NGUYỄN THẾ THÀNH xây DỰNG một số CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CAO đặc THÂN ý dĩ KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Để đảm bảo chất lượng trong quá trình sản xuất của một cơ sở, vấn đề kiểm soát chất lượng phải được thực hiện trong suốt quá trình sản xuất, từ nguyên liệu đầu vào, các sản phẩm trung gi

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THẾ THÀNH

XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CAO ĐẶC THÂN Ý DĨ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, với tình cảm chân thành nhất, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho

em có môi trường học tập tốt trong suốt thời gian em học tập, nghiên cứu tại trường

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn TS Nguyễn Quỳnh Chi

và TS Phạm Tuấn Anh đã hướng dẫn, chỉ bảo và động viên giúp em vượt qua khó

khăn khi thực hiên khóa luận này

Xin cảm ơn bạn Phí Khánh Linh đã hỗ trợ, giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong

những ngày đầu thực hiện khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ

em và đưa ra nhiều góp ý trong quá trình thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2020

Sinh viên Nguyễn Thế Thành

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Tác dụng dược lý 7

1.1.5 Công dụng 9

1.2 Vài nét về hướng dẫn xây dựng chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu 9

1.2.1 Theo Dược điển Việt Nam V 9

1.2.2 Theo hướng dẫn của châu Âu 10

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 13

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý dĩ bằng HPLC 14

2.2.2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân

cây Ý dĩ bằng HPLC 15

2.3.2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý dĩ bằng HPLC 22

3.1.1 Thu mẫu và điều chế cao nước Ý dĩ 22

3.1.2 Khảo sát quá trình xử lý mẫu 22

3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 23

3.2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ 26

3.2.1 Cảm quan 26

3.2.2 Mất khối lượng do làm khô 26

3.2.3 pH 27

3.2.4 Định tính bằng phản ứng hóa học 28

3.2.5 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28

3.2.6 Định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân Ý dĩ bằng HPLC 29

3.3 Bàn luận 30

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

COD Calcium oxalate dihydrate

COM Calcium oxalate monohydrate

DĐVN V Dược Điển Việt Nam V

FDA The Food and Drug Administration

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IC50 Half maximal inhibitory concentration

ICH The International Council for Harmonisation of Technical

Requirements for Pharmaceuticals for Human Use

RSD Relative Standard Deviation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần trong hạt Ý dĩ 4

Bảng 1.2 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với cao dược liệu theo DĐVN V 9

Bảng 1.3 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với dược liệu theo EMA 10

Bảng 1.4 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với chế phẩm dược liệu theo EMA 11

Bảng 1.5 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với thuốc dược liệu theo EMA 11

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu Ý dĩ thu hái 13

Bảng 2.2 Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient 16

Bảng 2.3 Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ 20

Bảng 3.1 Kết quả hàm lượng cao từ 10 mẫu dược liệu 22

Bảng 3.2 Hàm lượng acid p-coumaric chiết được trong mỗi lần 22

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 24

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 24

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu 25

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu NA01 25

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu BN01 26

Bảng 3.8 Kết quả hàm ẩm các mẫu cao 27

Bảng 3.9 Kết quả xác định pH các mẫu cao 27

Bảng 3.10 Kết quả xác định các nhóm chất trong cao Ý dĩ 28

Bảng 3.11 Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu cao thân Ý dĩ 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm các thứ khác nhau của Ý dĩ [18] 3

Hình 1.2 Thành phần hóa học của thân cây Ý dĩ 7

Hình 3.1 Tổng lượng acid p-coumaric chiết được với số lần chiết khác nhau 23

Hình 3.2 Đường chuẩn và phương trình hồi quy của acid p-coumaric 24

Hình 3.3 Hình ảnh sắc ký đồ cao thân Ý dĩ khi quan sát ở UV 254 nm (A), 366 nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin - acid sulfuric (C) 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.) là một cây thuốc nam có nhiều công dụng hữu

ích đối với sức khỏe của cả người lớn lẫn trẻ nhỏ Trong đông y, Ý dĩ được sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc thẩm thấp và lợi tiểu Bộ phận của Ý dĩ thường được sử dụng

là hạt (quả) Hạt Ý dĩ đã được nghiên cứu với rất nhiều tác dụng như chống ung thư [41], chống dị ứng [38], tác dụng trên nội tiết [53], tác dụng chống oxy hóa [54] Sau khi thu hoạch hạt xong, phần thân còn lại của Ý dĩ thường bị bỏ đi Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy dịch chiết thân cây Ý dĩ có tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu trên cả mô hình

in vitro và in vivo [12], [14] Acid p-coumaric trong thân Ý dĩ là thành phần đã được

chứng minh có hoạt tính [12], [14], là căn cứ để xây dựng tiêu chuẩn định tính cũng như định lượng

Ý dĩ mọc hoang nhiều tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc [13] và loài ý dĩ mọc hoang này thường bị bỏ đi và không có giá trị sử dụng gì Do đó, đây là nguồn tài nguyên dồi dào, có giá trị sử dụng cao và có thể tận dụng nguồn nguyên liệu đang bị lãng phí này để đưa vào sản xuất Hiện nay với các sản phẩm từ thiên nhiên, thay vì sử dụng dược liệu như nguồn nguyên liệu thô, xu hướng hiện nay là sử dụng các dạng bào chế

để thuận tiện Trong đó, dạng bào chế cao đặc hay được sử dụng làm sản phẩm trung gian cho các dạng bào chế khác

Để đảm bảo chất lượng trong quá trình sản xuất của một cơ sở, vấn đề kiểm soát chất lượng phải được thực hiện trong suốt quá trình sản xuất, từ nguyên liệu đầu vào, các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng Từ đó đòi hỏi có tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng Tiếp nối đề tài “Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ”

[12], đề tài “Xây dựng một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng cao đặc thân Ý dĩ” được

thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý dĩ bằng HPLC

2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [46], vị trí của cây Ý dĩ Coix

lachryma-jobi L có thể được tóm tắt như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Hành (Liliopsida) Phân lớp: Thài lài (Commelinidae) Bộ: Lúa (Poales)

Họ: Lúa (Poaceae) Chi: Coix Loài: Coix lachryma-jobi L

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Đặc điểm hình thái: Ý dĩ là một loài cây sống hàng năm, có thể cao tới 1-2 m,

giống cây ngô Thân nhẵn bóng không có lông, có vách dọc Lá hình mác to, dài 10-40

cm, rộng 1,5-3 cm có những gân nổi rõ, gân giữa to Hoa đơn tính mọc cùng gốc, mọc

ở kẽ thành bông Hoa đực mọc phía trên, hoa cái ở phía dưới hình trứng, được bao bọc bởi một lá bắc rất dày Quả thóc (thường gọi nhầm là hạt), hình trứng, một mặt phẳng, một mặt lồi, đáy tròn, đầu thuôn nhọn, có vỏ ngoài mềm, nhẵn bóng, dễ bóc, màu xám, nhạt, nhân màu trắng [9],[13]

Thực vật chí Trung Quốc phân biệt 4 thứ Ý dĩ khác nhau chủ yếu dựa trên hình thái quả [18]:

* Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L

Quả hình trứng, cứng và bóng, kích thước 7-11 x 6-10 mm

* Coix lachryma-jobi L var ma-yuen (Rom) Stapf

Quả mảnh, có rãnh, màu xanh xám hoặc nâu đen, hình elip đến gần hình cầu, kích thước 8-12 x 4-9 mm, giòn, dễ vỡ

* Coix lachryma-jobi L var puellarum (Balansa)

Quả hình cầu, rất cứng rắn, màu trắng hoặc hơi xanh, đường kính 4-5 mm

* Coix lachryma-jobi L var stenocarpa (Oliver)

Quả hình trụ, bóng, màu trắng, hơi xanh hoặc nâu, 7-15 × 2-3 mm

Hình 1.1 Đặc điểm các thứ khác nhau của Ý dĩ [18]

Sinh thái: Ý dĩ là cây ưa sáng và ưa ẩm Tùy theo từng loại giống khác nhau, mà

có loại hạt Ý dĩ thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở phía nam, với nhiệt độ trung bình từ 23-26oC Trong khi đó, giống Ý dĩ trồng ở các tỉnh phía bắc lại thiên về khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới Ý dĩ sinh trưởng tốt trên các loại đất tơi xốp, thoát nước nhanh và giàu chất mùn Từ một quả giống, sau 4-5 tháng, đã tạo thành một khóm gồm nhiều nhánh, có chiều cao đến 2m Hoa Ý dĩ được tạo thành một bông kép sau này cho rất nhiều quả Khi quả chín, toàn cây tàn lụi, phần gốc còn lại tiếp tục

tái sinh cho các thế hệ mới năm sau [13]

Phân bố: Ý dĩ được tìm thấy ở nhiều quốc gia như Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ,

Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philipin, Sri Lanka, Thái Lan, [18] Tại Việt Nam, Ý dĩ mọc tự nhiên phân bố rải rác ở một số tỉnh vùng núi phía bắc, như Lào

mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe suối ở rừng hay trong thung lũng Độ cao phân bố từ 300-1000 m Ý dĩ trồng thường không cố định theo khu vực Vào đầu những năm 90, cây được trồng nhiều ở Kon Tum (Sa Thày), Đồng Nai từ năm 1995-1997 ở Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu) và Hà Nội [13]

1.1.3 Thành phần hóa học

Hạt: Cho đến hiện nay, rất nhiều thành phần của hạt Ý dĩ đã được xác định Một

số nhóm chất chính trong hạt Ý dĩ gồm: carbohydrat; protein; lipid; các chất khoáng; các vitamin, carotenoid, phytosterol, policosanol; polyphenol; alcol phenolic và aldehyd; acid phenolic; flavonoid; lignan và neolignan; lactam và spiroenon

Acid amin Leucin, lysin, arginin, tyrosin,

Acid béo Acid oleic, acid linoleic, acid

palmitic, acid stearic

[19], [51]

Triglycerid

Coixenolid, -monolinolein 1,2-linolein-3-olein, 1,2-olein-3-linolein, 1-palmitin-2-olein-3-linolein 147, triolein và 1,2-olein-3-palmitin

1,2,3-trilinoleylglycerol, 1,2- 149 dilinoleyl-3-oleylglycerol, 1,2-

[4], [29], [31], [32], [33], [51], [54]

dilinoleyl-3-palmitoylglycerol, dioleoyl-1-linoleylglycerol, 150 2-linoleyl-3-oleyl-1-palmitoylglycerol, 1,2,3-trioleylglycerol, 2,3-dioleyl 1-palmitoylglycerol

2,3-ceramide (2S, 3S, 4R)-2-[(20R)-20- hydroxytetracosanoyl-amino]-1,3,4-octadecanetriol

coixenolide [(2S, hexadec-9-enoyl]oxybutan-2-yl]

[50]

Policosanol

docosanol (C22), tetracosanol (C24), hexacosanol (C26) và octacosanol (C28)

[36] [35]

Acid phenolic

Acid benzoic, acid hydroxycinnamic, acid syringic, acid ferulic, acid chlorogenic, acid

vanillic, acid caffeic, acid coumaric và p-hydroxybenzoic và acid protocatechuic

p-[33], [34], [35], [36], [55]

Flavonoid

Các dẫn xuất của nhóm chalcon, flavonol, flavon, flavanon và isoflavon

[30], [33], [35], [48] Lignan và

neolignan

Syringaresinol, 4-ketopinoresinol và mayuenolid

Zhepiresionol và ficusal

[23], [36]

[23]

Rễ: Rễ Ý dĩ chứa protein, chất béo, tinh bột [9] Ngoài ra còn chứa benzoxazolon,

một số dẫn chất lignan, syringyl glycerol [13] Trong đó, nhóm chất benzoxazinoid glycosid đã xác định được công thức của 11 hợp chất [22] gồm coixlachrysid B; (2R)-2-hydroxy-7-methoxy1,4(2H)-benzoxazin-3-on glucosid (HMBOA-Glc); (2R)-2-hydroxy-4,7-dimethoxy-1,4(2H)-benzoxazin-3-on glucosid (HDMBOA-Glc, ) ; (8S)-tarennon ; 8R-evofolin B; alcol 3,4,5-trimethoxybenzylic; α-hydroxypropiosyringon; β-hydroxypropiovanillon; β-hydroxypropiosyringon; 1-O-feruloylglycerol; acid 10Z,13Z-nonadecadienoic

Lá: Chứa benzoxazolon [13]

Thân: Các nghiên cứu tới hiện tại đã xác định được trong thân Ý dĩ có các nhóm

chất: flavonoid, coumarin, đường khử, polysaccharid, sterol, acid hữu cơ [12] Từ các

phân đoạn dịch chiết của thân cây Ý dĩ, sự có mặt của 7 hợp chất đã được xác định:

stigmast-4-en-3-on 1, β-sitosterol 2, stigmasterol 3, (E)-ethyl-3-(4-hydroxyphenyl)

acrylat 4, acid isovanillic 5, 4-hydroxy benzaldehyd 6 [6], [8] và acid p-coumaric 7

[14]

stigmasterol beta-sitosterol

(E)-ethyl-3-(4-hydroxyphenyl) acrylat acid isovanillic

4-hydroxy benzaldehyd acid p-coumaric

Hình 1.2 Thành phần hóa học của thân cây Ý dĩ

1.1.4 Tác dụng dược lý

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý của các bộ phận hạt, rễ cây Ý dĩ Tuy nhiên, phần thân thường bị coi là phế phẩm sau khi thu hoạch và cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng dược lý của thân cây Ý dĩ

Hạt: Hiện tại, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của hạt Ý

dĩ từ các cấp độ in vitro, in vivo đến thử nghiệm lâm sàng Hạt Ý dĩ có tác dụng chống

oxy hóa [48], [21], [54]; chống viêm [20], [33], [34], [35] ; tăng cường miễn dịch [16],

[17] ; chống ung thư [23], [37], [51], [41]; chống béo phì [28]; điều hòa nội tiết [31], [49], [53], chống dị ứng [38]

Rễ: Rễ Ý dĩ có tác dụng chống viêm [43], hạ đường huyết [3]

Thân: Các nghiên cứu hiện tại về thân Ý dĩ tập trung vào hai tác dụng chính: đó là

tác dụng hạ đường huyết và tác dụng điều trị sỏi tiết niệu

Theo hướng tác dụng hạ đường huyết, một nghiên cứu của Phạm Văn Năm đã đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết thân cây Ý dĩ trên mô hình gây đái tháo đường bằng streptozocin Kết quả cho thấy sau 5 ngày liên tục uống dịch chiết, trên lô chuột uống dịch sắc nước, glucose huyết giảm 48,28 % và trên lô chuột uống dịch chiết ethanol giảm 51,16 % [10] Phân đoạn cloroform có tác dụng gây hạ glucose huyết tốt nhất trong các phân đoạn dịch chiết thân Ý dĩ Cụ thể: sau 7 ngày cho chuột uống cắn phân đoạn chiết cloroform thân cây Ý dĩ (33 mg/kg) glucose huyết hạ 50,84 % so với ngày đầu tiên (gliclazid 20 mg/kg giảm 57,33 %, metformin 53,0 %) [5]

Theo hướng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu, nhóm nghiên cứu của Phạm Đức Vịnh và cộng sự [14] bước đầu đã đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của

dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của thân Ý dĩ ở cấp độ in vitro và in

vivo và nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo tập trung đánh giá tác dụng dụng in vivo trên

sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ [12]

Về tác dụng ức chế tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần Ý dĩ: Dịch

chiết toàn phần Ý dĩ cho thấy tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể calci oxalat và tác dụng này tăng theo nồng độ Khi có mặt dịch chiết Ý dĩ, các tinh thể calci oxalat có xu hướng chuyển từ dạng COM sang dạng COD (COD là dạng tinh thể ít kết tập, ít gắn với

tế bào biểu mô ống thận do đó dễ đào thải hơn COM)

Trong số các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn ethyl acetat là phân đoạn có tác dụng

ức chế mạnh nhất sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro Từ phân đoạn ethyl acetat

nhóm nghiên cứu đã phân lập được thành phần chính là acid p-coumaric Kết quả đánh

giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của acid p-coumaric cho thấy: ở nồng độ ≥ 1 mM,

acid p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0 % ở nồng độ 10 mM Tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của acid p-coumaric mạnh hơn chứng

dương natri citrat, với giá trị IC50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy 95 %: 1,47 – 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95 %: 8,29 – 11,16) của natri citrat [14]

Về tác dụng ức chế tinh thể calci oxalat in vivo: Dịch chiết Ý dĩ ở mức liều 2,52

g/kg đã thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành sỏi sau 28 ngày điều trị tương tự chứng dương natri citrat 2,5 g/kg [14]

Với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo và cộng sự [12] kết quả cho thấy thân Ý dĩ

sử dụng đường uống với mức liều 2,52 g/kg không ảnh hưởng tới thể tích nước tiểu, pH nước tiểu, số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu nhưng lại làm giảm sự lắng đọng sỏi tại thận gây ra bởi ethylen glycol tương tự chứng dương natri citrat Điều này cho thấy tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu của Ý dĩ không liên quan đến tác dụng lợi tiểu đề cập đến trong y văn [17] Như vậy Ý dĩ là dược liệu có tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu đặc biệt là dự phòng tái phát sỏi

1.1.5 Công dụng

Theo y học cổ truyền, hạt Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn Hạt Ý dĩ có tác dụng lợi tiểu, kiện tỳ hóa thấp, trừ phong thấp, đau nhức, thanh nhiệt độc trừ mủ nên dùng để chữa tả, lỵ, tiêu phù thũng, chữa gân co quắp không co duỗi được, phong thấp lâu ngày không khỏi [3], [9], [13] Ý dĩ còn làm thuốc bổ dưỡng cho cơ thể, nhất là đối với trẻ

em Ý dĩ hầm với hạt sen và thịt nạc là món ăn- vị thuốc cho những người gầy yếu, cơ thể suy dinh dưỡng [13]

Theo kinh nghiệm dân gian, tại một số vùng tại Diễn Châu, Nghệ An, người dân

đã sử dụng nước sắc thân Ý dĩ để chữa sỏi thận

1.2 Vài nét về hướng dẫn xây dựng chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu

1.2.1 Theo Dược điển Việt Nam V

Đối với các chế phẩm là cao dược liệu, chỉ tiêu chất lượng phải đạt theo quy định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chung sau đây [11]:

Bảng 1.2 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với cao dược liệu theo DĐVN V

1 Độ tan Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi điều chế cao

4 Hàm lượng cồn Đạt từ 90 % đển 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn

5 Kim loại nặng Không quá 20 phần triệu

6 Dung môi tồn

dư Xác định nếu dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước

7 Dư lượng hóa

Đáp ứng yêu cầu quy định

1.2.2 Theo hướng dẫn của châu Âu

1.2.2.1 Kiểm soát chất lượng các sản phẩm từ dược liệu

Theo hướng dẫn của European Medicines Agency, với các sản phẩm từ dược liệu luôn cần một quy trình để đảm bảo chất lượng mong muốn của các sản phẩm thu được Quy trình này gồm có kiểm soát nguồn nguyên liệu đầu vào, kiểm soát sản phẩm trung gian và cuối cùng là kiểm soát các thuốc dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe như là một sản phẩm cuối cùng [24]

Kiểm soát nguồn nguyên liệu đầu vào

- Đối với dược liệu, cần kiểm soát các chỉ tiêu sau [25]:

Bảng 1.3 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với dược liệu theo EMA

1 Đặc tính Nguồn gốc, bộ phận dùng, trạng thái

Nguồn gốc địa lý và các điều kiện dược liệu được thu hái

2 Đặc điểm Cảm quan, hiển vi

3 Định tính Cảm quan, hiển vi, sắc ký, phản ứng hóa học

4 Định lượng Marker hoạt tính, marker phân tích

5 Các chỉ

tiêu khác

Kích thước dược liệu

Hàm lượng nước

Tạp chất: Tạp vô cơ, kim loại nặng, mycotoxin, thuốc trừ sâu

Kiểm soát sản phẩm trung gian

Quá trình kiểm soát trung gian là tất cả các thử nghiệm kiểm soát, với các chi tiết

về quy trình và giới hạn cho phép được áp dụng ở bất kỳ giai đoạn trung gian nào của quy trình sản xuất, đặc biệt nếu các thử nghiệm này không thể được thực hiện trên sản phẩm thuốc dược liệu

Đối với dạng bào chế trung gian như cao dược liệu, cần kiểm soát các chỉ tiêu sau [25]:

Bảng 1.4 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với chế phẩm dược liệu theo EMA

1 Đặc tính Nguồn gốc, loại chế phẩm (lỏng, khô)

Tỉ lệ dược liệu trong chế phẩm

2 Đặc điểm Cảm quan

3 Định tính Tối ưu để phân biệt với các chất gần giống, giả mạo

4 Định lượng Marker hoạt tính, marker phân tích

5 Các chỉ

tiêu khác

Tạp chất: Dung môi tồn dư, tạp vô cơ, kim loại nặng, giới hạn kim loại nặng, mycotoxin, thuốc trừ sâu

Kiểm soát sản phẩm cuối cùng

Đối với sản phẩm cuối cùng là thuốc dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, cần phải kiểm tra chi tiết các chỉ tiêu sau [25]:

Bảng 1.5 Các chỉ tiêu cần kiểm soát với thuốc dược liệu theo EMA

1 Mô tả Dạng bào chế (kích thước, hình dạng, màu sắc)

Các tiêu chí phải được duy trì đến hạn cuối của sản phẩm

Nếu có thay đổi màu trong quá trình bảo quản, thì phải định lượng

2 Định tính Tối ưu để phân biệt với các chất gần giống, giả mạo

Trường hợp có chứa dạng bột, phương pháp cảm quan và hiển vi có thể được sử dụng

3 Định lượng Marker hoạt tính, marker phân tích

4 Tạp chất - Các tạp chất phát sinh từ dược liệu/ chế phẩm dược liệu như dư

lượng thuốc trừ sâu, kim loại nặng Nếu được kiểm soát trong các bước trước không cần kiểm soát

- Tương tự, dung môi còn lại phát sinh từ quá trình sản xuất chế phẩm dược liệu (ví dụ: chiết xuất) không cần phải được kiểm soát trong sản phẩm dược thảo với điều kiện là nó được kiểm soát thích hợp trong chỉ tiêu trong quá trình chiết xuất

- Trong trường hợp có các sản phẩm thoái hóa của dược liệu/ chế phẩm (ví dụ: aglycon từ hydroxyanthracen glycosid), chúng cần được theo dõi trong sản phẩm thuốc thảo dược

5 Giới hạn vi

sinh

Giới hạn cho các thuốc uống và các thuốc dùng đường khác

Ngoài các chỉ tiêu trên, cần thêm các chỉ tiêu khác tùy thuộc vào các dạng bào của thuốc dược liệu là viên nén, viên nang; các thuốc dạng lỏng đường uống hay các thuốc dược liệu chứa dược liệu (như trà thảo dược)

1.2.2.2 Kiểm soát độ ổn định của sản phẩm

Vì toàn bộ chất dược liệu hoặc chế phẩm dược liệu được coi là hoạt chất, nên chỉ xét đến tính ổn định của các thành phần có tác dụng dược lý đã biết sẽ không đủ Tính

nhiều càng tốt, ví dụ, bằng phương pháp sắc ký vân tay thích hợp Cũng cần chứng minh rằng tỷ lệ của chúng vẫn tương đương với dấu vân tay ban đầu [24]

Trong trường hợp sản phẩm dược liệu có chứa dược liệu hoặc chế phẩm dược liệu

có thành phần tác dụng dược lý đã biết, sự thay đổi về hàm lượng hoạt chất trong thời hạn sử dụng được đề xuất không được vượt quá 5 % giá trị giá trị đã khai báo, trừ khi

có lý do Trong trường hợp sản phẩm dược liệu có chứa dược liệu hoặc chế phẩm dược liệu không xác định được thành phần có tác dụng dược lý, có thể chấp nhận thay đổi hàm lượng của marker trong thời hạn sử dụng đề xuất là ± 10 % giá trị ban đầu [24]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Dược liệu là phần thân của cây Ý dĩ Thông tin về các mẫu Ý dĩ được trình bày

Nơi thu mẫu Ngày thu

1

DB01

TP Điện Biên - Điện Biên 05/09/2019

Coix lachryma-jobi L var lachryma–jobi L., họ Lúa (Poaceae)

2 YB01 Yên Bình - Yên

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích

- Hóa chất: bột magnesi kim loại, acid clohydric đậm đặc, natri hydroxid 10 %,

- Chất chuẩn: acid p-coumaric của hãng BioPurify Phytochemicals với hàm lượng

98 %

- Methanol, nước cất, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC

- Dung môi: ethanol 90 %, methanol, ethyl acetat, toluen, acid formic… dùng cho chiết xuất và sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của hãng Merck (Đức)

- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gan, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pipet ), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình triển khai sắc ký )

2.1.2.2 Thiết bị dùng trong nguyên cứu

₋ Tủ sấy Memmert (Đức)

₋ Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ)

₋ Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

₋ Bể siêu âm Wisd (Trung Quốc)

₋ Cân xác định hàm ẩm Ohaus (Trung Quốc)

₋ Lò nung Nabertherm (Đức)

₋ Bếp đun cách thủy Memmert (Đức)

₋ Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG (máy chấm sắc ký tự động Linomat 5, buồng chụp bản mỏng TLC Visualiser có kết nối máy tính với phần mềm VisionCATs, bình khai triển sắc ký)

₋ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) gồm: bơm LC-20AD, detector DAD SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều nhiệt CTO-20A; cột tách C18 Zorbax (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

₋ Máy đo pH Euteck instrument pH 510

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý

dĩ bằng HPLC

₋ Thu các mẫu Ý dĩ tại một số tỉnh thành và điều chế cao nước Ý dĩ

- Khảo sát quá trình xử lý mẫu

- Thẩm định phương pháp phân tích

2.2.2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ

Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao từ thân Ý dĩ:

- Định lượng acid p-coumaric trong các mẫu cao đặc thân Ý dĩ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý

dĩ bằng HPLC

2.3.1.1 Thu mẫu và điều chế cao nước Ý dĩ

Mẫu Ý dĩ sau khi được thu hái từ các tỉnh thành sẽ được làm tiêu bản và lưu lại Sau đó tiến hành chiết xuất và điều chế cao nước từ thân cây Ý dĩ theo quy trình sau:

Cân khoảng 50 g dược liệu đã được cắt thành các đoạn nhỏ dài từ 2-3 cm vào nồi 1,2 L Thêm nước vừa ngập dược liệu và đun sôi trong 1 giờ Lọc thu dịch chiết qua bông Lặp lại quá trình chiết như trên thêm 2 lần, mỗi lần 1 giờ Gộp dịch lọc, để lắng

12 giờ sau đó gạn lấy dịch trong Dịch chiết nước tiếp tục được cô trên dụng cụ có đáy rộng để thu được cao đặc, sấy 24 giờ trong tủ sấy tĩnh có thông khí ở nhiệt độ 70oC

₋ Tính toán phần trăm cao thu được theo công thức:

𝑚𝑑𝑙 𝑥 (1−𝐴𝑑𝑙)𝑥100 % Trong đó: H (%): phần trăm cao thu được từ dược liệu

mc (g): khối lượng cao thu được

mdl (g): khối lượng dược liệu

Adl (%): độ ẩm dược liệu

2.3.1.2 Khảo sát quá trình xử lý mẫu

Điều kiện khảo sát ban đầu được tiến hành dựa trên kết quả định lượng acid coumaric bằng phương pháp HPLC trong dược liệu cây Ý dĩ của Nguyễn Thị Thảo và cộng sự [12] Tiến hành khảo sát số lần chiết với ethyl acetat để đảm bảo toàn bộ lượng acid p-coumaric được chiết toàn bộ, quy trình xử lý mẫu được tiến hành như sau: Cân chính xác khoảng 0,25 g cao hòa tan cao trong 10 ml nước (siêu âm 15 phút) rồi đem chiết lỏng-lỏng với 10 ml EtOAc trong 5 lần, mỗi lần 10 phút Dịch chiết EtOAc mỗi lần được cô đặc đến cắn và hòa tan vào MeOH, định mức vào bình 25 ml rồi lọc

p-• Phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân Ý dĩ bằng HPLC

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,25 g cao hòa tan cao trong 10 ml nước (siêu âm

15 phút) rồi đem chiết lỏng-lỏng với EtOAc (số lần chiết được khảo sát ở trên, mỗi lần

10 phút) Sau đó đem cô đặc đến cắn và hòa tan vào MeOH, định mức vào bình 25 ml rồi lọc qua màng lọc 0,45 μm (bỏ 5 ml dịch lọc đầu) để được dung dịch tiêm sắc kí Dựa vào quy trình mà Nguyễn Thị Thảo và cộng sự đã xây dựng để định lượng acid p-coumaric trong dược liệu là thân Ý dĩ [12] và bước sóng hấp thụ cực đại của acid p-coumaric là 309 nm, lựa chọn các điều kiện cho quá trình định lượng acid p-coumaric trong cao thân Ý dĩ như sau :

- Chương trình dung môi: gồm 2 kênh

- Kênh A: pha nước chứa acid phosphoric 0,01 %

Tính thích hợp hệ thống được dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và

độ lặp lại của hệ thống sắc kí đủ để tiến hành quá trình phân tích Pha một mẫu chuẩn

có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic, thời gian lưu yêu cầu là RSD ≤ 2 % [47]

❖ Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 6 mẫu chuẩn có nồng độ là 11,25; 18; 22,5; 27; 33,75; 54 µg/ml Xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ acid p-

coumaric có trong mẫu chuẩn Từ các thông số thu được tính toán hệ số tương quan r, yêu cầu r ≥ 0,99 [15]

❖ Độ đặc hiệu

Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Độ đặc hiệu có thể đánh giá bởi độ phân giải của pic cần phân tích và pic gần với nó nhất [15], [27] Độ phân giải Rs được tính bằng thời gian lưu của 2 pic t1, t2 và độ rộng đáy pic W1 và W2

2.3.2 Thiết lập một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc thân Ý dĩ

2.3.2.1 Cảm quan

Mô tả các mẫu cao đặc thân Ý dĩ về thể chất, màu sắc, mùi vị

2.3.2.2 Mất khối lượng do làm khô

- Thử theo phụ lục 9.6 - DĐVN V [11]

- Tiến hành: Lấy khoảng 1 g cao đặc sấy ở nhiệt độ 100oC đến khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg), làm 3 lần với mỗi mẫu rồi lấy kết quả trung bình

pH bằng các dung dịch đệm chuẩn có pH=7, pH=10 và pH=4 Nhúng điện cực vào dung dịch cao đặc 1 % và đo trị số pH ở cùng điều kiện đo của các dung dịch đệm chuẩn khi hiệu chỉnh máy Làm 3 mẫu, lấy kết quả trung bình

2.3.2.4 Định tính bằng phản ứng hóa học

Dựa vào kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của Nguyễn Thị Thảo [12] cho thấy dược liệu thân cây Ý dĩ có flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử, polysaccharid và sterol Chúng tôi kiểm tra sự có mặt của các nhóm chất flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử và sterol trong mẫu cao đặc thu được bằng các phản ứng hóa học

Định tính flavonoid

Cân 0,25 g cao rồi cho vào cốc có mỏ Thêm 10 ml ethanol 90 % Đun cách thủy sôi trong vài phút Lọc nóng Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính: phản ứng cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với FeCl3, phản ứng diazo hóa

 Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng

10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt) Đun cách thủy sôi vài phút, phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

 Phản ứng với kiềm

- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Phản ứng dương tính nêu khi thêm vài giọt dung dịch NaOH 10 % sẽ thấy xuất hiện tủa vàng Thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm

- Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được

mở nút, phản ứng dương tính sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên Nhỏ một giọt khác trên giấy lọc làm chứng

Định tính coumarin

Cân 0,25 g cao đặc rồi cho vào cốc có mỏ Thêm 10 ml ethanol 90 % Đun cách thủy

sôi trong vài phút Lọc nóng Dịch lọc được dùng để làm các phản ứng

 Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết

Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %

Ống 2 để nguyên

Phản ứng dương tính khi xảy ra các hiện tượng sau:

- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

Ống 1: Có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

Tiến hành và kết quả tương tự phần định tính flavonoid

 Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng

với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5 % Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại

Phản ứng dương tính khi phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau

Định tính acid hữu cơ

Cân khoảng 0,25 g cao cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng

2 ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính nếu có bọt khí thoát

ra

Cân khoảng 0,25 g cao cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml nước cất, đun sôi Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Thêm 1 ml dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy sôi vài phút Phản ứng dương tính khi xuất hiệu tủa

đỏ gạch

Định tính polysaccharid

Cân khoảng 0,25 g cao cho vào cốc có mỏ, thêm 20 ml nước cất, đun sôi vài phút Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm:

Ống 1: 4 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

- Quan sát huỳnh quang

3 Acid hữu cơ - Phản ứng với tinh thể Na2CO3

4 Đường khử - Phản ứng với thuốc thử Fehling A và thuốc thử

Fehling B

5 Polysaccharid - Phản ứng với thuốc thử Lugol

6 Sterol - Phản ứng Lieberman- Burchardat

2.3.2.5 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 0,25 g cao dược liệu cho vào cốc có mỏ Hòa

tan cao đặc trong khoảng 10 ml nước rồi đem chiết với EtOAc (2 lần x 10 ml) Dịch chiết ethyl acetat được loại nước bằng khoảng 0,2 g Na2SO4 khan, bay hơi dung môi đến cắn Lấy cắn hòa tan trong 5 ml MeOH để được dung dịch chấm sắc kí

- Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: hòa tan acid p-coumaric trong MeOH rồi pha loãng

để được dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml

- Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck) Bản mỏng được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ

- Dung môi khai triển: Toluen - ethylacetat - acid formic (7:3:1)

- Đưa chất lên bản mỏng: 5 µL mẫu thử; 5 µL chất đối chiếu được đưa lên bản mỏng

dưới dạng vạch dài 5 mm

- Khai triển: 9 cm

- Làm khô: trong không khí

- Quan sát: dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm

- Hiện màu: sử dụng thuốc thử vanilin/acid sulfuric, sấy bản mỏng ở 1100C trong 5 phút Quan sát dưới ánh sáng thường

2.3.2.6 Định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân Ý dĩ bằng HPLC

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch thử của các mẫu cao dựa vào phương pháp

đã được xây dựng Dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử và đường chuẩn, tính hàm lượng acid p-coumaric trong các mẫu cao Hàm lượng acid p-coumaric trong các mẫu cao được tính theo công thức sau:

𝐻𝐿(%) = C x 25 x P

106 x M × 100 %

Trong đó:

C: Nồng độ acid p-coumaric trong dung dịch mẫu thử tính theo phương trình hồi quy (µg/ml)

P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (Pacid p-coumaric chuẩn = 0,98)

M: Khối lượng mẫu cao đem phân tích (g)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân cây Ý dĩ

bằng HPLC

3.1.1 Thu mẫu và điều chế cao nước Ý dĩ

10 mẫu cao được điều chế từ 10 mẫu dược liệu thu hái ở các nơi khác nhau được

ký hiệu và tính phần trăm cao thu được từ dược liệu

Bảng 3.1 Kết quả hàm lượng cao từ 10 mẫu dược liệu

Mẫu cao

Cao Lượng

dược liệu (g)

Hàm ẩm dược liệu (%)

Lượng cao (g)

Hàm lượng cao (%)

Hàm lượng cao thu được từ mẫu Ý dĩ tại Đại Từ - Thái Nguyên cao nhất đạt 20,94

%, từ Yên Bình - Yên Bái thấp nhất đạt 11,12 % Các mẫu còn lại dao động trong khoảng

từ 10-20 %

3.1.2 Khảo sát quá trình xử lý mẫu

Dịch chiết EtOAc mỗi lần chiết được xử lý và định lượng Kết quả lượng acid coumaric chiết được trong mỗi lần được thể hiện ở bảng 3.2

p-Bảng 3.2 Hàm lượng acid p-coumaric chiết được trong mỗi lần

Hình 3.1 Tổng lượng acid p-coumaric chiết được với số lần chiết khác nhau

Kết quả trên cho thấy, khi chiết với 4 lần, hàm lượng acid p-coumaric chiết được đạt trên 99 %, nên có thể coi toàn bộ lượng acid p-coumaric từ cao dược liệu đã được chiết Do đó tiến hành lựa chọn số lần chiết với EtOAc là 4 lần, mỗi lần 10 ml trong 10 phút làm quy trình để chuẩn bị mẫu thử định lượng acid p-coumaric bằng HPLC

Từ kết quả nghiên cứu, lựa chọn phương pháp định lượng gồm: quá trình xử lý mẫu, các thông số HPLC và công thức tính hàm lượng acid p-coumaric trong cao như khảo sát Để khẳng định kết quả này là chính xác và tin cậy, chúng tôi đã tiến hành thẩm định phương pháp phân tích

3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích

3.1.3.1 Tính thích hợp hệ thống

Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc kí, tiến hành pha một mẫu chuẩn có nồng độ 33,75 µg/ml, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn cho kết quả được trình bày ở bảng 3.3:

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống

3.1.3.2 Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính

Chuẩn bị một dãy gồm 6 dung dịch acid p-coumaric chuẩn có nồng độ 11,25 µg/ml

đến 54 µg/ml rồi tiến hành sắc kí Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.4 Đường chuẩn và phương trình hồi quy được thể hiện ở hình 3.2

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ

0500000

R² = 0,9991, do đó phương pháp định lượng acid p-coumaric đạt độ tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 11,25 µg/ml đến 54 µg/ml

3.1.3.3 Độ đặc hiệu

Tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp phân tích Khi chạy mẫu trắng

và nền mẫu không thấy xuất hiện pic của acid p-coumaric Khi chạy mẫu thử và mẫu chuẩn, xuất hiện pic của acid p-coumaric ở thời gian khoảng 15 phút và độ phân giải của acid p-coumaric khi tiến hành chạy trên mẫu Hoàng Mai- Nghệ An là:

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu

m cao

(g) 0,2527 0,2523 0,2529 0,2519 0,2511 0,2458 Thời gian lưu

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được trình bày trong bảng 3.6 và 3.7

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại mẫu NA01

m cao

( g) 0,2527 0,2523 0,2529 0,2519 0,2511 0,2458 Diện tích pic

(mAu.s) 2384887 2412905 2434245 2362892 2440577 2286836

Hàm lượng

p-coumaric (%) 0,287 0,291 0,293 0,285 0,296 0,282 Hàm lượng trung bình tìm thấy acid p-coumaric trong mẫu Hoàng Mai - Nghệ An

3.2.2 Mất khối lượng do làm khô

Chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô đánh giá hàm lượng nước có trong cao

Bảng 3.8 Kết quả hàm ẩm các mẫu cao

Theo số liệu bảng 3.8 có thể thấy độ ẩm trung bình của cao từ khoảng 3-8 % Đa

số các mẫu cao đạt tiêu chuẩn cao đặc theo DĐVN V Có 2 mẫu cao ở Nghệ An và Hòa Bình đạt tiêu chuẩn cao khô theo DĐVN V [11]

3.2.3 pH

Chỉ tiêu này dùng để xác định pH của mẫu cao ở nồng độ 1 % Kết quả xác định

pH được trình bày như trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả xác định pH các mẫu cao

Theo số liệu ở bảng 3.9 có thể thấy pH của các mẫu cao từ 5,07 đến 7,19 Điều này

có thể giải thích bằng việc các hàm lượng các hợp chất flavonoid và acid p-coumaric có trong các mẫu cao là khác nhau nên ảnh hưởng đến pH của các mẫu cao

3.2.4 Định tính bằng phản ứng hóa học

Tiến hành định tính các nhóm chất flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử

và polysaccharid trong 10 mẫu cao bằng các phản ứng hóa học thường quy Kết quả được trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Kết quả xác định các nhóm chất trong cao Ý dĩ

TT Mẫu cao Flavonoid Coumarin

Acid hữu

cơ

Đường khử Polysaccharid Sterol

do hàm lượng acid p-coumaric thấp ở trong cao Do đó, có thể lựa chọn phản ứng định tính flavonoid và đường khử để đưa ra tiêu chuẩn định tính cao Ý dĩ bằng phản ứng hóa học

3.2.5 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Tiến hành sắc ký với hệ dung môi: Toluen - ethylacetat - acid formic (7:3:1)

Kết quả thu được ở hình 3.3

Hình 3.3 Hình ảnh sắc ký đồ cao thân Ý dĩ khi quan sát ở UV 254 nm (A), 366

nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanilin - acid sulfuric (C)

Ghi chú:

Chuan: acid p-coumaric chuẩn nồng độ 0,1 mg/ml

Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ khi so sánh có thể thấy không có sự khác biệt

nhiều về thành phần hóa học của 10 mẫu cao Ý dĩ Các mẫu thử có vết tương đương với

vị trí của acid p-coumaric chuẩn và được quan sát rõ nhất dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử vanilin - acid sulfuric (Rf = 0,55) Ngoài ra, sắc ký đồ của tất cả các mẫu thử đều quan sát rõ thấy 1

vết phát huỳnh quang xanh dương nhạt (Rf = 0,42) và 1 vết phát huỳnh quang xanh đậm (Rf = 0,84) khi quan sát dưới bước sóng λ = 366 nm

3.2.6 Định lượng acid p-coumaric trong cao đặc thân Ý dĩ bằng HPLC

Áp dụng quy trình đã xây dựng được để định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ, kết quả được trình bày ở bảng 3.11

Bảng 3.11 Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu cao thân Ý dĩ

TT Mẫu cao Khối lượng

(g)

Diện tích pic (mAu.s)

Hàm lượng p-coumaric (% kl/kl)

Do vậy, nghi ngờ một chất có cấu trúc tương tự với acid p-coumaric ở mẫu Ý dĩ thu hái tại Hòa Bình

3.3 Bàn luận

Sỏi thận là bệnh lý thường gặp nhất của đường tiết niệu Chế độ ăn uống không hợp lý, nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh sống ở vùng nóng, vùng nhiệt đới, là những yếu tố

thuận lợi để bệnh sỏi thận tiết niệu dễ phát sinh Sau khi viên sỏi được hình thành, nếu

sỏi còn nhỏ, thường viên sỏi đi theo đường nước tiểu và được tống ra ngoài Nhưng nếu viên sỏi bị vướng lại ở một vị trí nào đó trên đường tiết niệu, thì sỏi sẽ lớn dần, gây cản trở lưu thông của nước tiểu, đưa đến ứ đọng và dãn phình ở phía trên chỗ tắc và gây ra các biến chứng như tắc nghẽn, nhiễm trùng và phá hủy dần cấu trúc của thận [1] Khi mắc sỏi tiết niệu, 80 % sỏi có thể đào thải tự nhiên trong 2 năm đầu tiên, những loại sỏi

có nhiều cơ hội đào theo đường tự nhiên là những sỏi nhỏ < 5 mm Quá trình đào thải này nhanh và sớm hơn có thể nhờ điều trị nội khoa dùng thuốc [7] Sau điều trị, tỷ lệ tái phát sỏi tương đối lớn Theo Fine Joshua K, Pak Charles YC (1995) cho thấy tỷ lệ tái phát là 0,09/bệnh nhân/năm nếu được điều trị và 0,67/bệnh nhân/năm nếu không được điều trị [26] Chính vì vậy, bên cạnh điều trị tan sỏi và tống sỏi, việc điều trị dự phòng cũng đóng một vai trò rất quan trọng Các thuốc hóa dược hiện nay có vai trò quan trọng trong việc điều trị nội khoa sỏi tiết niệu nhưng lại chưa tỏ ra hiệu quả trong việc dự phòng sỏi tiết niệu và gây ra nhiều tác dụng không mong muốn Trong khi đó, dịch chiết thân cây Ý dĩ cho thấy tác dụng điều trị sỏi tiết niệu là tương đương so với natri citrat ở

cả mức độ in vitro và in vivo [12], [14] Đồng thời, với cơ chế tác dụng lên các tinh thể

calci oxalat, làm các tinh thể này chuyển từ dạng COM sang dạng COD (là dạng tinh thể ít kết tập, ít gắn với tế bào biểu mô ống thận do đó dễ đào thải hơn) nên thân Ý dĩ được coi là dược liệu có tiềm năng trong việc dự phòng tái phát sỏi tiết niệu Hiện nay,

Ý dĩ đã được trồng ở nhiều nơi để thu hoạch hạt, còn phần thân thì thường bỏ đi sau khi thu hoạch và không có giá trị gì Hơn nữa, hiện nay loài Ý dĩ được sử dụng để lấy quả

là Coix lachryma-jobi L var ma-yuen (Rom) Stapf còn loài Coix lachryma-jobi L var

lachryma-jobi L thường mọc hoang ở nhiều nơi và không được sử dụng

Là một bệnh mạn tính có tính chất lâu dài nên việc sử dụng một nguồn nguyên liệu giá rẻ, dồi dào và an toàn như Ý dĩ để điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu là một hướng đi

có tiềm năng khá lớn Bên cạnh đó, để việc điều trị cho bệnh nhân được thuận tiện, cần phát triển các dạng bào chế thuận tiện hơn cho việc sử dụng Thay vì sử dụng dược liệu thô, xu hướng hiện nay là điều chế cao dược liệu như một dạng sản phẩm trung gian để

có thể tạo ra các dạng bào chế viên nén, viên nang có khả năng phát triển thành sản phẩm thương mại tốt Để có thể đưa một sản phẩm vào điều trị, cần phải có các tiêu chuẩn đánh giá để đảm bảo chất lượng của sản phẩm đó Hiện nay, đã có đề tài xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu là thân Ý dĩ [12] Còn dạng bào chế trung gian là cao Ý dĩ, hiện nay trong Dược Điển Việt Nam và trên thế giới cũng như các đề tài, hiện chưa có các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thân Ý dĩ

Một quy trình sản xuất các sản phẩm từ dược liệu gồm có từ nguồn nguyên liệu đầu vào, trải qua quá trình chiết xuất để thu được dạng bào chế trung gian là cao lỏng, cao đặc, cao khô rồi qua quá trình bào chế để thu được sản phẩm cuối cùng Việc đảm bảo cho chất lượng của sản phẩm phải được tiến hành trên tất cả các khâu trong quá trình đó từ lúc bắt đầu là việc trồng hái, thu mẫu bảo quản đến khi kết thúc bằng các dạng bào chế cuối cùng Vì vậy, với mỗi giai đoạn trong quá trình sản xuất cần phải có các chỉ tiêu để kiểm soát các sản phẩm này nhằm đảm bảo quy trình sản xuất có khả năng ra sản phẩm một cách ổn định và đạt chất lượng yêu Do đó, đề tài đã đưa các các chỉ tiêu và phương pháp đánh giá để giúp kiểm tra chất lượng cao Ý dĩ như là một sản phẩm trung gian sau khi đã có các chỉ tiêu giúp đánh giá chất lượng là nguồn dược liệu đầu [12]

Đối với các sản phẩm là dược liệu và có nguồn gốc từ dược liệu, việc lựa chọn một

tính đã biết, đã được chứng minh hoạt tính trong các thử nghiệm in vitro và in vivo nên

được lựa chọn là một “marker hoạt tính” để cho các tiêu chuẩn sau này

Trong nghiên cứu này, phương pháp sắc với nước được lựa chọn không chỉ do thao tác đơn giản, dễ dàng mà còn do các nguyên nhân sau đây Thứ nhất, thân Ý dĩ là một dược liệu rắn chắc, do đó sắc với nước là một phương pháp tốt để có thể chiết được acid p-coumaric Thứ hai, nước là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm Việc sử dụng nước sẽ giúp tiết kiệm chi phí sản xuất để có thể sản xuất ra một sản phẩm giá rẻ, giúp bệnh nhân tiết kiệm chi phí trong quá trình chữa bệnh, thứ mà đã khiến cho nhiều bệnh nhân không thể tiếp tục điều trị và nhiều bệnh mạn tính được gọi là “bệnh của người giàu” do chi phí để duy trì việc sử dụng thuốc quá đắt đỏ Cuối cùng, hiện nay xu hướng của thế giới là sử dụng những dung môi xanh trong chiết xuất dược liệu để an toàn cho người sử dụng và cũng là góp phần bảo vệ môi trường Hiện nay có hai dung môi xanh rất tốt hay được sử dụng là nước và ethanol Trong một nghiên cứu có chỉ ra rằng, khi sử dụng ethanol làm dung môi, acid p-coumaric có thể xảy ra phản ứng ester hóa với ethanol trong dung môi,

từ đó làm giảm hàm lượng acid p-coumaric trong sản phẩm [45] Do đó, đề tài đã không

sử dụng ethanol mà sử dụng nước làm dung môi chiết xuất

Từ các mẫu dược liệu từ những địa điểm khác nhau, cao nước Ý dĩ đã được điều chế và đánh giá các chỉ tiêu gồm: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, pH, định tính bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng và định lượng

Chỉ tiêu cảm quan giúp nhận biết cao nguyên liệu có đạt chất lượng hay không một cách sơ bộ nhất Cao ý dĩ phải có dạng bột, màu nâu, mùi thơm đặc trưng, có vị hơi đắng

Chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô để đánh giá lượng nước có trong cao Đối với cao nước Ý dĩ, mặc dù đã sấy trong tủ sấy nhưng chỉ có mẫu cao ở Hoàng Mai - Nghệ

An có độ ẩm dưới 5 %, đạt tiêu chuẩn cao khô theo Dược Điển Việt Nam V Các mẫu còn lại có độ ẩm đều trên 5 % Điều này có thể là do trong các mẫu cao có lượng đường lớn (thể hiện ở độ nhớt cao khi lọc và phản ứng định tính đường rất rõ ràng) nên khó có thể sấy về độ ẩm phù hợp với tiêu chuẩn cao khô với các thiết bị sấy thông thường như

tủ sấy tĩnh mà cần các thiết bị sấy chuyên dụng hơn như thiết bị cô đặc tuần hoàn hay thiết bị cô đặc loại rotor [2]

Chỉ tiêu pH để đánh giá độ hoạt động của các ion H+ trong dung dịch pH các mẫu cao có mức độ dao động là từ 5-7 Điều này có thể giải thích bằng việc ngoài acid p-