Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học: Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang

Nội dung nghiên cứu của khóa luận là xây dựng phương pháp định lượng tanin tổng trong thực vật bằng phương pháp đo quang phổ. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp. Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng.

KHÓA LU N T T NGHI P Đ I H C CÔNG NGH  K  THU T HÓAẬ Ố Ệ Ạ Ọ Ệ Ỹ Ậ  

H CỌ

 XÂY D NG PHỰ ƯƠNG PHÁP Đ NH LỊ ƯỢNG TANNINS T NG TRONGỔ  

L I C M  N Ờ Ả Ơ

Trước tiên, em xin g i l i c m  n chân thành và s  tri ân sâu s c đ iử ờ ả ơ ự ắ ố  

v i ớ TS. Tr n Quang H i ầ ả  ­ gi ng viên khoa Hóa ­ Trả ường Đ i h c Côngạ ọ  Nghi p Hà N i đã giúp đ  em trong quá trình làm khóa lu n.ệ ộ ỡ ậ

Trung tâm Nghiên c u và Chuy n giao công ngh , Vi n Hàn Lâm Khoa h cứ ể ệ ệ ọ  

và Công ngh  Vi t Nam ệ ệ đã h t lòng hế ướng d n, ch  b o, truy n đ t ki nẫ ỉ ả ề ạ ế  

th c kinh nghi m quý báu cho emứ ệ

C m  n gia đình, t t c  b n bè đã luôn  ng h , giúp đ  và là chả ơ ấ ả ạ ủ ộ ỡ ỗ 

d a tinh th n, ngu n đ ng viên cho em trong nh ng lúc khó khăn.ự ầ ồ ộ ữ

Trong quá trình làm báo cáo này m c dù đã đặ ượ ực s  giúp đ  t n tìnhỡ ậ  

và h t s c c  g ng nh ng do trình đ  và th i gian nghiên c u còn h n chế ứ ố ắ ư ộ ờ ứ ạ ế nên không th  tránh để ược nh ng thi u sót. Vì v y, em kính mong nh nữ ế ậ ậ  

được ý ki n đóng góp ch  b o c a các quý th y cô.ế ỉ ả ủ ầ

      Em xin chân thành c m  n! ả ơ

       Hà N i, ngày 28 tháng 5 năm 2020ộ       Sinh viên

       Ph m Th  Hoaạ ị

LOD:  Gi i h n phát hi n (Limit of detection)ớ ạ ệ

LOQ: Gi i h n đ nh l ng (Limit of quantitation)ớ ạ ị ượ

HPLC:   S c   ký   l ng   hi u   năng   cao   (High   ­   performance   liquidắ ỏ ệ  chromatography)

M  Đ U Ở Ầ

Vi t Nam là m t nệ ộ ước có th m th c v t đa d ng và phong phú v iả ự ậ ạ ớ  nhi u loài th c v t, đề ự ậ ượ ử ục s  d ng trong phòng và đi u tr  b nh, cũng nhề ị ệ ư 

b  dổ ưỡng nâng cao s c kh e cho con ngứ ỏ ười. Có nhi u loài th c v t đề ự ậ ượ  c

ví nh  là m t lo i dư ộ ạ ược li u đệ ược dùng ph  bi n trong y h c dân gian làmổ ế ọ  thu c. Các nghiên c u cho th y, tanin có trong nhi u loài th c v t nh :  i,ố ứ ấ ề ự ậ ư ổ  chè xanh, măng c t  Tanin có nhi u ho t tính sinh h c nh : ho t tínhụ ề ạ ọ ư ạ  kháng khu n, kháng n m, ch ng kh i u, kháng virut  nên nó đẩ ấ ố ố ượ ứ  c  ng

d ng khá r ng rãi trong y h c hi n đ i ngày nay.ụ ộ ọ ệ ạ

Ngày nay, đ  xác đ nh hàm lể ị ượng c a các ch t trong nhi u loài th củ ấ ề ự  

v t, nhi u k  thu t phân tích m i và hi n đ i nh  quang ph  UV ­ Vis,ậ ề ỹ ậ ớ ệ ạ ư ổ  HPLC, quang ph  đ o hàm… đã đổ ạ ược áp d ng vào vi c phân tích. Trongụ ệ  

đó, quang ph  UV ­ Vis là phổ ương pháp đượ ử ục s  d ng r ng rãi vì nó có độ ộ 

nh y cao, phân tích thu n ti n.ạ ậ ệ

Song song v i vi c tìm ra các kĩ thu t m i thì vi c ki m tra l i giá trớ ệ ậ ớ ệ ể ạ ị 

c a phủ ương pháp phân tích v i m c đích đ m b o đ  chính xác, đ  tin c yớ ụ ả ả ộ ộ ậ  

c a s  li u phân tích và tăng tính  ng d ng c a phủ ố ệ ứ ụ ủ ương pháp đó trong th cự  

ti n cũng r t quan tr ng. Vì v y, tôi ch n đ  tài ễ ấ ọ ậ ọ ề “Xây d ng ph ự ươ ng pháp  

đ nh l ị ượ ng tannins t ng trong th c v t b ng k  thu t đo quang’’ ổ ự ậ ằ ỹ ậ

M c tiêu c a đ  tài: Xây d ng phụ ủ ề ự ương pháp và đ nh lị ượng tanin t ngổ  trong m t s  m u cao chi t t  th c v t b ng phộ ố ẫ ế ừ ự ậ ằ ương pháp đo quang ph ổ

 N i dung nghiên c u:ộ ứ

­ Xây d ng phự ương pháp đ nh lị ượng tanin t ng trong th c v t b ngổ ự ậ ằ  

phương pháp đo quang ph  Xác đ nh gi i h n phát hi n (LOD) vàổ ị ớ ạ ệ  

gi i h n đ nh lớ ạ ị ượng (LOQ) c a phủ ương pháp

­ Áp d ng phụ ương pháp đã được xây d ng đ  đ nh lự ể ị ượng tanin t ngổ  trong m t s  m u cao chi t trà hoa vàng.ộ ố ẫ ế

CH ƯƠ NG 1: T NG QUAN Ổ

1.1 T NG QUAN V  TANINỔ Ề

1.1.1 Khái ni m, tính ch t [1]ệ ấ

* Khái ni m:ệ

Tanin được đ nh nghĩa là ‘‘nh ng h p ch t polyphenol có trong th cị ữ ợ ấ ự  

v t, có v  chát đậ ị ược phát hi n dệ ương tính v i thí nghi m thu c da’’ vàớ ệ ộ  

được đ nh lị ượng d a vào m c đ  h p ph  trên b t da s ng chu n. C  chự ứ ộ ấ ụ ộ ố ẩ ơ ế thu c da độ ược gi i thích do tanin có nhi u nhóm OH phenol, t o nhi u dâyả ề ạ ề  

n i hydro v i các m ch polypeptid c a protein. N u phân t  tanin càng l nố ớ ạ ủ ế ử ớ  thì s  k t h p v i protein càng ch t. Kh i lự ế ợ ớ ặ ố ượng phân t  dao đ ng t  5000ử ộ ừ  

­ 20000 đvc

Hình 1.: Liên k t hidro gi a tanin v i protein ế ữ ớ

* Tính ch t:ấ

Tanin thường là nh ng ch t r t phân c c, d  tan trong dung môi phânữ ấ ấ ự ễ  

c c  nh   c n,  aceton,   methanol,  propylene   glycon,  glycerin  etylacetat  …ự ư ồ  không tan trong các dung môi kém phân c c nh : hexan, benzen, d u h a …ự ư ầ ỏ  1.1.2 Phân lo i ạ

D a vào c u trúc hóa h c có th  chia tanin làm 2 lo i chính: taninự ấ ọ ể ạ  

th y phân và tanin ng ng t ủ ư ụ

1.1.2.1 Tanin th y phân [1] ủ

Tanin th y phân đủ ược còn được g i là tanin pyrogallic. Lo i này cóọ ạ  

nh ng đ c đi m sau: Khi th y phân b ng axit ho c b ng enzym tanase thìữ ặ ể ủ ằ ặ ằ  

gi i phóng ra ph n đả ầ ường và ph n không đầ ường. Ph n đầ ường thường là glucose, đôi khi g p đặ ường đ c bi t ví d  đặ ệ ụ ường hamamelose. Ph n khôngầ  

ph i đả ường là các axit. Axit hay g p là axit gallic. Các axit gallic n i v iặ ố ớ  nhau theo dây n i depsid đ  t o thành axit m­digallic, m­trigallic v.v  Ph nố ể ạ ầ  

đường và ph n không ph i đầ ả ường n i v i nhau theo dây n i este (khôngố ớ ố  

ph i dây n i acetal) nên ngả ố ười ta coi tanin lo i này là nh ng pseudo ­ạ ữ  glycosid. 

Hình 1.: C u t o c a axit gallic, axit m ­ digallic và axit m ­ trigallic ấ ạ ủ

Tính ch t đ c tr ng c a tanin lo i này là: ấ ặ ư ủ ạ

+ Khi c t khô   180 ­ 200°C s  thu đấ ở ẽ ược pyrogallol là ch  y u. ủ ế

+ Khi đun nóng v i HCl s  cho axit gallic ho c axit ellargic. ớ ẽ ặ

+ Cho k t t a bông v i chì axetat 10 %.  ế ủ ớ

+ Cho k t t a màu xanh đen v i mu i s t (III). ế ủ ớ ố ắ

+ Thường d  tan trong nễ ước. 

* Ví d  v  c u trúc c a các tanin th y phân, đụ ề ấ ủ ủ ược phân l p trongậ  

th c v t:ự ậ

Năm 2005, Masturah Markom và các c ng s  đã nghiên c u phân l pộ ự ứ ậ  

được 3 lo i c a tanin th y phân: axit gallic, axit ellagic, corilagin trong câyạ ủ ủ  

Di p H  Châu (ệ ạ Phyllanthus urinaria) [17].

       axit ellagic

­3­ol ho c flavan­3,4­ diol. ặ

Tanin nhóm này có nh ng đ c đi m sau: ữ ặ ể

­ Dưới tác d ng c a axit ho c enzym d  t o thành ch t đ  tanin hayụ ủ ặ ễ ạ ấ ỏ  phlobaphen. Phlobaphen r t ít tan trong nấ ước là s n ph m c a s  trùng hi pả ẩ ủ ự ệ  hoá kèm theo oxy hoá, do đó tanin nhóm này còn được g i là phlobatanin.ọ  Phlobaphen là đ c tr ng c a m t s  dặ ư ủ ộ ố ược li u nh  v  Canh ki na, v  Qu  ệ ư ỏ ỏ ế

­ Khi c t khô thu đấ ược pyrocatechin là chính. 

­ Cho k t t a màu xanh lá đ m v i mu i s t (III). ế ủ ậ ớ ố ắ

­ Cho k t t a bông v i nế ủ ớ ước brom. 

­ Khó tan trong nước h n tanin pyrogallic.ơ  

Tanin ng ng t  hay g p trong các chi Acacia, Camellia, Cinchona,ư ụ ặ  Cinnamomum, Rheum, Salix   

      flavan ­ 3 ­ ol       flavan ­ 3,4 ­ diol 

Hình 1.: C u t o c a các flavanol ấ ạ ủ

* Ví d  v  c u trúc c a các tanin ng ng t , đụ ề ấ ủ ư ụ ược phân l p trong th cậ ự  

Hình 1.: C u t o c a epigallocatechin gallate ấ ạ ủ

Năm 2001, Xueli Cao và các c ng s  đã nghiên c u phân l p độ ự ứ ậ ược hai 

ch t: GCG (Gallocatechin gallate), ECG (Epicatechin gallate) t  trà xanhấ ừ  

(Camellia sinensis) b ng cách s  d ng s c ký phân b  ngằ ử ụ ắ ố ược dòng v i haiớ  

h n   h p   dung   môi   (ethyl   acetate:   ethanol:   nỗ ợ ước;   hexane:   ethyl   acetate: 

nước). [25]

Hình 1.: C u t o c a epicatechin gallate ấ ạ ủ

Hình 1.: C u t o c a gallocatechin gallate ấ ạ ủ

1.1.2 Ho t tính sinh h c c a taninạ ọ ủ

Theo các nghiên c u khoa h c c a nứ ọ ủ ước ngoài thì tanin là h p ch t cóợ ấ  nhi u ho t tính sinh h c.ề ạ ọ

1.1.2.1 Ho t tính kháng khu n ạ ẩ

Các ho t tính kháng khu n c a tanin đã đạ ẩ ủ ược công nh n t  trậ ừ ước đây 

và đ c tính c a tanin đ i v i vi khu n, n m và n m men đã độ ủ ố ớ ẩ ấ ấ ược nhà khoa 

h c Scalbert nghiên c u [6]. Các c  ch  đọ ứ ơ ế ược đ  xu t cho đ n nay đ  gi iề ấ ế ể ả  thích ho t tính kháng khu n c a tanin bao g m  c ch  các enzym c a viạ ẩ ủ ồ ứ ế ủ  khu n ngo i bào, tác đ ng tr c ti p lên quá trình chuy n hóa c a vi khu nẩ ạ ộ ự ế ể ủ ẩ  thông qua s   c ch  quá trình photphoryl oxy hóa, s  kh  ion kim lo i gâyự ứ ế ự ử ạ  

ra s  thay đ i hình thái c a t  bào và tăng tính th m c a màng [7]. Cácự ổ ủ ế ấ ủ  

b ng ch ng đã ch  ra r ng màng t  bào vi sinh v t là n i ch  y u tác đ ngằ ứ ỉ ằ ế ậ ơ ủ ế ộ  

c ch  c a tanin [8]. Do tính k t t a v i protein là m t tính ch t ph  bi n

cho t t c  các tanin, cho nên ho t tính kháng vi khu n c a các loài vi sinhấ ả ạ ẩ ủ  

v t có liên quan ch t ch  đ n thành ph n hóa h c và c u trúc c a tanin.ậ ặ ẽ ế ầ ọ ấ ủ

1.1.2.2 Ho t tính kháng vi­rút ạ

Tanin đã được các nhà nghiên c u ch ng minh có ho t tính đáng kứ ứ ạ ể 

ch ng l i m t s  lo i vi­ rút, nh  vi­ rút gây suy gi m mi n d ch   ngố ạ ộ ố ạ ư ả ễ ị ở ườ  i(HIV), vi­ rút adeno và norovirus [9]. Vào năm 1991, tác gi  G.T. Tan và cácả  

c ng s  đã ch ng minh tanin gây tác d ng  c ch  HIV­1 b ng cách saoộ ự ứ ụ ứ ế ằ  chép ngược vi­ rút [10]. Đ n năm 2011, S. Ciesek và các c ng s  cũng đãế ộ ự  

ch ng minh epigallocatechin trong trà xanh  c ch  đứ ứ ế ượ ực s  xâm nh p c aậ ủ  vi­ rút viêm gan C [11]. Tanin có nhi u ho t tính kháng vi­ rút khác nhau tùyề ạ  thu c vào thành ph n và c u trúc hóa h c.ộ ầ ấ ọ

1.1.2.3 Ho t tính ch ng viêm ạ ố

Tanin có các ho t tính ch ng viêm khác nhau. Các nghiên c u in vitroạ ố ứ  

c a tác gi  X. Terra và các c ng s  năm 2007, đã ch  ra r ng tanin t  h tủ ả ộ ự ỉ ằ ừ ạ  nho làm gi m b nh viêm th p kh p [12]. Đ n năm 2014, M. Park và cácả ệ ấ ớ ế  

c ng s  ch ng minh tanin ng ng t  chi t xu t t  h t mâm xôi đen có khộ ự ứ ư ụ ế ấ ừ ạ ả 

năng ch ng viêm,  c ch  t  bào RAW 264.7 do lipopolysacarit gây ra trongố ứ ế ế  quá trình s n xu t NO m t ch t trung gian gây viêm [13].ả ấ ộ ấ

1.1.2.4 Ho t tính ch ng oxy hóa ạ ố

Các h p ch t phenolic đã đợ ấ ược các nhà khoa h c nghiên c u là ch tọ ứ ấ  

ch ng oxy hóa hi u qu  [14]. Tanin v i h u h t là các nhóm hydroxyl số ệ ả ớ ầ ế ẽ 

d  b  oxy hóa nh t, do đó chúng s  có ho t tính ch ng oxy hóa l n nh tễ ị ấ ẽ ạ ố ớ ấ  [15]. Ho t tính ch ng oxy hóa c a tanin đạ ố ủ ượ ức  ng d ng r ng rãi trong lĩnhụ ộ  

v c y t  đ  ngăn ng a các b nh v  tim m ch, b nh ung th , b nh loãngự ế ể ừ ệ ề ạ ệ ư ệ  

xương [16]. 

1.1.3 M t s  phộ ố ương pháp đ nh lị ượng tanin 

Có nhi u nhà khoa h c trên th  gi i ti n hành nghiên c u đ  xácề ọ ế ớ ế ứ ể  

đ nh hàm lị ượng tanin trong nhi u đ i tề ố ượng th c v t khác nhau. S  d ngự ậ ử ụ  

m t s  phộ ố ương pháp nh : chu n đ , đo quang, s c ký l ng hi u năngư ẩ ộ ắ ỏ ệ  cao… 

1.1.3.1 Ph ươ ng pháp chu n đ  [23] ẩ ộ

Theo phương pháp c a AOAC (1980), đ  đ nh lủ ể ị ượng tanin, phươ  ngpháp được th c hi n nh  sau: L y 5 ml d ch chi t đự ệ ư ấ ị ế ược hòa tan v i 12,5 mlớ  dung d ch indigo­carmin và 375 ml nị ước. H n h p đỗ ợ ược chu n đ  v i dungẩ ộ ớ  

d ch KMnOị 4  làm dung d ch chuy n t  màu xanh sang màu vàng v i màuị ể ừ ớ  

h ng nh t   vi n. Th  tích c a dung d ch KMnOồ ạ ở ề ể ủ ị 4  là t ng th  tích hàmổ ể  

lượng tanin bao g m c  các thành ph n khác (Y). Đ  xác đ nh thành ph nồ ả ầ ể ị ầ  khác không ph i tanin (X), l y 50ml dung d ch chi t v i 25 ml dung d chả ấ ị ế ớ ị  gellatin. H n h p đỗ ợ ược làm  m cho đ n khi gellatin đấ ế ược hòa tan hoàn toàn sau đó được làm l nh và đ nh m c đ n v ch v i dung d ch mu i bão hòa,ạ ị ứ ế ạ ớ ị ố  thêm 50 ml dung d ch axit và NaCl bão hòa và 5 g b t cao lanh. H n h pị ộ ỗ ợ  

đượ ắc l c 15 phút và l c qua màng l c whatman 1. L y 12,5 ml d ch l c tr nọ ọ ấ ị ọ ộ  

v i 12,5 ml th  tích dung d ch indigo carmin và 375 ml nớ ể ị ước. Chu n đ  v iẩ ộ ớ  dung d ch KMnOị 4 cho t i khi chuy n thành dung d ch màu h ng nh t nhớ ể ị ồ ạ ư 

trước. Th  tích c a dung d ch KMnOể ủ ị 4  th c đự ược s  d ng đ  chu n đử ụ ể ẩ ộ tanin được tính theo giá tr  c a Y và X: ị ủ

       1mL dung d ch chu n KMnOị ẩ 4 = 0,595 ml dung d ch axit oxalic 0,1Nị       1mL dung d ch axit oxalic 0,1N = 0,0042 g tanin.ị

Năm 2015, tác gi  Jyotismita Khasnabis và các c ng s  đã ti n hànhả ộ ự ế  xác đ nh hàm lị ượng tanin trong các lo i trà khác nhau b ng phạ ằ ương pháp chu n đ  M u trà đẩ ộ ẫ ược chi t trong nế ướ ởc   nhi t đ  70ệ ộ oC trong 5 phút. 

D ch chi t đị ế ượ ọc l c qua màng Whatman.1 và được ly tâm v i t c đ  10000ớ ố ộ  vòng/15 phút. D ch l c đị ọ ượ ưc l u tr    4ữ ở oC đ  đ nh lể ị ượng b ng phằ ươ  ngpháp chu n đ  v i dung d ch KMnOẩ ộ ớ ị 4 v i ch t ch  th  indigo­cacmin. Hàmớ ấ ỉ ị  

lượng tanin trong các lo i trà đạ ược xác đ nh: m u trà đen có hàm lị ẫ ượ  ngtanin là 13,36%, trà xanh có hàm lượng tanin là 2,65%, trà ô long có hàm 

lượng 8,66%. [18]

Năm 2009, Maria Atanassova và Valentina Christova­Bagdassarian đã 

ti n hành xác đ nh hàm lế ị ượng tanin trong các lo i th c v t khác nhau b ngạ ự ậ ằ  

phương pháp chu n đ  Các lo i m u đẩ ộ ạ ẫ ược chi t trong nế ước c t kh  ionấ ử  trong th i gian 4 gi    nhi t đ  phòng. Sau đó, ti n hành l c d ch chi t,ờ ờ ở ệ ộ ế ọ ị ế  

d ch l c thu đị ọ ược chu n đ  b ng dung d ch KMnOẩ ộ ằ ị 4 v i ch t ch  th  indigo­ớ ấ ỉ ịcacmin. Hàm lượng tanin c a các lo i th c v t l n lủ ạ ự ậ ầ ượt là: táo (0,58%), cherry ng t (1,25%), qu  m c qua (0,67%), h  tiêu đ  (0,69%). [26]ọ ả ộ ồ ỏ

1.1.3.2 Ph ươ ng pháp s c ký l ng hi u năng cao [3] ắ ỏ ệ

Trong phương pháp s c ký l ng hi u năng cao, có 4 phắ ỏ ệ ương pháp 

đ nh lị ượng thường dùng:

Phương pháp chu n ngo i: là phẩ ạ ương pháp đ nh lị ượng c  b n, trongơ ả  

đó c  2 m u chu n và th  đ u đả ẫ ẩ ử ề ược tiên hành s c ký trong cùng đi u ki n.ắ ề ệ  

Sau đó so sánh di n tích (ho c chi u cao) pic c a m u th  v i di n tíchệ ặ ề ủ ẫ ử ớ ệ  (ho c chi u cao) pic c a m u chu n s  tính đặ ề ủ ẫ ẩ ẽ ược n ng đ  c a các ch tồ ộ ủ ấ  trong m u th   ẫ ử

Phương pháp chu n n i: thêm vào c  m u chu n l n m u th  nh ngẩ ộ ả ẫ ẩ ẫ ẫ ử ữ  

lượng b ng nhau c a m t ch t tinh khi t, r i ti n hành s c ký trong cùngằ ủ ộ ấ ế ồ ế ắ  

đi u ki n. Ch t đề ệ ấ ược thêm này g i là chu n n i. T  nh ng d  ki n v :ọ ẩ ộ ừ ữ ữ ệ ề  

di n tích (ho c chi u cao) pic và lệ ặ ề ượng (ho c n ng đ ) c a chu n, chu nặ ồ ộ ủ ẩ ẩ  

n i và m u th , có th  xác đ nh độ ẫ ử ể ị ược hàm lượng c a thành ph n c n đ nhủ ầ ầ ị  

lượng trong m u th  m t cách chính xác. ẫ ử ộ

Phương pháp thêm chu n: Thêm vào m u th  nh ng lẩ ẫ ử ữ ượng đã bi tế  

c a các ch t chu n tủ ấ ẩ ương  ng v i các thành ph n có trong m u th  r i l iứ ớ ầ ẫ ử ồ ạ  

ti n hành x  lý m u và s c ký trong cùng đi u ki n. N ng đ  ch a bi tế ử ẫ ắ ề ệ ồ ộ ư ế  

c a m u 9 th  đủ ẫ ử ược tính d a vào s  chênh l ch n ng đ  lự ự ệ ồ ộ ượng ch t thêmấ  vào và s  tăng c a di n tích ho c chi u cao pic. ự ủ ệ ặ ề

Phương pháp chu n hoá di n tích: Hàm lẩ ệ ượng ph n trăm c a m tầ ủ ộ  

ch t trong h n h p nhi u thành ph n đấ ỗ ợ ề ầ ược tính b ng t  l  ph n trăm di nằ ỷ ệ ầ ệ  tích pic c a nó so v i t ng di n tích c a t t c  các pic thành ph n trên s củ ớ ổ ệ ủ ấ ả ầ ắ  

ký đ  ồ

Tác gi  Trupti P. Durgawale và các c ng s  đã s  d ng phả ộ ự ử ụ ương pháp HPLC đ  xác đ nh hàm lể ị ượng tanin trong loài cây h  Đ u vào năm 2016.ọ ậ  Công trình nghiên c u s  d ng c t s c kí C18, h n h p methanol và nứ ử ụ ộ ắ ỗ ợ ướ  ctheo t  l  th  tích 50:50 làm dung môi pha đ ng v i pH = 4,5, t c đ  phaỉ ệ ể ộ ớ ố ộ  

đ ng là 1,0 ml/phút t i bộ ạ ước sóng 270 nm. T ng th i gian ch y là 12 phút.ổ ờ ạ  

K t qu  thu đế ả ược th i gian l u là 3,1 phút. Phờ ư ương pháp này đã được xác 

nh n và tuy n tính c a axit tannic trong ph m vi n ng đ  0­60 mg/ml. [19]ậ ế ủ ạ ồ ộ

Tác gi  Tushar Dhanani và các c ng s  đã s  d ng phả ộ ự ử ụ ương pháp HPLC ­ PDA đ  xác đ nh hàm lể ị ượng c a 5 lo i tanin th y phân: axit gallicủ ạ ủ  

(GA), axit corilagin (CL), axit chebulagic (CB), axit ellagic (EA) và axit chebulinic (CN) trong v  qu  cây chiêu liêu vào năm 2014. Công trình sỏ ả ử 

d ng c t s c ký C18, h n h p dung môi ACN (acetonitril) và TFA (0,05%)ụ ộ ắ ỗ ợ  trong nước, t c đ  pha đ ng là 1,0 ml/phút t i bố ộ ộ ạ ước sóng 270 nm. K t quế ả thu được th i gian l u c a 5 lo i tanin th y phân l n lờ ư ủ ạ ủ ầ ượt là: GA (2,91 phút), CL (12,09 phút), CB (16,12 phút), EA (17,66 phút), CN (18,59 phút). LOD (gi i h n phát hi n) c a GA, CL, CB, EA và CN l n lớ ạ ệ ủ ầ ượt là 1,0; 0,5; 1,0; 0,5 và 1,0 µg/ml. LOQ (gi i h n đ nh lớ ạ ị ượng) c a GA, CL, CB, EA vàủ  

CN l n lầ ượt là 2,5; 1,0; 2,5; 1,0 and 2,5 µg/ml. [22]

1.1.3.3 Ph ươ ng pháp đo quang

Tác gi  Philipả ­Edouard Shay và các c ng s  s  d ng phộ ự ử ụ ương pháp đo 

đ  h p th  quang v i thu c th  butanol ­ HCl ­ s t đ  xác đ nh hàm lộ ấ ụ ớ ố ử ắ ể ị ượ  ngtanin ng ng t  trong các loài th c v t năm 2017. M u khô đư ụ ự ậ ẫ ược chi t b ngế ằ  dung   môi   methanol   (300mL)   và   được   axit   hóa   b ng   axit   trifluoroaceticằ  (TFA) 0,05%. Các bước được tóm t t nh  sau: 500 µl d ch m u ch a taninắ ư ị ẫ ứ  

ng ng t  cho tác d ng v i 2000µl dung d ch thu c th  butanol ­ HCl choư ụ ụ ớ ị ố ử  thêm 67mL thu c th  s t (NHố ử ắ 4Fe(SO4)2  2% trong HCl 2N) và đ    trongể ủ  kho ng th i gian 2,5h   nhi t đ  70°C. Màu c a ph n  ng đả ờ ở ệ ộ ủ ả ứ ược phát hi nệ  trên máy quang ph    bổ ở ước sóng 550 nm. Hàm lượng tanin ng ng t  đư ụ ượ  c

đ nh lị ượng d a trên đ  h p th  quang thu đự ộ ấ ụ ược c a m u thí nghi m đ iủ ẫ ệ ố  chi u v i đế ớ ường chu n proanthocyanidin. [20]ẩ

Tác gi  Oi­Wah Lau, Shiu­Fai Luk and Hsiao­Lan Huang đã ti n hànhả ế  xác đ nh tanin m u chè vào năm 1989. M u đị ẫ ẫ ược chi t trong nế ướ ởc   nhi tệ  

đ  80ộ oC, m u đẫ ượ ọc l c. Tanin trong m u, kh  ion s t (III) thành ion s t (II)ẫ ử ắ ắ   nhi t đ  80

ở ệ ộ oC trong 20 phút. Sau đó ion s t (II) ph n  ng v i thu c thắ ả ứ ớ ố ử 1,10 ­ phenanthrolin   pH 4,4 t o thành m t ph c màu. Đo đ  h p thở ạ ộ ứ ộ ấ ụ quang c a dung d ch t i bủ ị ạ ước sóng 540 nm và xây d ng đự ường chu n trongẩ  

kho ng 0­5,5 µg/mL c a axit tanic v i đ  d c 0,213 A/ppm. Hàm lả ủ ớ ộ ố ượ  ngtanin trong chè xác đ nh đị ược là 9,45%. [21]

1.2 CÁC TH C V T CH A NHI U TANINỰ Ậ Ứ Ề

Tanin là nhóm các h p ch t phân b  ph  bi n trong th c v t b c caoợ ấ ố ổ ế ự ậ ậ  

 nh ng cây hai lá m m, các h  th c v t hay g p giàu tanin:

lượng tanin trong m t s  loài dộ ố ược li u thệ ường khá cao chi m t  6 ­ 35 %,ế ừ  

đ c bi t trong Ngũ b i t  có th  lên đ n 50 ­ 70 % chúng đặ ệ ộ ử ể ế ượ ức  ng d ngụ  nhi u trong lĩnh v c y h c và trong ngành công nghi p th c ph m.ề ự ọ ệ ự ẩ

B ng 1.: Hàm l ả ượ ng tanin trong m t s  loài th c v t [5] ộ ố ư ậ

Ngũ b i tộ ử 43,2

Lá (trà hoa vàng) 15 ­ 30

Hình 1.: M t s  loài th c v t ch a nhi u tanin ộ ố ự ậ ứ ề

1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PH  UV ­ VIS Đ NH LỔ Ị ƯỢNG TANIN

1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang [2]

Phương pháp phân tích quang ph  là phổ ương pháp phân tích quang 

h c d a trên vi c nghiên c u s  tọ ự ệ ứ ự ương tác c a b c x  ánh sáng trên ch tủ ứ ạ ấ  

kh o sát ho c s  h p th  các b c x  dả ặ ự ấ ụ ứ ạ ưới m t tác đ ng hóa lý nào đó.ộ ộ

1.3.1.1 Nguyên t c c a phép đo ph  UV ­ VIS ắ ủ ổ

Ph  h p th  quang phân t  vùng UV­VIS (190 ­ 800 nm) là ph  h pổ ấ ụ ử ổ ấ  

th  c a các ch t tan   tr ng thái dung d ch đ ng th  c a ch t trong m tụ ủ ấ ở ạ ị ồ ể ủ ấ ộ  dung môi nh t đ nh nh  nấ ị ư ước, methanol, benzen, toluen, chloroform, hay 

m t s  ch t mà phân t  c a nó trong đi u ki n bình thộ ố ấ ử ủ ề ệ ường nó t n t i ồ ạ ở 

tr ng thái h i nh  khí CHạ ơ ư 4, NH3, CO2. Vì th  mu n th c hi n đế ố ự ệ ược phép đo 

ph  này chúng ta ph i th c hi n các công vi c sau đây:ổ ả ự ệ ệ

 Chu n b  dung d ch m u:  ẩ ị ị ẫ

N u các ch t phân tích có h p th  quang UV­VIS: Trế ấ ấ ụ ường h p này taợ  

ph i hòa tan nó vào trong m t dung môi phù h p, t o ra dung d ch trong vàả ộ ợ ạ ị  

đ ng th , nh  m t s  ch t h u c : Benzen, phenol, nitrophenol, naphthalen,ồ ể ư ộ ố ấ ữ ơ  anthracene. Các ch t vô c  nh  Iấ ơ ư 2, các mu i Kố 2CrO4, K2Cr2O7 và KMnO4

Nh ng ch t không có ph  h p th  quang UV­VIS:  Trữ ấ ổ ấ ụ ường h p nàyợ  

ch  y u là các ion kim lo i, hay các anion, chúng ta ph i cho các ch t nàyủ ế ạ ả ấ  tác d ng v i m t thu c th  R nào đó trong m t dung môi và   đi u ki nụ ớ ộ ố ử ộ ở ề ệ  thích h p đ  t o ra m t h p ch t ph c b n có kh  năng h p th  quangợ ể ạ ộ ợ ấ ứ ề ả ấ ụ  UV­VIS nh y, sau đó đo ph  c a dung d ch ph c thu đạ ổ ủ ị ứ ược

N u m u phân tích là ch t khí: Chúng ta ph i ch a m u vào trongế ẫ ấ ả ứ ẫ  

m t  ng cuvet đóng kín đ  đ t vào bu ng đo ph  Hay b m dòng khí m uộ ố ể ặ ồ ổ ơ ẫ  qua cuvet trong khi đo v i m t t c đ  h ng đ nh (phớ ộ ố ộ ằ ị ương pháp đo dòng 

ch y).ả

 Đo ph :  ổ

Cho m u vào cuvet và chi u chùm sáng kích thích  ẫ ế   phù h p vàoợ  cuvet có dung d ch m u c a h p ch t c n phân tích, đ  cho các phân tị ẫ ủ ợ ấ ầ ể ử 

ch t phân tích hay s n ph m ph c c a nó h p th  tia b c x  ấ ả ẩ ứ ủ ấ ụ ứ ạ , đ  t o raể ạ  

ph  h p th  quang UV­VIS c a nó. Vì th  ch t phân tích (m u phân tích)ổ ấ ụ ủ ế ấ ẫ  

c n đầ ược đ ng vào  ng đo hay cuvet có b  dày nh t đ nh (L = 0,5 đ n 2ự ố ề ấ ị ế  cm)

 Ghi đo ph : ổ

Thu chùm sáng đi qua cuvet, phân ly ph  đó và ch n m t tia sáng ổ ọ ộ  ở 

v  trí h p th  c c đ i c a băng ph  c a ch t phân tích và đo cị ấ ụ ự ạ ủ ổ ủ ấ ường đ  h pộ ấ  

th  quang Aụ    ở max  c a ch t đó trong các đi u ki n đã ch n, hay quétủ ấ ề ệ ọ  (Scan) đ  ghi c  m t vùng ph  mong mu n.ể ả ộ ổ ố

 Hi n th  ph , k t qu  đo: ệ ị ồ ế ả

Ghi giá tr  đ  h p th  quang Aị ộ ấ ụ  Vi c này có th  đệ ể ược th c hi nự ệ  

b ng nhi u công c  khác nhau, nh  đ ng h  đo năng lằ ề ụ ư ồ ồ ượng h p th , máyấ ụ  

t  ghi đ  ghi đ  h p th  Aự ể ộ ấ ụ  dướ ại d ng các pic h p th , hay hi n k t quấ ụ ệ ế ả 

đo A , b ng máy hi n s  (digital), hay ghi vào đĩa c a máy tính, sau đó xằ ệ ố ủ ử 

lý ti p b ng các chế ằ ương trình theo yêu c u c n k t qu  đo   d ng nào (đầ ầ ế ả ở ạ ộ 

h p th  quang A, đ  truy n qua T, n ng đ  Cấ ụ ộ ề ồ ộ x ch t phân tích). ấ

1.3.1.2 C u t o và nguyên lý ho t đ ng c a máy đo quang ph   ấ ạ ạ ộ ủ ổ

+ Bu ng đ t cuvet và cuvet ch a m u đ  đo ph ; ồ ặ ứ ẫ ể ổ

+ B  đ n s c (h  quang) đ  thu ph , phân ly và ch n tia sáng X c nộ ơ ắ ệ ể ổ ọ ầ  đo; 

+  Detector và modul đi n t ;ệ ử

+ Máy trang b  ghi nh n và ch  th  k t qu  đo ph ị ậ ỉ ị ế ả ổ

Ngoài ra, máy đo ph  còn đổ ược trang b  thêm các thi t b  nh :ị ế ị ư

+ B  l y m u t  đ ng;ộ ấ ẫ ự ộ

+ H  máy tính và ph n m m (h  UV­ VIS) hoàn ch nh;ệ ầ ề ệ ỉ

+ Các chương trình thu t toán.ậ

 Ngu n sáng: ồ

Trong các máy đo ph  h p th  quang phân t  UV­VIS (phép đo quangổ ấ ụ ử  

h p th ) ngấ ụ ười ta thường dùng lo i đèn ngu n là D2­Lamp (đèn h  quangạ ồ ồ  hydro), W­Lamp (đèn s i đi m Wolfram).ợ ể

 B  ph n t o tia sáng đ n s c: ộ ậ ạ ơ ắ

Đ  t o để ạ ược tia sáng đ n s c (hay chính xác là vùng sáng có vùngơ ắ  

ph  h p) trong máy đo quang ngổ ẹ ười ta thường dùng lăng kính, cách t  hayử  kính l c sáng.ọ

 Cuvet:

Cuvet là d ng c  ch a dung d ch phân tích ho c dung môi. Trongụ ụ ứ ị ặ  

th c t  ta thự ế ường g p cuvet hình tr  đáy vuông. Có các ch t li u hay sặ ụ ấ ệ ử 

d ng là cuvet nh a, th y tinh ho c th ch anh. Khi đo   vùng ph  kh  ki nụ ự ủ ặ ạ ở ổ ả ế  nên ch n cuvet nh a hay th y tinh, nh ng khi đo   vùng ph  t  ngo i thìọ ự ủ ư ở ổ ử ạ  

nh t thi t ph i dùng cuvet th ch anh vì th y tinh h p th  tia t  ngo i.ấ ế ả ạ ủ ấ ụ ử ạ  Không s  d ng cuvet nh a khi đo v i dung môi h u c  Khi làm vi c v iử ụ ự ớ ữ ơ ệ ớ  các dung môi bay h i ph i đ y n p cuvet.ơ ả ậ ắ

 T  bào nhân quang đi n: ế ệ

T  bào quang đi n là b  ph n bi n quang năng thành đi n năng r iế ệ ộ ậ ế ệ ồ  chuy n vào b  ph n ghi đo.ể ộ ậ

 Detector:

Detector là b  ph n thu nh n chùm sáng và chuy n chúng thành tínộ ậ ậ ể  

hi u đi n đ  đo cệ ệ ể ường đ  chùm sáng đó. Các tín hi u ghi, đo độ ệ ược x  lý vàử  cho ra k t qu  giá tr  đ  h p th  quang tế ả ị ộ ấ ụ ương  ng c a dung d ch. Ngày nayứ ủ ị  

h u h t các máy đo quang lo i t t đ u có b  ph n ghi đo đầ ế ạ ố ề ộ ậ ược k t n i v iế ố ớ  máy tính

b) Nguyên lý ho t đ ng: ạ ộ

Các đèn phát ra ngu n sáng chi u vào h  th ng th u kính (h  gồ ế ệ ố ấ ệ ươ  ng

h i t ) t o ra chùm sáng tr ng đi qua khe h p vào b  ph n tán s c. Khiộ ụ ạ ắ ẹ ộ ậ ắ  chùm sáng tr ng chi u vào lăng kính ngay l p t c nó b  tán s c thành các tiaắ ế ậ ứ ị ắ  sáng đ n s c chi u v  m i phía. Tia sáng ph n x  qua các th u kính gơ ắ ế ề ọ ả ạ ấ ươ  ng

ph ng ra kh i bu ng tán s c đ n b  ph n phân chia chùm sáng, b  ph nẳ ỏ ồ ắ ế ộ ậ ộ ậ  này s  hẽ ướng chùm sáng đ n các cuvet đ ng m u nghiên c u. Detector sế ự ẫ ứ ẽ 

ti p nh n và phân tích các chùm sáng qua cuvet, chuy n tín hi u ánh sángế ậ ể ệ  thành tín hi u đi n và cho hi n lên máy tính k t qu  đo.ệ ệ ệ ế ả

Hình 1.: S  đ  nguyên t c c u t o c a máy đo quang ph ơ ồ ắ ấ ạ ủ ổ

1.3.1.3 Ph m vi  ng d ng c a phép đo ph  UV­Vis ạ ứ ụ ủ ổ

Phương pháp đo quang UV­Vis đã và đang đượ ức  ng d ng r t phụ ấ ổ 

bi n. Vì nó là phế ương pháp đ n gi n, d  th c hi n và máy móc l i khôngơ ả ễ ự ệ ạ  

đ t ti n, phù h p cho vi c phân tích đ nh lắ ề ợ ệ ị ượng nhi u ch t v i hàm lề ấ ớ ượ  ng

nh , ví d  nh : ỏ ụ ư

­ Đ  xác đ nh các ch t: ể ị ấ

+ Phân tích các ch t h u c ; ấ ữ ơ

+ Phân tích thu c, dố ược ph m, s n ph m nông nghi p; ẩ ả ẩ ệ

+ Phân tích các ion kim lo i trong các đ i tạ ố ượng m u khác nhau. ẫ

m t thu c th  có th  tác d ng độ ố ử ể ụ ược v i nhi u ion kim lo i cùng cho ph cớ ề ạ ứ  màu có c c đ i h p th  trùng nhau, hay g n nhau.ự ạ ấ ụ ầ

1.3.1.4 Ph ươ ng pháp đ nh l ị ượ ng

Trong phương pháp đo quang ph , phổ ương pháp thường dùng đ  đ nhể ị  

lượng là: phương pháp đường chu n và phẩ ương pháp thêm chu nẩ

a) Ph ươ ng pháp đ ườ ng chu n: ẩ

* C  s  đ nh lơ ở ị ượng c a phủ ương pháp: 

D a vào phự ương trình đ nh lu t Lambert ­ Beer:ị ậ

A =  L.CTrong đó: A là đ  h p th  quang c a dung d ch c n đo, ộ ấ ụ ủ ị ầ  là h  s  h p thệ ố ấ ụ phân t , C là n ng đ  ch t, L là b  dày c a l p dung d ch (b  dày c aử ồ ộ ấ ề ủ ớ ị ề ủ  cuvet)

* Cách ti n hành:ế

­ Chu n b  dãy dung d ch chu n và các m u phân tích: Chu n b  m tẩ ị ị ẩ ẫ ẩ ị ộ  dãy dung d ch chu n có n ng đ  chính xác (thông thị ẩ ồ ộ ường chu n b  v i 5ẩ ị ớ  

n ng đ  khác nhau n m trong vùng tuy n tính c a m i quan h   Aồ ộ ằ ế ủ ố ệ ­ Cx) cùng trong đi u ki n v i m u phân tích, nh  ch t n n, môi trề ệ ớ ẫ ư ấ ề ường pH,

­ Ch n các đi u ki n đo ph : Nghiên c u ch n đi u ki n phù h pọ ề ệ ổ ứ ọ ề ệ ợ  

nh t đ  đo ph  UV­VIS c a ch t phân tích trong dãy dung d ch chu n vàấ ể ổ ủ ấ ị ẩ  

m u phân tích, nh  các thông s  máy đo Aẫ ư ố x, đi u ki n đo, th i gian đo, lo iề ệ ờ ạ  cuvet 

­ Đo ph  các m u chu n và m u phân tích: Đo ph  h p th  quangổ ẫ ẩ ẫ ổ ấ ụ  UV­VIS c a dãy dung d ch chu n và m u phân tích theo các đi u ki n đãủ ị ẩ ẫ ề ệ  

ch n.ọ

­ D ng đự ường chu n và xác đ nh n ng đ  Cẩ ị ồ ộ x: T  các c p giá tr  A ­ Cừ ặ ị  

tương  ng c a các dung d ch chu n, ta d ng đứ ủ ị ẩ ự ường chu n trong h  t a đẩ ệ ọ ộ