Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một số loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật

ây dựng phương pháp xác định dư lư ng ột số hóa chất bảo ệ thực ật trong thực phẩ chức năng, bao gồ :  Khảo sát các điều kiện tách chiết ẫu phân tích  Thẩ định phương pháp đã xây dựng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- o0o -

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH 8

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11

1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 11

1.1.1 Khái niệm: 11

1.1.2 Nhóm Clo hữu cơ (organnochlorine-OC) 11

1.1.3 Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus-OP) 12

1.1.4 Nhóm carbamat (CA) 12

1.1.5 Nhóm Pyrethroid (PY) 13

1.1.6 Nhóm Neonicotinoid 13

1.2 Tình hình sử dụng và tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩ dư c liệu T CN 13

1.3 Mức dư lư ng tối đa cho phép (Maxi u Residue Li it - MRL) 15

1.4 Các phương pháp xác định HCBVTV 16

1.4.1 Các kỹ thuật xử lý mẫu 16

1.4.1.1 Các kỹ thuật truyền thống 16

1.4.1.2 Kỹ thuật QuEChERS 17

1.4.2 Các kỹ thuật phân tích 18

1.4.2.1 hương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA) 18

1.4.2.2 hương pháp điện di mao quản 20

1.4.2.3 hương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 21

1.4.2.4 hương pháp sắc ký khí 22

1.4.2.5 hương pháp sắc ký lỏng khối phổ 24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ HƯƠNG HÁ NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tư ng nghiên cứu 27

2.1.1 Hóa chất bảo vệ thực vật 27

2.1.2 Đối tư ng phân tích 30

2.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 31

2.2.1 Mục tiêu 31

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 31

2.3 hương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 hương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS 32

2.3.2 hương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) 33

2.3.2.1 Nguyên tắc chung: 33

2.3.2.2 Sắc ký lỏng (HPLC) 34

2.3.2.3 Khối phổ (Mass Spectrometry - MS) 35

2.3.3 hương pháp xác nhận hiệu lực [11] 37

2.3.3.1 Tính chọn lọc đặc hiệu 37

2.3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lư ng 38

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 38

2.3.3.4 Độ lặp lại (độ chụ ) độ thu hồi (độ đúng) 39

2.3.4 hương pháp xử lý số liệu 40

2.4 hương tiện nghiên cứu 40

2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 40

2.4.2 Dung môi, hóa chất 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích HCBVTV 43

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS 43

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ (MS) 43

3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng (LC) 45

3.1.1.3 Đánh giá độ lặp lại của hệ thống 48

3.1.2 Khảo sát điều kiện tách chiết HCBVTV trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật 50

3.1.2.1 Khối lư ng mẫu phân tích 50

3.1.2.1 Thời gian l ướt mẫu trước khi chiết 51

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH thông qua so sánh các quy trình QuEChERS 52 3.1.2.3 Khảo sát thành phần d-SPE 53

3.1.2.4 Đánh giá ảnh hưởng nền 55

3.2 Đánh giá hiệu lực phương pháp 56

3.2.1 Tính chọn lọc đặc hiệu của phương pháp 56

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lư ng (LOQ) 57

3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 58

3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 60

3.3 Ứng dụng phương pháp 61

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1 Kết luận 63

4.2 Kiến nghị 64

PHỤ LỤC 71

Phụ luc 1: Sắc đồ khảo sát gradient thành phần pha động 71

Phụ lục 2: Sắc đồ HCBVTV ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 73

Phụ lục 3: Sắc đồ phân tích một số mẫu thực 74

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu n y đư c thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Hóa phân tích, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Kiểm nghiêm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Thị Thúy và TS Lê Thị Hồng Hảo

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cả ơn TS Trần Thị Thúy và TS Lê Thị Hồng Hảo đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận

Tôi cũng xin gửi lời cả ơn tới gia đình thân yêu đã luôn bên cạnh và động viên tôi hoàn thành tốt luận ăn n y

Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2013

Nguyễn Văn Hùng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ionization

Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển

Spectrometry

Sắc ký khí khối phổ

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh QuEChERS với phương pháp truyền thống 18

Bảng 2.1 Một số HCBVTV đư c nghiên cứu trong luận ăn 27

Bảng 3.1 Các điều kiện MS phân tích HCBVTV 43

Bảng 3.2: Các thông số hoạt động đã tối ưu của nguồn ion hoá 45

Bảng 3.3 Khảo sát thành phần gradient pha động 47

Bảng 3.4 Tóm tắt điều kiện gradient để tách hỗn h p HCBVTV 48

Bảng 3.5 Độ lặp lại của hệ thống 49

Bảng 3.6 Giới hạn định lư ng của các HCBVTV 58

Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi của phương pháp 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí 22

Hình 2.1: Các bước thực hiện kỹ thuật QuEChERS 32

Hình 2.2: Mô hình hệ thống LC-MS/MS 34

Hình 2.3: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba 37

Hình 3.1 Sắc đồ tổng ion của hỗn h p chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL và sắc đồ của 2 mảnh ion con của carboxin, 2 mảnh ion con của carbaryl 46

Hình 3.2 Sắc ký đồ một số HCBVTV theo chế độ gradient 4 48

Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình QuEChERS ban đầu 51

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hiệu suất chiết 52

Hình 3.5 So sánh hiệu suất chiết HCBVTV theo 3 quy trình (quy trình 1: quy trình ban đầu; quy trình 2: AOAC 2007.01 và quy trình 3: EN 15662) 53

Hình 3.6 Ảnh hư ng của lư ng PSA sử dụng đến độ thu hồi 54

Hình 3.7 Ảnh hư ng của lư ng GCB sử dụng đến độ thu hồi 54

Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình QuEChERS đã tối ưu 55

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nền mẫu (trà mướp đắng) 56

Hình 3.9 Sắc đồ pic dimethoat ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 57

Hình 3.10: Một số đường chuẩn phân tích HCBVTV 59

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩ đang l ấn đề báo động với người dân và các cấp quản lý Nhiều vụ việc như sử dụng những hóa chất cấm trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, sản phẩm kém chất lư ng lưu h nh trên thị trường đang gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng Các vụ ngộ độc thực phẩ ng y c ng gia tăng trong đó có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật càng làm bùng lên lo âu của người tiêu dùng

Thuốc bảo vệ thực vật đư c coi là một ũ khí có hiệu quả của con người trong việc phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng Bên cạnh ưu điểm là bảo vệ năng suất cây trồng, thuốc bảo vệ thực vật còn gây ra nhiều các tác hại khác như làm ô nhiễ ôi trường gây độc cho người và gia súc tăng chi phi sản xuất, và nhất l để lại tồn dư trong nông sản dư c liệu gây ảnh hưởng đến chất lư ng nông sản dư c liệu và sức khỏe người tiêu dùng Tác động tiêu cực của thuốc bảo vệ thực vật càng trở nên nghiêm trọng khi con người sử dụng không đúng cách và quá lạm dụng vào thuốc

Theo khảo sát thực tế tại một số vùng trồng cây dư c liệu ở nước ta người dân đã sử dụng hầu hết các loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đang lưu h nh trên thị trường để hạn chế sâu bệnh, bảo vệ dư c liệu Một phần dư c liệu đó đư c chế biến thành các loại thực phẩm chức năng đang đư c bán trên thị trường

Thực phẩm chức năng (TPCN) đư c biết đến là loại thực phẩm không chỉ cung cấp dinh dưỡng cơ bản mà còn có chức năng phòng chống bệnh tật tăng cường sức khỏe nhờ các chất chống oxy hóa (beta-caroten, lycopen, lutein, vitamin

C, vitamin E ), chất xơ ột số thành phần khác… Như ậy thực phẩm chức năng không phải là thuốc nhưng lại có tác dụng hỗ tr điều trị, phòng chống bệnh như thuốc Chính vì vậy các loại thực phẩm chức năng yêu cầu phải tuyệt đối an toàn với người sử dụng

Hiện nay, ở Việt Na chưa có nhiều nghiên cứu về phương pháp xác định đồng thời nhiều loại HCBVTV trên T CN đặc biệt là các sản phẩm TPCN có nguồn gốc thảo dư c Hơn nữa các phương pháp phân tích thông thường chỉ hướng đến

phân tích vài chất hoặc 1 nhó HCBVTV chưa xác định đồng thời nhiều nhóm chất trong cùng một lần phân tích do đó chưa thể kiể soát đư c h lư ng HCBVTV trong những sản phẩm này

Với lý do trên chúng tôi đã lựa chọn đề t i:” Xác định dư lượng hóa chất

bảo vệ thực vật trong một số loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật”

Mục tiêu thực hiện đề tài luận văn là:

1 ây dựng phương pháp xác định dư lư ng ột số hóa chất bảo ệ thực ật trong thực phẩ chức năng, bao gồ :

 Khảo sát các điều kiện tách chiết ẫu phân tích

 Thẩ định phương pháp đã xây dựng

2 Áp dụng phương pháp xác định dư lư ng thuốc bảo ệ thực ật để khảo sát ột số ẫu thực phẩ chức năng có nguồn gốc từ thực ật

l thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớ Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển” [30]

Các loại hóa chất bảo ệ thực ật gồ nhiều loại ột số nhóm chính bao

gồ [2, 38]:

- HCBVTV nhó Clo hữu cơ

- HCBVTV nhó Lân hữu cơ

- HCBVTV nhó yrethroid tổng h p

- HCBVTV nhóm Carbamat

- HCBVTV nhóm Neonicotinoid

Ngo i ra còn có ột số nhó khác như: N hữu cơ S hữu cơ các chất trừ sâu

ô cơ nhó thuốc trừ sâu sinh học …

1.1.2 Nhóm Clo hữu cơ (organnochlorine-OC)

HCBVTV clo hữu cơ l các h p chất hữu cơ đư c hình th nh khi thay thế các nguyên tử hidro của phân tử hidrocacbon dẫn xuất bằng các nguyên tử clo

Trong phân tử các h p chất n y tồn tại òng benzen hoặc dị òng (O N hay S) thường l các dẫn xuất clo của ột số h p chất hữu cơ như diphenyletan cyclodien benzen hexan…) Đặc điể quan trọng của các h p chất cơ clo l độc tính cao phổ tác động rộng nhưng ké chọn lọc rất bền ững trong ôi trường nên thời gian tác động lâu d i ( í dụ như DDT có thời gian bán phân huỷ l 20 nă chúng ít bị

đ o thải tích luỹ o cơ thể sinh ật qua chuỗi thức ăn) Đại diện của nhóm này

là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlo, Lindan Methoxychlor… Mặc dù các HCBVTV cơ clo có tác dụng diệt trừ ạnh đối ới nhiều loại sâu hại nhưng do ấn

đề ô nhiễ ôi trường dư lư ng HCBVTV trong nông sản sự tích lũy đầu độc cao đối cơ thể con người các lo i động ật ng y nay đa số các HCBVTV

cơ clo đã bị cấ sử dụng [2]

1.1.3 Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus-OP)

HCBVTV nhóm lân hữu cơ chủ yếu là h p chất của photpho hóa trị 5, chúng

là các este của axit photphoric (H3PO4) và dẫn xuất Các h p chất cơ photpho có độc tính rất cao nên hiệu lực diệt trừ sâu hại cao và nhanh chóng, phổ tác động rộng, kém bền vững trong ôi trường do dễ bị chuyển hóa, phân hủy hoặc bị thủy phân trong ôi trường kiềm và axit H p chất cơ photpho l những chất cực độc, vừa có khả năng tích lũy ạnh, vừa gây độc cấp tính cho hệ thần kinh của con người và động vật Nhó n y tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ gây choáng váng và chết Nhóm này bao gồm một số h p chất như parathion malathion, diclorvos, clorpyrifos, dimethoat, trichlorfon, edifenphos… H p chất cơ photpho l nhó HCBVTV đư c sử dụng phổ biến nhất nhưng ng y nay do độc tính cao nên rất nhiều chất trong nhóm n y đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụng ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới [2]

1.1.4 Nhóm carbamat (CA)

HCBVTV nhóm cacbamat là các este của axit cacbamic (H2N-COOH) và dẫn xuất Các h p chất cacba at có độc tính cao, phổ tác động hẹp hơn so ới h p chất cơ clo cơ photpho hiệu lực diệt trừ sâu hại cao, kém bền do dễ bị thủy phân

trong ôi trường kiềm và axit Các h p chất carbamat cũng có khả năng tích lũy đầu độc hệ thần kinh của con người động vật nhưng độc tính kém các h p chất

cơ photpho Khi sử dụng chúng tác động trực tiếp vào men cholinestraza của hệ thần kinh có cơ chế gây độc giống như nhó lân hữu cơ Đại diện cho nhóm này như: carbofuran carbaryl aldicarb, fenobucarb, isoprocarb etho yl… [2]

1.1.5 Nhóm Pyrethroid (PY)

Là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên l hỗn h p của các este khác nhau ới cấu trúc phức tạp đư c tách ra từ hoa của những giống cúc n o đó Sau đó, những Y tổng h p xuất hiện đư c sử dụng phổ biến Nhó n y có tác dụng luôn giữ kênh Na ở trong ng tế b o thần kinh gây ảnh hưởng sự dẫn truyền các xung thần kinh

Một số HCBVTV tiêu biểu của nhó như: Allethrin, Bifenthrin, Etofenprox, Fenvalerate, Permethrin, Phenothrin, Prallethrin, Resmethrin, Cyhalothrin, Lambda-cyhalothrin …[2]

1.1.6 Nhóm Neonicotinoid

Neonicotinoid l nhó thuốc trừ sâu có liên quan đến nicotin đư c sử dụng

từ những nă 1980 Nhó thuốc n y có độc tính thấp hơn hó carba at nhó lân hữu cơ; hơn nữa có độc tính thấp trên người Một số nước hạn chế sử dụng những chất của nhó n y ì ột số bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giả bầy đ n) đối ới ật ong Một số chất thuộc nhó n y như imidachloprid, acetamiprid thia ethoxa dinotefuran … [2]

1.2 Tình hình sử dụng và tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật t ong thực h

dư c iệu và T CN

Việc phát minh và sử dụng HCBVTV thực sự đã tạo nên một cuộc cách mạng trong sản xuất nông lâm nghiệp Từ những nă 1940 HCBVTV cơ clo như DDT, chỉ đư c sử dụng chủ yếu cho mục đích quân sự trong Chiến tranh thế giới thứ 2 cho đến ngày nay sự gia tăng ề chủng loại, trữ lư ng, phạm vi ứng dụng của các HCBVTV là vô cùng lớn và khó có thể thống kê đư c một cách đầy đủ

Theo Thông tư số 21/2013 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, danh mục các HCBVTV đư c phép sử dụng hiện nay tại Việt Na đã lên tới 1614 hoạt chất (trong đó có 745 hoạt chất thuốc trừ sâu), số HCBVTV bị hạn chế sử dụng

là 13 hoạt chất và 29 hoạt chất bị cấm sử dụng [15]

Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, có 23% số hộ nông dân vi phạm quy định về sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, dẫn đến tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trên nông sản Một số loại thuốc trừ sâu độc hại đã bị cấm sử dụng nhưng hiện vẫn có nhiều người tì cách đưa ề nông thôn Số mẫu rau, quả tươi có dư lư ng hóa chất bảo vệ thực vật chiếm từ 30-60% trong đó số mẫu rau, quả có dư lư ng hóa chất bảo vệ thực vật ư t quá giới hạn cho phép chiếm từ 4-16%, một số hóa chất bảo vệ thực vật bị cấm sử dụng như Metha idophos ẫn còn dư lư ng trong rau [10]

Theo báo cáo của Viện dư c liệu thì 90% thuốc YHCT tại th nh phố Hồ Chí Minh l nhập lậu hầu hết các dư c liệu đều bị chiết xuất nên các hoạt chất trong

dư c liệu không đả bảo Chất lư ng thuốc Đông dư c hiện nay ẫn còn thiếu những qui định ề giới hạn ki loại nặng qui dịnh ề tồn dư thuốc bảo ệ thực ật hóa chất kích thích tăng trưởng Theo cục bảo ệ thực ật thì 100% lư ng HCBVTV phải nhập khẩu trong đó Trung Quốc chiế khoảng 70% [12]

Việc kiể tra khống chế dư lư ng HCBVTV trong dư c liệu nhằ giả thiểu tác hại của chúng đối ới sức khỏe con người l hết sức cần thiết Cho đến nay chúng ta ẫn chưa đánh giá đư c tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng dư c liệu

ở sách Dư c Điển Việt Na cũng chưa qui định giới hạn HCBVTV tồn dư trong

dư c liệu cũng như phương pháp kiể tra chúng [12]

Qua khảo sát của Viện dư c liệu có 25/91 ẫu dư c liệu khảo sát có dư

lư ng HCBVTV hay gặp nhất l các ẫu dư c liệu có các bộ phận thường dùng l

lá hoa như khổ sâ ngải cứu tía tô húng quế kinh giới cúc hoa ướp đắng rau á… các ẫu dư c liệu khô như đương qui sâ ngưu tất… [12]

Nă 2004 tác giả Trần Việt Hùng cộng sự đã nghiên cứu h lư ng ột

số HCBVTV trên dư c liệu tại Hưng Yên phát hiện thấy có ặt cyper ethrine (nhóm PY) và trichlorfon (nhóm OP) Một số nghiên cứu khác cũng phát hiện thấy

cyper ethrine trichlorfon DDT DDE Lindane… trong ột số dư c liệu trên thị trường H Nội [3]

Đối ới T CN tuy chưa có con số thống kê nghiên cứu chính thức nhưng

ột số ẫu nghiên cứu đã phát hiện dư lư ng HCBVTV Vì ậy iệc xác định tồn

dư HCBVTV trong T CN đư c chiết xuất từ các dư c liệu trên l hết sức cần thiết

Dư lư ng l phần còn lại của hoạt chất các sản phẩ chuyển hóa các thành phần khác có trong thuốc tồn tại trên cây trồng nông sản đất nước sau ột thời gian dưới tác động của hệ sống điều kiện ngoại cảnh Mức dư lư ng tối đa cho phép (MRL) l giới hạn tối đa dư lư ng HCBVTV (thường biểu thị bằng g/kg) l nồng độ cao nhất của dư lư ng thuốc có trong ột đơn ị sản phẩ nông sản hay thực phẩ ở đó có thể đư c chấp nhận không gây hại cho người sử dụng MRL đư c tính dựa trên độc tính của HCBVTV dữ liệu ề tồn dư trong sản phẩ đư c sản xuất theo quy trình GA (Thực hành nông nghiệp tốt) lư ng sản phẩ con người sử dụng

Mỗi HCBVTV có ột giá trị MRL khác nhau trên từng nền ẫu Hơn nữa MRL của ỗi nước lại khác nhau do sự khác nhau ề số lư ng sản phẩ cách sử dụng của từng nước WHO FAO quy định MRL theo tiêu chuẩn Codex trong đó quy định cụ thể cho ỗi HCBVTV trong từng nền ẫu Tuy nhiên hiện nay ẫn còn rất nhiều HCBVTV chưa có quy định ề MRL Để giải quyết ấn đề n y ột

số quốc gia tổ chức trên thế giới như Nhật Bản Châu Âu Mỹ … sử dụng giá trị MRL chung (defaut alue) cho tất cả các HCBVTV l 0,01 mg/kg [44]

Với các đối tư ng l dư c liệu thực phẩ chức năng có nguồn gốc dư c liệu trong ột số Dư c điển như dư c điển châu Âu (EP IV), dư c điển Mỹ (USP 26) qui định giới hạn cho phép đối ới ột số HCBVTV Tuy nhiên, ẫn có rất nhiều HCBVTV chưa có MRL trên dư c liệu thực phẩ chức năng Do đó ức 0,01 g/kg ẫn đư c xe l MRL chung của các đối tư ng n y

Tại Việt Na thông tư 46-2007-QD – Bộ Y Tế đã qui định ức giới hạn tối

đa cho phép của HCBVTV trong các sản phẩ nông sản: hoa quả rau củ thịt cá… Các tiêu chuẩn n y đều dựa trên tiêu chuẩn Codex do chưa có các nghiên cứu ở Việt

Na ề đánh giá nguy cơ ô nhiễ HCBVTV Hiện nay ức 0,01 g/kg đư c đa

số các phòng thí nghiệ lựa chọn như l ức phương pháp phân tích phải đạt

đư c để phân tích HCBVTV

1.4 Các hương há xác định HCBVTV

Để xác định dư lư ng HCBVTV cần phải trải qua quá trình tách chiết để lấy

đư c chất cần phân tích ra khỏi nền ẫu sau đó sử dụng ột kỹ thuật để phát hiện định lư ng

1.4.1 Các kỹ thuật xử ý ẫu

1.4.1.1 Các kỹ thuật truyền thống

Mục đích của phương pháp phân tích đa dư lư ng l phân tích đồng thời nhiều HCBVTV trong cùng ột lần thực hiện do đó các kỹ thuật chiết cũng hướng đến chiết đư c c ng nhiều HCBVTV c ng tốt Các kỹ thuật chiết thông thường như chiết lỏng lỏng (LLE) chiết pha rắn i chiết pha rắn chiết hệ phân tán rắn đã đư c nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích HCBVTV

Đầu tiên phải kể đến l kỹ thuật chiết lỏng lỏng (LLE) đư c sử dụng rất phổ biến đã đư c nhiều tiêu chuẩn có uy tín chấp nhận như USFDA AOAC [16][17] Về nguyên tắc ẫu phân tích đư c đồng nhất hóa trong hỗn h p nước aceton sau đó sử dụng ột dung ôi ké phân cực (như n-hexan, cyclohexan hoặc ether) để chiết HCBVTV khoảng 2-3 lần Tiêu biểu nhất trong số n y l phương pháp AM 302 của USFDA còn gọi l phương pháp Luke [43] Một số nghiên cứu khác sử dụng acetonitril hoặc ethyl acetat để chiết HCBVTV ra khỏi nền ẫu Dịch chiết đư c cô cạn hòa cắn trong dung ôi thích h p có thể phân tích Tuy nhiên dịch chiết thường có khá nhiều tạp chất do đó các phương pháp n y thường phối h p thê quá trình l sạch thông qua sắc ký cột chiết pha rắn (S E) sắc ký thẩ thấu gel (G C) Một số phương pháp sử dụng thê các kỹ thuật hỗ tr như i sóng áp suất, vi chiết pha rắn (S ME) hệ phân tán pha rắn (MS D) cũng đư c sử dụng để chiết HCBVTV [31, 37, 42, 54] Tuy nhiên phạ i áp dụng của những kỹ thuật n y rất hạn chế thường chỉ phân tích đư c 1 nhó HCBVTV nhất định

1.4.1.2 Kỹ thuật QuEChERS

Nă 2003 Anastassiades cộng sự [21, 35] giới thiệu ột phương pháp

ới để phân tích dư lư ng HCBVTV, sau này đư c gọi l phương pháp QuEChERS ( iết tắt của quick – nhanh, easy – dễ cheap – rẻ effecti e – hiệu quả rugged - ổn định safe – an toàn) QuEChERS l ột phương pháp phân tích đa

dư lư ng thuốc trừ sâu trong nhiều loại nền ẫu khác nhau chỉ cần có khoảng 70 – 100% nước trong th nh phần ( ẫu khô đư c cho thê nước) Như tên gọi của nó chuẩn bị ẫu theo QuEChERS có nhiều thuận l i so ới các phương pháp truyền thống khác ẫn đả bảo kết quả phân tích hương pháp QuEChERS ban đầu

đư c báo cáo đầu tiên nă 2002 tại hội nghị phân tích dư lư ng Châu Âu bởi Anastassisdes Lehotay cộng sự Nă 2003 Lehotay các cộng sự [21] nghiên cứu thẩ định phương pháp n y cho thấy phương pháp n y cho kết quả tốt ới 207 chất trong số 235 thuốc trừ sâu trên các nền ẫu rau x lách nho ca ; tuy nhiên những chất nhạy ới pH bị ảnh hưởng rõ rệt Sau đó Lehotay cộng sự [41] thay đổi phương pháp gốc bằng cách sử dụng đệ acetat pH 4 8-5,0 để tăng độ thu hồi của thuốc trừ sâu hương pháp n y sau đó đã đư c nghiên cứu thí nghiệ liên phòng trong 13 phòng thí nghiệ ở 7 quốc gia đối ới 30 thuốc trừ sâu trên nền

ẫu trở th nh phương pháp chính thức của AOAC 2007.01 [18] o nă 2007 Cùng thời gian đó Anastassiades cộng sự ở Stuttgart cũng phát triển ột phương pháp QuEChERS khác sử dụng đệ citrat ở pH 5 hương pháp n y đã

đư c thẩ định liên phòng ở nhiều phòng thí nghiệ ở Đức nă 2008 trở th nh phương pháp châu Âu CEN 15662 [54] Sau n y nhiều phiên bản nữa của phương pháp QuEChERS đã đư c phát triển gồ iệc bổ sung thê C18 o SA; hoặc bổ sung GCB đối ới ẫu rau xanh

hương pháp QuEChERS phải đạt đư c giới hạn phát hiện (LOQ) < 10 µg/kg đối với các chất phân tích và khoảng tuyến tính có thể đến 5000 µg/kg tùy từng chất và thiết bị sử dụng Về bản chất, chất hấp phụ PSA có thể lưu giữ các thuốc trừ sâu có chứa nhó carboxylic như 2 4-D và daminozide Với các mẫu nhiều béo độ thu hồi của nhiều chất bị giả khi h lư ng béo tăng; do đó cho thêm chất hấp phụ C18 có ai trò khá đáng kể đối với mẫu nhiều béo GCB có tác

dụng làm sạch các sterols, chlorophyll, và các chất có cấu trúc phẳng GCB do vậy cũng lưu giữ các thuốc trừ sâu có cấu trúc phẳng ( như thiabendazole terbufos quitozene, hexachlorobenzene) Sử dụng 7,5 mg GCB với mỗi ml sẽ cho thu hồi chấp nhận đư c ( ~ 70%) với các thuốc trừ sâu dạng phẳng trong khi loại đư c ~ 90% chlorophyll

Bảng 1.1 So sánh QuEChERS với phương pháp truyền thống

Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) và sắc ký khí khối phổ 2 lần MS/MS) là những phương tiện hữu hiệu để phối h p với QuEChERS Tuy nhiên, vẫn hoàn toàn có thể phối h p QuEChERS với LC, GC sử dụng các detector khác Tuy nhiên vì có acetonitril trong dịch chiết phương pháp n y không thể sử dụng cho GC-NPD hoặc các detector bị ảnh hưởng bởi lư ng Nitơ trong phân tử Ngoài

(GC-ra cũng có thể sử dụng EtOAc thay ì MeCN để phù h p cho các thiết bị này

Ng y nay phương pháp QuEChERS đã đư c triển khai trên nhiều đối tư ng khác nhau như chè ngũ cốc…; cũng đã ứng dụng để phân tích các h p chất khác như đa dư lư ng thuốc thú y acryla ids AHs…

1.4.2 Các kỹ thuật phân tích

1.4.2.1 Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA)

Phân tích dòng chảy là một kĩ thuật phân tích động trong đó ẫu phân tích ở dạng lỏng đư c bơ o dòng chất mang chuyển động liên tục Sau đó trong òng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong dòng chất mang, hay

đư c bơ trực tiếp o đầu vòng phản ứng để tạo ra một sản phẩm có thể phát hiện

đư c theo một tính chất hóa lí n o đó nhờ một loại detector phù h p Các tính chất hóa lí đó thường là: độ hấp thụ quang phân tử (vùng UV-VIS), tính chất phát xạ và hấp thụ của nguyên tử, tính chất huỳnh quang, sự thay đổi chiết suất, tính chất điện hóa Ứng với mỗi tính chất người ta có một loại detector

Tác giả Ana M García-Campana và cộng sự đã phát triển phương pháp ới

để xác định carbaryl trong thực phẩm thực vật nước tự nhiên bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy Đối với mẫu nước, lọc qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành phân tích Đối với mẫu quả, tiến hành chiết mẫu bằng etylacetat và làm sạch qua các loại cột chiết pha rắn như nhô oxit SA C18 silica Hiệu suất chiết tốt nhất khi sử dụng cột nhôm oxit Carbayl chỉ phát huỳnh quang khi có của chất oxi hóa KMnO4 trong ôi trường kiềm nhẹ Hệ thống phân tích dòng chảy để xác định carbaryl gồm

3 kênh chứa 3 dung dịch khác nhau: NaOH, luminol và KMnO4 Tại các điều kiện tối ưu khoảng tuyến tính carbaryl từ 5 – 100ng/ml và giới hạn phát hiện là

4 9ng/ l Đây l ột phương pháp đơn giản, nhanh và dễ dàng kết h p với phương pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat [33]

Một phương pháp xác định carbaryl bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy sử dụng detector UV – Vis đã đư c các tác giả Karim D Khalaf, A Morales-Rubio và

M de la Guardia nghiên cứu Mẫu đư c chiết với xylen bơ o hệ thống phân tích dòng chảy Tại đây carbaryl sẽ phản ứng với naphtholate và dung dịch p-aminophenol 50pg/ml trong sự có mặt của dung dịch KIO4 0,004M để tạo thành

h p chất mang màu iodophenol Chất n y đư c xác định bằng detector UV – Vis tại bước sóng 596nm Hệ thống phân tích dòng chảy gồm 4 kênh: p-aminophenol,

IO4-, H2O NaOH hương pháp có giới hạn phát hiện 26,5ng/ml với tần suất bơ mẫu 110 lần/giờ Độ thu hồi carbaryl trên các nền mẫu khác nhau khá cao từ 95 – 102% [39]

Một phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector huỳnh quang để xác định carbofuran đã đư c đề cập hương pháp dựa trên phản ứng của carbofuran với KMnO4 và luminol trong ôi trường kiềm nhẹ sẽ tạ thành h p chất màu Carbofuran bị oxi hóa tạo thành anion 3-aminophthalate – dạng kích thích bền và

đư c xác định bằng detector huỳnh quang Khoảng tuyến tính của carbofuran từ

0,06 – 0,5µg/ml, giới hạn phát hiện 0,02µg/ml hương pháp đã ứng dụng thành công xác định dư lư ng carbofuran trong mẫu rau diếp [34]

hương pháp phân tích dòng chảy có ưu điểm là nhanh, thiết bị phân tích dễ kiếm và rẻ tiền Tuy nhiên phương pháp không thể xác định đồng thời các HCBVTV Do vậy phương pháp cũng ít đư c ứng dụng để phân tích HCBVTV

1.4.2.2 Phương pháp điện di mao quản

Wang L và cộng sự đã tách xác định dư lư ng thuốc trừ sâu carbamat bằng phương pháp điện di mao quản đẳng áp Cột mao quản có đường kính 75µm

đư c nhồi hạt ODS 3µ ha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm

CH3COONH4 5mM (pH=6,5) chứa 1mM SDS và 0,01% trietylamine (TEA) Tại các điều kiện tối ưu 10 carba at đã đư c tách nhanh trong vòng 20 phút Các mẫu rau đư c làm sạch qua S E hương pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 – 1,6mg/kg

và hiệu suất thu hồi từ 51,3 – 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11 4% hương pháp đã đư c áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau [55]

ác định dư lư ng fenoxycarb trong lúa mì bằng phương pháp điện di mao quản khô phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Các ẫu bột ì đư c chiết với aceton rồi đư c làm sạch bằng cách chiết lỏng-lỏng với diclo etan hương pháp HPLC sử dụng detector UV tại bước sóng  = 199nm, cột C18 pha động là MeOH : H2O = 6 : 4 (theo thể tích) hương pháp điện di sử dụng mao quản đường kính 50µm x 48,5cm x 48cm chiều dài hiệu dụng, thế giữa hai đầu là 30kV, dung dịch đê CH3COONH4 20mM (pH=9) trong 95% MeOH Cả hai phương pháp đều

có giới han phát hiện thấp 0 008 g/kg đối với H LC 0 024 g/kg đối với điện di mao quản khô và hiệu suất thu hồi cao trên 85% Hai phương pháp đã đư c ứng dụng để xác định fenoxycarb trong các mẫu lúa mì [42]

hương pháp sắc ký mao quản điện động học ixen đã xác định đồng thời aldicarb, carbofuran và một số dạng chuyển hóa của nó trong nước bề mặt Các mẫu

đư c đư c làm sạch qua cột chiết pha rắn có chứa 500mg than hoạt tính Các chất

đư c tách bằng hệ thống sắc ký mao quản điện động học mixen sử dụng cột mao quản có đường kính 75µm, chiều dài hiệu dụng của cột 50cm Các chất đư c tách trong ôi trường đệm natri borat/acid clohidric (20mM, pH=8) và sử dụng natri

dodecyl sunfat 140mM làm chất hoạt động bề mặt để tạo ra các ixen Các điều kiện chạy áy: điện thế tách 23kV, thời gian bơ ẫu 12s, nhiệt độ cột tách 25C

và detector UV tại bước sóng 210n hương pháp có giới hạn phát hiện từ 2 –

7 4µg/l độ thu hồi cao từ 77 – 97% với độ lệch chuẩn tương đối 2 – 7% [20]

Kĩ thuật điện di ao quản l ột kĩ thuật ới đư c phát triển khoảng hơn 10

nă trở lại đây Đây l ột kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh tốn ít dung ôi hóa chất Việc xác định các hóa chất bảo ệ thực ật bằng thiết bị n y ẫn đang

đư c nghiên cứu chưa có nhiều loại thuốc trừ sâu đư c xác định bằng phương pháp này

1.4.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Các tác giả Tethgatuk P., Jinsart W and Arnold P đã phân tích profenofos trong ẫu nước ương tại các trang trại trồng rau thuộc tỉnh atu tanee Thái Lan bằng kĩ thuật chiết pha rắn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (R -

H LC) 100 l ẫu nước đư c dẫn qua cột chiết pha rắn ODS (100 g chất hấp phụ) rồi rửa giải bằng 5 l dung ôi axetonitril/nước (6:4 / ) độ thu hồi của rofenofos xác định đư c từ ẫu thê chuẩn l 90% Bơ 20μl dịch chiết o hệ thống H LC LDC4100 cột ODS 12 5c ×4 tốc độ pha động 1 l/phút detector

UV đo ở bước sóng 220n Nồng độ rofenofos trong các ẫu nước xác định đư c nằm trong khoảng 0 11 đến 1 11pp [54]

Tác giả Grou E cộng sự đã xác định thuốc bảo ệ thực ật carbamat trong đất nước bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bước sóng 254n Các ẫu nước đư c chiết lỏng lỏng ới diclo etan các ẫu đất

đư c l sạch bằng cột florisil Dịch chiết đư c đe cô quay đến cạn hòa cặn bằng 1ml metanol đe đo Giới hạn phát hiện của phương pháp đối ới ẫu nước từ 0,005 – 0 01µg/g đối ới ẫu đất từ 0 05 – 0,1µg/g [31]

Tác giả Tang F và cộng sự đã xác định dư lư ng thuốc trừ sâu nhóm carbamat trong sau bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao H TLC tại 2 bước sóng  = 243nm và  = 207n hương pháp có hiệu suất thu hồi từ 70,13 – 103,7% tại nồng độ 1 – 5mg/kg [53]

Tác giả Islam A cộng sự đã phân tích dư lư ng Chlorpyrifos trong các

ẫu thực ật tại Lahore akistan bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

H LC Mẫu đư c xay nhỏ cân khoảng 10 ga rồi trộn ới 20 ga natri sunfat khan 2 5 ga natri clorua; chiết bằng 100 l hỗn h p dung ôi gồ etanol etyl axetat diclo etan trên thiết bị lắc; lọc lấy dịch rồi cô quay thổi khô hòa cặn

bơ 20μl dung dịch lên hệ thống H LC Cột tách Zorbax R C18 (đường kính trong 4 6 ; d i 250 ; cỡ hạt 5μ ) ha động l hỗn h p axetonitril 82 5%; nước 17%; axit axetic 0 5% Detector ảng diod (DAD) [37]

hương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao l ột phương pháp thông dụng để xác định các h p chất hữu cơ hương pháp n y đã đư c ứng dụng để xác định đồng thời các chất BVTV Tuy nhiên phương pháp có độ nhạy ké khi sử dụng detector UV còn khi sử dụng detector huỳnh quang phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ có thể nhận biết chất phân tích thông qua thời gian lưu Đối ới những nền ẫu phức tạp các chất phân tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền ẫu nếu

chỉ dựa o thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định chất cần phân tích

1.4.2.4 Phương pháp sắc ký khí

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

Trong sắc ký khí chất phân tích dạng khí đư c ận chuyển thông qua cột bằng khí ang

Trong sắc ký khí sơ đồ hình 1-5 ẫu chất lỏng hay khí dễ bay hơi đư c tiê qua ột ách ngăn ( ột đĩa cao su) o ột cổng nóng trong đó nó bốc hơi nhanh chóng Hơi đư c quét qua cột bằng khí ang He N2 hay H2 chất phân tích đư c tách ra đi tới detector kết quả đư c hiển thị trên áy tính Cột phải đủ nóng để cung cấp đủ áp lực hơi cho chất phân tích đư c rửa giải trong ột thời gian

h p lý Các detector đư c duy trì ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ của cột nhờ ậy tất cả các chất phân tích đều ở dạng khí

Conacher H.B và cộng sự đã xác định ethylcarba at trong đồ uống bằng phương pháp sắc ký khí với detector cộng kết điện tử (Electron Capture Detector - ECD) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Các mẫu đư c pha loãng bằng ethanol 10% rồi đư c chiết bằng diclometan Dịch chiết đư c đe cô đến gần cạn đe đo hương pháp n y đã đư c đánh giá ở 5 phòng thí nghiệm với 4 phòng sử dụng detector ECD và 1 phòng sử dụng detector MS Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp, khoảng 5µg/kg đối với detector ECD 0 5µg/kg đối với detector MS [23]

Kawasaki M và cộng sự đã xác định thuốc trừ sâu carba at nhó nitơ hữu cơ trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ hương pháp đã xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu trong một số thực phẩ như táo khoai tây gạo, chuối… Mẫu đư c chiết bằng aceton đư c làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột diatomaceous, cột diatomit kết h p với cột C18, cột florisil Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80% Sau đó ẫu đư c xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Chương trình chạy khối phổ đư c chia làm 7 cửa sổ thời gian lưu và mỗi cửa sổ có từ 10 – 15 mảnh ion con Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp từ 0,01 – 0,1µg/ml [40]

Hu X và cộng sự nghiên cứu xác định đa dư lư ng thuốc trừ sâu trong nước táo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Mẫu nước táo đư c chiết bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5 l/phút hương pháp có độ thu hồi 70 – 110% và

hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2mg/kg [36]

Các tác giả Phạm Thanh Kỳ, Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quỳ đã xác định đồng thời 18 hoạt chất thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ hotpho hữu cơ Pyrethroid trong 66 mẫu dư c liệu bằng phương pháp sắc ký khí sử dụng chiết lạnh hoặc chiết Shoxlet kết h p phân tích bằng detecter cộng kết điện tử (ECD), detecter khối phổ MS detecter nitơ – photsopho N D hương pháp có giới hạn phát hiện thấp ở mức nanogam hoặc dưới nanoga độ thu hồi các chất đều ≥ 70% [5]

hương pháp sắc ký khí đã đư c ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật như các chất clo hữu cơ lân hữu cơ pyrethroid carba at Tuy nhiên phương pháp chỉ phân tích đư c những chất dễ bay hơi còn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian và hóa chất Hơn nữa để phân tích đư c đồng thời các chất thì cần thời gian phân tích dài

1.4.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật mới tuy nhiên đã đư c nhiều tác giả nghiên cứu phương pháp xác định HCBVTV trên nhiều đối tư ng mẫu khác nhau Đây l phương pháp có nhiều ưu điể như:

- Có độ nhạy cao đặc biệt là sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất phù h p để phân tích dư lư ng

- Có khả năng tách các chất dựa theo /z do đó cùng ới khả năng tách các chất qua H LC thì phương pháp n y có thể phân tich đồng thời rất nhiều HCBVTV trong cùng một lần chạy

- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lư ng

và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất

- Có khả năng phân tích đư c những chất không thể phân tích bằng sắc ký khí như các chất ké bay hơi các chất không bền nhiệt

Với những ưu điể như ậy, LC-MS/MS đã đư c nhiều tác giả nghiên cứu

để phân tích HCBVTV đặc biệt phù h p khi phối h p với kỹ thuật QuEChERS để

xử lý mẫu Nă 2003 khi Anatassiades Lehotay lần đầu tiên công bố phương pháp QuEChERS đã cho thấy khả năng phối h p của phương pháp n y ới cả sắc

ký lỏng và sắc ký khí khối phổ

Nă 2007 Anastassiades và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS tách

80 loại thuốc trừ sâu thuộc các nhóm hóa học khác nhau từ các sản phẩm có hàm

lư ng lipid thấp Hỗn hơp 38 thuốc trừ sâu chiết từ chanh gai, nho khô, bột mì và dưa chuột đư c phân tích bằng GC-MS/MS Hỗn h p 42 thuốc trừ sâu còn lại chiết

từ ca rư u ang đỏ nho đỏ, nho khô và bột ì đư c phân tích bằng LC-MS/MS Các HCBVTV lựa chọn cho nghiên cứu này bao gồm những chất thường xuyên phát hiện ư t quá mức giới hạn dư lư ng tối đa (MRL) trong thực phẩm Mức thêm chuẩn cho các thí nghiệm kiể tra độ thu hồi là: 0,005; 0,01; 0,02 và 0,2 mg/kg để phân tích GC-MS/MS, và 0,01 và 0,1 mg/kg cho phân tích LC-MS/MS Khả năng phát hiện định lư ng của các HCBVTV cao ngay cả khi nồng độ thấp,

tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu lớn độ chính xác cao Độ thu hồi trong khoảng 70-110% ( trung bình trên 98%); độ lệch chuẩn tương đối nói chung dưới 10% (trung bình trên 4,3%) Dựa trên những kết quả n y các phương pháp đã đư c chứng minh là kỹ thuật hiệu quả và mạnh mẽ, phù h p để giám sát việc tuân thủ MRL thuốc trừ sâu của một loạt các sản phẩm nông nghiệp [48]

Nă 2007, Lehotay và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật QuEChERS phân tích dư

lư ng 16 HCBVTV trong ô liu và dầu ô liu Nền mẫu này có chứa h lư ng lipid cao gây ảnh hưởng xấu đến độ thu hồi và gây hại cho hệ thống sắc ký truyền thống Tác giả đã nghiên cứu và tối ưu hóa bằng cách sử dụng hệ phân tán d-SPE với các chất hấp phụ khác nhau (C18 SA GCB…) để tăng hiệu suất thu hồi và giảm thiểu ảnh hưởng nhiễu của nền mẫu Dịch chiết đư c phân tích trên cả hai thiết bị GC-MS

và LC-MS/MS với chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) Kết quả cho thấy phương pháp đạt đư c sự phục hồi có thể chấp nhận định lư ng 70 – 109% với RSDs < 20% cho GC-MS và 88 – 130% với RSDs < 10% cho LC-MS/MS và LOD bằng

hoặc thấp hơn qui định mức dư lư ng tối đa cho phép của các thuốc trừ sâu [25]

Nă 2010 Afify và cộng sự đã phân tích đa dư lư ng 150 loại thuốc trừ sâu trong nho bằng kỹ thuật QuEChERS kết h p sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS ở chế độ APCI Thuốc trừ sâu đư c chọn từ nhiều nhó khác nhau thường đư c phát hiện trong nho và các rau quả trên thị trường Ai Cập Kết quả thu hồi ở ba nồng độ

khác nhau (0 01 0 05 0 1 g / kg) dao động trong khoảng 70 -110% độ lệch chuẩn tương đối RSDs từ 1 – 25% (n=6) [19]

Nă 2012 Chen cộng sự sử dụng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao kết h p khối phổ hai lần (UHPLC-MS/MS) xác định đa dư lư ng 116 HCBVTV trong thực vật đư c sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc Mẫu

đư c chiết và làm sạch bằng kỹ thuật QuEChERS và phát hiện bởi MS/MS dưới chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) định lư ng bằng đường chuẩn trên nền mẫu Khoảng tuyến tính đường chuẩn tốt với nồng độ từ 5 – 100 ng/ml, giới hạn định lư ng (LOQs) nhỏ hơn 0 01 mg/kg với hầu hết các thuốc trừ sâu Độ thu hồi trung bình của hầu hết các thuốc trừ sâu trong khoảng 70 – 120%

UHPLC-ở 3 nồng độ khác nhau từ 0 01 g/kg đến 0,1mg/kg với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 15% hương pháp đã đư c áp dụng trên 138 mẫu thực từ 102 loại thuốc thảo dư c Trung Quốc, phát hiện 95 mẫu dương tính [24]

Những ví dụ nêu trên cho thấy, sự phối h p giữa QuEChERS và LC-MS/MS

là một xu hướng đang đư c nhiều nghiên cứu hiện nay tập trung o để phân tích HCBVTV Đối với T CN đây ẫn là một vấn đề mới nhưng hứa hẹn những kết quả khả quan Do đó chúng tôi đã quyết định lựa chọn cách tiếp cận QuEChERS với kỹ thuật LC-MS/MS để nghiên cứu phương pháp phân tích đa dư lư ng HCBVTV trong một số TPCN có nguồn gốc thực vật

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ HƯƠNG HÁ NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tư ng nghiên cứu

6 Acetamiprid C10H11ClN4 Neonicotinoid

7 Carbaryl

(Sevin)

C12H11NO2 201,22 g mol−1

14 Emamectin C49H75NO13

886,12 g mol−1

Macrocyclic Lactone

2.1.2 Đối tượng phân tích

Thực phẩm chức năng đư c sử dụng để xây dựng đánh giá hiệu lực của phương pháp l tr ướp đắng

Ứng dụng phương pháp để phân tích HCBTV trên một số thực phẩm chức năng: tr túi lọc, trà atiso – nhân sâm, trà thanh nhiệt, trà rau má, trà trái nhàu, trà gừng quế, trà khổ qua, trà trinh nữ hoàng cung, trà hồng sâm, viên nang ô mai - phục linh, viên nang linh chi – tr xanh… nước ép trái nhàu, dịch chiết nghệ

2.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Mục tiêu

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời 25 HCBVTV trong TPCN có nguồn gốc thực vật bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - khối phổ LC/MS/MS với 2 mục tiêu cụ thể như sau:

- Xây dựng phương pháp xác định dư lư ng ột số hóa chất bảo ệ thực

ật trong thực phẩ chức năng bao gồ :

 Khảo sát các điều kiện tách chiết ẫu phân tích

 Khảo sát phương pháp bao gồm:

 Khảo sát điều kiện MS

 Khảo sát điều kiện LC

 Khảo sát điều kiện tách chiết mẫu

- Ứng dụng hương há

Áp dụng phương pháp ới xây dựng để xác định tồn dư 25 hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật trong 16 sản phẩm TPCN có nguồn gốc thực vật đang lưu h nh trên thị trường

2.3 hương há nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS

Nguyên tắc: hương pháp QuEChERS dựa trên chiết một lần bằng

acetonitril đã đư c đệm hóa và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng nhờ muối magie sulfat (MgSO4) Qúa trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-S E) đư c dùng để loại các axit hữu cơ nước còn dư các th nh phần khác nhờ phối h p chất hấp phụ amin bậc 1 bậc 2 (PSA) và MgSO4;( Nếu cần, C18 và GBC đư c sử dụng để lần lư t loại các chất béo và cholorophyll); dịch chiết đư c tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuật khối phổ

Các bước thực hiện QuEChERS:

Hình 2.1: Các bước thực hiện kỹ thuật QuEChERS

Cân 15 g mẫu

Thêm 15 ml ACN (lắc)

6g MgSO4, khan; 1,5g NaCl (lắc, ly tâm)

150mg MgSO4 khan, 50g PSA Option: +50 mg C18 và 7,5 mg GCB

Option: +50 mg C lắc và ly tâm 18 và 7,5 mg GCB

Đối tư ng mẫu phân tích trong luận ăn n y l các loại TPCN có nguồn gốc thực vật thường tồn tại ở 3 dạng: tr nước ép và viên nang có nền mẫu phức tạp Do

đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích h p để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector tăng khả năng phát hiện hương pháp QuEChERS tuy ới

đư c phát triển nhưng đã thể hiện những ưu điể ư t trội so với các phương pháp khác trong phân tích đa dư lư ng HCBVTV

Ưu điểm của phương pháp:

• Nhanh (với 10 mẫu có thể tiến hành xử lý mẫu trong 30 phút)

• Đơn giản (ít tốn thiết bị, dụng cụ đơn giản, tối thiểu đư c nguồn gây sai số)

• Ít tốn kém cho quá trình phân tích (chi phí xử lý mẫu khoảng 100 nghìn đồng/1 mẫu)

• Tăng độ nhạy của phương pháp do dung dịch chiết không bị pha loãng nhiều lần

• An to n cho con người ôi trường

2.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS)

hương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là một kĩ thuật mới đư c phát triển trong những nă gần đây hương pháp n y tuy ới ra đời nhưng nó đư c ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các hóa chất bảo vệ thực vât hương pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến h ng tră các loại thuốc trừ sâu khác nhau

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lư ng phân tử của các h p chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lư ng điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo th nh n y đư c tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lư ng hoặc cấu trúc phân

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó l các silica trần hoặc các silica đư c gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN )

- Sắc ký pha ngư c: pha tĩnh thường là các silica đã đư c ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng sắc ký pha ngư c với cột đảo

XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm i.d., cỡ hạt 2,5 µm) (Waters, Mỹ) và tiền cột XBridge C18 (20 mm x 3,9 mm i.d cỡ hạt 3,5 µm), (Waters, Mỹ)

Chân không

- ha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu l nước, tuy nhiên

để phân tích các chất hữu cơ cần thê các dung ôi khác để giả độ phân cực như MeOH ACN ha động loại n y đư c dùng trong sắc ký pha liên kết ngư c

- ha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đư c khả năng rửa giải người ta thường phối h p 2 hay 3 dung ôi để có đư c dung ôi có độ phân cực từ thấp đến cao phù h p với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

ha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng ai trò tách các chất mà còn góp phần vào khả năng ion hoá của chất Chúng cũng có những yêu cầu cao hơn ề độ tinh khiết h lư ng các tạp chất Có những loại pha động đư c sản xuất riêng cho LC-MS/MS

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ pha động gồm có dung dịch acid acetic 0 1% trong nước và methanol; chế độ gradient áp suất cao

2.3.2.3 Khối phổ (Mass Spectrometry - MS)

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu đư c ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa o bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu đư c sẽ chuyển o áy tính để xử lí lưu trữ

* Nguồn ion: Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đư c dẫn tới nguồn ion để

chuyển thành dạng hơi đư c ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thường

đư c sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI)

Kĩ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu đư c dẫn o ùng có trường điện từ mạnh đư c duy trì ở hiệu điện

thế cao 4kV Tại đây dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện đư c hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đư c kết h p với dòng khí khô để l bay hơi dung môi Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương (ESI+) và ion âm (ESI-)

ESI l kĩ thuật ion hóa mề có độ nhạy cao Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein peptit cacbonhydrat nucleotit polyetilen glycocol, và các chất phân cực có khối lư ng phân tử nhỏ

* Bộ phận phân tích khối: Sau khi đã đư c ion hoá các ion đư c đưa đến bộ phân

tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn pha thê để thu đư c các ion con Các kỹ thuật phân tích khối đư c sử dụng phổ biến là bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay Bộ phân tích khối ba tứ cực đư c sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS đây chính l kỹ thuật đư c chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Tứ cực đư c cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Một trường điện từ đư c tạo ra bằng sự kết h p giữa dòng một chiều (DC) điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực đư c đóng ai trò như ột

bộ lọc khối Khi một trường điện từ đư c áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa /z trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z phù h p mới có thể đi qua đư c bộ lọc này

Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực ghép nối với nhau (hình 1.7) Trong đó tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có ặt như khí N2 Ar He Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn ion con (daughter ions) Q2 không đóng ai trò l bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion

do Q1 chuyển đến Sau đó tất cả các ion con đư c chuyển qua bộ tách Q3 Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion đư c chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện