Khóa luận xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MSMS

Vì vậy, nhằm đưa ra được phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu với hiệu suất thu hồi cao và phương pháp đơn giản, cũng như tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “X

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

- -

HÀ ANH TUẤN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019

C opyri

ght @ Sc hool

HÀ ANH TUẤN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2014.Y Người hướng dẫn 1: TS Nguyễn Thị Phương Người hướng dẫn 2: TS Nguyễn Hữu Tùng

Hà Nội – 2019

C opyri

ght @ Sc hool

những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) cùng với các anh chị,bạn

bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã

dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019

Sinh vi ên

Hà Anh Tuấn

C opyri

ght @ Sc hool

of Me

di ci

ne a

nd Pha

rm ac

y, VNU

M ỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về aflatoxin 2

1.1.1 Giới thiệu về aflatoxin 2

1.1.2 Tính chất hóa lý 2

1.1.3 Điều kiện sinh aflatoxin 7

1.1.4 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin 8

1.1.5 Độc tính của aflatoxin lên cơ thể người 9

1.1.6 Những nghiên cứu về phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu 10

1.2 Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS) 15

1.2.1 Sắc ký ái lực miễn dịch 15

1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ 16

CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 21

2.2.1 Chất chuẩn 21

2.2.2 Hóa chất 21

C opyri

ght @ Sc hool

of Me

di ci

ne a

nd Pha

rm ac

y, VNU

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 22

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu 22

2.3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử 23

2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí 23

2.4.3 Quy trình thẩm định phương pháp 23

2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 23

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) 24

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 24

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 25

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 27

3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29

3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 29

3.2.2 Khảo sát pha động 30

3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33

3.3.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 33

3.3.2 Khảo sát dung môi làm sạch 34

3.4 Thẩm định phương pháp 35

C opyri

ght @ Sc hool

of Me

di ci

ne a

nd Pha

rm ac

y, VNU

3.4.1 Độ chọn lọc của phương pháp 35

3.4.2 Tính phù hợp hệ thống 36

3.4.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 37

3.4.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39

3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hôi 40 3.5 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong dược liệu 42 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

C opyri

ght @ Sc hool

CV% Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

ELISA Enzyme – Linked Immuno Sorbent

Assay

Kỹ thuật miễn dịch liên

kết với enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện tử

HCC Hepatocellular carcinoma Ung thƣ biểu mô tế bào

C opyri

ght @ Sc hool

PBS Phosphate-Buffered Saline Dung dịch đệm

phosphat

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương

đối

SPE Solid phase extract Chiết pha rắn

SPE-IM Solid phase extract-Immuno Chiết pha rắn với cột ái

lực miễn dịch TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

C opyri

ght @ Sc hool

of Me

di ci

ne a

nd Pha

rm ac

y, VNU

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Tính chất của một vài aflatoxin 4

Bảng 1 2 Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước 11

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu thu mua 21

Bảng 3.1 Thông số MS tối ưu 28

Bảng 3 2 Một số chương trình gradient khảo sát 30

Bảng 3 3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 32

Bảng 3 4 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau 34 Bảng 3 5 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch 35

Bảng 3 6 Ion mẹ và ion con của các aflatoxin 35

Bảng 3 7 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp 37

Bảng 3 8 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất 38

Bảng 3 9 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp 40

Bảng 3 10 Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu 41

C opyri

ght @ Sc hool

of Me

di ci

ne a

nd Pha

rm ac

y, VNU

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ 18

Hình 1.2 Bộ phân tích tử cực chập ba 19

Hình 3.1 Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ ESI-positive 28

Hình 3 2 Phổ khối của ion con các aflatoxin 29

Hình 3 3 Sắc ký đồ chương trình gradient 1 31

Hình 3 4 Sắc ký đồ chương trình gradient 2 31

Hình 3 5 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 36

Hình 3 6 Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin 39

C opyri

ght @ Sc hool

Trong những năm gần đây, dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược

liệu được nhân dân sử dụng ngày càng nhiều Để đảm bảo người dân được sử dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng như an toàn cho sức khỏe, ngoài việc đảm bảo các tiêu chí trong Dược điển các sản phầm này cũng nên được kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là aflatoxin Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dược liệu khác nhau Tuy nhiên, trong nước hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý

mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chưa được cao Vì vậy, nhằm đưa ra được phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu với hiệu suất thu hồi cao và phương pháp đơn giản, cũng như tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định

hàm lượng aflatoxin trong một số dược liệu với mục tiêu:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dược liệu bằng phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM)

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội

C opyri

ght @ Sc hool

1.1.1 Giới thiệu về aflatoxin

Aflatoxin được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự

kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây Những con gà tây này bị hoại tử gan sau khi được cho ăn lạc mốc và aflatoxin được xác định

là nguyên nhân gây bệnh [15,25]

Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus

Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trước và sau khi thu hoạch, khi

bảo quản cũng như chế biến Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin như ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu như hạt đậu, hạt hướng dương, bông; các loại gia vị như ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát ) [10,20]

Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tương tự nhau và đều là dẫn chất của difuranocoumarin, được tổng hợp nhờ con đường polyketide Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lượt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2

[27] Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80%

tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm Thông thường, nếu không có aflatoxin B1thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1và AFG2 [10,14]

C opyri

ght @ Sc hool

C opyri

ght @ Sc hool

Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi

nấm chủ yếu thường gặp sinh aflatoxin B1 [12] Hầu hết các chủng nấm

khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng lượng dạng tinh bột [6] Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn

phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học

 Điều kiện môi trường và cơ chất:

Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lượng (thường dưới dạng tinh

bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm (Zn) Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thường có trong những sản phẩm nhiều tinh bột, các hạt có dầu như hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14]

Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin Nhiệt độ

tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lượt là 12oC và

42oC Nhiệt độ tối ưu để hình thành aflatoxin là 25-35o

C, nhiệt độ tối ưu để tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28oC Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của

nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông

sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21]

Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều phần lớn

C opyri

ght @ Sc hool

sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng

1.1.4 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm

AFB1 được chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin 8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan Sự epoxide hóa AFB1 là một bước nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thư Aflatoxin exo-8,9-epoxide là một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine Aflatoxin-N7-guanine methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thư [13,19]

exo-Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng chức năng của acid nucleic và protein Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn

ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và dịch mã [12]

AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm

giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu AFB1 ức chế phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6PGlucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12]

C opyri

ght @ Sc hool

Aflatoxin-8,9-xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lượng dưới dạng ATP của ty thể

và gây tăng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [12,13]

1.1.5 Độc tính của aflatoxin lên cơ thể người

Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở người phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13]

Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thương gan cấp với biểu hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn

hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng, thậm chí có thể gây tử vong

Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lượng trung bình đến lượng lớn aflatoxin [12,14]

Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lượng thấp đến trung bình aflatoxin, thường không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra Sau thời gian phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột

biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung thư trong đó HCC (ung thư biểu mô tế bào gan) là loại ung thư thường gặp do AFB1 [12,14]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thư gan IARC phân loại AFB1 là tác nhân gây HCC nhóm I [23] Cơ chế HCC do AFB1 được chứng minh là do đột biến gen p53 – gen ức chế khối u Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh nhân HCC [14] Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1

và virus HBV hoặc HCV [27] Ở những cá thể có HbsAg dương tính, aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những người không nhiễm virus

C opyri

ght @ Sc hool

AFB1 còn được báo cáo có liên quan đến hội chứng giống như hội

chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng như ho, sốt, thay đổi trương lực

cơ, nôn Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ

nội tạng, thoái hóa thần kinh Khi gan bị tổn thương do AFB1 dẫn đến amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không được giải độc

khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội

Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dược

liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều người có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể được

giảm tới mức tối thiểu nhờ các phương pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin trong sản phẩm và dược liệu

1.1.6 Những nghiên cứu về phương pháp định lượng aflatoxin trong

dược liệu

+ Tốc độ dòng: 1mL/phút + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

aflatoxin B1, B2, G1, G2 trên nến mẫu

Rhammus purshiana

[26]

2 LC-FLD

Phương pháp chiết lạnh + chiết pha rắn để làm

giàu

methanol : nước (70:30, v/v), methanol:

nước (80:20, v/v) và methanol : nitric acid1%

+ Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18 column (250 × 4.6 mm i.d.) + Pha động: methanol:nước (52:48, v/v) với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L acid nitric 65%

+ Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút + Detector phát hiện: máy dò huỳnh quang FP-1520, bước sóng kích thích và

aflatoxin B1, B2, G1, G2 trên các nền

l ạnh + chiết pha rắn để làm

giàu

methanol : nước (85:15, v/v)

+ Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS Column (5µm, 4.6 x 250 mm) + Pha động: dung dịch khử ion hon hợp nước-acetonitrile-methanol (60:20:20, v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and

120 mg KBr

+ Tốc độ dòng: 1 mL/phút + Detector phát hiện: máy dò huỳnh quang Shimadzu LC-10 AD Model, bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 360 và 435nm

AFB1 trong thuốc

từ thảo dược và dược liệu

[24]

II Các nghiên cứu trong nước

Phương pháp chiết

l ạnh + chiết pha rắn để làm

methanol : nước (85:15, v/v)

+ Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x 50mm, 5ϻm)

+ Pha động: kênh A: nước; kênh B:

methanol; chạy chế độ Gradient

+ Tốc độ dòng: 0,2ml/phút

Các loại aflatoxin trong dược liệu [2]

Phương pháp chiết lạnh + chiết pha

r ắn để làm giàu

methanol : nước (6:4, v/v)

+ Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH (2,1x100 mm, 1,7ϻm)

+ Pha động: kênh A: amoni acetat 10mM; kênh B: methanol; chạy chế độ Gradient

+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút + Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

aflatoxin B1 trong dược liệu [7]

C opyri

ght @ Sc hool

Từ những nghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nước và trên

thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dược liệu khác nhau Tuy nhiên, trong nước

hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chưa được cao Vì vậy,

nhằm đưa ra được phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu với hiệu

suất thu hồi cao và phương pháp đơn giản, cũng như tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lượng

aflatoxin trong một số dược liệu

C opyri

ght @ Sc hool

Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuốc thử liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp Lưu giữ

chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong

cơ thể sống như: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone – receptor [1]

Để thực hiện sắc ký ái lực người ta cố định một thành phần của cặp

tích có thành phần thứ hai được đưa vào cột nhờ một pha động có pH xác

định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải

Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có

hai thành phần của cặp tương tác đặc hiệu và liên kết với nhau Nhờ một dung

ái lực đi ra khỏi cột Phát hiện và định lượng bằng một detector thích hợp [1]

- Ph ối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích,

quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực Phối tử ái lực có thể có nguồn

gốc sinh học (kháng thể, protein ) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức càng cua kim loại )

- Ch ất mang: là những chất rắn được dùng để cố định phối lực ái tử

trong cột sắc ký Một số chất mang thường dùng trong sắc ký ái lực là agarose

và agarose liên kết, cellulose, silica

b) S ắc ký ái lực miễn dịch

Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái lực là kháng thể hoặc kháng nguyên Do tính đặc hiệu cao của tương tác kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ

C opyri

ght @ Sc hool

- Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích

- Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn

Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng được một lần (kháng thể bị biến tính) [25]

1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các

chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy

phụ thuộc vào các yếu tố đó Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1]

 Pha tĩnh

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường

là các hạt hình cầu có đường kính 1,5–10 ϻm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- S ắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl

ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 )

- S ắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch

cacbon dài C18, C8 )

 Pha động

C opyri

ght @ Sc hool

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các

chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl ether , ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril

Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]:

- Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá

trình chạy sắc ký

- Gradient: tỷ lệ các thành phần dung môi pha động thay đổi trong quá

trình chạy sắc ký Chế độ này phù hợp với mẫu phân tích nhiều thành phần

với khả năng phân cực khác nhau, tăng khả năng rửa giải, rút ngắn thời gian phân tích

b) Kh ối phổ (MS)

 Nguyên tắc:

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6

Pa

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic)

có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất [1]

Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu:

C opyri

ght @ Sc hool

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ

- B ộ nạp mẫu: là bộ phận đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng

hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp Bộ nạp mẫu có thể phân thành hai nhóm chính là nhóm nạp mẫu trực tiếp và nhóm nạp mẫu gián tiếp Trong nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bọ phân tích khác được kết nối với khối phổ như sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS), điện di mao quản (CE/MS)

- B ộ nguồn ion: trong máy khối phổ, có nhiều cách để ion hóa phân tử

và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Một số kỹ thuật thường dùng như ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện, ion hóa bằng giải hấp Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng tia điện ESI

Kỹ thuật này tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch Dung dịch ở trong một mao quản kim loại (tốc độ dòng dao động từ 1mL đến 10mL/phút)

Người ta đặt một điện trường giữa đầu mao quản và một điện cực, các giọt

mịn hạt sương mang điện tích được tạo thành và gia tốc đến điện cực Kỹ thuật ESI thích hợp để ion hóa các chất phân cực và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng phân tử lớn (M ≤ 100000)

không

C opyri

ght @ Sc hool

- B ộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau

thành từng phần riêng biệt Tính năng của máy khối phổ chủ yếu phụ thuộc vào bộ phân tích khối

Có 4 loại bộ phân tích khối chính thường được sử dụng:

1 Bộ phân tích từ

2 Bộ phân tích tứ cực

3 Bộ phân tích thời gian bay

4 Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron

Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ đề cập đến bộ phân tích

khối tử cực chập ba Bộ phân tích khối tử cực chập ba gồm ba bộ tứ cực nối

tiếp nhau Mỗi bộ gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau Có một khoảng không giữa 4 cực đó để các ion bay qua

- Detector: là bộ phận có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín

hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Có 2 dạng detector truyền thống: nhân electron và nhân quang

c) S ắc ký lỏng – khối phổ

C opyri

ght @ Sc hool

Sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật sắc ký lỏng có đầu ra kết nối với

khối phổ Bộ nguồn ion hóa bằng phun sương khử solvat cho phép chuyền

chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi để ion hóa Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ được ứng dụng nhiều trong phân tích các chất độc và xác định

nồng độ thuốc trong cơ thể do có nhiều ưu điểm như [1]:

- Cho thông tin về cấu trúc chất phân tích

- Tính chọn lọc cao

- Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14 gam nên kỹ thuật này thường được dùng để phân tích hàm lượng siêu vết

- Có thể phân tích các chất dựa vào tỷ lệ m/z của ion phân tử và ion sản phẩm

mà không cần tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu có nhiều thành phần

C opyri

ght @ Sc hool

Chuẩn Aflatoxin (Supelco, USA): AFB1 (Lot: LB04859); AFB2 (Lot:

LB04871); AFG1 ( Lot: LB02201); AFG2 (Lot: LB04861) dạng lỏng có nồng

độ 1 ppm

2.2.2 Hóa chất

- Các dung môi dùng cho LCMS: methanol, acetonitril của hãng Merck

C opyri

ght @ Sc hool

- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua

của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích P.A

- Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorid (Merck, Đức)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hóa

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS 8045 của Shimadzu

- Cột sắc ký Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) của Shimadzu

- Máy lắc ngang HS 260 (IKA, Đức)

- Cột chiết pha rắn Aflatest chứa kháng thể đơn dòng (VICAM, Mỹ)

- Bộ dụng cụ chiết pha rắn Visiprep TM 24 (Supelco, Mỹ)

- Cân phân tích Mettle Toledo có độ chính xác 0,1mg (Mettle Toledo, Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g (Precisa Gravimetry,

- Thu thập mẫu Cát căn, Trạch tả, hạt Sen để tiến hành nghiên cứu

- Thái mẫu, sấy mẫu dược liệu ở nhiệt độ 50oC đến khi độ ẩm đạt khoảng 5%

- Bảo quản trong túi kín cho tới khi đưa vào nghiên cứu chiết xuất

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu

Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích:

C opyri

ght @ Sc hool

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ (MS)

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu được hàm lượng aflatoxin là lớn nhất

- Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC

2.3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội

Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử

- Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2018 – 20/04/2019

- Địa điểm lấy mẫu: chợ Ninh Hiệp, phố Lãn Ông

- Khối lượng mẫu: 0,5 kg/mẫu

- Dược liệu được xay nhỏ, đựng trong túi nilon

- Bảo quản ở nơi thoáng mát

2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ (MS): Lựa chọn ion mẹ, ion con, các

thế Q1, Q2, Q3 thích hợp để thu được tín hiệu phân tích cao nhất

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Thành phần pha động, chương trình gradient

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu được hàm lượng aflatoxin là lớn nhất: Khảo sát thành phần dung môi chiết, dung môi loại tạp

2.4.3 Quy trình thẩm định phương pháp

2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc

- Khái niệm

C opyri

ght @ Sc hool

Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp

chất khác như: các tiền chất, các chất chuyển hóa, tạp chất

Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình

- Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ

Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất

tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định

cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phương

pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ)

- Khái niệm

được phát hiện với mức tin cậy xác định

mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả

có độ chính xác mong muốn

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

C opyri

ght @ Sc hool

ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại

lượng đo được và nồng độ các chất phân tích

- Xác định:

Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc

của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

( ) ⃐

√∑ ( ̅)

Trong đó:

- xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i

- ̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

- N: Số lần thử nghiệm

Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các

giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp

nhận là đúng

C opyri

ght @ Sc hool

Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được

so với giá trị lý thuyết

( ) Trong đó:

- R: độ thu hồi (%)

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết

bị (phần mềm LCSolution) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel

C opyri

ght @ Sc hool

khối, dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng

độ mỗi chất 100 ppb được tiến hành tiêm vào hệ thống khối phổ với các điều

- Điều kiện khối phổ:

+ Nebulizing Gas Flow: 3 L/ phút

+ Heating Gas Flow: 10 L/ phút

+ Interface Temperature: 300 oC

+ DL Temperature: 250oC

+ Heat block Temperature: 400oC

+ Drying Gas Flow: 10 L/ phút

+ Interface Voltage: -5kV đối với ESI-positive

Kết quả thu được khi quan sát ở chế độ ESI-positive, thấy có mảnh ion

mẹ [M+H]+ của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có giá trị m/z tương ứng là 313,20; 315,20; 329,15 và 331,15 Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu

đã được công bố trước đây