Bài giảng Thực hành Hóa sinh học - ThS. Cao Ngọc Minh Trang

Bài giảng Thực hành Hóa sinh học gồm các nội dung chính như: Phản ứng biuret xác định liên kết peptid; Biến tính protein; Phương pháp sorensen; Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme; Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa và kìm hãm đến hoạt tính của enzyme;... Mời các bạn cùng tham khảo!

NHỮNG ĐIỂM CẦN CHÚ Ý TRONG THỰC HÀNH HÓA SINH

I Đối với sinh viên thực tập

- Mỗi nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí nghiệm cho bài tập thực tập của mình

- Sinh viên phải có mặt trong phòng thí nghiệm đúng giờ qui định, phải có mặt tại phòng thí nghiệm suốt thời gian thực tập Sinh viên đến trễ 15 phút không được vào phòng thí nghiệm Khi kết thúc thí nghiệm sinh viên phải báo cáo kết quả với giáo viên hướng dẫn trước lúc ra về

- Sinh viên vắng mặt phải có giấy phép và phải xin thực tập bù bữa khác

- Sinh viên phải xem kỹ bài thực tập trước khi vào phòng thí nghiệm

- Mỗi nhóm thực tập cử một sinh viên đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, vỡ) báo cáo ngay cho giáo viên hướng dẫn Sinh viên phải rửa dụng cụ sạch sẽ trước và sau khi thực tập Kết thúc buổi thực tập mỗi nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ nhóm mình làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát, hư hỏng phải báo ngay cho phụ trách phòng thí nghiệm biết

- Mỗi buổi thực tập, nhóm trực nhật có nhiệm vụ: nhắc nhở các nhóm dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước và cửa trước khi ra về

- Mỗi nhóm sinh viên làm bài báo cáo kết quả theo yêu cầu của từng bài thực tập, nộp kết quả cho giáo viên hướng dẫn vào cuối buổi thực tập hoặc buổi kế tiếp

- Kết thúc mỗi bài thực tập có kiểm tra kết quả và đánh giá cho điểm

II Đối với phòng thí nghiệm

1 Cẩn thận khi tiến hành thí nghiệm, không được sử dụng những máy móc, dụng

cụ khi chưa biết rõ cách sử dụng Phải hiểu biết rõ tính chất của các hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc

2 Tất cả chai lọ đựng hóa chất đều có nhãn, khi dùng phải đọc kỹ tên và nồng độ, dùng xong phải đậy đúng nút và để lại đúng chỗ cũ Phần lớn các hóa chất là độc nên phải hết sức cẩn thận

3 Đối với các chất kiềm, acid đậm đặc phải lưu ý:

- Không được hút bằng miệng

- Phải dùng ống đong hoặc bình nhỏ giọt

- Phải đổ acid hoặc kiềm vào nước khi cần pha loãng chúng

- Phải đặt nghiêng miệng ống nghiệm hoặc cốc về phía không có người

- Khi acid bị đổ ra ngoài thì cho nhiều nước để làm loãng acid

4 Khi theo dõi dung dịch đang sôi không được đưa mặt gần hay khi để một chất lỏng (chất kiềm) vào cốc phải đưa ra xa Khi đun một chất lỏng trong ống nghiệm hay cho acid, kiềm vào phải đặt ống nghiệm nghiêng một góc 45 độ Khi đung phải lắc đều và hướng miệng ống nghiệm về phía không có người

5 Khi làm việc với chất dễ cháy:

Khi sử dụng các chất dễ cháy như ether, xăng, benzene, chloroform, natri, kali cần lưu chú ý:

- Không dùng lửa ngọn và tránh xa lửa ngọn

- Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt (chất dễ cháy, dễ bốc hơi có thể làm nổ máy hay bật nút, hơi bốc ra gặp ngọn lửa sẽ cháy, cả khi ngọn lửa ở xa)

- Khi chữa cháy phải bình tĩnh dập tắt ngọn lửa bằng khăn ướt hay bình chữa cháy

6 Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh:

- Kiểm tra dụng cụ kỹ trước khi dùng

- Tránh đổ vỡ

- Dụng cụ nào dùng cho việc đó Khi đun, chỉ được đun bằng dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt

- Dụng cụ phải được rửa sạch trước và sau khi sử dụng

- Không dùng dụng cụ thủy tinh, chai lọ để chứa các chất kiềm mạnh hoặc acid đậm đặc có tác dụng bề mặt ăn mòn thủy tinh như HF

7 Khi làm việc với dụng cụ điện hoặc sử dụng điện tay phải khô, chỗ làm việc phải khô Kiểm tra kỹ nguồn điện và dây dẫn điện khi sử dụng

III An toàn ở phòng thí nghiệm hóa sinh

Những tai nạn có thể xảy ra trong các phòng thí nghiệm nói chung và labo hóa sinh nói riêng bao gồm:

- Nhiễm khuẩn, ký sinh trùng và virus từ các mẫu bệnh phẩm

- Tai nạn gây ra do hóa chất độc hóa học, các chất ăn mòn, thủy tinh bị gẫy hay bị điện giật

- Cháy hoặc nổ do các hóa chất hay dung môi dễ cháy, dễ nổ

- Để đảm bảo an toàn, hạn chế những tai nạn trong khi làm việc tại phòng thí nghiệm cần phải chú ý những điểm sau đây:

1 Tránh bị nhiễm khuẩn

Đối với cá nhân:

- Rửa tay bằng xà phòng sau khi làm thí nghiệm

- Mặc áo choàng trong phòng thí nghiệm

- Không ăn uống, hút thuốc lá trong phòng thí nghiệm Không để bất kỳ thức ăn hay

đồ uống trong tủ lạnh của phòng thí nghiệm

Đối với các mẫu bệnh phẩm:

Các bệnh phẩm là những mẫu xét nghiệm lấy từ bệnh nhân thường có thể gây nhiễm khuẩn, virus viêm gan, ký sinh trùng … Vì vậy:

- Không hút trực tiếp bệnh phẩm bằng pipet, dùng pipet có lắp quả bóp bằng cao su

- Nếu ống ly tâm đựng bệnh phẩm bị vỡ trong khi ly tâm, phải dùng kẹp để gắp các mảnh vỡ ra

- Khử trùng các dụng cụ bị nhiễm khuẩn sau khi làm xét nghiệm theo qui định ở phần rửa dụng cụ

2 An toàn khi sử dụng hóa chất và thuốc thử

Đối với các chất dễ cháy như dung môi (ete, toluene, methanol, ethanol, aceton) và một số hóa chất khác có ghi biểu tượng tránh lửa trên nhãn:

- Trước khi mở nút phải tránh xa ngọn lửa trần từ 2 – 3 m

- Không đun trực tiếp trên ngọn lửa, phải đun cách thủy hoặc trên bếp điện kín

- Đối với chất ăn mòn như các acid (H2SO4, HNO3, CCl3COOH, H3PO4 …) và kiềm (NaOH, KOH):

- Không được hút trực tiếp bằng mồm, phải dùng pipet tự động hoặc có lắp quả bóng cao su

- Khi đổ các dung dịch vào chai hay ống nghiệm phải từ từ, thận trọng, làm dưới tầm mắt để tránh dung dịch bị bắn vào mắt

- Khi hòa tan các chất ăn mòn thể đặc vào nước Ví dụ: hòa NaOH vào nước hay hòa loãng acid đặc vào nước cần phải tiến hành hết sức thận trọng vì đó là phản ứng tỏa nhiệt Đặc biệt cần chú ý khi hòa loãng acid, phải đổ acid vào nước, đổ từ từ, tuyệt

bình thủy tinh

Đối với các chất độc là những chất có thể gây chết người hoặc gây bệnh nặng nếu ngửi hay nuốt phải hoặc dính vào da Ví dụ những chất độc phổ biến trong phòng thí nghiệm như: kali cyanua, nitrat thủy ngân II, natri azid, natrinitropusiat, thiosemicarbazid, chloroform, methanol, acid clohydric…:

- Cần hết sức thận trọng khi thao tác với các chất độc

- Những chất độc phải được cất ngay vào tủ khóa sau khi sử dụng Không để tự do trên bàn thí nghiệm hay trên đĩa cân

Những chất oxy hóa (chlorat, pechlorat, peroxyd mạnh, kali dichromat, acid chromic…) cũng phải thao tác hết sức cẩn thận vì chúng cũng gây nguy hiểm cho

da và mắt

Những hóa chất gây ung thư: là những chất có khả năng gây ung thư nếu hít hay nuốt phải, hoặc dính vào da Ví dụ: benzen, benzidin, o-toludin (khác với o – tuluidin), α- và β-naphtylamin, nitrosamin, nitrosophenyl … Khả năng gây ung thư của các chất trên tỷ lệ với thời gian tiếp xúc và nồng độ hóa chất gây ung thư Vì vậy phải hết sức cẩn thận, nên dùng găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với chúng

IV Các biện pháp sơ cấp cứu tại phòng thí nghiệm

Sơ cấp cứu là biện pháp tạm thời đối với các trường hợp thương tích nhẹ hoặc trước khi đưa bệnh nhân đến bệnh viện như:

1 Bỏng

a Bỏng do nhiệt (hay vật nóng)

- Bỏng nhẹ: Lấy vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric bão hòa đắp lên mặt vết bỏng

- Bỏng nặng: Đắp nhẹ vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric lên vết bỏng, sau đó chuyển đi bệnh viện

b Bỏng do hóa chất

Việc trước tiên là ngâm vết thương vào chậu nước to hoặc để vết thương dưới vòi nước chảy thật nhẹ Sau đó mới trung hòa hóa chất Chú ý các trường hợp sau:

- Bỏng do acid: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch bicarbonate natri 8%

- Bỏng do kiềm: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric 3%

Khi bị chất độc vào miệng:

- Acid: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch bicarbonate natri 1%

- Kiềm: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch acid 1%

- Các hóa chất khác: Xúc miệng nhiều lần bằng nước lạnh

4 Nhiễm hơi độc

Đưa nạn nhân ra nơi thoáng khí, nới rộng quần áo cho dễ thở Hô hấp nhân tạo trong lúc di chuyển đến bệnh viện

5 Điện giật

Trước hết ngắt mọi cầu dao điện có liên quan đến phòng thí nghiệm Nới rộng quần

áo nạn nhân sau khi đem ra nơi thoáng Hô hấp nhân tạo trong khi chờ chuyển đến bệnh viện nếu là trường hợp nặng

6 Hỏa hoạn

- Ngọn lửa nhỏ: dập tắt bằng khan, vải bố ướt hay cát

- Lửa bắt đầu cháy quần áo: lăn vài vòng dưới đất để dập tắt ngọn lửa, trong khi các bạn lấy vải ướt trùm lên chỗ cháy và ép sát cho đến khi lửa tắt Tránh chạy hoảng

- Dùng bình chửa cháy trước phòng thí nghiệm để dập lửa

Lưu ý: Sinh viên phải báo ngay cho nhân viên phòng thí nghiệm hoặc giáo viên hướng

dẫn về mọi sự cố trong phòng thí nghiệm

7 Xử lý chất thải

- Hóa chất thừa: Phần lớn các thuốc thử, hóa chất thừa được đổ từng ít một vào bể

rửa rồi xả nước Một số hóa chất kiềm và acid phải được trung hòa trước khi đổ vào bể rửa

- Bệnh phẩm thừa: Những bệnh phẩm đã dùng để làm xét nghiệm như máu, nước

tiểu, dịch não tủy … thường là những chất truyền nhiễm Sau khi làm xét nghiệm, các mẫu bệnh phẩm thừa còn lại phải được hủy đi cẩn thận để tránh lây lan Phương pháp

không cần thu hồi)

- Hóa chất và bệnh phẩm nguy hiểm: như những hoá chất độc có khả năng gây ung

thư, gây nổ cần được chứa vào bình chuyên dụng và được xử lý theo phương thức riêng

CÁC DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC TẬP HÓA SINH

Cách rửa các dụng cụ:

• Cần phải biết tính chất của những chất làm bẩn dụng cụ để có thể chọn phương pháp rửa trong từng trường hợp riêng (trong nước nóng hay nước lạnh, trong dd kiềm, trong các muối hay acid hoặc trong các dung môi hữu cơ)

• Các dụng cụ sau khi rửa sạch được ngâm vào dd sulfocromic là hỗn hợp của

K2Cr2O7 10% và acid sulfuric đđ cùng một thể tích trong 1 ngày Sau đó, đem rửa sạch với nước máy và tráng một lần với nước cất, xong sấy khô trong tủ sấy dụng cụ

Ống nghiệm (tube)

• Có thể tích khác nhau, hình trụ ( Ø = 16, 18,…)

• Lưu ý khi đun nóng 1 dd trong ống nghiệm: dd không được đầy quá 1/3 ống nghiệm và ống được giữ nghiêng 450, luôn lắc đều Không được đun nóng ngay tại đáy ống nghiệm mà ngọn lửa phải được để vào thành của ống nghiệm

Ống hút (pipette)

• Loại có vòng mờ trên đầu ống: dung tích của ống gồm cả giọt cuối cùng dính trong ống nên phải thổi giọt này ra

• Loại có bầu an toàn: dùng để hút những dd độc

• Loại có hai vạch: thể tích ghi trên ống là thể tích giữa 2 vạch

• Loại thông thường có chia độ

Ống chuẩn đô ( burette)

• Được gắn trên giá và có khóa để điều chỉnh lượng chất lỏng chảy ra trên ống có

phân độ

• Được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm phân tích

• Bình nón có nút mài được gọi là bình xác định chỉ số iode

Phễu chiết hay bình lóng

• Dùng để tách riêng các chất lỏng không hòa tan vào nhau

• Khi lắc bình lóng tay phải giữ nút ở đầu trên và đầu dưới bình

Bình hút ẩm

• Là dụng cụ thủy tinh có thành dày và có nắp dùng để làm khô từ từ và để bảo quản những chất dễ hút hơi ẩm từ không khí Phần dưới của bình có đặt những chất hút ẩm

• Khi mở nắp bình phải đẩy nắp về một phía và tránh nhấc nắp lên cao

Chương I: PROTEIN

Trong môi trường kiềm, các liên kết peptide trong protein có thể phản ứng với

Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ ở dưới dạng anion Cường

độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide Một số hợp chất có hai nhóm amid như Biuret, oxamid cũng cho phản ứng Biuret dương tính

Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng protein do có màu bền vững và ổn định

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch protein trứng khoảng 1% (Pha loãng 1 lòng trắng trứng với 15 thể tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc, bảo quản ở 4 o

C Khi dùng pha loãng 0,1%)

- Dung dịch gelatin 0,1% trong nước

- Dung dịch glycin 0,1% trong nước

- Dung dịch CuSO4 1% trong nước

- Dung dịch NaOH 10% trong nước

Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt)

Dung dịch gelatin 0,1% trong nước (giọt)

Dung dịch glycin 0,1% trong nước (giọt)

Dung dịch NaOH 10% trong nước (giọt)

Dung dịch CuSO4 1% trong nước (giọt)

Bài 2: BIẾN TÍNH PROTEIN

Sự biến tính của protein được ứng dụng trong các xét nghiệm lâm sàng, trong kiểm nghiệm thuốc và thực nghiệm hóa sinh như:

- Kết tủa protein trong các nguyên liệu sinh vật để tiếp tục nghiên cứu cấu trúc và tính chất sinh học của chúng

- Định tính và định lượng protein trong các dịch chiết và dịch sinh vật (đặc biệt là phản ứng xác định protein niệu để thăm dò chức năng thận)

- Giải độc muối kim loại nặng (Hg, Cu, Pb) bằng protein (trứng, sữa) trong trường hợp cơ thể chưa kịp hấp thu hoặc có thể sử dụng trong phòng bệnh cho những người phải tiếp xúc với các hóa chất này

Thông thường sự biến tính của protein là không thuận nghịch, nhưng trong một

số trường hợp nếu loại bỏ được tác nhân gây biến tính thì protein vẫn giữ được cấu dạng và tính chất ban đầu của nó

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch protein trứng không có NaCl (Lọc lòng trắng trứng gà qua vải thưa Trộn lẫn một thể tích lòng trắng với 15 thể tích nước cất Trộn kỹ rồi lọc lại sẽ thu được dung dịch protein trứng khoảng 1% Bảo quản ở 4 o

- Dung dịch acid trichloracetic 10%

- Dung dịch acid sulfosalicylic 20%

- Dung dịch CuSO4 5% trong nước

- Dung dịch Pb(CH3COO)2 5% trong nước

- Pipet Pasteur

- Quả bóp cao su 1 – 2 mL

- Phễu nhỏ

- Giấy lọc

2.1 Biến tính protein bằng nhiệt độ

Protein bị kết tủa khi đun sôi trong môi trường trung tính hay acid yếu vì bị mất lớp áo nước và vì phần lớn protein có pI  5 (trừ protamin và histon có chứa nhiều acid amin kiềm nên có pI  8), nếu cho thêm chất điện giải cũng làm trung hòa điện tích gây tủa protein dễ dàng hơn

Dung dịch NaCl bão hòa (giọt)

Dung dịch NaOH 10% (giọt)

Đun sôi ống nghiệm và nhận xét sự kết tủa

2.2 Biến tính protein bằng acid vô cơ mạnh

Dưới tác dụng của acid vô cơ đậm đặc, protein bị kết tủa Tủa sẽ hòa tan trở lại khi cho thừa acid, trừ acid nitric Vì vậy HNO3 được sử dụng để định tính protein trong nước tiểu

Tiến hành:

Tủa protein bằng HNO3 và H2SO4

Dùng 2 ống nghiệm:

HNO3 đặc (giọt) nhỏ từ từ vào thành ống để nghiêng 5

H2SO4 đặc (giọt) nhỏ từ từ vào thành ống để nghiêng 5

Xuất hiện tủa trắng của protein ở mặt ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng Sau đó lắc nhẹ ống nghiệm Thêm 5 giọt acid mỗi loại vào 2 ống tương ứng

Nhận xét kết quả ở 2 ống nghiệm

2.3 Biến tính protein bằng acid hữu cơ:

Phản ứng kết tủa protein bằng acid hữu cơ xảy ra không thuận nghịch Trong labo hóa sinh thường dùng:

- Acid tricloracetic (CCl3COOH) để kết tủa protein nhưng không kết tủa peptid

và acid amin nên được dùng để khử tạp protein ra khỏi huyết thanh trong các xét nghiệm định lượng các chất phi protid như ure, acid amin, acid uric, … sau đó muốn loại bỏ nó ra khỏi dịch lọc chỉ cần đun sôi vì acid này sẽ bị hủy thành CHCl3 và CO2

- Acid sulfosalicylic [C6H3(OH)(COOH)SO3H] được dùng để phát hiện protein trong nước tiểu và các dung dich sinh học khác

Tiến hành:

Cho vào 1 ống nghiệm:

- Dung dịch protein 0,1 %: ……… 5 giọt

- Dung dịch acid trichloracetic: ………2 giọt

Nhận xét kết quả

2.4 Biến tính protein bằng muối kim loại nặng

Ion kim loại nặng có khả năng gắn vào các nhóm chức ở mạch nhánh của acid amin trong phân tử protein làm phá vỡ cấu trúc không gian và gây tủa Nếu cho thừa muối kim loại nặng (trừ AgNO3 và HgCl2), tủa sẽ tan vỡ lại do hấp thụ các ion kim loại tạo điện tích dương trên phân tử protein

Nhận xét sự tạo thành tủa trong 2 ống Cho thừa 2 muối vào 2 ống tương ứng

Quan sát sự hòa tan trở lại của tủa

2.5 Biến tính protein bằng dung môi hữu cơ:

Protein kết tủa bông hay bị vẩn đục trong dung môi hữu cơ như alcol, aceton, ether … do bị mất lớp áo nước Tủa càng dễ dàng nếu có thêm các chất điện giải và môi trường trung tính hay hơi acid Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ có thể thuận nghịch nếu được tiến hành ở nhiệt độ thấp (-150C đến 00C), trong thời gian ngắn và được tách nhanh ra khỏi dung môi

Tiến hành:

Cho vào 1 ống nghiệm:

- Dung dịch protein trứng 0,1% 5 giọt

- Ethanol 95o

……….15 – 20 giọt Sau đó thêm:

- NaCl bão hòa ……… 1 giọt

Nhận xét kết quả

Bài 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN (Phương pháp xác định đạm formol)

Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn suất metylenic Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm carboxyl ttrong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH

Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp số nhóm carboxyl và nhóm amin

tự do bằng nhau

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch formol (pha 10ml formol với 2ml dd phenolphtalein 0,5%, dùng NaOH 0,1N trung hòa cho đến khi có màu hồng nhạt và chỉ chuẩn bị trước khi dùng)

- Lấy 2 bình nón: bình 1 dùng làm bình kiểm tra, bình 2 dùng làm bình thí nghiệm

- Cho vào bình 1: 10ml nước cất, thêm vào 5ml dd formol và 5ml dd NaOH 0,1N

Sau đó dùng H2SO4 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt, thêm 2 giọt NaOH 0,1N, màu đỏ tưuơi xuất hiện, ứng với pH=8,8

- Cho vào bình 2: 10ml dịch mẫu, thêm 5ml dd formol và chuẩn độ bằng dd NaOH

0,1N đến khi có màu đỏ tươi (đậm hơn màu ở bình kiểm tra) Dùng H2SO4 0,1N để hiệu chỉnh màu của dịch trong bình đến hồng nhạt, sau đó thêm vài giọt NaOH 0,1N để có màu đỏ tươi, tương đương với màu ở bình kiểm tra (pH=8,8)

- Thêm vào bình 1: 4 giọt NaOH 0,1N, xuất hiện màu đỏ tươi ứng với pH=9,1

- Thêm vào bình 2: vài giọt NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ tươi giống như bình 1 (pH=9,1)

Tính kết quả:

N (mg%) = [(V 2 – v 2 ) – (V 1 – v 1 )] 1,4.100/a

V1 là tổng lượng kiềm dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 1

v1 là tổng lượng acide dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 1

V2 là tổng lượng kiềm dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 2

v2 là tổng lượng acide dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 2

a là lượng mẫu(g) ứng với 10ml dịch mẫu dùng để xác định N

Tính lượng đạm amin N trong mẫu thí nghiệm trên

Chương II: ENZYME

Bài 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme Sự tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách nâng nhiệt độ chỉ có hiệu quả trong một khoảng nhiệt độ tương đối hẹp

Nhiệt độ tối thích của phần lớn các enzyme là trong khoảng 40 – 600

C Càng xa nhiệt độ thích hợp hoạt độ của các enzyme càng giảm

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch tinh bột 1%

- Nước cất, nước đá

- Dung dịch Iod 5mmol/L trong KI 3%

- Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần)

các ống nghiệm ở các nhiệt độ cũ

Sau 1, 2, 4, 6, 8 và 12 phút lấy từ mỗi ống 1 giọt, nhỏ vào các giọt dung dịch Iod đã chuẩn bị sẵn trên bản kính Quan sát màu tạo thành

Nhận xét sự sai khác giữa các mẫu và giải thích

KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

- Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme

- Chất kìm hãm (ức chế) là giảm ái lực của enzyme với cơ chất hay làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 20 lần)

Bài 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α – AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

Các amylase là các enzyme thủy phân tinh bột, có 2 loại là α- amylase và

β- amylase Sự tác dụng của hỗn hợp α- amylase và β- amylase trên tinh bột cho ta hỗn hợp càng lúc càng nhiều glucose, maltose và dextrin đơn giản

Để xác định hoạt độ của enzyme, ta xác định nồng độ enzyme thấp nhất có khả năng gây thủy phân hoàn toàn tinh bột cho các sản phẩm không đổi màu dd iode Đó là nguyên tắc của phương pháp Wohlgemouth

Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột ở 370C sau 30 phút có chất Cl-

làm chất hoạt hóa

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần)

- Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 10, cho vào mỗi ống 1ml dd NaCl 0,9%

- Thêm vào ống 1: 1ml dịch enzyme, lắc đều, lấy ra 1ml cho vào ống 2, lắc kỹ, lấy ra 1ml cho vào ống 3…Tiếp tục làm thao tác trên cho đến ống 10, lấy 1ml từ ống 10

bỏ đi

- Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều và giữ yên ở 37 0

C trong 30 phút