Khóa luận ứng dụng mô tả phân tử ISIDA trong thiết kế các hợp chất ức chế enzyme histone deacetylase 2 trong điều trị ung thư

29 Hình 3.2: Các mảnh cấu trúc quan trọng được lựa chọn trong mô hình M1, M2 và M3 phản ánh mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học ức chế enzyme HDAC2 ..... Nhờ nh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Hà Nội – 2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1 TS LÊ THỊ THU HƯỜNG

2 TS PHẠM THẾ HẢI

Hà Nội – 2018

Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền -

khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tình trực tiếp chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại học

Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn

bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn

Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện còn hạn hẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, Ngày 25 tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Đoàn Việt Nga

HDAC Histone deacetylase HDAC2 Histone deacetylase 2

MLR Phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến

Q2LOO Hệ số xác định cho tập kiểm tra QSAR Tương quan định lượng giữa cấu trúc – tác

dụng RMSE Sai số toàn phương SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid

@

and

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình1.1: Quá trình acetyl hóa histone / deacetyl hóa được điều chỉnh bởi các

enzyme HAT và HDAC 5

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 5

Hình 1.3: Mối liên quan của các dạng HDAC khác nhau tới quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào 9

Hình 1.4: Cấu trúc một số dãy acid hydroxamic được tổng hợp 13

ở Việt Nam 13

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid hydroxamic 20

thu thập được 20

Hình 2.2: Các bước xây dựng mô hình QSAR và ứng dụng mô hình trong thiết kế và dự đoán 22

Hình 2.3: Cơ chế đếm mảnh cấu trúc trong mô tả phân tử ISIDA 23

Hình 2.4: Biểu di n công thức N- 5-hydroxypyridin-2-yl acetamide theo chương trình tô màu và gắn nhãn 24

Hình 2.5: Hai loại mảnh cấu trúc theo chuỗi và nhánh với các phân loại: nguyên tử và liên kết, chỉ nguyên tử, chỉ liên kết 25

Hình 3.1: Các mảnh cấu trúc sử dụng trong mô hình QSAR 29

Hình 3.2: Các mảnh cấu trúc quan trọng được lựa chọn trong mô hình M1, M2 và M3 phản ánh mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học ức chế enzyme HDAC2 34

@

and

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng 11

Bảng 2.1: Giá trị IC50thực nghiệm của 45 hợp chất trong CSDL 21

Bảng 3.1: Các thông số đánh giá chéo và độ thích hợp của các mô hình tuyến tính trên tập TS 31

Bảng 3.2: Tính toán khả năng dự đoán của mô hình tuyến tính trên tập PS 32

Bảng 3.3: Cấu trúc và giá trị dự đoán IC50 của các hợp chất mới thiết kế 36

Bảng 3.4: Dẫn xuất của khung 4a 37

@

and

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư 3

1.1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới 3

1.1.2 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam 3

1.2 Tổng quan HDAC 4

1.2.1 Khái niệm histon deacetylase 4

1.2.2 Phân loại các histon deacetylase 6

1.2.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC2 7

1.3 Các chất ức chế histon deacetylase 10

1.3.1 Trên thế giới 10

1.3.2 Tại Việt Nam 11

1.3.3 Cấu trúc các chất ức chế HDAC 13

1.3.4 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 14

1.4 Mô hình tương quan định lượng tính chất – tác dụng (QSAR) 15

1.4.1 Lịch sử QSAR 15

1.4.2 Đại cương về QSAR 15

1.4.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Cơ sở dữ liệu (CSDL) 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp thiết kế và dự đoán hợp chất thiết kế mới bằng mô hình QSAR từ mảnh cấu trúc 21

2.2.2 Tính toán tham số phân tử 23

2.2.3 Thi ết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra 25

2.2.4 Xây dựng mô hình 26

2.2.5 Đánh giá mô hình 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả 27

3.1.1 Các mô hình QSAR thu được 27

3.1.2 Đánh giá mô hình 30

@

and

3.2 Bàn luận 37

3.2.1 Về phương pháp tính toán tham số phân tử 37

3.2.2 Về mô hình QSAR 37

3.2.3 Về thiết kế hợp chất mới 38

3.2.4 Kết quả dự đoán khả năng ức chế HDAC2 của các hợp chất acid hydroxamic mới 38

C HƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

2 vì tỉ lệ mắc ung thư [27]

Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới chống lại ung thư luôn là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học, trong đó có Việt Nam Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc nói chung và các thuốc điều trị ung thư nói riêng hiện nay vẫn chủ yếu dựa trên các phương pháp thực nghiệm thử-lỗi với nhược điểm là tốn thời gian, tiền bạc và cho hiệu quả thấp [30]

Ngoài ra, các thuốc điều trị ung thư hiện đang còn nhiều hạn chế Do đó yêu cầu cấp bách đặt ra là phải nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọc trên đích phân tử nhằm phát huy tối đa hiệu quả, ít độc hơn

Nhờ những tiến bộ trong di truyền học và sinh học phân tử, Histon deacetylase (HDAC) được chỉ ra là một trong những đích tác dụng phân tử cho điều trị ung thư, trong đó HDAC2 thuộc nhóm I được đánh giá là một đích phân tử quan trọng do có biểu hiện quá mức trong quá trình deacetyl hoá các histon xảy ra ở hầu hết các dòng tế bào ung thư người [14, 66] Vì vậy, các chất ức chế HDAC2 đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng [6, 8, 43]

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu xác định, phát hiện và thử hoạt tính của hợp chất ức chế HDAC2 có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp hóa học [3-5] Trong các nhóm chất ức chế HDAC2, các acid hydroxamic là nhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất vì có cấu trúc đơn giản, có khả năng tổng hợp với điều kiện của Việt Nam Acid hydroxamic có nhóm –NHOH tạo được phức bền với Zn2+ ở trung tâm hoạt động của HDAC2 mang lại hoạt tính ức chế enzyme mạnh Để vừa tiết kiệm thời gian công sức cũng như tính đặc hiệu, nghiên cứu đã lựa chọn thực hiện theo phương pháp thiết kế thuốc hợp lý dựa trên khung cấu trúc acid hydroxamic

Trong những năm gần đây, nghiên cứu sàng lọc hợp chất ức chế HDAC2

dựa trên các phương pháp trợ giúp bởi máy tính, hay còn gọi là phương pháp in

silico đã trở thành một hướng đi mới, đầy tiềm năng [48] Các mô hình in silico là

Fragment based drug discovery bắt đầu với tập hợp các phân tử cấu trúc nhỏ dựa trên cấu tạo của đích và đồng thời các mảnh cấu trúc này sẽ được ứng dụng trong thiết kế hợp chất mới Một trong số các FBDD sử dụng phổ biến hiện nay là mô tả

phân tử thiết kế và phân tích dữ liệu in silico (ISIDA-In Silico design and Data

Analysis Với mô tả phân tử ISIDA, quá trình thiết kế thuốc mới trong điều trị ung thư sẽ được tối ưu hóa do ứng dụng linh hoạt mô tả trong sàng lọc, dự đoán và thiết

kế hợp chất mới

Từ các vấn đề nêu trên, mục tiêu chung của nghiên cứu này là “Ứng dụng

mô tả phân tử ISIDA trong thiết kế các hợp chất ức chế enzyme histone deacetylase 2 trong điều trị ung thư” Với mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng được các mô hình toán học QSAR sử dụng mô tả phân tử ISIDA định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính ức chế HDAC2

- Đánh giá mô hình QSAR theo các thông số thống kê

- Ứng dụng mô hình xây dựng được trong sàng lọc, dự đoán và thiết kế hợp chất mới

1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thƣ và tử vong do ung thƣ

1.1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới

Ung thư đang là một trong những căn bệnh dẫn đến tử vong hàng đầu trên toàn thế giới Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới-WHO, trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư Trong số đó, các ca tử vong do các ung thư chủ yếu là:

ung thư phổi 1,59 triệu ca , ung thư gan 745000 ca , ung thư dạ dày 723000 ca , ung thư đại trực tràng 694000 ca , ung thư vú 521000 ca , ung thư thực quản (400000 ca) [33]

Dự kiến, số lượng các ca ung thư mới sẽ có khả năng tăng khoảng 70% trong vòng hai thập kỉ tới, số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14 triệu trong 2012 lên 22 triệu trong vòng hai thập kỉ tới Hơn 60% số các ca ung thư mới hàng năm trên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và Nam Mỹ, chiếm 70% số các ca

tử vong ung thư thế giới [33]

5 yếu tố nguy cơ hàng đầu về hành vi và chế độ ăn uống có liên quan đến 30% trường hợp tử vong do ung thư đó là: chỉ số khối cơ thể cao béo phì , ăn

ít rau quả tươi, ít tập thể dục, nghiện thuốc lá hoặc rượu Ngoài ra, các bệnh nhi m virus HBV, HCV và một số type Human Papilloma Virus HPV là nguyên nhân của trên 20% số các ca tử vong ung thư ở các nước thu nhập thấp

và thu nhập trung bình [38]

1.1.2 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam

Vào năm 2012, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở Việt Nam trên nam giới

là gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dạ dày 9.406 ca, đại trực tràng 4.561 ca và mũi họng 3.301 ca; các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: vú 11.067 ca, phổi 5.783 ca, gan 5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca và dạ dày 4.797 ca [64] Tổng số ca tử vong do ung thư là 91.600 ca, trong đó: số nam giới tử vong do ung thư là 58.200 ca: ung thư gan chiếm 26,9%, phổi 24,4%, dạ dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trực tràng 5,2% và do ung thư khác là 23,2%; số nữ giới tử vong do ung thư là 33.400 ca: ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, vú 12,5%, dạ dày 12,1%, đại trực tràng 8% và do ung thư khác là 39,3% [64]

Nhi m sắc thể được cấu thành bởi: ADN, protein histon và protein không phải histon [29] Đơn vị cơ bản của nhi m sắc thể là nucleosom Mỗi nucleosom gồm 146 cặp base ADN được gói trong một protein histon octame [34] tạo bởi 4 thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [15]

Vào năm 1964, Allfrey VG, Faulkner R, Mirsky AE [7] đã khám phá ra quá trình acetyl hóa thuận nghịch của protein histone và ý nghĩa của biến đổi sau phiên

mã này với điều hòa biểu hiện gen Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng các đầu amino của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình methyl hóa, phosphoryl hóa hoặc acetyl hóa sau dịch mã Quá trình acetyl hoá là một trong những cơ chế điều hoà chính của biểu thị gen, là chìa khóa làm thay đổi cấu trúc nhi m sắc thể và biến đổi sau phiên mã Deacetyl hóa histone là quá trình ngược lại của acetyl hóa, làm tăng tương tác ion giữa histon tích điện dương và ADN tích điện âm, giúp đóng xoắn bằng cách cho cấu trúc chromatin nhỏ gọn hơn và ngăn chặn sự sao chép gen

vì đã làm hạn chế khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã Ngoài ra, acetyl hóa histone còn liên kết với các chức năng bộ gen khác như lắp ráp chromatin, sửa chữa DNA và tái tổ hợp Kiểm soát quá trình biểu thị gen này phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hoạt động của enzym histon acetylase và enzym histon deacetylase, nhờ vào sự điều hoà quá trình acetyl hoá lysin ở phần đuôi histon [10] Ngoài ra, quá trình acetyl hóa cũng liên quan đến rất nhiều protein không histone non-histone proteins) với bản chất có vai trò như một chất nền đóng vai trò quan trọng trong việc quy định sự biểu hiện gen cũng như các protein khác trong các con đường điều tiết sự tăng sinh tế bào, di chuyển tế bào, chu trình chết của tế bào và tạo mạch Histon acetyltransferase (HAT) là enzym acetyl hóa nhóm -NH2 trong gốc lysin đầu N tận của histon, làm trung hòa điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng tương tác của histon với ADN tích điện âm tạo cấu trúc mở chromatin Vì vậy, sự acetyl hóa histon tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch mã xảy ra hình 1.1b [10, 28]

Histon deacetylase HDAC là enzym có tác dụng đối lập với HAT HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ acetyl lysin Ac-Lys ở đầu N tận của histon, làm đóng xoắn chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã Hình 1.1

Hình1.1: Quá trình acetyl hóa histone / deace tyl hóa đƣợc điều chỉnh bởi các

enzyme HAT và HDAC (Ngu ồn: www.quora.com)

Trung tâm hoạt động HDAC gồm 2 phần chính Hình 1.2 : ion Zn2+

là coenzyme của HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống Cấu trúc rất linh động, có thể biến đổi phù hợp với chiều dài cơ chất khác nhau Trên miệng túi có một vành nhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC [40, 61]

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC

Tính đến nay, các nhà khoa học đã chỉ ra 18 loại HDAC khác nhau, được chia thành 4 nhóm (I-IV trong đó các HDAC phụ thuộc vào Zn2+ thuộc nhóm I, II

và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” và thường được sử dụng để sàng lọc và thiết kế các chất ức chế HDAC mới [36, 40, 46, 67]

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 Các enzym này có ở phần nhân của nhiều loại tế bào Các HDACs nhóm I có kích thước nhỏ, thường biểu hiện ở khắp mọi nơi trong các mô khác nhau của trên người và thường đóng một vai trò chính trong sự tồn tại của tế bào, sự sinh trưởng phát triển và sự khác biệt

Nhóm II gồm nhóm IIa và nhóm IIb Trong đó nhóm IIa có HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10 Các enzym này biểu thị mô đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân

Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 SIRT : SIRT 1 – 7, chúng có ở bào tương, ty thể và nhân

Nhóm IV: HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào

Các enzym nhóm I, II và IV phụ thuộc vào Zn2+

Nhóm III là các enzym có cấu trúc phụ thuộc NAD [54, 67] Nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8) có cấu trúc tương

đồng với Rdp3 ở tế bào nấm men S.cerevisiae, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ

hoạt động khi nằm trong phức hợp protein HDAC nhóm I có ở nấm men, động vật có vú và thực vật Ở động vật có vú, các HDAC này được chia thành 2 phân nhóm là HDAC1/2 và HDAC3

- HDAC1 và 2 có cấu trúc khá tương đồng 82% Vùng xúc tác nằm ở đầu

N tạo nên phần chính của protein Các cofactor là cần thiết cho hoạt động của HDAC HDAC1, 2 hoạt động khi nằm trong phức hợp như phức hợp SIN 3, NuRD/NRD/Mi2 và CoREST Phosphoryl hóa serin trên HDAC1, 2 điều hòa hoạt động của chúng và tạo nên phức hợp với các cofactor khác [24, 53]

- HDAC3 được tìm thấy trong phức hợp với N-coR (nuclear receptor

copressor và phức hợp với SMRT Khoảng 68% vùng các acid amin của HDAC3 cần thiết cho cả hoạt tính deacetyl hóa và ức chế phiên mã [53]

- HDAC8 không được xếp vào phân nhóm nào vì nó chủ yếu có ở động vật

có xương sống Hoạt động của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase A [53, 57]

Nhóm II gồm HDAC 4,5,7,9 nhóm IIa và HDAC6,10 nhóm IIb tương đồng với HDAC1 trong tế bào nấm men HDAC nhóm II có kích thước phân tử

phiên mã Nhóm này chứa tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di chuyển

từ nhân ra bào tương và ngược lại [31]

Nhóm III gồm SIRT1-7 tương tự Sir2 ở tế bào nấm men HDAC nhóm III này không liên quan đến các nhóm khác, chúng có ở trong nhân SIRT 1,6,7 , bào tương SIRT2 hoặc ty thể SIRT 3,4,5 Nhóm HDAC III ít được nghiên cứu ở

người, nhưng được xác định có cơ chế hoạt động phụ thuộc cofactor NAD+ [53].`

Nhóm IV gồm HDAC11 chỉ có ở người Nghiên cứu hệ thống loài thấy rằng HDAC11 liên quan gần hơn với HDAC3,8 nên có thể giả định HDAC11 liên quan mật thiết với HDAC nhóm I hơn là nhóm II HDAC11 có vùng xúc tác ở đầu N và có thể bị ức chế bởi trapoxin dẫn chất của TSA HDAC11 chưa được tìm thấy trong các phức hợp HDAC đã biết để có thể xác định chức năng sinh học [31, 53]

HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [50, 65]

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự biểu hiện gen, kiểm soát bởi thay đổi biểu sinh là rất quan trọng đối với sự khởi đầu và tiến triển của rất nhiều bệnh trong đó có ung thư Thay đổi biểu sinh làm thay đổi biểu hiện gen mà cấu trúc DNA không thay đổi, do đó, dẫn đến bệnh tật - trái ngược với đột biến DNA – vì thế có tiềm năng đảo ngược bởi các enzyme nhắm mục tiêu chịu trách nhiệm

dược lý trong sửa đổi di truyền ngoại sinh HDACs có mặt trong hầu hết các mô

và cho thấy biểu hiện quá mức hoạt động của enzyme, tăng mạnh phản ứng deacetyl hóa đuôi histon và cấu trúc sợi nhi m sắc Sự có mặt quá nhiều, chức năng và tăng sinh các HDAC nhóm I và II có liên quan tới khối u ác tính bao gồm ung thư biểu mô tế bào T [11] cũng như sự tăng biểu hiện của nhóm I HDAC1, HDAC2 và HDAC3 được xác định là yếu tố cần thiết cho sự gia tăng và phát triển của tế bào ung thư thông qua các bằng chứng thực nghiệm, tiền lâm sàng và lâm sàng về các ảnh hưởng sinh học liên quan đến sự thay đổi trong hoạt động của HDAC Ngoài ra, HDAC nhóm I có mặt trong các khối u ác tính và huyết học có

xu hướng tương quan với tiên lượng xấu hơn, với biểu hiện tăng cao HDAC2 [63]

Ngược lại, sự biểu hiện các HDAC nhóm II 4,5, 6, 7 và 10 có xu hướng liên quan đến tiên lượng tốt hơn như tế bào ung thư phổi Đó là lý do mà mối tương quan giữa HDAC và ung thư chưa thật rõ ràng, tuy nhiên lựa chọn ức chế HDAC nhóm

Phức hợp chứa HDAC2 cũng liên quan đến gen điều chỉnh phiên mã qua thụ thể trung gian Những phức hợp chứa gen biến đổi biểu sinh khác, chẳng hạn như MeCp2 – là một protein có nhóm liên kết methyl Các enzyme vận chuyển nhóm methyl DNA DNMT1, DNMT3A và DNMT3B, sự methyl transferases histone SUVAR39H1 và G9a và histon bị bỏ đi nhóm methyl LSD1 , cho thấy một cách khác mà HDAC2 quy định biểu hiện gen và sửa chữa nhi m sắc [39]

HDAC2 cũng quy định biểu hiện gen thông qua sự deacetyl của yếu tố phiên mã cụ thể bao gồm STAT3 và SMAD7 HDAC2 là một chìa khóa quan trọng của gen điều hòa chu kỳ tế bào, quá trình tế bào tự tiêu diệt, kết dính tế bào

và di cư Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã của các gen liên quan đến quá trình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mô, phát triển tim và tế bào thần kinh [55]

Các đột biến có thể có ở HDAC2 xuất hiện ở tế bào soma HDAC2 bị đột biến trong các khối u lẻ tẻ và trong các khối u phát sinh ở người có ung thư biểu

mô đại trực tràng không polyp di truyền Đột biến này do sự cắt bỏ 9 adenin ở exon tạo thành protein không hoạt động Sự biểu hiện các dạng đột biến của HDAC2 gây ra sự kháng với tác dụng của các chất ức chế HDAC Việc thiếu các biểu hiện và chức năng HDAC2 tạo nên sự tăng điều chỉnh gen thúc đẩy tăng trưởng khối u [25, 42] HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau:

tế bào nhỏ và ung thư biểu mô tế bào gan HDAC2 biểu hiên quá mức liên quan đến ung thư một phần thông qua việc chọn lọc sai lầm của nó và sự im lặng của các gen ức chế khối u Sự ức chế của gen p21WAF1 ức chế khối u ở vùng khởi động và có thể được đảo ngược bởi việc điều trị bằng thuốc ức chế HDAC [52]

Biểu hiện HDAC2 tương quan với tiên lượng xấu khi bệnh ở giai đoạn tiên triển trong ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, dạ dày và biểu mô tế bào gan

Ung thư đại tràng: Các nghiên cứu cho thấy trong loại khối u này sự phiên

mã HDAC2 được điều chỉnh bởi tín hiệu beta-catenin-TCF-myc đã bị xóa bỏ trong bệnh ung thư đại tràng HDAC2 biểu hiện quá mức tương quan với tiên lượng xấu và bệnh ở giai đoạn tiến triển trong ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, Ropero và các cộng sự tìm thấy một sự đột biến bất hoạt của HDAC2 trong ung

Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu của Weichert và các cộng sự thấy rằng HDAC2 được biểu hiện mạnh mẽ trong hơn 70% các trường hợp phân tích ung thư tuyến tiền liệt Sự gia tăng trong biểu hiện HDAC2 có liên quan với tăng cường tăng sinh tế bào khối u

Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào và sự phân chia của HDAC2 gây ra ngừng chuyển pha G1/S trong chu kỳ tế bào Trong quá trình chuyển đổi G1/S,sự phân chia đích của HDAC2 có tính chọn lọc gây ra các biểu hiện của p16 INK4a và p21 WAF1/Cip1 , và đồng thời ức chế sự biểu hiện của cyclin D1, CDK4 và CDK2 Do đó, sự ức chế HDAC2 dẫn đến sự giảm điều chỉnh của gen đích E2F/DP1 thông qua việc giảm sự phosphoryl hóa protein PRB [9]

Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính COPD : giảm hoạt động và biểu hiện HDAC2 được tìm thấy trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính COPD Việc giảm hoạt động của HDAC2 làm tăng điều hòa các gen liên quan đến phản ứng viêm và kháng corticosteroid trong COPD [9]

đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thư Cho đến nay, nhiều chất ức chế HDAC UHDAC đã được công bố và có thể chia thành các nhóm cấu trúc: acid hydroxamic, benzamides, acid béo mạch ngắn

và peptide vòng [16]

Trong các nhóm chất ức chế HDAC, các acid hydroxamic là nhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất bởi cấu trúc đơn giản, d tổng hợp và có nhóm -NHOH tạo được phức bền với Zn+2 ở trung tâm hoạt động của HDAC, đáp ứng được chức năng gắn kết với nhóm kẽm và giúp tăng hoạt tính ức chế enzym Hiện nay, FDA đã phê duyệt một acid hydroxamic UHDAC điển hình

là vorinostat suberoylanilide hydroxamic acid, Zolinza vào năm 2006 sử dụng

B ảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng

Acid carboxylic

Butyrat AN-9 tiền thuốc Acid valproic Phenyl butyrat

I, II

I, II

II Peptid vòng Depsipeptid (FK228) I, II

Tuy nhiên, mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như: các acid hydroxamic bị chuyển hoá nhanh, độ ổn định còn kém; các benzamide có thể là nguyên nhân dẫn đến tác dụng phụ của các thuốc an thần ; các peptid vòng khó tạo thành về mặt hoá học và FK-228 có phần gắn kết với ion Zn2+chứa thiol [37]

1.3.2 Tại Việt Nam

Một số nghiên cứu tìm kiếm hợp chất ức chế HDAC2 đã được thực hiện và công bố trên các tạp chí trong nước và quốc tế Tất cả các nghiên cứu trên đều được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Nguy n Hải Nam thuộc Đại học Dược

Cấu trúc các chất ức chế HDAC thường gồm 3 phần chính hình 1.5):

- Nhóm khóa hoạt động cap group hay nhóm nhận diện bề mặt SRG : là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề mặt amino acid Đã có nhiều nghiên cứu thay đổi vùng nhóm khóa hoạt động này trước đây như thêm nhóm thế halogen, vòng diazol, thiazol dựa trên sườn cấu trúc SAHA, Như đã được chứng minh thì vùng nhóm khóa hoạt động cần phải có sự xuất hiện các hydrocacbon thơm, có thể thêm các nhóm thế halogen, cacbonyl, methyl, triflourmethyl ceton hoặc liên kết không no để tăng mức độ ức chế

- Vùng cầu nối linker : thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết

Van der Waals với kênh enzym

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm Zinc binding group - ZBG): nhóm tạo chelat với kẽm trong vùng trung tâm hoạt động của HDAC2 do đó tăng mức độ tương tác

và khả năng ức chế enzyme Trong khung cấu trúc hydroxamic, –NHOH chịu trách nhiệm chính cho vai trò này

Hình 1.5: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC (a) và khung cấu trúc

acid hydroxamic đảm nhiệm vai trò nhóm kết thúc (b)

Như vậy, các phần trong cấu trúc của các chất ức chế HDAC đều tham gia vào quá trình hình thành liên kết với enzym và phát huy tác dụng Chúng tôi sẽ thiết

kế các hợp chất mới bằng cách thay đổi nhóm khóa hoạt động và vùng cầu nối, giữ

cố định nhóm kết thúc mang cấu trúc acid hydroxamic

1.3.4 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC đối với ung thư là do khả năng tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào, từ đó làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính Một trong những yếu tố được coi là then chốt, quyết định hoạt tính chống ung thư của các hợp chất này là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng mi n dịch và ức chế sự tạo mạch cũng là vai trò rất quan trọng của các UHDAC, gián tiếp ức chế sự phát triển của các khối u Ngoài ra các chất ức chế HDAC ngăn cản các đuôi histon

có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác

Với vai trò sinh học của HDAC và các nghiên cứu về các chất UHDAC cho thấy đấy là mục tiêu quan trọng cần hướng tới trong điều trị ung thư Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới có khung cấu trúc acid hydroxamic có tiềm năng ức chế HDAC2 là một hướng đi đúng đắn nhằm tìm kiếm các hợp chất mới với khả năng

ức chế cao hơn, ít độc tinh, cải thiện được sinh khả dụng của các nhà khoa học [2]

Vào năm 1868, Crum-Brown và Frasher đã nhận xét rằng tác dụng sinh học

là hàm số của cấu trúc hóa học và đây cũng chính là khởi nguồn của phương pháp xây dựng mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học

(QSAR- Quantitative Structure-Activity Relationships) Đến năm 1893, Richet đã cho rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất lí hóa

Đến năm 1935, phương trình Hammett được coi là mô hình đầu tiên biểu di n mối quan hệ hoạt tính và cấu trúc:

số hóa lí và hoạt tính sinh học, ví dụ:

Log (1/C) = k1+ k22+ k3

Trong đó: C là nộng độ mol mà tại đó hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh học,

: hằng số kỵ nước, : hằng số thế Hammett; k1, k2, k3 là các hệ số hồi quy

Kể từ đây, phương trình QSAR đã được xây dựng bằng những phương pháp,

kĩ thuật xây dựng đa dạng đã ra đời và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

1.4.2 Đại cương về QSAR

Về mặt toán học, mô hình QSAR biểu di n mối tương quan định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính thông qua phương trình:

Trong đó, Y là biến phụ thuộc, phản ánh hoạt tính sinh học của các hợp chất

Giá trị của Y được xác định thông qua các nghiên cứu thực nghiệm cho giá trị cụ

thể, ví dụ như nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzym (IC50), MIC (Minimum Inhibitory Concentration): nồng độ ức chế tối thiểu, hay nồng độ kìm khuẩn tối thiểu (dùng trong vi sinh); MBC (Minimum Bactericidal Concentration): nồng độ

diệt khuẩn tối thiểu; EC50 (Effective Concentration): nồng độ 50% tác dụng tối

đa Y cũng có thể nhận giá trị rời rạc, ví dụ như có hay không có hoạt tính, hoạt

tính mạnh hay yếu Các biến x trong mô hình QSAR được gọi là các tham số phân

dụng các thuật toán thống kê (statistical) hoặc học máy (machine learning) Một số

kỹ thuật thống kê thường được sử dụng trong xây dựng mô hình QSAR có thể kể đến như mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network); hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear Regression), phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis)

1.4.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR

Các bước để xây dựng mô hình QSAR [59] gồm:1) Xây dựng cơ sở dữ liệu (CSDL ; 2 Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc bằng sử dụng các phần mềm giúp biểu di n và tính toán; 3) Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử (TSPT) và các giá trị đại lượng biểu di n hoạt tính; 4) Đánh giá mô hình; 5 Giải thích các kết quả và sử dụng mô hình trong quá trình sàng lọc ảo nếu có thể

Xây dựng cơ sở dữ liệu: CSDL thường là cấu trúc của các hợp chất hoá học

đã được chứng minh hoạt tính sinh học in vitro Để hạn chế các yếu tố gây sai số

cho mô hình, CSDL thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương đồng về cấu trúc,

về protocol, Các giá trị sinh học được hiệu chỉnh, mang tính đại diện và có ý nghĩa thống kê

Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc: Đây là quá trình

chuyển đổi toán học và lôgic chuyển đổi thông tin cấu trúc hóa học mã hóa thành dạng số giúp máy tính có thể “hiểu” được

Thiết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra: CSDL được chia thành tập huấn

luyện TS-Training set chiếm 75%, được sử dụng để xây dựng mô hình và tập kiểm tra PS-Prediction set để đánh giá khả năng dự đoán của các mô hình đã xây

dựng được

Xây dựng mô hình QSAR: sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các TSPT và giá trị đại lượng biểu di n hoạt tính

Đánh giá mô hình: Đánh giá mô hình là giai đoạn quan trọng liên quan đến khả năng ứng dụng của mô hình Mô hình cần có độ khớp, độ ổn định thông qua đánh giá nội trên tập TS và khả năng dự đoán tốt thông qua đánh giá ngoại trên tập

PS dựa trên các thông số thống kê Để đánh giá mô hình QSAR, các kĩ thuật hay

, R2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mô hình với các giá trị

thực nghiệm càng tốt; r2> 0,8 thì mô hình mới có ý nghĩa Công thức tính hệ số xác định như sau:

Khả năng Fit của mô hình được xác định thông qua sai số toàn phương trung

bình (RMSE- root mean square errors) Giá trị RMSE cho biết độ sai lệch giữa giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán của mô hình:

√ ∑

Trong đó y và lần lượt là giá trị hoạt tính sinh học thực nghiệm và dự đoán của các hợp chất trên tập TS, ym làu trung bình hoạt tính thực nghiệm, n là số lượng phân tử hợp chất của tập TS đang kiểm tra

Một mô hình dự đoán tốt thì giá trị RMSE nên thấp hơn 0.5 [56]

MAE: sai số tuyệt đối MAE-root mean square errors được định nghĩa là sự

khác biệt lớn nhất của giá trị y thực tế so với y dự đoán [13]

| |

Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2

LOO, Q2LOOđược đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave one out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các biến đã lựa chọn và tính toán lại các thông số của mô hình Q2 càng gần 1, tính tổng quát hóa của mô hình càng cao, mô hình càng ổn định Thông thường, yêu cầu Q2

> 0,7 thì mô hình mới bền vững Công thức hệ số tương quan chéo tính như sau:

Q 2 = 1 -∑ y iy^i / i



Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của quan sát

thứ i; y^i / igiá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng mô hình đã

loại biến i; ylà giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc

Đánh giá ngoại: Để đánh giá ngoại mô hình đã xây dựng được tức là đánh

giá khả năng dự đoán chính xác của mô hình, do đó đầu tiên cần phải so sánh đó sai khác của giá trị hoạt tính quan sát thực tế và giá trị dự đoán trên tập PS thông qua giá trị sai số toàn phương trung bình RMSE

Tuy nhiên, khi dự đoán của các mô hình được tính toán trên nhiều đặc tính khác nhau biến đáp ứng cần phải được so sánh, RMSE bị một nhược điểm đó là giá trị của nó phụ thuộc vào số lượng các đặc tính được xem xét, do đó sự so sánh này không có ý nghĩa Chính vì lý do này, khả năng dự đoán ngoại được đánh giá thông qua giá trị Q2

F, Q2F càng lớn mô hình càng cho thấy độ tuyến tính của tập kiểm tra và do vậy chứng tỏ khả năng dự đoán của mô hình cao

2 1

∑ (y iy)

2 3

F

Q = 1 - ∑

^

y ∑ (y i y)

Trong đó nTR ; nEXTtương ứng là số các quan sát tập huấn luyện và kiểm tra;

yi,

^

y, lần lượt là giá trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i;

yEXT và yTR là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc trên tập PS và TS [62]

Ngoài ra, đánh giá mô hình cũng dựa trên một số các thông số thống kê có ý

nghĩa khác như hệ số phân phối Fisher, tính phù hợp của hệ số tương quan CCC-

concordance correlation coefficient),

Cuối cùng, mô hình MLR được đánh giá tương quan ngẫu nhiên tương phản bằng kiểm tra ngẫu nhiên Y với 2 hệ số r2

scr và q2scr Nếu đỉnh trục Y không vượt quá 0.3–0.4 đối với r2

scr và 0.05 đối với q2

scr thì mô hình tự do trong tương quan, các biến độc lập không ảnh hưởng lẫn nhau và ảnh hưởng đến kết quả dự đoán của mô ình Quá trình tính toán giá trị r2 2 được lặp lại 2000 lần

Giải thích đƣợc cơ chế (nếu có thể)

Mô hình cần được giải thích về vai trò của các biến trong mô hình, qua đó giúp định hướng thiết kế các hợp chất mới từ các mô tả phân tử đóng góp hoạt tính

có mặt trong mô hình