Bệnh sốt Zika hiện nay đã không còn mang cấp độ đại dịch như cách đây 3 năm (năm 2016), tuy nhiên việc phòng tránh cũng như chẩn đoán vẫn phải luôn được kiểm soát sắt sao. Do những mối nguy hại biến chứng ảnh hưởng lớn đến cộng đồng, nhất là trẻ em với bệnh teo não. Dựa vào những nghiên cứu trên, với phương pháp RT-PCR ta có thể chẩn đoán được các mẫu bệnh phẩm như máu, nước tiểu, huyết thanh có chứa virus Zika ở các giai đoạn. Hiện nay bệnh sốt Zika vẫn chưa có biện pháp để điều trị đặc hiệu, phần lớn vẫn dựa trên việc chẩn đoán để có các biện pháp xử lý khác nhau. Các phương pháp phát hiện vật liệu di truyền vẫn là phương pháp hiệu quả, tuy nhiên vẫn có nhiều trường hợp sai sót trong quá trình chẩn đoán so với một số phương pháp về miễn dịch học, vì vậy cần cải thiện các phương pháp chẩn đoán, có thể kết hợp nhiều phương pháp thực hiện song song cũng như tìm kiếm, nghiên cứu các phương pháp điều trị mới cũng là 1 hướng phát triển tiềm năng.
Trang 1
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG 3
DANH MỤC HÌNH ẢNH 4
GIỚI THIỆU 5
I Tổng quan 6
1 Tình hình dịch Zika xảy ra trên thế giới: 6
2 Tình hình dịch Zika xảy ra trong nước: 6
II Đặc điểm chung 7
1.Virus Zika 7
1.1.Hình thái cấu trúc 7
1.1.1.Hình thái 7
1.1.2.Cấu trúc 8
a.Cấu trúc hạt virus: 8
b.Sức đề kháng của virus 9
2 Đặc điểm gây bệnh 9
3.Muỗi Aedes Aegypti 11
III Phương pháp chẩn đoán 11
1 Kỹ thuật sinh học phân tử PCR 12
1.1 Nguyên lý 12
1.2 Hóa chất 13
1.3 Mẫu bệnh phẩm 14
1.4 Các bước tiến hành 14
1.5 Kết quả 18
Trang 22 Nhuộm miễn dịch huỳnh quang phát hiện kháng thể 19
2.1 Nguyên lý 19
2.2 Các bước tiến hành 20
2.3 Kết quả 20
IV Dự phòng và điều trị vaccin 20
1.Dự phòng 20
2.Vaccin 20
3 Phương pháp khác 21
V Kết luận……… 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 22
Trang 3DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 : Bộ mồi cho phản ứng RT-PCR……… 12
Bảng 3.2: Bộ mồi cho phản ứng realtime RT-PCR……….12
Bảng 3.3: Số lượng thành phần Agarose được chuẩn bị……….……….13
Bảng 3.4 : Cài đặt chương trình cho máy Realtime RT-PCR……… 15
Bảng 3.5: Ưu nhược điểm của 2 phương pháp………… ………16
Trang 4DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 : Cấu trúc bên ngoài của Virus Zika dưới cấp độ phân tử……… 7
Hình 1.2: Cấu trúc của hạt virus thuộc họ Flaviviridae……….8
Hình 1.3: Cấu trúc gen của các virus thuộc họ Flaviviriddae………9
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình lây truyền virus zika……….9
Trang 5GIỚI THIỆU
Virus Zika thuộc chi Flavivirus thuộc họ Flaviviridae, cũng bao gồm các loại virus gây bệnh khớp khác như sốt xuất huyết, sốt vàng da và viêm não nhật bản Zika ban đầu được phân lập từ một loài khỉ Raveus trong rừng Zika ở Uganda vào năm 1947
và sau đó đã được phát hiện trong các vụ dịch người lẻ tẻ ở Châu Phi, Đông Nam Á
và quần đảo Thái Bình Dương trước khi được xác định ở miền đông Brazil vào đầu năm 2015 Kể từ đó, Zika đã nhanh chóng lam rộng khắp thế giới Trọng tâm là ở khắp bán cầu tây, bao gồm Đông Nam Hoa Kỳ, củng như ở Châu Âu và Đông Nam
Á Mặc dù lây truyền chủ yếu qua vết cắn của muỗi Aedes bị nhiễm bệnh, nhưng Zika cũng đã được phát hiện trong các chất dịch cơ thể như nước tiểu, sữa mẹ, nước bọt và tinh dịch của người bị nhiễm bệnh Khả năng lây lan qua đường tình dục cũng được thiết lập Nhiễm Zika thường không có triệu chứng hoặc các dấu hiệu và triệu chứng tương đối nhẹ bao gồm sốt, đau khớp, phát ban và viêm kết mạc Hội chứng Guillain – Barre (hội chứng làm tê liệt thần kinh ở người lớn) có liên quan đến nhiễm Zika ở người lớn Biến chứng ở trẻ em là gây hội chứng đầu nhỏ, hệ thần kinh không phát triển Các nhà nghiên cứu nổi tiếng về dịch tễ học, miễn dịch học -và các lĩnh vực khác đang hợp tác với nhau để hỗ trợ tốt hơn cho vô
số bác sĩ lâm sàng và bệnh nhân đang chiến đấu với mầm bệnh
Virus lây truyền cho người qua vector trung gian là muỗi cái Aedes Aegypti, dân gian gọi là muỗi vằng Ngoài ra cũng có một số dòng muỗi cùng chi với Aedes
Aegypti như A africanus, A apicoargenteus, A furcifer,…củng có thể lan truyền
virus
Trang 6I Tổng quan
1 Tình hình dịch Zika xảy ra trên thế giới:
Vào ngày 2/9/2016, tổ chức y tế thế giới (WHO) đã có cuộc họp về những diễn biến bất thường của dịch Zika đang bùng phát mạnh tại một số nước và cho rằng dịch Zika vẫn là mối quan ngại đối với ngành y tế thế giới Trong cuộc họp tại Thụy
Sỹ, ông David Heymann chủ tịch ủy ban khẩn cấp của WHO đã nói rằng các đợt bùng phát mới của dịch Zika đang xảy ra tại nhiều khu vực của thế giới và có nguy
cơ ngày càng lan rộng Các đợt bùng phát dịch được xác nhận tại các khu vực địa lý mới như Guinea và Singapore Số các ca lây nhiễm có thể tiếp tục gia tăng Virus Zika được phát hiện tại Brazil năm 2015 và đến năm 2016 đã lan rộng khắp Châu
Mỹ Loại virus này lan truyền qua muỗi Aedes Aegypti, quan hệ tình dục và truyền
Thái Lan củng là nước có số người nhiễm Virus Zika cao nhất khu vực với gần
100 ca nhiễm tại 10 tỉnh thành trong vòng 1 năm này (năm 2016)
Vào năm 2016, Virus Zika đã xuất hiện tại hơn 50 quốc gia trên thế giới Tuy nhiên, trên thế giới vẫn chưa tìm ra vaccine
2 Tình hình dịch Zika xảy ra trong nước:
Trong năm 2016, tình hình dịch bệnh Virus Zika diễn biến phức tạp trên khắp thế giới thì Việt Nam củng là nước chịu ảnh hưởng của đại dịch
Tính đến gày 28/11/2016 thành phố Hồ Chí Minh ghi nhận 83 trường hợp nhiễm Virus Zika tại 17/24 quận huyện, trong đó có 9 thai phụ đang theo dõi thai kì Thành phố Hồ Chí Minh là trung tâm kinh tế du lịch của cả nước, chiếm 40 – 60% khách quốc tế đến Việt Nam, củng như khách các khu vực khác trong cả nước, nên Virus Zika dễ dàng xâm nhập và lây lan trong cộng đồng
Ngày 20/10/2016, Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế cho biết phát hiện một trường hợp nhi nhiễm Virus Zika tại Việt Nam Kết quả xét nghiệm tại viện Pasteus thành
Trang 7phố Hồ Chí Minh khẳng định bệnh nhi 4 tuổi đang sống tại huyện Bến Lức, tỉnh Long An đã mắc chứng dị tật bẩm sinh đầu nhỏ do Virus Zika gây ra Trong vòng 1 tuần Việt Nam đã có thêm 4 trường hợp nhiễm Virus Zika, trong đó lại phát hiện thêm một bé gái 4 tháng tuổi ở huyện Krông Buk, Đắk Lắk, một em bé 4 tuổi và 1
Virus Zika thuộc chi Flavachus thuộc họ Flaviviridae
Virus Zika có dạng hình cầu, tương đồng với các chủng virus khác trong nhóm
Flavivirus như: viêm não nhật bản, sốt xuất huyết, sốt vàng da Lớp màng dày bao
bọc bên trong Virus Zika là lớp protein đa diện, còn lớp vỏ bên ngoài có nhiều giác hút mọc trên bề mặt được gọi là Eglycoprotein, cho phép virus bám dính và lây nhiễm sang các tế bào khác của vật chủ
Có 2 dòng Zika: dòng Châu Phi và dòng Châu Á Nghiên cứu loài cho thấy virus lây lan ở Châu Mỹ có liên quan chặt chẽ nhất đến dòng Châu Á, trong đó có đợt bùng nỗ dịch tại Pháp
Hình 1.1 : Cấu trúc bên ngoài của Virus Zika dưới cấp độ phân tử
Hình B : Cấu trúc bên ngoài của Virus Zika, Hình C : Cấu trúc bên ngoài của
virus zika khi được cắt
Trang 81.1.2 Cấu trúc
a Cấu trúc hạt virus:
Cấu trúc hạt Virus Zika giống như các virus thuộc họ Flaviviridae khác
Capsid (lớp vỏ protein bên ngoài của virus) có đối chứng khối, lõi bên trong là RNA một sợi, bao quanh bởi màng lipid kép chứa các protein vỏ E và M Hạt virus
có đường kính khoảng 40nm
Hình 1.2: Cấu trúc của hạt virus thuộc họ Flaviviridae A: Hình cắt cấu trúc của hạt virus, B: Hình cấu trúc của hạt virus
(Nguồn: Chambers T và cộng sự, năm 1990)
Lõi RNA của virus Zika dài 10.749bp với 2 vùng không mã hóa được gọi là 5’ NCR và 3’ NCR (non-coding regions) Khung đọc mở của virus Zika đọc như sau : 5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ và mã hóa cho một polyprotein và sau đó nó được cắt thành capsid (C), màng tiền thân (prM), vỏ (E),
và các protein không cấu trúc (NS) Các protein E tạo nên bề mặt hạt virus và tham gia vào quá trình sao chép bằng cách gắn lên thụ thể của các tế bào cảm thụ NS1, NS3 và NS5 là những protein kích thước lớn và có tính bảo tồn cao trong khi protein NS2A, NS2B, NS4A, NS4B là những protein nhỏ hơn và kỵ nước Vùng 3’NCR tạo thành một cấu trúc vòng lặp và 5’NCR cho phép dịch mã thông qua một nucleotide methyl hoặc một protein gắn kết gen (Đoàn Bình Minh, 2016)
Trang 9Hình 1.3: Cấu trúc gen của các virus thuộc họ Flaviviriddae
(Nguồn: Chambers T và cộng sự, năm 1990)
2 Đặc điểm gây bệnh
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình lây truyền virus zika
Trang 10Ngoài lây truyền qua muỗi đốt là con đường chủ yếu, còn nhiều đường lây truyền khác có thể làm truyền virus Zika như:
Truyền từ mẹ sang thai nhi trong quá trình mang thai hoặc khi sinh, các nhà khoa học phát hiện RNA của virus Zika có trong nước ối và sữa của người mẹ bị nhiễm Zika Đứa trẻ khi sinh ra sẽ bị ảnh hưởng của virus Zika và gây ra dị tật đầu nhỏ bẩm sinh
Lây truyền qua đường tình dục, truyền từ một người đàn ông cho đối tác tình dục của họ vì RNA của virus Zika được phát hiện có trong tinh dịch Tính đến tháng
4 năm 2016 phương thức lây truyền này đã ghi nhận ở 6 quốc gia Argentina, Chile, Pháp, Ý, New Zealand, và Hoa Kỳ trong đợt dịch năm 2015
Năm 2009, Brian Foy, một nhà sinh học tại Đại học bang Colorado đã truyền virus Zika sang vợ của mình qua đường tình dục Ông trước đó đã đến thăm Senegal để nghiên cứu về muỗi, và đã bị muỗi đốt vài lần Một vài ngày sau khi trở
về Mỹ, ông bị bệnh và được xác định rằng đó là một căn bệnh gây ra bởi virus Zika Sau khi quan hệ tình dục không an toàn với vợ của mình, bà ta đã phát triển các triệu chứng của bệnh Zika Foy là người đầu tiên được biết tới đã truyền virus Zika qua đường tình dục sang một người khác
Một người đàn ông Texas (Mỹ) được phát hiện nhiễm virus Zika do quan hệ với bệnh nhân vừa trở về từ vùng dịch ở Venezuela Thông tin được trung tâm kiểm soát và phòng tránh dịch bệnh Mỹ (CDC) xác nhận ngày 2/2 Đây là trường hợp lây nhiễm qua đường tình dục đầu tiên ở Mỹ
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố virus Zika là“ tình trạng khẩn cấp
y tế công cộng quốc tế “bởi những lo ngại ngày càng tăng về khả năng có thể gây
dị tật bẩm sinh Tổ chức đã đưa ra một số dấu hiệu nhận biết lâm sàng khi bị nhiễm virus Zika, thời gian ủ bệnh Zika khoảng 2 – 12 ngày sau khi bị muỗi đốt Đến thời
kì phát bệnh sẽ có các triệu chứng như sốt nhẹ từ 37,8 – 38,50C, mệt mõi, mọc ban rát sẩn trên da, đau các khớp nhỏ ở bàn tay và bàn chân, viêm xung huyết kết mạc, đau cơ, nhức đầu, đau hố mắt, cơ thể suy nhược Một số ít bệnh nhân có thể đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy, loét niêm mạc hay ngứa
Trang 11Mọi người được biết virus Zika là do muỗi vằn Aedes Aegyti lây truyền ra,
loại virus này gây tật đầu nhỏ ở trẻ sơ sinh nếu phụ nữ mang thai nhiễm bệnh Nó không chỉ gây tật đầu nhỏ ở trẻ sơ sinh mà còn là nguyên nhân dẫn đến hội chứng làm tê liệt thần kinh ở người lớn (thường gọi là hội chứng tự miễn dịch Guillain – Barre)
Dị tật đầu nhỏ: virus Zika gây ảnh hưởng đến trẻ sơ sinh, làm đầu trẻ không được phát triển bình thường, gọi là tật đầu nhỏ Tật đầu nhỏ được định ghĩa là sự thoái hóa hay dị dạng não ở trẻ sơ sinh với kích thước đầu nhỏ hơn bình thường và đôi khi dẫn đến tử vong Brazil là quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nhất bởi virus Zika, có gần 4.000 ca bị bệnh đầu nhỏ, với 49 ca tử vong
Hội chứng làm tê liệt thần kinh ở người lớn (hội chứng Guillain – Barre):
theo các chuyên gia của WHO hội chứng Guillain – Barre là một bệnh lí hiếm gặp khi hệ thống miễn dịch tấn công một phần hệ thần kinh ngoại biên Những triệu chứng đầu tiên của chứng rối loạn này bao gồm nhiều cấp độ của những cảm giác suy yếu hoặc tê buốt ở chân tay và phần trên cơ thể Những triệu chứng này gia tăng cho đến khi các cơ không còn sử dụng được nữa và người bệnh gần như liệt hoàn toàn Mặc dù có bệnh nhân hồi phục được song phần lớn vẫn tiếp tục cảm nhận mức
độ suy yếu
3 Muỗi Aedes Aegypti
Muỗi Aedes Aegypti thuộc chi Aedes và họ Cuicidae dân gian gọi là muỗi vằn Ngoài ra củng có một số dòng muỗi cùng chi với Aedes Aegypti như A.africanus,
A.apicoargenteus, A.furcifer,…
Khi hút máu người hay động vật bị nhiễm virus Zika, virus sẽ nhân lên trong cơ thể muỗi và ủ bệnh sau 10 ngày để có thể gây truyền virus cho người và động vật khác Mỗi cá thể muỗi nhiễm virus Zika có thể truyền virus cho các thế hệ muỗi con cháu
Sự phân bố muỗi Aedes Aegypti được đánh giá là rộng lớn nhất từng được ghi
nhận, hầu như loài muỗi này đã có mặt ở các châu lục, bao gồm Bắc Mỹ và các ngoại vi của Châu Âu
III Phương pháp chẩn đoán
Trang 121 Kỹ thuật sinh học phân tử PCR
1.1 Nguyên lý
Quy trình xét nghiệm virus Zika dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phương pháp sinh học phân tử Hiện nay, kỹ thuật Realtime RT-PCR hay RT-PCR được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh với các tác nhân là virus
Kỹ thuật RT-PCR
RNA tổng số được tách từ mẫu bệnh phảm lâm sàng nghi nhiễm Zika Sau
đó, RNA được cho vào hỗn hợp RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho virus Zika RNA có thể được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (máu, huyết thanh…) hoặc
từ dịch nuôi cấy tế bào
Kỹ thuật realtime RT-PCR
Quy trình xét nghiệm virus Zika dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phương pháp sinh học phân tử, phương pháp này là phản ứng chuỗi polymerase (realtime PCR) Hiện nay, realtime RT-PCR đã trở thành ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực chẩn đoán bệnh với các tác nhân virus Phương pháp này
sử dụng thêm bộ mẫu dò phát huỳnh quang (probe) có khả năng phát hiện sản phẩm (vật liệu di truyền của virus) trong quá trình tổng hợp sản phẩm Mẫu dò là một đoạn oligonucleotit (vd: Taqman®probe) được gắn với một chất nhuộm phát tín hiệu huỳnh quang ở đầu 5’ ®, đầu kia được gắn với tuốc nhuộm tắt huỳnh quang (Q) Khi mẫu nguyên vẹn, Q co vai trò nhận năng lượng phát ra từ R (hiệu ứng chuyển năng lượng huỳnh quang) Nếu có trình tự đích, mẫu dò và mồi sẽ gắn vào khuôn, quá trình tổng hợp bắt đầu Trong quá trình tổng hợp, enzym Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease sẽ cắt các nucleotid của mẫu dò từ đầu 5’, giải phóng R khỏi Q, làm tăng tín hiệu huỳnh quang của R Càng nhiều sản phẩm tạo thành thì càng nhiều mẫu bị phân cắt và tín hiệu của R phát ra càng nhiều Mắt đọc tín hiệu huỳnh quang của mãy sẽ thu tín hiệu R, xử lý bằng phần mềm và đưa ra kết quả cuối cùng
1.2 Hóa chất
Hóa chất
Trang 13AA
50µM 50µM
ZIKA nhóm
Chung
ZIKVF ZIKVR
538 - 1558
1902 – 1883
GCTGGDGCRGACACHGGRAC
T RTCYACYGCCATYTGGRCTG
50µM 50µM
ZIKA nhóm
Asia
ZIKVF9027a ZIKVR9197c
9121 - 9141
9312 – 9290
CCTTGGATTCTTGAACGAGGA AGAGCTTCATTCTCCAGATCA
A
50µM 50µM
Bộ mồi cho phản ứng realtim RT-PCR
Trình tự các cặp mồi và probe cho zika
Bảng 3.2: Bộ mồi cho phản ứng realtime RT-PCR
độ Mồi định
chung các
nhóm
(Genotype)
Zika1087 Zika1108FAM
Zika1163c
5’-CCGCTGCCCAACACAAG-3’
3’
5’AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA-5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’
100µM 100µM
25µM
Trang 14nhóm
Asian
Genotype
Zika4507Cfam Zika4552c
5’-CCACGCTCCAGCTGCAAAGG-3’
5’-ATCCCATAGAGCACCACTCC-3’
100µM 25µM
1.3 Mẫu bệnh phẩm
Loại mẫu : máu
Điều kiện bảo quản : bảo quản lạnh từ 2 – 80C
1.4 Các bước tiến hành BƯỚC 1 : Tách chiết mẫu
Kiểm tra độ đồng nhất 560µl đệm AVL có chứa chất mang ARN trong tube
phút, chuyển cột sang tube 2ml sạch
↓
Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn đệm AW2
Chuyển cột vào tube 1,5ml và loại bỏ tube chứa dịch lọc cũ
Trang 15↓
Thêm vào cột 60µl đệm AVE và ủ ở hiệt độ phòng trong 1 phút
↓
Ly tâm 8000 vòng trong 1 phút để toàn bộ ARN tách khỏi màng silicagel Sau khi
ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dịch lọc
Tra mẫu và chạy máy
+ Cho 5µl mẫu RNA bệnh phẩm vào hỗn hợp sinh phẩm đã chuẩn bị cho phản ứng RT-PCR Mẫu chứng dương : được thực hiện tại tủ an toàn mẫu
+ Đặt các tube vào máy, khỏi động và kiểm tra chương trình trước khi chạy máy luân nhiệt cổ điển theo yêu cầu xét nghiệm
+ Ghi chép ma thiết bị sử dụng, block sử sụng (nếu có)
+ Sau khi kết thúc quá trình chạy máy, mang các mẫu sang phòng điện di và tiến hành điện di sản phẩm RT-PCR
Điện di sản phẩm
+ Chuyển sản phẩm PCR vào thạch