống viêm [17]

1.3.8.3 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, tính bình Quy kinh can, tỳ, thông hành 12 kinh [13]

- Công năng, chủ trị: Ích khí, dưỡng huyết, dùng trong bệnh khí huyết hư nhược mệt mỏi thiếu máu Nhuận phế, chỉ ho, tả hỏa giải độc, điều hòa phương thuốc, hoãn cấp chỉ thống [13]

- Liều dùng 4-12g [5]

1.3.8.4 Định tính

Định tính bằng sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Cam thảo chuẩn [5], [20], [21] (phụ lục 3)

1.4 Tổng quan về sắc kí đồ dấu vân tay

- Định nghĩa về dấu vân tay hóa học: Là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu thị dưới dạng sắc kí đồ, các phổ và các đồ thị…được ghi bằng các kỹ thuật phân tích Các kỹ thuật sắc kí (bao gồm sắc kí lỏng và sắc kí khí) thường được áp dụng khi thiết lập dấu vân tay hóa học của dược liệu [5]

- Yêu cầu thiết lập sắc kí đồ dấu vân tay: Lựa chọn mẫu dược liệu phải đảm bảo tính đại diện và bảo quản đúng quy định theo chuyên luận riêng Phương pháp chiết và điều kiện sắc kí phù hợp được lựa chọn và tối ưu hóa tùy thuộc thành phần hóa học hoặc các chất đánh dấu trong mỗi dược liệu Dịch chiết được sử dụng cho phân tích là toàn phần hay nhóm chất đại diện được quy định trong từng chuyên luận riêng Phương pháp cần đảm bảo tính chính xác, độ lặp lại và độ ổn định [5]

- Phương pháp xác định dấu vân tay hóa học của dược liệu bằng kỹ thuật sắc kí lớp mỏng được tiến hành theo 2 bước chính:

 Phân tích sàng lọc, xác định các thành phần chưa được biết của dược liệu

 Tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của nhóm chất

đã được phát hiện sơ bộ từ kết quả phân tích sàng lọc của dược liệu bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng [8]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cốm vị thuốc: Thiên môn đông, Thiên hoa phấn, Tri mẫu, Nhân sâm, Mạch môn đông, Hoàng cầm, Cam thảo, Hà diệp được bào chế bằng phương pháp sắc với nước, cô, sấy khô, được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy, Hà Nội), đạt tiêu chuẩn cơ sở (phụ lục 4)

- Cốm phương thuốc: Bào chế bằng cách phối hợp cốm các vị thuốc theo tỉ lệ trong công thức (bảng 2-1)

- Cốm Placebo tương ứng với mỗi vị thuốc: Bào chế bằng cách phối hợp cốm các vị thuốc theo công thức cốm phương thuốc mà không có vị dược liệu cần đối chiếu

Bảng 2-1 Công thức bào chế của một gói cốm Nhị đông (3,75 g)

Thành phần Khối lượng cốm/gói cốm

- Tủ sấy Memmert (Germany)

- Chày, cối, rây 500

- Máy siêu âm

- Máy ly tâm

- Cân kỹ thuật Precisa (Switzeland)

- Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland) gồm:

Bộ chấm bản mỏng Linonat V, buồng triển khai đáy kép và bộ chụp ảnh CAMAG TLC scanner III, bếp sấy bản mỏng CAMAG

- Bếp cách thuỷ

- Pipet chính xác các loại, micro pipet, và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

2.1.2.2 Hóa chất, dược liệu chuẩn

- Dược liệu chuẩn được cung cấp bởi công ty VCP

- Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 dốc Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Ethanol tuyệt đối, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, butyl acetat, acid formic, methanol, chloroform,…

- Bản sắc kí lớp mỏng Silicagel 60 F254 của Merck

2.1.2.3 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Định tính và xác định tính đặc hiệu của các vị dược liệu trong cốm phương thuốc Nhị đông bằng sắc kí lớp mỏng [5], [8]

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

- Dược liệu chuẩn: Thiên môn đông, Thiên hoa phấn, Tri mẫu, Nhân sâm, Mạch

môn đông, Hoàng cầm, Cam thảo, Hà diệp

- Các mẫu cốm vị thuốc: Thiên môn đông, Thiên hoa phấn, Tri mẫu, Nhân sâm, Mạch môn đông, Hoàng cầm, Cam thảo, Hà diệp

- Cốm phương thuốc Nhị đông: Trộn các mẫu cốm vị thuốc trong phương thuốc với tỷ lệ các mẫu cốm như sau:

Thiên môn đông 1,2 g

Thiên hoa phấn 0,225 g

Tri mẫu 0,375 g

Nhân sâm 0,1875 g

Hoàng cầm 0,3 g Mạnh môn đông 1,35 g Cam thảo 0,075 g

Hà diệp 0,0375 g

- Cốm placebo được trộn theo tỷ lệ cốm vị thuốc trong phương thuốc với khối lượng thích hợp theo bảng sau:

Bảng 2-2 Tỷ lệ khối lượng cốm placebo

Khối

lượng

cốm (g)

TMD

THP P-TM P-NS

MMD P-HC P-CT P-HD

Khảo sát chiết các mẫu cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc của từng

vị dược liệu trên một số dung môi chiết (methanol, ethanol, ether, …) và phương pháp chiết (ngâm ở nhiệt độ phòng, chiết nóng, chiết siêu âm,…) Lựa chọn phương pháp chiết cho sắc kí đồ có vết phun gọn, các vết tách tốt, cốm phương thuốc và cốm vị thuốc có nhiều vết rõ, tương ứng, các vết đặc trưng hiện rõ

2.2.3 Điều kiện triển khai sắc kí

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60 F254, hoạt hóa ở 110℃ trong 60 phút

- Pha động: Khảo sát các hệ dung môi khác nhau tùy từng dược liệu

- Phun mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag), tốc độ phun 100 nl/s

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc kí tự động ADC2

+ Kiểm soát độ ẩm: Dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút

+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 25 ml dung môi pha động

+ Thể tích dung môi khai triển: 10 ml

+ Khoảng cách triển khai là 80 mm kể từ đáy bản mỏng Sấy khô bản mỏng trong 5 phút

Tiến hành: Phun các mẫu trên băng dài 6 mm, cách mép dưới bản mỏng 10 mm, cách mép ngoài 20 mm Triển khai theo điều kiện chung

Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc thuốc thử hiện màu đặc trưng tùy loại dược liệu

Chụp ảnh sắc kí đồ: Buồng chụp Camag

Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên môn đông trong cốm phương thuốc Nhị đông

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Cân các mẫu đã được tính toán vào 3 bình nón riêng biệt theo lượng đã tính toán:

 Cốm placebo Thiên môn đông: 2,55 g

 Cốm phương thuốc Nhị đông: 3,75 g

 Cốm vị thuốc Thiên môn đông: 1,2 g

- Chuẩn bị 3 mẫu cùng một điều kiện chiết với hai phương pháp chiết như sau:

Phương pháp chiết 1: Cân các mẫu đã được tính toán vào bình nón có nút mài

100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem

cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 20 ml nước, chiết bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 20 ml chloroform Gộp dịch chiết chloroform đem cô cách thủy tới

cắn, hoà tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch để phun sắc kí

Phương pháp chiết 2: Cân các mẫu đã được tính toán vào bình nón có nút mài

100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm trong 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy tới cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước 3 lần, mỗi lần 20 ml n-butanol bão hòa Gộp dịch chiết n-butanol đem cô cách thủy tới cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol được dung

dịch để phun sắc kí

- Chọn hệ dung môi ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1) để triển khai mẫu chiết (cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc) của từng phương pháp chiết trên cùng một bản mỏng

Kết quả: Kết quả của 2 phương pháp chiết được thể hiện ở hình 3-1:

Hình 3-1 Khảo sát phương pháp chiết Thiên môn đông sau khi phun thuốc thử

vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric

Ghi chú:

P-Clo: Cốm placebo chiết chloroform P-Me: Cốm placebo chiết butanol

ND- Clo: Cốm phương thuốc chiết chloroform ND- Me: Cốm phương thuốc chiết butanol

C- Clo: Cốm vị thuốc chiết chloroform C- Me: Cốm vị thuốc chiết butanol

Nhận xét: Phương pháp chiết 2 cho các vết tách tốt hơn, vết tách rõ và có vết

đặc hiệu không có ở cốm placebo nhưng có ở cốm phương thuốc và cốm vị thuốc Chọn phương pháp chiết 2 để khảo sát tiếp điều kiện sắc kí

3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu: Cốm phương thuốc, cốm placebo, cốm vị thuốc, dược liệu chuẩn

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cốm và dược liệu đã được tính toán:

Bảng 3-1 Khối lượng cốm và dược liệu Thiên môn đông

Cốm placebo Thiên môn đông 2,55 g Cốm vị thuốc Thiên môn đông 1,2 g Cốm phương thuốc Nhị đông 3,75 g Dược liệu Thiên môn đông chuẩn 3 g Cân các mẫu đã được tính toán vào bình nón có nút mài 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm trong 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy tới cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-butanol đã bão hòa nước 3 lần, mỗi lần 20

ml n-butanol bão hòa Gộp dịch chiết n-butanol đem cô cách thủy tới cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch để phun sắc kí

Tiến hành:

 Pha động:

- Hệ 1: Ethyl acetat- methanol- nước (8:2:1)

- Hệ 2: Ethyl acetat- methanol- nước (7:2:1)

- Hệ 3: Ethyl acetat- methanol- nước (6:2:1)

 Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Thiên môn đông: 4 µl

Cốm phương thuốc Nhị đông: 4 µl

Cốm vị thuốc Thiên môn đông: 9 µl

Dược liệu Thiên môn đông chuẩn: 9 µl

 Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc kí theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Phát hiện: Phun thuốc thử vanillin 2,0% trong ethanol và acid sulfuric

Kết quả: Hệ 1 cho vết đặc hiệu và tách vết tốt nhất (hình 3-2 và bảng 3-2)

Bảng 3-2 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Thiên môn đông trong cốm phương

thuốc Nhị đông sau khi phun thuốc thử

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

P-TMD: Placebo Thiên môn đông C-TMD: Cốm vị thuốc Thiên môn đông

ND: Cốm phương thuốc Nhị đông DL-TMD: Dược liệu Thiên môn đông chuẩn

P- TMD DL-TMD

Trên sắc kí đồ quan sát sau khi phun TT vanillin 2,0% trong ethanol và acid sulfuric các vết tách tốt và có vết tương ứng nhau Trong đó:

- Cốm vị thuốc Thiên môn đông có 4 vết tương ứng với dược liệu Thiên môn đông chuẩn (Rf = 0,08; 0,12; 0,16; 0,28)

- Cốm phương thuốc Nhị đông có 9 vết, trong đó có 3 vết tương ứng với cốm vị thuốc và dược liệu Thiên môn đông chuẩn (Rf = 0,08; 0,12; 0,16)

- Cốm phương thuốc Nhị đông và cốm vị thuốc Thiên môn đông có 1 vết đặc hiệu tương ứng với dược liệu Thiên môn đông chuẩn mà placebo không có (Rf = 0,12)

3.2 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Thiên hoa phấn trong cốm phương thuốc Nhị đông

3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Cân các mẫu đã được tính toán vào 3 bình nón riêng biệt theo khối lượng đã tính:

 Cốm placebo Thiên hoa phấn: 4,7 g

 Cốm phương thuốc Nhị đông: 5 g

 Cốm vị thuốc Thiên hoa phấn: 0,3 g

- Chuẩn bị mẫu cùng một điều kiện chiết với hai phương pháp chiết như sau:

Phương pháp chiết 1: Cân các mẫu theo lượng đã tính toán cho vào bình nón

có nút mài 100 ml, thêm 20 ml ethanol, siêu âm 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml ethanol được dịch

đem đi phun sắc kí

Phương pháp chiết 2: Cân các mẫu đã được tính toán vào bình nón có nút

mài 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 20 ml nước, chiết bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 20 ml chloroform Gộp dịch chiết chloroform đem

cô cách thủy tới cắn, hoà tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch để

phun sắc kí

- Chọn hệ dung môi toluen- ethyl acetat- acid formic (4:4:1) để triển khai mẫu chiết (cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc) của từng phương pháp chiết trên cùng một bản mỏng

Kết quả: Kết quả của 2 phương pháp chiết được thể hiện ở hình 3-3:

Hình 3-3 Khảo sát phương pháp chiết Thiên hoa phấn soi ở bước sóng 366 nm Ghi chú:

P-Et: Cốm placebo chiết ethanol P-Clo: Cốm placebo chiết chloroform

ND- Et: Cốm phương thuốc chiết ethanol ND- Clo: Cốm phương thuốc chiết chloroform

C- Et: Cốm vị thuốc chiết ethanol C- Clo: Cốm vị thuốc chiết chloroform

Nhận xét: Phương pháp chiết 2 cho các vết tách tốt hơn, vết tách rõ và có vết

đặc hiệu không có ở cốm placebo nhưng có ở cốm phương thuốc và cốm vị thuốc Chọn phương pháp chiết 2 để khảo sát tiếp điều kiện sắc kí

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu: Cốm phương thuốc, cốm placebo, cốm vị thuốc, dược liệu chuẩn

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cốm và dược liệu được tính toán theo bảng sau:

Bảng 3-3 Khối lượng cốm và dược liệu Thiên hoa phấn

Cốm placebo Thiên hoa phấn 4,7 g Cốm phương thuốc Nhị đông 5 g Cốm vị thuốc Thiên hoa phấn 0,3 g Dược liệu Thiên hoa phấn chuẩn 2 g Cân các mẫu đã được tính toán vào bình nón có nút mài 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút/ 40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 20 ml nước, chiết bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 20 ml chloroform Gộp dịch chiết chloroform đem cô cách thủy tới cắn, hoà tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch để phun sắc kí

Tiến hành:

 Pha động:

- Hệ 1: Toluen- ethyl acetat- acid formic (5:4:1)

- Hệ 2: Toluen- ethyl acetat- acid formic (4:4:1)

- Hệ 3: Tuluen- ethyl acetat- acid formic (4:8:1)

 Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Thiên hoa phấn: 7 µl

Cốm vị thuốc Thiên hoa phấn: 10 µl

Cốm phương thuốc Nhị đông: 7 µl Dược liệu Thiên hoa phấn: 10 µl

 Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc kí theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Phát hiện: Soi dưới bước sóng 366 nm

Kết quả: Hệ 2 cho vết đặc hiệu và vết tách tốt nhất (bảng 3-4 và hình 3-4)

Bảng 3-4.Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Thiên hoa phấn trong cốm phương

thuốc Nhị đông soi ở bước sóng 366 nm

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

P-THP: Placebo Thiên hoa phấn ND: Cốm phương thuốc Nhị đông

C-THP: Cốm vị thuốc Thiên hoa phấn DL-THP: Dược liệu Thiên hoa phấn chuẩn

Trên sắc kí đồ quan sát ở bước sóng 366 nm các vết tách tốt và có vết tương ứng nhau Trong đó:

- Cốm vị thuốc Thiên hoa phấn có 4 vết tương ứng với dược liệu Thiên hoa phấn chuẩn (Rf = 0,05; 0,08; 0,34; 0,79)

- Cốm phương thuốc Nhị đông có 10 vết, trong đó có 4 vết tương ứng với cốm

vị thuốc Thiên hoa phấn (Rf = 0,05; 0,08; 0,34; 0,41), 5 vết tương ứng với dược liệu Thiên hoa phấn chuẩn (Rf = 0,05; 0,08; 0,34; 0,44; 0,61)

- Cốm phương thuốc Nhị đông và cốm vị thuốc Thiên hoa phấn có 1 vết đặc hiệu tương ứng với dược liệu Thiên hoa phấn chuẩn mà placebo không có (Rf = 0,05)

3.3 Định tính và xác định tính đặc hiệu của dược liệu Tri mẫu trong cốm phương thuốc Nhị đông

3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Cân các mẫu đã được tính toán vào 3 bình nón riêng theo lượng đã tính biệt:

 Cốm placebo Tri mẫu: 4,5 g

 Cốm phương thuốc Nhị đông: 5 g

 Cốm vị thuốc Tri mẫu: 0,5 g

- Chuẩn bị 3 mẫu cùng một điều kiện chiết với hai phương pháp chiết như sau:

Phương pháp chiết 1: Cân các mẫu theo lượng đã tính toán cho vào bình nón

có nút mài 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút/ 40 ℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml methanol được

dịch đem đi phun sắc kí

Phương pháp chiết 2: Cân các mẫu theo lượng đã tính toán cho vào bình

nón có nút mài 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút/40℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 10 ml nước + 1

ml HCl Đem đi siêu âm trong 45 phút, để nguội, chiết bằng chloroform 2 lần, mỗi lần 20 ml chloroform Gộp dịch chiết chloroform đem cô cách thủy tới cắn, hoà tan cắn trong 2 ml methanol được dung dịch để phun sắc kí

- Chọn hệ dung môi toluen- ethyl acetat- acid formic (7:4:1) để triển khai mẫu chiết (cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc) của từng phương pháp chiết trên cùng một bản mỏng

Kết quả: Kết quả của 2 phương pháp chiết được thể hiện ở hình 3-5

Hình 3-5 Khảo sát phương pháp chiết Tri mẫu sau khi phun thuốc thử vanillin 2,0%

trong ethanol và acid sulfuric

Ghi chú:

P-Clo: Cốm placebo chiết chloroform P-Me: Cốm placebo chiết methanol

ND- Clo: Cốm phương thuốc chiết chloroform ND- Me: Cốm phương thuốc chiết methanol

C- Clo: Cốm vị thuốc chiết chloroform C- Me: Cốm vị thuốc chiết methanol

Nhận xét: Phương pháp chiết 1 cho các vết tách tốt hơn, vết tách rõ và có vết

đặc hiệu không có ở cốm placebo nhưng có ở cốm phương thuốc và cốm vị thuốc Chọn phương pháp chiết 1 để khảo sát tiếp điều kiện sắc kí

3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu: Cốm phương thuốc, cốm placebo, cốm vị thuốc, dược liệu chuẩn

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cốm và dược liệu được tính toán theo bảng sau:

Bảng 3-5 Khối lượng cốm và dược liệu Tri mẫu

Cốm placebo Tri mẫu 4,5 g Cốm phương thuốc Nhị đông 5 g Cốm vị thuốc Tri mẫu 0,5 g Dược liệu Tri mẫu chuẩn 2 g Cân các mẫu theo lượng đã tính toán cho vào bình nón có nút mài 100 ml, thêm

20 ml methanol, siêu âm 30 phút/ 40 ℃ rồi lọc Gộp dịch lọc, đem cô cách thủy đến

cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml methanol được dịch đem đi phun sắc kí

Tiến hành:

 Pha động:

- Hệ 1: Toluen- aceton (9:1)

- Hệ 2: Toluen- ethyl acetat- acid formic (6:4:1)

- Hệ 3: Toluen- ethyl acetat- acid formic (7:4:1)

- Hệ 4: Toluen- ethyl acetat- acid formic (8:4:1)

 Thể tích phun mẫu: Mỗi mẫu 4 µl

 Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc kí theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Phát hiện: Phun thuốc thử vanillin 2.0% trong ethanol và acid sulfuric Kết quả: Hệ 3 cho vết đặc hiệu và vết tách tốt nhất (bảng 3-6 và hình 3-6)

Bảng 3-6 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Tri mẫu trong cốm phương thuốc Nhị

đông sau khi phun thuốc thử

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

P-TM: Placebo Tri mẫu ND: Cốm phương thuốc Nhị đông

C-TM: Cốm vị thuốc Tri mẫu DL-TM: Dược liệu Tri mẫu chuẩn