Nghiên cứu xác định thành phần và một số hoạt tính sinh học của lá trầu không (piper betle l )

* Dung môi: Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là phẩm chất và đặc tính của dung môi sử dụng, do đó dung môi dùng trong trích ly cần phải đạt được những yêu cầu

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Tr ần Duy Phong

Công ngh ệ sinh học

Hà N ội, 2008

Tr ần Duy Phong

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hoàng Đình Hòa

Hà N ội, 2008

L ỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn sự quan tâm giúp đỡ trong thời gian qua của Viện đào tạo Sau đại học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện Khoa học

và công nghệ Việt Nam

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Hoàng Đình Hòa và PGS.TS Phạm Quốc Long, những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Học viên - Trần Duy Phong

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả được công bố trong luận văn là trung thực, chính xác, được nghiên cứu bởi chính bản thân Các số liệu trích dẫn được ghi rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung trình bày trong

luận văn

H ọc viên - Trần Duy Phong

M ỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN 0

LỜI CAM ĐOAN 1

MỤC LỤC 2

Danh mục các bảng 4

Danh mục các hình 5

MỞ ĐẦU 6

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 7

1.1 Tổng quan về trầu không 7

1.1.1 Tên gọi 7

1.1.2 Mô tả 8

1.1.3 Phân bố, sinh thái 8

1.1.4 Cách trồng và bộ phận sử dụng 9

1.1.5 Thành phần hóa học 9

1.1.6 Hoạt tính sinh học 10

1.1.7 Tính vị, công năng, công dụng 12

1.1.8 Bài thuốc có trầu không 13

1.2 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu 14

1.2.1 Phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi 15

1.2.2 Phương pháp chưng cất hơi nước 17

1.2.3 Vi sóng 21

1.2.4 Siêu âm 24

1.3 Các kết quả nghiên cứu về tinh dầu lá trầu không 25

1.3.1 Về thành phần tinh dầu lá trầu không 25

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá trầu không 29

CHƯƠNG II – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nguyên liệu 35

2.2 Sơ đồ thực nghiệm 36

2.3 Phương pháp chiết xuất 36

2.3.1 Chưng cất 36

2.3.2 Trích ly 36

2.4 Phương pháp GC/MS 37

2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng VSV kiểm định 37

2.6 Phương pháp thử hoạt tính chống Oxi hóa 39

2.6.1 Phương pháp thử với enzym peroxidaza 39

2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính DPPH 40

2.7 Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào 41

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả thu mẫu chưng cất và mẫu trích ly 44

3.2 Kết quả phân tích GC/MS 45

3.2.1 Kết quả GC/MS mẫu chưng cất 45

3.2.2 Kết quả GC/MS mẫu trích ly bằng MeOH 48

3.2.3 Kết quả GC-MS mẫu trích ly bằng n - hexan 50

3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định 53

3.4 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa 54

3.5 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 56

3.6 So sánh thành phần tìm thấy trong các mẫu thí nghiệm 62

3.7 So sánh thành phần tìm thấy trong các kết quả nghiên cứu 65

3.7 Tổng hợp kết quả thử hoạt tính sinh học 70

3.8 Bàn luận về liên hệ giữa thành phần và hoạt tính sinh học của lá trầu không 71 K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

Tài liệu tham khảo 73

PHỤ LỤC 1 - Một số hình ảnh về thiết bị được sử dụng 75

PHỤ LỤC 2 - Kết quả thử nghiệm GC/MS đối với các mẫu thí nghiệm 77

Danh m ục các bảng

1 Bảng 1.1 Thành phần tinh dầu lá trầu không (Hà Nội) 27

2 Bảng 1.2 Các hợp chất có hàm lượng lớn của sáu loại trầu

không (Sri Lanka) được xác định bởi GLC 28

3 Bảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu không

4 Bảng 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC đối với vi sinh vật

của tinh dầu lá trầu không (Sri Lanka) 30

5 Bảng 1.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi sinh vật

kiểm định của tinh dầu lá trầu không (Phillipine) 31

6 Bảng 1.6 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá trầu không

9 Bảng 3.2 Thành phần trong mẫu trích ly bằng MeOH 47

10 Bảng 3.3 Thành phần trong mẫu trích ly bằng n - hexan 49

11 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định 52

12 Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa 53

13 Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 55

14 Bảng 3.7 So sánh thành phần lá trầu không ở 3 mẫu chiết

15 Bảng 3.8 So sánh thành phần của 3 mẫu thí nghiệm với các

16 Bảng 3.9 Các thành phần không xuất hiện trong 3 mẫu thí

17 Bảng 3.10 Các thành phần không xuất hiện trong các nghiên

18 Bảng 3.11 Tổng hợp kết quả thử hoạt tính sinh học 71

Danh m ục các hình

2 Hình 2.1 Lá trầu quế dùng trong nghiên cứu 36

3 Hình 3.1 Kết quả thu mẫu chưng cất và mẫu trích ly 43

5 Hình 3.3 Phổ GC MS của mẫu trích lý bằng MeOH 47

6 Hình 3.4 Phổ GC/MS của mẫu trích ly bằng n - hexan 49

7 Hình 3.5 Ảnh chụp mẫu thử bằng phương pháp DPPH 54

8 Hình 3.6 Ảnh chụp mẫu thử bằng phương pháp thử Peroxidaza 54

9 Hình 3.7 Ảnh chụp tế bào ung thư phát triển bình thường 55

10 Hình 3.8 Ảnh chụp tế bào KB xử lý với mẫu trích ly MeOH 56

11 Hình 3.9 Ảnh chụp tế bào KB xử lý với mẫu trích ly n-Hexan 56

12 Hình 3.10 Ảnh chụp tế bào KB xử lý với mẫu chưng cất 57

13 Hình 3.11 Ảnh chụp tế bào HepG2 xử lý với mẫu trích ly

14 Hình 3.12 Ảnh chụp tế bào HepG2 xử lý với mẫu trích ly

15 Hình 3.13 Ảnh chụp tế bào HepG2 xử lý với mẫu chưng cất 58

16 Hình 3.14 Ảnh chụp tế bào Lu xử lý với mẫu trích ly n-hexan 59

17 Hình 3.15 Ảnh chụp tế bào Lu xử lý với mẫu chưng cất 59

18 Hình 3.16 Ảnh chụp tế bào Lu xử lý với mẫu trích ly MeOH 60

19 Hình 3.17 Ảnh chụp tế bào MCF7 xử lý với mẫu trích ly MeOH 60

MỞ ĐẦU

Trầu không (Piper betle L.) là loài cây được trồng phổ biến ở Việt Nam [4], được gắn với tục ăn trầu của người dân Ngoài việc nhai trầu để bảo vệ răng, trầu không còn được sử dụng trong các bài thuốc dân gian để chữa cảm mạo, chữa vết thương, vết bỏng, sai khớp, bong gân [2]…

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thành phần cũng như hoạt tính sinh học của trầu không, tuy nhiên, các nghiên cứu tại Việt Nam thường tách rời giữa xác định thành phần và hoạt tính sinh học [1, 3, 16] nên khó định hướng được ứng dụng hoạt tính sinh học của lá trầu không vào các sản phẩm

cụ thể Thực tế cho thấy Việt Nam có rất ít sản phẩm ứng dụng từ các hoạt tính của

lá trầu không, ngoài ra, hoạt tính gây độc tế bào (chống ung thư) của lá trầu không

đã được một số tài liệu nhắc đến [1, 4] nhưng chưa có nghiên cứu cụ thể nào về vấn

đề này

Tình hình thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu xác định thành phần và một số hoạt tính sinh học của lá trầu không (Piper Betle L) được tiến hành với mục đích: (1) Nghiên cứu một cách hệ thống về thành phần và hoạt tính sinh học của lá trầu không; (2) Xác định các hoạt tính sinh học quan trọng của lá trầu không, trong đó

có hoạt tính gây độc tế bào (chống ung thư) Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ có ý nghĩa nhất định trong việc định hướng ứng dụng lá trầu không vào các sản phẩm thực tế, phục vụ thiết thực cho cuộc sống

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 T ổng quan về trầu không

1.1.1 Tên gọi

Trầu không – Piper betle L

Tên khác: Trầu cay, trầu lương, thổ lâu đằng

Tên nước ngoài: Betel pepper, betel – leaf, vine pepper (Anh); poivrier bétel, bétel, chavique bétel (Pháp)

Họ: Hồ tiêu (Piperaceae)

Hình 1.1 Trầu không – Piper betle L

1.1.2 Mô tả

Dây leo bám Cành hình trụ, nhẵn, có khía dọc, bén rễ ở những mấu Lá mọc

so le, hình tim tròn, gốc đôi khi hơi lệch, đầu nhọn, dài 10 – 13 cm, rộng 4,5 – 9 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, gân nổi rất rõ ở mặt dưới; cuống lá có bẹ kéo dài.Cụm hoa mọc buông thõng ở kẽ lá thành bông ngắn; lá bắc tròn hoặc hình trái xoan; hoa đực dài có cuống có lông, nhị 2, chỉ nhị ngắn; hoa cái dài khoảng 5 cm, cuống phủ lông dày, bầu có lông ở đỉnh

• Quả mọng, tròn và có lông ở đỉnh

• Toàn cây có tinh dầu thơm, cay

• Mùa hoa quả : tháng 5 – 8

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Trầu không có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia; được trồng từ

2500 năm trước, sau lan sang Madagasca và Đông Phi Ở Trung Quốc, trầu không cũng được ghi chép từ đời nhà Tần 618 – 907 sau Công nguyên Đến đầu thế kỷ 15, cây bắt đầu được đưa sang Châu Âu Ngày nay, trầu không không còn gặp trạng thái hoang dại; mà được trồng phổ biến khắp các nước nhiệt đới ở vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanca, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Philippin, Campuchia, Việt Nam, Lào, Nam Trung Quốc và đảo Hải Nam [1, 2, 4]

Ở Việt Nam, trầu không cũng đã được nhắc đến trong truyện cổ “Trầu – Cau”

từ thời các vua Hùng, cách đây khoảng 2000 năm Hiện nay cây được trồng ở khắp nơi (trừ vùng núi cao lạnh trên 1500m) như vườn các gia đình, trang trại (ở miền Nam) và cả trên các cánh đồng Việc trồng trầu không ở Việt Nam cũng như ở các nước châu Á khác thường gắn với tục ăn trầu của người dân

Trầu không thuộc loại cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng; sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, nhiệt độ trung bình từ 22 đến 260C; lượng mưa 2000 – 3500mm/năm (hoặc trên 4000mm/năm ở Malaysia) [1] Trầu không thích nghi với các loại đất giàu chất hữu cơ, có thành phần sét cao, với pH từ 6 đến 7 Do đặc điểm của loại cây leo bám, nên trồng trầu không phải có giá thể (thân cây gỗ, cây cau,

tường nhà) hoặc có giàn dỡ Cây trồng được 3 – 4 năm mới thấy có hoa quả; hiện chưa quan sát được cây con mọc từ hạt, song trầu không lại có khả năng tái sinh dinh dưỡng rất khoẻ

Trầu không là một cây trồng quan trọng Trải qua lịch sử lâu đời về trồng trọt, hiện nay, quần thể trầu không có nhiều giống khác nhau Ở Viện thực vật học quốc gia Ấn Độ người ta đã thu nhập được 85 loại trầu không Ấn Độ là nước trồng trầu không nhiều nhất thế giới (khoảng 50.000ha), sau đến Bangladesh (12.700 ha) Riêng Thái Lan, sản lượng trầu không hàng năm dành cho xuất khẩu đến 4500 tấn, tương đương 3,7 – triệu đô la Mỹ [1]

1.1.4 Cách trồng và bộ phận sử dụng

Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân Cắt đoạn thân bánh tẻ dài 40 – 50 cm, có rễ ở đốt, vùi sâu 2/3 xuống cạnh bể nước, chân tường hoặc nơi có ẩm thường xuyên Cần làm giàn hoặc cho cây leo bám lên tường Luôn tưới đủ ẩm, thỉnh thoảng bón thêm vôi bột cũ

Lá thu hái quanh năm, dùng tươi Còn dùng rễ

1.1.5 Thành ph ần hóa học

Theo phân tích, cứ 100 gam lá trầu không thì có đến 85.4% độ ẩm, 3.1% protein, 0.8% chất béo, 2.3% muối khoáng, 2.3% chất xơ và 6.1% carbohydrate Hàm lượng khoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, caroten, thiamin, riboflavin, niacin và vitamin C [3]

Lá trầu không chứa tanin, đường, điataza và tinh dầu Tinh dầu của nó có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay, chứa đựng năm propenylphenol có tính chất khử nấm, trừ giun: Chavicol, chavibetol, allyl pyrocatechol, chavibetol acetat, allylcatechol acetat Những chất phenol khác cũng

đã được tìm ra: Hydroxy chavicol, eugenol, methyl eugenol, isoeugenol, flavon, quercetin, nhiều nhất là safrol trong hoa Hydroxy chavicol, tác dụng mạnh nhất, cùng eugenol và tocopherol là những chất chống oxi hóa đã được chiết xuất từ thân trầu Những chất 3b-acetyl ursolic acid, ursolic acid và b-sitosterol có tính chất

chống viêm; b-sitosterol cũng đã được xác định dưới dạng palmitat trong rễ trầu cùng piperin, piperlonguminin trong thân và tritriacontan, cepharadion, dotriacontanoic, stearic acid trong lá [3, 4]

Tại Ấn độ, một cuộc khảo cứu các tinh dầu, phân biệt được các loại trầu trồng

ở các vùng Trầu Bangla chứa nhiều eugenol (64%), đặc biệt chống nấm, trầu Desawari nhiều propenyl benzodioxol (45%) Hai chất anethol và cis-caryophyllen nổi trội trong trầu Meetha Trong năm loại trầu vùng Kapoori thì có cả một loạt hóa chất: a-thujen, b-ocimen, d-cadinen,… Trầu Sanchi đặc biệt có steraldehyd không tìm ra trong các trầu khác [4]

resorcinol Nước cất lá có tác dụng ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro

trong thử nghiệm pha loãng với nồng độ ức chế thấp nhất 1:5000 [4]

Trầu không có tác dụng kháng Entamoeba histolytica phân lập từ bệnh phẩm Tinh dầu diệt động vật nguyên sinh Paramaecium caudatum với độ pha loãng đến 1:10.000 Trầu không có tác dụng diệt nấm mạnh đối với 24 chủng Trichophyton

rubrum, 3 ch ủng T mentagrophytes, 3 chủng T tosurans, 1 chủng T verrucosum, 4

chủng Microsporum canis, 2 chủng M gypseum và 2 chủng Epidermophyton

biết họ đã tìm thấy một hoạt chất trong lá trầu, chất axit chlorogenic có thể tiêu diệt

tế bào bình thường [1]

Trầu không có tác dụng chống co thắt trên mô cơ trơn, ức chế sự tăng quá mức của nhu động ruột, gây trung tiện, có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương ở động vật có vú Liều chết có tác dụng gây mê sâu và gây chết sau vài giờ Trầu không đã được đánh giá về tác dụng làm giảm trạng thái căng thẳng về thần kinh ở người và có tác dụng tốt trên bệnh nhân hen phế quản Piperbetol, methylpiperbetol, piperol A và piperol B, phân lập từ trầu không, ức chế đặc hiệu sự kết tập tiểu cầu thỏ gây bởi yếu tố hoạt hoá tiểu cầu một cách phụ thuộc vào nồng độ Liều ức chế

IC50 của các chất trên và ginkgolid B vào khoảng 18,2; 10,6; 114,2; 11,8 và 4,8 µmol/lít, tương ứng Hoạt lực ức chế của ginkgolid B bằng khoảng 2,8; 1,2; 22,8 và 1,4 lần lớn hơn của piperbetol, methylpiperbetol, piperol A và piperol B Các kết quả nghiên cứu cho thấypiperbetol, methlpiperbetol, piperol A và piperol B là những chất đối kháng với cụ thể của yếu tố hoạt hoá tiểu cầu in vitro [4]

Cao cồn cuống lá trầu không cho chuột cống trắng cái uống 4 liều khác nhau (250 – 1000 mg/kg/ngày), trong những ngày 1 – 10 sau khi giao hợp, có tác dụng chống làm tổ phụ thuộc vào liều Với liều uống 1g/kg, tỷ lệ ức chế làm tổ 90% Tác dụng chống làm tổ do hoạt tính kháng steroid của cao trầu không Đồng thời trọng lượng tử cung giảm, và cùng với tác dụng chống làm tổ, có thể trầu không tác động đến sự tiết hoặc việc sử dụng progesteron Cao cồn cuống lá trầu không được cho chuột cống trắng đực uống với liều 800 – 1500 mg/kg, và cho chuột nhắt trắng đực uống với liều 50 – 100 mg/kg trong 60 ngày liên tục để nghiên cứu về tác dụng trên khả năng sinh sản và những thông số về hormon nam tính khác trên các cơ quan sinh sản nam Những kết quả nghiên cứu gợi ý về tác dụng ức chế sự sinh tinh trùng hoặc kháng androgen của trầu không ở chuột [4]

Trong thử nghiệm về tác dụng gây biến trạng gen gián phân, sự trao đổi chéo,

và đột biến ngược trên những chủng lưỡng bội của Saccharomyces cerevisiae cho

thấy cao nước lá trầu không không gây sự đột biến ở men khi không có sự hoạt hoá

chuyển hoá, không làm tăng tần suất những thể biến trạng, thể tái hợp và thể đột biến ngược, không gây chết tế bào và không ức chế sự phân chia tế bào Việc đánh giá hàm lượng DNA ở nhân các tế bào tuyến ở dạ dày chuột nhắt trắng in situ bằng phương đo quan tế bào cho thấy sự biến đổi có ý nghĩa của hàm lượng trung bình DNA sau thời gian dài( 6 – 10 tháng) nhai lá trầu không với hạt cau và vôi tôi [4] Cao nước lá trầu không chế thành thuốc mỡ có tác dụng làm vết thương ở thỏ chóng lành do thúc đẩy nhanh sự co và sự biểu mô hoá vết thương, ít ảnh hưởng đến sự tạo mô hạt Mỡ trầu không chứa 1% cao trầu không đã được áp dụng cho 18 bệnh nhân bỏng vôi từ độ hai tới độ ba Kết quả 7 bệnh nhân bỏng 6 – 18% khỏi sau

10 – 15 ngày, 7 bệnh nhân bỏng 40% khỏi sau 25 – 38 ngày, 4 bệnh nhân bỏng 25 – 46% khỏi sau 54 – 124 ngày Mỡ trầu không 1% có tác dụng tốt trị bỏng độ hai nông và sâu, và có tác dụng hạn chế đối với bỏng độ ba Dùng uống, trầu không làm giảm sốt ở một số bệnh nhân bỏng [2]

Thuốc đắp không gây xót và phản ứng phụ khác Tinh dầu trầu không có tác dụng kích ứng trên da và niêm mạc, và gây phản ứng viêm khi tiêm dưới da hoặc bắp thịt Lá trầu không có tác dụng chống oxy hoá; đun nóng với dầu, mỡ, bơ, ngăn chặn được sự ôi khét Tác dụng này do phenol, đặc biệt là hydroxy - chavicol có trong trầu không Ảnh hưởng về mô bệnh học của việc nhai lá trâu không, hạt cau, với thuốc lá

đã được nghiên cứu trên chuột nhắt trắng với mô hình niêm mạc tuyến dạ dày

Cho chuột uống liên tục trong 5 tháng cao chiết từ thuốc lá với lá trầu không, hạt cau và vôi với liều thường dùng của người nghiện nhai trầu, nhận thấy có hiện tượng dị sản ruột rõ rệt ở tất cả chuột Tác dụng này chủ yếu do thuốc lá; trầu không

và vôi có tác dụng bảo vệ làm giảm hiện tượng dị sản và loạn sản do thuốc lá Các kết quả thí nghiệm làm sáng tỏ nguyên nhân của hiện tượng người nhai trầu thường xuyên với thuốc lá khối lượng lớn dễ mắc bệnh ung thư [4]

1.1.7 Tính vị, công năng, công dụng

Trầu không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh: phế tỳ, vị, có tác dụng trừ phong thấp, chống lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng

Trầu không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mày đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng Ngày dùng 8 – 16g, dưới dạng thuốc sắc Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa

Lá trầu không và gừng sống ép lấy nước chữa ho, khó thở, đầy bụng Nước ép

lá trầu không nhỏ vào tai chữa đau tai Súc miệng hàng ngàyvới nước có dịch ép lá trầu không phòng được viêm họng, có tác dụng hổ trợ các thuốc chữa bệnh bạch hầu Lá trầu không và lá ráy, giã nhỏ, hơ nóng, đắp chữa sưng tấy Trầu không (3 –

5 lá), hạt cau (1 hạt) Phơi khô, tán bột rắc làm thuốc cầm máu Lá trầu không (2 – 4 g), nhai nuốt nước chữa đau bụng lạnh dạ, tiêu chảy, nôn mửa, không tiêu Lá trầu không vò đắp chữa hắc lào, mày đay, ghẻ ngứa ,sâu kiến đốt; nếu giã hoà với rượu bôi lại chữa bỏng; Phụ nữ có thai không nên dùng

Ở Ấn Độ, lá và tinh dầu trầu không được dùng điều trị các bệnh xuất tiết, bệnh phổi và làm thuốc đắp, thuốc súc miệng hoặc thuốc ngửi trong bệnh bạch hầu Lá trầu không có trong thành phần chế phẩm thuốc cổ truyền Ấn Độ phối hợp với một

số dược liệu khác trị hen phế quản Thuốc hoàn bào chế từ rễ trầu không, thuỷ xương bồ và sen được dùng trong 10 ngày liền từ ngày đầu hành kinh để điều trị đau kinh Ở Indonesia, lá trầu không nghiền nát có trong thành phần một thuốc đặt

âm đạo mà người phụ nữ thường dùng 4 -11 ngày sau khi sinh con

1.1.8 Bài thuốc có trầu không

- Chữa cảm mạo: Dùng lá trầu không đánh gió, xát ở xương sống từ trên xuống dưới

- Chữa vết thương: Lá trầu không, lá thanh táo, lá cỏ răng cưa, lượng bằng nhau, giã nát đắp Lá trầu không tươi (40g) rửa sạch, đun với hai lít nước sôi trong 15 – 20 phút Để nguội, gạn lấy nước trong, cho phèn phi (8g) vào, đánh tan, rồi rửa

- Chữa bỏng: Lá trầu không phơi khô, tán bột, chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt, cô thành cao đặc, rồi pha chế với vaselin thành thuốc mỡ 1% bôi hằng ngày

- Chữa mụn nhọt: Lá trầu không, lá thồm lồm, hoa dâm bụt, đều bằng nhau, giã nát đắp

- Chữa đái nhắt: Rễ trầu không (hoặc thân lá), rễ cau, mỗi vị 10g Sắc uống ngày một thang Dùng vài ngày đến khi khỏi

- Chữa viêm chân răng có mủ: Lá trầu không, nấu cao bôi

- Chữa sai khớp, bong gân: Lá trầu không 12g, nghệ già 20g, lá cúc tần,lá xạ can, mỗi vị 12g Giã nát, trộn với một ít giấm bọc gạc đắp lên chổ sưng đau, 2 – 3 ngày thay băng một lần

- Chữa vết thương, bỏng: Lá trầu không tươi, hành tươi, tỏi tươi, mỗi vị 300g;

lá ớt tươi 200g, mật lợn 1 lít Hành tỏi bỏ vỏ, cùng với trầu không, lá ớt giã nhỏ, cho nửa líat nước nấu kỹ, lọc 2 – 3 lần, cô còn khoảng 300ml Cho vào 1 kg đường đun thành cao lỏng rồi cho mật lợn vào canh kỹ, đựng vào lọ kín Ngày bôi một lần

- Thuốc xoa bóp (đánh gió) chống say nắng: Lá trầu già 5 lá, tóc rối 15g, dầu hoả (loại dầu trắng trong) 5ml Giã nát lá trầu, trộn với dầu hỏa, tóc rối, gói vào vải mềm Xát lên người theo chiều dọc cơ thể từ trên xuống, chủ yếu là phần ngực bụng

và thăn lưng

1.2 Cá c phương pháp chiết xuất tinh dầu [5]

Phương pháp phổ biến để chiết xuất tinh dầu hiện đang được sử dụng là trích

ly và chưng cất hơi nước Ngoài ra, một số phương pháp hiện đại khác cũng đang được nghiên cứu ứng dụng là vi sóng và siêu âm

Tuy nhiên, tất các các phương pháp và quy trình chiết xuất đều phải đảm bảo một số điều kiện sau:

- Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

- Quy trình thu nhận tinh dầu phải phù hợp nguyên liệu

- Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất Nguyên tắc chiết xuất của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như:

- Dễ bay hơi

- Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 1000C

- Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ

- Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí

1.2.1 Phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi

- Có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng, nên thành phần hóa học của tinh dầu ít bị thay đổi

- Được áp dụng để chiết xuất cô kết (concrete) từ hoa mà còn dùng để tận chiết khi các phương pháp khác không chiết xuất hết hoặc dùng để chiết xuất các loại nhựa dầu (oleoresin) gia vị

* Nguyên tắc:

Dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu có trong các mô cây đối với các dung môi hữu cơ

* Dung môi:

Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là phẩm chất

và đặc tính của dung môi sử dụng, do đó dung môi dùng trong trích ly cần phải đạt được những yêu cầu sau đây:

+ Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên liệu

+ Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu + Không có tác dụng hóa học với tinh dầu

+ Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần

+ Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị, không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

+ Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch ly trích để thu hồi dung môi, nhiệt độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu Điểm sôi của dung môi nên thấp hơn điểm sôi của cấu phần dễ bay hơi nhất trong tinh dầu

+ Ngoài ra, cần có thêm những yếu tố phụ khác như: giá thành thấp, nguồn cung cấp dễ tìm, …

Thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện kể trên Người ta sử dụng cả dung môi không tan trong nước như: dietil eter, eter dầu hỏa, hexan, cloroform… lẫn dung môi tan trong nước như: etanol, aceton… Trong một

số trường hợp cụ thể, người ta còn dùng một hỗn hợp dung môi

* Quy trình trích ly:

Phương pháp này thích hợp cho các nguyên liệu có chứa lượng tinh dầu không lớn lắm hoặc có chứa những cấu phần tan được trong nước và không chịu được nhiệt độ quá cao Quy trình kỹ thuật gồm các giai đoạn sau đây:

+ Trích ly: Nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình chứa Trong một

số trường hợp, để gia tăng khả năng trích ly, nguyên liệu cần được xay nhỏ trước Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi cần được xáo trộn đều trong suốt thời gian trích ly Nên khảo sát trước xem việc gia nhiệt có cần thiết hay không, nếu cần, cũng không nên gia nhiệt quá 500C để không ảnh hưởng đến mùi thơm của sản phẩm sau này + Xử lý dung dịch trích ly: Sau khi quá trình trích ly kết thúc, dung dịch trích

ly được lấy ra và có thể thay thế bằng dung môi mới sau một khoảng thời gian nhất định, tùy theo nguyên liệu Tách nước (nếu có) ra khỏi dung dịch, rồi làm khan bằng Na2SO4 và lọc Dung môi phải được thu hồi ở nhiệt độ càng thấp càng tốt để tránh tình trạng sản phẩm bị mất mát và phân hủy Do đó, nên loại dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phương pháp chưng cất dưới áp suất kém (cô quay) Dung môi thu hồi có thể dùng để trích ly lần nguyên liệu kế tiếp

+ Xử lý sản phẩm trích ly: Sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sản phẩm là một chất đặc sệt gồm có tinh dầu và một số hợp chất khác như nhựa, sáp, chất béo, cho nên cần phải tách riêng tinh dầu ra Chất đặc sệt này đem đi chưng cất bằng hơi nước để tách riêng tinh dầu ra Tinh dầu có mùi thơm tự nhiên, nhưng khối lượng thu được kém, ngoài ra tinh dầu này có chứa một số cấu phần thơm có nhiệt độ sôi cao nên có tính chất định hương rất tốt

+ Tách dung dịch từ bã: Sau khi tháo hết dung dịch trích ly ra khỏi hệ thống, trong bã còn chứa một lượng dung dịch rất lớn (khoảng 20 – 30% lượng dung môi trích ly) Phần dung dịch còn lại nằm trong nguyên liệu thường được lấy ra bằng phương pháp chưng cất hơi nước (trường hợp dung môi không tan trong nước), hoặc ly tâm, lọc ép (trường hợp dung môi tan trong nước) Sau đó dung dịch này cũng được tách nước, làm khan và nhập chung với dung dịch trích ly

Chất lượng thành phẩm và hiệu quả của phương pháp trích ly này phụ thuộc chủ yếu vào dung môi dùng để trích ly Để đạt kết quả tốt thì dung môi sử dụng phải thoả mãn được các yêu cầu đã được trình bày ở trên

Vì dung môi dễ bay hơi nên chúng ta cần phải lưu ý đến tỉ lệ thất thoát dung môi trong quy trình trích ly vì việc này có thể ảnh hưởng rất lớn đến giá thành sản phẩm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, khi muốn tiến hành phương pháp trích ly với dung môi dễ bay hơi, cần tiến hành sử dụng phương pháp truyền thống như khuấy từ ở nhiệt độ phòng hoặc đun – khuấy từ (kèm ống hoàn lưu) hay phương pháp dùng Soxhlet Ngoài ra, cùng với sự phát triển ngày càng mạnh mẽ của “hóa học xanh”, mà ngày nay, chúng ta còn áp dụng các phương pháp mới như là: trích

ly có sự hỗ trợ của siêu âm và vi sóng

* Ưu và khuyết điểm:

+ Ưu điểm: sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi thơm tự nhiên Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác

+ Khuyết điểm: Yêu cầu cao về thiết bị; thất thoát dung môi; quy trình tương đối phức tạp

1.2.2 Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một

thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn

* Lý thuyết chưng cất:

Chưng cất có thể được định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau,

áp suất hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần bách phân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại Nếu

vẽ đường cong áp suất hơi của từng chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng với một áp suất, ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất Thí dụ, ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100 0C và benzen sôi ở

80 0C và chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau Thực hành cho thấy, nếu đun hỗn hợp này dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 69 0C cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng với bất kì tỉ lệ nào Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 690C,

áp suất hơi của nước là 225 mmHg và benzen là 535 mmHg

Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cất hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật

* Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước:

+ Sự khuếch tán:

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị

vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau:

“Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào

thực vật Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn

đi Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lượng nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các

mô thoát ra ngoài hết

Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô Nhưng nếu lượng nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần tan dễ trong nước

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng đều và dễ dàng

Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trên cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước Thí dụ, khi chưng cất hơi nước hạt caraway nghiền nhỏ và không nghiền, đối với hạt không nghiền thì carvon (nhiệt độ sôi cao nhưng tan nhiều trong nước) sẽ ra trước, còn limonen (nhiệt độ sôi thấp, nhưng ít tan trong nước) sẽ ra sau Nhưng với hạt caraway nghiền nhỏ thì kết quả chưng cất ngược lại

+ Sự thủy giải: Những cấu phần este trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho

ra acid và alcol khi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

+ Nhiệt độ: Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá nhiệt (trên 100oC) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng

có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, sự

khuếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng tăng theo

Trong công nghiệp, dựa trên thực hành, người ta thường sử dụng một số phương pháp sau:

* Chưng cất bằng nước:

Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chất nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc đó nồi phải trang

bị những cánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này Thí dụ điển hình là mùi tinh dầu hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích vì eugenol và ancol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác

- Ưu điểm:

+ Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

+ Thiết bị gọn, dễ chế tạo

+ Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp trích ly, hấp thụ

+ Thời gian tương đối nhanh

- Khuyết điểm:

+ Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

+ Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy

+ Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị)

+ Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn nhưng tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

* Thu hồi thêm tinh dầu từ nước chưng:

Thường tinh dầu trong nước chưng nằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan Dạng phân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phải chưng cất lại Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể thêm NaCl để gia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng

Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu, người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger (hình vẽ phần phụ lục) với hai loại ống hứng tinh dầu, tùy theo tinh dầu nặng hay nhẹ:

xoay đó Cơ sở của hiện tượng phát nhiệt do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao (2,45x109 Hz), điện trường này sẽ gây ra một xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất

Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn,

do đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 … trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ

Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của

vi sóng Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng

* Hiện tượng làm nóng vật chất bởi vi sóng

Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua được không khí, gốm sứ, thủy tinh, polimer và phản xạ trên bề mặt các kim loại Độ xuyên thấu tỉ lệ nghịch với tần số, khi tần số tăng lên thì độ xuyên thấu của vi sóng giảm Đối với một vật chất có độ

ẩm 50% với tần số 2450 MHz có độ xuyên là 10 cm Ngoài ra, vi sóng có thể lan truyền trong chân không, trong điều kiện áp suất cao…

Năng lượng của vi sóng rất yếu, không quá 10-6 eV, trong khi năng lượng của một nối cộng hóa trị là 5 eV, do đó bức xạ vi sóng không phải là một bức xạ ion hóa

Có một số công trình đã khẳng định được tính vô hại của vi sóng đối với sinh vật Chẳng hạn, khi nghiên cứu sự phát triển của enzim trong điều kiện vi sóng, người ta nhận thấy rằng ảnh hưởng của vi sóng rất giống ảnh hưởng của các gia nhiệt thông thường

Vi sóng cung cấp một kiểu đun nóng không dùng sự truyền nhiệt thông thường Với kiểu đun nóng bình thường, sức nóng đi từ bề mặt của vật chất lần vào bên trong, còn trong trường hợp sử dụng vi sóng, vi sóng xuyên thấu vật chất và làm nóng vật chất ngay từ bên trong Vi sóng tăng hoạt động những phân tử phân

cực, đặc biệt là nước Nước bị đun nóng do hấp thu vi sóng bốc hơi tạo ra áp suất cao tại nơi bị tác dụng, đẩy nước đi từ tâm của vật đun ra đến bề mặt của nó

* Trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng:

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp trích ly)

Lưu ý là mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giống nhau do cấu tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ Kết quả này được phản ánh qua thời gian trích ly

Trong sự chưng cất hơi nước, việc trích ly tinh dầu có thể thực hiện trong điều kiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệu chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng) Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục (trường hợp lượng nước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự trích ly chấm dứt

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất có chứa oxigen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng

có độ phân cực kém) nên sự trích ly chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng

Năm 1998, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêu điểm hỗ trợ cho sự ly trích bằng Soxhlet (FMASE – Focused Microwave Assisted Soxhlet Extraction) Hệ thống này giúp cho thời gian ly trích hợp chất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệ những hợp chất dễ bị phân hủy tăng lên

1.2.4 Siêu âm

Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16 Hz –

18 kHz) Về mặt thực hành, siêu âm được chia làm hai vùng:

+ Vùng có tần số cao (5 – 10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoán bệnh + Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 kHz), ứng dụng trong các ngành khác (kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt gọt, …) dựa trên khả năng cung cấp năng lượng của siêu âm

* Hiện tượng tạo bọt và vỡ bọt

Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt” (khoảng cách liên phân tử) Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu

kỳ đầu và vỡ trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn Năng lượng này có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vị trí không thể tẩy rửa bằng phương pháp thông thường, khoan cắt những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa học, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa nhiệt dẻo, …

Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho phương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian ly trích Trong một số trường hợp, phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ Trong trường hợp tinh dầu vi sự ly trích bằng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩm luôn có mùi thơm tự nhiên

Các thiết bị siêu âm hiện nay chủ yếu bao gồm hai dạng:

+ Bồn siêu âm (40 kHz)

+ Thanh siêu âm (20 kHz)

Hiện nay trong phòng thí nghiệm thường sử dụng bồn siêu âm trong phương pháp trích ly

* Bồn siêu âm:

Bồn thường làm bằng inox, bên dưới đáy bồn có gắn những bộ phận phát ra

nhiệt độ lên cao Bồn siêu âm có ưu điểm là năng lượng được phân bố đồng đều, thuận tiện thao tác, và dễ sử dụng nhưng lại có khuyết điểm là chỉ có một tần số cố định, đôi khi không kiểm soát được nhiệt độ (khi siêu âm trong một thời gian dài), không thực hiện được ở nhiệt độ thấp

Hiện nay bồn siêu âm được chế tạo với nhiều kích thước lớn nhỏ khác nhau để phù hợp với vật chứa bên trong Khi sử dụng bồn siêu âm, nhớ cho một ít chất hoạt động bề mặt vào lượng nước trong bồn để gia tăng khả năng siêu âm Bình chứa nguyên liệu cần đổ ngập dung môi với mức dung môi nên thấp hơn hoặc ngang bằng lớp nước bên ngoài

1.3 Các kết quả nghiên cứu về tinh dầu lá trầu không

1.3.1 Về thành phần tinh dầu lá trầu không

1.3.1.1 Thành ph ần tinh dầu lá trầu không ở Hà Nội [16]

Thành phần của tinh dầu lá trầu không trồng tại Hà Nội chứa khoảng 50 chất, trong đó 20 chất được xác định, eugenol là chất chiếm hàm lượng lớn nhất

Lá trầu không được rửa kỹ, đem nghiền nhỏ và đưa vào chưng cất lôi cuốn hơi nước trong 4 giờ Tinh dầu sau đó trích ly bằng dung môi Trong nghiên cứu này, 3 loại dung môi là ethyl acetate, diethyl ether và n-hexane đã được thử nghiệm Sau khi tách dung môi, tinh dầu đã được khử nước với Na2SO4 khan Tinh dầu được bảo quản ở 5 0C cho đến khi được phân tích

Thiết bị được sử dụng là máy sắc ký Agilent GC 6890 với cột HP 5 (30m

x 0,25mm i.d., độ dày 0,25µm) Nhiệt độ cột được lập trình là 60 0C (2 phút) đến 220 0C (20 phút) với tốc độ gia nhiệt là 4 0C/phút Nhiệt độ đầu dò là 250

0C Khí vận chuyển là Nitơ, tốc độ dòng là 1,5 ml/phút Thiết bị Agilent GS

6890 cùng với Agilent MS 5971 đã được sử dụng cho phân tích GC/MS Cột HP5 (30m x 0,25mm i.d., độ dày 0,13µm) được gắn kết với GC Các điều kiện

GC là giống như mô tả ở trên cho GC 6890 Các điều kiện MS như sau: Điện thế ion hóa 70 eV; ion nguồn nhiệt độ 250 0C; khí vận chuyển là heli, tốc độ dòng là 1,5 ml/phút

B ảng 1.1 Thành phần tinh dầu lá trầu không (Hà Nội)

RI: Xác định dựa trên thời gian lưu

MS: Xác định dựa trên so sánh phổ khối lượng

1.3.1.2 Thành phần tinh dầu lá trầu không ở Sri Lanka [6]

Nguyên liệu là lá trầu không được thu thập từ các huyện của Sri Lanka Sáu giống trầu không của địa phương là Galdalu, Mahamaneru, Kudamaneru, Ratadalu, Nagawalli và Malabulath được sử dụng trong nghiên cứu này

Mẫu lá tươi được cắt nhỏ và chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp trích ly với ethanol trong thiết bị Soxhlet trong 8 giờ

Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng phương pháp phân tích sắc ký khí lỏng (GLC) với thiết bị Shimadzu GC - 14 B, đầu dò FI và cột silica Supelcowax TM-10 Các thành phần dễ bay hơi được xác định bằng phương pháp phân tích GC/MS với thiết bị Hewlett-Packard 5890 Series II, đầu

β-neol Safrole Eugenol

4-Terpi-bitol acetate

Chavi-ocatechol diacetate

1.3.1.3 Thành ph ần tinh dầu lá trầu không ở Philippine [7]

Lá trầu không được thu thập từ các địa phương khác nhau ở Philippine (La Union, Abra, Iloilo City, Palawan and Malaybalay, Bukidnon) để nghiên cứu

Lá trầu không được cắt nhỏ và chưng cất thu tinh dầu, sau đó đem đi phân tích thành phần bằng phương pháp sắc ký khí-khối phổ GC/MS

B ảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu không (Philippine)

17 Copaene 0,59

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá trầu không

1.3.2.1 Ho ạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá trầu không ở Sri Lanka [6]

Nguyên liệu là lá trầu không được thu thập từ các huyện của Sri Lanka Sáu giống trầu không của địa phương là Galdalu, Mahamaneru, Kudamaneru, Ratadalu, Nagawalli và Malabulath được sử dụng trong nghiên cứu này

Mẫu lá tươi được cắt nhỏ và chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp trích ly với ethanol trong thiết bị Soxhlet trong 8 giờ

Kiểm tra tính kháng khuẩn: Tinh dầu lá trầu không đã được sử dụng cho các

nghiên cứu tính kháng khuẩn Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu là Escherichia coli (NCTC 10148), Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662), Staphylococcus epidermidis (NCTC 4276), Staphylococcus aureus (NCTC 85321), Streptococcus pyogens Các giá

trị MIC được xác định bằng cách sử dụng các kỹ thuật pha loãng đa nồng độ

B ảng 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi sinh vật của tinh dầu lá trầu

không (Sri Lanka)

S aureus S

epidermidis

P

aeruginosa E coli S pyogens

Tinh dầu thô 5,00 x 103 1,00 x 104 1,00 x 104 3,12 x 103 2,50 x 102

Mẫu trích ly

bằng ethanol 5,00 x 103 1,00 x 104 1,00 x 104 5,00 x 103 1,25 x 103Đối chứng

1.3.2.2 Ho ạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá trầu không ở Philippine [7]

Lá trầu không được thu thập từ các địa phương khác nhau ở Philippine (La Union, Abra, Iloilo City, Palawan and Malaybalay, Bukidnon) để nghiên cứu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu trầu không được xác định bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu

là Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Candida albicans và Trichophyton mentagrophytes

B ảng 1.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi sinh vật kiểm định của tinh

d ầu lá trầu không (Phillipine)

Nồng độ

pha loãng

(µg/ml)

Mức độ phát triển của vi sinh vật thử nghiệm

S aureus S pyogenes C albicans T mentagrophytes

Từ bảng khảo nghiệm trên cho thấy, nồng độ tối thiểu ức chế của

Staphylococcus aureus là 62, 5 μg/ml, Streptococcus pyogenes 15,60 μg/mL, Candida albicans 250μg/mL và Trichophyton mentagrophytes là 1,95 μg/ml

1.3.2.3 Ho ạt tính kháng khuẩn và chống oxi hóa của tinh dầu trầu không

ở Thái Lan [14]

Lá trầu không được lấy từ Bangkok, Thái Lan để nghiên cứu

Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu là trầu không: Các vi

sinh vật sử dụng trong nghiên cứu này là Aeromonas hydrophila DMST 2798, Bacillus cereus DMST 5040, Escherichia coli DMST 4212, Escherichia coli 0157:H7 DMST 12743, Listeria monocytogenes DMST 17303, Micrococcus luteus DMST 15503, Pseudomonas aeruginosa DMST 4739, Salmonella enteridis DMST 15676 và Staphylococcus aureus DMST 8840 lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật ở Viện Nghiên cứu khoa học và công nghệ ( TISTR), Thái Lan

B ảng 1.6 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá trầu không (Thái Lan)

Xác định hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ chống oxy hóa tối thiểu (MOBICs): Tinh dầu lá trầu không cho thấy khả năng ức chế quá trình oxy hóa của β-carotene và được so sánh với chất tham khảo (ví dụ như BHA và BHT) Kết quả cho thấy tinh dầu lá trầu có hoạt tính chống oxi hóa nhẹ

B ảng 1.7 Hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá trầu không (Thái Lan)

Ch ất Yellow zone /mm Ch ỉ số chống oxy

hóa

MOBIC /µL mL -1

Yellow zone: Khu vực của màu vàng bao quanh giếng mẫu thử nghiệm đã được đánh dấu bằng bút, và đo đường kính bằng cách sử dụng Vernier calipers Chỉ số chống oxy hóa được thể hiện bằng công thức: (đường kính của vùng màu vàng - đường kính của giếng) / đường kính của giếng

Nồng độ chống oxy hóa tối thiểu (MOBIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của dầu trầu mà kết quả trong một vùng màu vàng

Nghiên cứu này cho thấy rằng tinh dầu lá trầu không có thể ức chế một phổ

rộng các vi sinh vật gây bệnh và làm hư hỏng thực phẩm L monocytogenes và S enteridis là hai tác nhân gây bệnh chủ yếu cho thực phẩm lại nhạy cảm nhất đối với các hiệu ứng ức chế của dầu trầu Dầu trầu cho thấy khả năng chống oxy hóa nhẹ so với chất chống oxy hóa tổng hợp

Qua nghiên cứu, phân tích, đánh giá các đề tài, công trình trong và ngoài nước

đã tiến hành đối với lá trầu không, có thể nhận thấy:

- Lá trầu không được trồng ở các khu vực khác nhau sẽ có thành phần, hoạt tính sinh học khác nhau

- Việt Nam chưa có các nghiên cứu một cách hệ thống và liên kết giữa thành phần của tinh dầu lá trầu không và hoạt tính sinh học của nó

- Khả năng kìm hãm phát triển tế bào (chống ung thư) của lá trầu không đã được nhiều tài liệu đề cập đến [1,4], tuy nhiên chưa thấy vấn đề này được nghiên cứu một cách cụ thể

Do đó, mục tiêu của luận văn này là: (1) Nghiên cứu xác định một số phương pháp chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá trầu không; (2) Xác định thành phần của tinh dầu, dịch chiết từ lá trầu không; (3) Thử ngiệm một số hoạt tính sinh học của lá trầu không; (4) Đưa ra một số kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG II – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên li ệu

Trầu quế - một trong hai loại trầu không phổ biến ở Việt Nam, được trồng tại Đan Phượng, Sơn Tây, Việt Nam và thu hoạch lá để nghiên cứu

Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, thường được dùng để ăn trầu

Tên khoa học: Piper betle L

Họ: Piperaceae

Tác giả giám định: TS Trần Huy Thái, Phó Viện trưởng Viện Sinh thái vi sinh vật, Viện KH&CN Việt Nam

Thời điểm lấy mẫu: Tháng 4/2010

Hình 2.1 Lá tr ầu quế dùng trong nghiên cứu

Lá trầu không (1kg) được cắt nhỏ, ngâm trong dung dịch MeOH với tỷ lệ 1: 2

Sử dụng bồn siêu âm để gia tăng hiệu quả trích ly (siêu âm 03 lần, nhiệt độ 30oC, thời gian 15’, tần số 40kHz) Bã được ngâm lần 2 trong dung dịch MeOH với tỉ lệ 1:

2 và chế độ siêu âm như trên

Lá trầu không

Tinh dầu Dịch chiết tổng Chiết n - hecxan

Dịch chiết

GC/MS Thử hoạt tính

kháng VSV kiểm định

Thử hoạt tính chống oxy hóa

Thử hoạt

tính độc tế bào

Dung dịch sau khi trích ly được đưa vào máy quay cất chân không IKA RV 06-ML 1-B để thu hồi MeOH và làm khan mẫu trích ly (nhiệt độ 50oC, tốc độ quay

Sử dụng phễu chiết để tách phần dung môi n – hecxan ra khỏi hỗn hợp và đưa

đi quay cất quay cất chân không bằng thiết bị IKA RV 06-ML 1-B để thu hồi n – hexan và làm khan mẫu trích ly (nhiệt độ 500C, tốc độ quay 75 vòng/phút)

Phần nước còn lại tiếp tục ngâm lần 2 trong dung môi n – hexan với tỉ lệ 1: 2

và tiến hành lặp lại các bước như trên

2.4 Phương pháp GC/MS

Xác định thành phần tinh dầu: Sử dụng phương pháp sắc khí – khối phổ (GC – MS) Thiết bị là máy phân tích GC-MS QP 2010, cột DB 5MS, tại Trung tâm giáo dục và sắc ký khí, Đại học Bách khoa Hà Nội Chương trình chạy: Dòng khí He, ion source: 200oC, injector: 230oC, interface: 250 oC; tốc độ gia nhiệt là 5oC /phút, lên đến 70oC giữ 2 phút và 260oC giữ 5phút

2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng VSV kiểm định [17]

Vi sinh vật kiểm định: Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923); Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC12222); Nấm sợi: Aspergillus biger (439), Fusarium oxysporum (M42); Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH20);

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-