Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 Các phương pháp nghiên cứu protein/ enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme; Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp; Cải biến protein/ enzyme; Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!

• Số lượng bao nhiêu?

• Độ tinh sạch như thế nào?

 Đối tƣợng

• Thu nhận từ đối tượng nào?

• Đối tượng đó như thế nào?

• Có thỏa mãn được “mục đích” không?

 Xây dựng quy trình

• Cần những nhóm phương pháp?

• Các phương pháp có tính khả thi không?

• Nhóm phương pháp phù hợp nhất là gì?

 Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme

• Phá tế bào

• Loại bỏ tạp chất

• Phân tách protein/ enzyme

• Bảo quản protein/ enzyme

 Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp

• Tách dòng

• Biểu hiện và tinh sạch

 Cải biến protein/ enzyme

 Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng

Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme

Protein nội bào Protein ngoại bào

Định tính và định lượng

Phá vỡ tế bào Loại bỏ tạp chất

Tinh sạch

Protein ngoại bào (Extracellular proteins)

Những protein được tổng hợp trong tế bào sau đó tiết ra ngoài môi

trường ngoại bào để thực hiện các chức năng sinh học của tế bào và

cơ thể:

• Protein tham gia truyền tín hiệu ngoại bào: hormone, cytokine,

chemokine

• Các enzyme tiêu hóa: trypsin, pepsin

• Protease ngoại bào: Cathesin

• Kháng thể dịch thể

Trypsin (EC3.4.21.4) và Chymotrypsine (EC3.4.21.1)

• Trypsin thuộc nhóm serine protease, nó thường cắt các chuỗi peptide tại vị trí

cacboxyl của lysine hoặc arginine (ngoại trừ trường hợp sau amino acid này là

proline)

• Chymotrypsin thường cắt các liên kết peptide tại vị trí cacboxyl của một số

amino acid kị nước có kích thước lớn như tyrosine, triptophan, phenylalanine

Pepsin (EC3.4.23.1)

• Pepsin thuộc nhóm aspartate protease, sinh ra ở trong dạ dày Cùng với

Trypsin và Chymotrypsin là 03 enzyme thuộc nhóm phân giải protein được tìm

thấy dưới dạng tinh thể trong hệ tiêu hóa

• Pepsin thường cắt hiệu quả đối với các liên kết peptide tạo ra giữa Amino acid

kị nước và Amino acid thơm như tyrosine, triptophan, phenylalanine

• Thu dịch nuôi cấy: Ly tâm  loại bỏ tế bào  Dịch enzyme

ngoại bào

• Nghiền đồng thể

• Siêu âm

• Dùng áp suất

• Nghiền với cát, hạt thủy tinh

• Vortex mạnh với các hạt thủy tinh

• Xử lý bằng enzyme: lysozyme

• Sử dụng: chất hoạt động bề mặt (SDS)

Phá vỡ tế bào : Tùy thuộc vào tính chất của mỗi loại tế

bào mà sử dụng phương pháp phù hợp

Các chất hoạt động bề mặt

• Ionic (cation hoặc anion): SDS, LiDS

Protein  các subunit (gây biến tính)  xác định Mw

• Nonionic: Triton X-100, Tween 20  tách phức hợp

protein (ít gây biến tính) (có khả năng kết tủa)

• Zwiterionic: CHAPS  hạn chế protein-protein interaction

 ít gây biến tính protein

Thao tác với protein enzyme

• Ở nhiệt độ thấp 40C

• Giảm thiểu các bước trong quy trình tách chiết, tinh sạch

• Bảo quản trong các đệm chiết phù hợp và có mặt các

chất ức chế protease (PMSF, EDTA)

• Các chất thường dùng trong quá trình bảo quản

(albumin, glycerol, PEG)

Các thành phần thường gặp trong dung dịch đệm tách chiết protein:

• PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mM): Ức chế protease

• HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, 50 mM , pH

7.5): Là phân tử lưỡng điện hữu cơ, dùng để tạo dung dịch đệm, duy trì pH

• EDTA (5 mM): Ức chế protease

• EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, 5 mM): tạo phức với một số ion kim

loại như Ca2+, Mg2+ Thường sử dụng trong biểu hiện và tinh sạch protein

• Na 3 VO 4 (Sodium orthovanadate, 1 mM): Là chất ức chế tyrosine

phosphatases, alkaline phosphatases and ATPases

• NaF (25 mM): Là chất ức chế Ser/Thr and acidic phosphatases

• DTT (Dithiothreitol, C 4 H 10 O 2 S 2 , 2 mM): Cắt các liên kết disulfide trong phân

tử protein

• Glycerol (5%): Tạo môi trường ổn định cho protein

• Triton X-100 (1%): Liên kết các cấu trúc màng

• Chất ức chế protease khác

Đệm tách chiết protein (Protein extraction buffer)

Các chất ức chế protease (Protease inhibitors)

 Là các phân tử có khả năng úc chế hoạt động chức năng của protease,

trong tự nhiên các chất ức chế này thường là các phân tử protein

 Phân loại protease: theo loại protein mà nó ức chế hoặc theo cơ chế tác

động

 Protease Inhibitor Cocktails: Là hỗn hợp các chất ức chế đã được thương

mại hóa, mỗi sản phẩm sẽ ức chế một nhóm protease khác nhau

• Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF): Ức chế một số serine protease

bằng cách tạo phức không thuận nghịch với các enzym này Chất này khi tan

trong nước sẽ nhanh chóng bị phân giải, khi sử dụng nên hòa tan trong các

dung môi như ethanol, isopropanol, DMSO…

• Ethylenediaminetetraacetate (EDTA): Ức chế metalloprotease thông qua việc

tạo phức với một số ion kim loại như Ca2+, Fe3+

• Pepstatin A: ức chế aspatyl protease như pepsin, renin, cathepsin D,

chymosin Chất này không tan trong nước, chloroform, benzen nhưng tan trong

methanol, ethanol hoặc DMSO khi có mặt acetic acid

• Leupeptin (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal): Là chất ức chế được tìm

thấy trong tự nhiên ức chế cysteine, serine vàthreonine protease (papain,

Bay hơi ở áp suất thấp

• Speed Vac (Vacumm)

Ly tâm dùng màng bán thấm

Thẩm tích (dialysis)

Bảo quản protein/ enzyme

• Phụ thuộc vào mục đích sử dụng

• Thời gian ngắn (giữ hoạt tính enzyme, khả năng

biến tính thấp): 1-7 ngày ở 40C

• Thời gian dài (> 7 ngày): giữ ở 40C dưới dạng

tủa với (NH4)2SO4 hoặc -800C

• Đông khô

• Bảo quản trong glycerol, albumin, PEG

Các chất cho bảo quản

Albumin:

Bổ sung trong các dung dịch đệm, tăng độ bền và ổn định cấu trúc protein/

enzyme  Pha loãng các dung dịch protein, enzyme

Glycerol:

• Chống đóng băng (dùng trong bảo quản protein enzyme lâu dài)

• Tương tự Ethylene glycol, propylene glycol khi tan trong nước  phá vỡ

các liên kết H giữa các phân tử H2O  không thể hình thành cấu trúc kết

tinh

• 60-70% glycerol  đóng băng ở -37.80C

• Thường sử dụng làm dung môi cho các enzyme

Dung dịch đệm

• Là hỗn hợp axit yếu và base liên hợp của

nó

• pH của dung dịch chỉ thay đổi không đáng

kể khi cho một lượng nhỏ axít hoặc kiềm

• Giá trị pKa càng lớn  khả năng phân ly càng thấp

• Dung dịch đệm tốt khi pH ~ pKa  Đệm axit, đệm kiềm

Chọn dung dịch đệm như thế nào ?

• Giá trị pH ~ pKa

• Mức thay đổi pH phụ thuộc vào độ pha loãng

• Lưu ý ảnh hưởng của nhiệt độ

• Khả năng hòa tan (protein enzyme quan tâm)

• Khả năng tương tác với các thành phần khác có trong dung dịch,

phản ứng enzyme

• Khả năng hấp thụ UV (đo quang phổ)

• Mức độ thấm qua màng sinh học (tương tác hay không tương tác

với tế bào)

• Chi phí

Lưu ý khi chọn dung dịch đệm

• Nồng độ: 50 mM  thử đầu tiên

• pH: tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm

• Loại đệm: cationic hoặc anionic buffer (sắc ký trao đổi ion) Tris 

cationic  trao đổi anion PBS  anionic  trao đổi cation

• Khi làm việc ở pH sinh lý (với tế bào, mô)  MES, PIPES, MOPS

(Good’s buffer)

Đệm phosphate

• Phạm vi pH 8-11

• Tủa hoặc gắn với nhiều cation đa trị

• Ức chế 1 số enzyme (kinase, phosphatase,

• Chứa nhiều nhóm NH2 có khả năng phản ứng

• Ảnh hưởng đến nhiều phản ứng enzyme (xúc tác bởi

alkaline phosphatase (dephosphoril hóa)

• Thấm qua màng sinh học (tương tác)

• pH chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ pha loãng

• Có khả năng gắn tạo phức với một số

protein (phức kim loại)

• Ít sử dụng với các hệ thống tế bào

Đệm MOPS

• Không gây ảnh hưởng đến sinh lý tế bào

• Ảnh hưởng đến phản ứng Lowry (Bradford

Đệm Borate

• Tạo phức với các mono, oligosaccharide,

nucleic acid, pyridine nucleotide

• Tương tác với glycerol

 Dựa vào tính mang điện của protein/ enzym

• Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

• Điện di (Electrophoresis)

• Tạo vùng đẳng điện (Isoelectric focusing)

 Dựa vào tính phân cực của protein/ enzym

• Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)

• Sắc ký giấy (Paper Chromatography)

• Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)

• Sắc ký ngược pha (Reverse-phase Chromatography)

• Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography)

 Dựa vào kích cỡ của protein

• Thẩm tích và siêu lọc (dialysis and ultrafiltration)

• Điện di trên gel (Gel Electrophoresis)

• Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

• Ly tâm siêu tốc (Ultracentrifugation)

 Sắc ký gắn ái lực (Specificity of binding-affinity chromatography)

Ly tâm siêu tốc (Ultracentrifugation)

Thẩm tích và siêu lọc (Ultrafiltration)

Sắc ký (Chromatography)

 Sắc kí là phương pháp tách các cấu tử được phân bố giữa hai pha: pha tĩnh

đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định

 Các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi

qua pha tĩnh Mẫu đi vào được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng)

có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp

 Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được

phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn Sự tương tác xảy ra

giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và

pha tĩnh

 Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với

những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí Kết quả là chúng

được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các

Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)

Sắc ký giấy (Paper Chromatography)

Sắc ký ngược pha (Reverse-phase Chromatography)

(Hydrophobic Interaction Chromatography)

Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)

Điện di protein trên gel (Gel electrophoresis): SDS-PAGE

25 mM Tris-HCl

200 mM Glycine 0.1% (w/v) SDS

Thành phần cho 1X Running Buffer

10 mM Beta-mercapto-ethanol

20 % v/v Glycerol 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v Bromophenolblue

Thành phần cho 5X Loading Buffer

Nhuộm gel: Sử dụng thuốc nhuộm có Coomassie Brilliant Blue hoặc bạc

Protein size marker: Là hỗn hợp các loại protein có trọng lượng phân tử khác

nhau đã được tinh sạch, dùng làm đơn vị chuẩn

(Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis)

(Recombinant Protein Technology)

Ứng dựng của protein tái tổ hợp:

 Phân tích các chức năng sinh học

 Nghiên cứu tương tác protein-protein

 Xác định quan hệ giữa cấu trúc và chức năng

 Nghiên cứu, xác định cấu trúc

 Nghiên cứu ứng dụng protein trong điều trị

• Phân lập gen mong muốn (tách dòng)

• Chuyển gen mong muốn vào vector biểu hiện

• Chuyển vector vào tế bào vật chủ

• Tăng sinh tế bào

• Tách chiết và tinh sạch protein

 Sản xuất protein tái tổ hợp như thế nào? (Lựa chọn các hệ

thống biểu hiện protein: vector biểu hiện, vật chủ)

 Bằng cách nào để biểu hiện được cấu trúc DNA tái tổ hợp?

(Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra thế nào, lựa chọn promoter,

tag-fusion)

 Protein tái tổ hợp sẽ được biểu hiện ở đâu trong tế bào? (Nội

bào, ngoài bào, thể vùi hay dịch tiết)

 Những vẫn đề phát sinh trong quá trình biểu hiện và tinh sạch

Tách dòng (Cloning)

Vector tách dòng (Cloning vector)

Lực chọn hệ thống biểu hiện căn cứ vào kích thước và đặc tính của

protein

– Các protein lớn (>100 kDa) Nên chọn eukaryote

– Các protein nhỏ (<30 kDa) Nên chọn prokaryote

– Các protein cần thiết phải có quá trình Glycosylation? Nên chọn

baculovirus hoặc tế bào động vật

– Cần năng suất cao, chi phí thấp ? Nên chọn E coli

– Các protein cần thiết phải có quá trình điều hòa sau dịch mã? Nên

chọn nấm men, baculovirus hoặc các tế bào eukaryote

Đặc điểm E coli Nấm men Tế bào động

Hệ thống biểu hiện vi khuẩn

• Sinh trưởng nhanh (có thể tạo

protein sau 8h nuối cấy)

• Năng suất biểu hiện cao (50-500

mg/L)

• Thành phần môi trường khá đơn

giản nên chi phí thấp

• Khó biểu hiện các protein lớn (>50 kDs)

• Không có quá trình glycosylation hoặc loại bỏ các peptide tín hiệu

• Các protein từ Eukaryotic đôi khi gây độc cho vi khuẩn

Hệ thống biểu hiện Pichia

• Có thể biểu hiện được những protein có kích thước lơn (>50 kDa)

• Có quá trình glycosylation và loại bỏ các peptide tín hiệu

• Có thể biểu hiện các protein giàu liên kết S-S

Những ưu điểm nội trội hơn vi khuẩn

• Nấm men là sinh vật nhân thực đơn bào

• Mang các đặc điểm giống với hệ thống biểu hiện vi khuẩn nhưng

có một số ưu điểm của tế bào nhân thực

• P pastoris là loài nấm men có thể sử dụng methanol như là nguồn

carbon (sử dụng alcohol oxidase)

• Có promoter rất mạnh cho biểu hiện gen alcohol oxidase (AOX)

(~ 30% protein được tạo ra khi cảm ứng)

Hệ thống biểu hiện Baculovirus

• Sinh trưởng rất chậm (10-12

ngày để set-up)

• Nuôi cấy tế bào chỉ thích hợp

trong khoảng 4-5 ngày

• Thời gian set-up lâu, không đơn

giản như nấm men

• Có thể biểu hiện protein lớn (>50 kDa)

• Có quá trình glycosylation chuẩn

và loại bỏ các peptide tín hiệu

• Sản lượng rất cao, chi phí thấp

• Autographica californica multiple nuclear polyhedrosis virus

(Baculoviurs)

• Virus này thường nhiễm vào tế bào một số côn trùng

• Chúng sử dụng promoter rất mạnh để tăng cường biểu hiện protein vỏ

sau khi đã xâm nhập vào trong tế bào

Baculovirus Expression

~12 ngày

Hệ thống biểu hiện tế bào động vật

• Sự chọn lọc tốn thời gian (Hàng

tuần cho việc set-up)

• Nuôi cấy tế bào chỉ phù hợp trong

những giai đoạn thời gian giới hạn

• Quá trình set-up tốn rất nhiều thời

gian, chi phí cao, sản lượng khiêm

tốn

• Có thể biểu hiện protein lớn (>50 kDa)

• Có quá trình glycosylation chuẩn

và loại bỏ các peptide tín hiệu, tạo

ra các prrotein đích thực

• Hiệu quả kinh tế cao

• Protein duy trì các liên kết disulfide

• Quá trình glycosylation ở mỗi loại

tế bào động vật là khác nhau

Baculovirus

• Thích hợp với hầu hết eukaryote

• Sự biểu hiện được giới hạn bởi giai đoạn nhiễm

• Quá trình tạo virut gồm rất nhiều bướcnumerous steps

• Duy trì số lượng virut cao

Tế bào động vật • Là môi trường tự nhiên cho các

protein động vật

• Lượng protein thấp

• Chi phí cao

 Vector biểu hiện cần thích hợp với hệ thống biểu hiện (vector từ

prokaryote cho tế bào prokaryote, vector từ eukaryote cho tế bào

• Phải có các đuôi ái lực (Affinity tag) hoặc trình tự có khả năng

bị hòa tan (Solubilization sequences)

• Phải có vùng nhận diện các vị trí cắt của enzym giới hạn

(multi-enzyme restriction site)

Lựa chọn vector biểu hiện

Các vùng quan trọng trên một vector biểu hiện

• Origin of replication (ORI) : Trình tự DNA cho phép DNA

polymerase thực hiện quá trình tái bản plasmid

• Các marker chọn lọc (Amp or Tet) : Đây là một gen, khi nó biểu

hiện sẽ cho phép tế bào vật chủ sống sót trên môi trường chọn lọc

• Vùng cảm ứng promoter : Trình tự ADN ngắn giúp tăng cường

biểu hiện của gen liền kề

• Multi-cloning site (MCS) : Trình tự ADN chữa nhiều vị trí cắt

enzym giới hạn khác nhau

• Tag-fusion : Trình tự ADN mã hóa cho một protein hoặc một đoạn

polipeptide

Đuôi ái lực (Affinity tag) Số Aa Trình tự Ái lực với

Cation-exchange Glutatione S-transferase 211 Protein Glutathione

Maltose-binding protein 396 Protein Cross-linked

amylose Streptavidin binding protein 38 Peptide Streptavidin

Calmodulin-binding protein 26 Peptide Calmodulin

Chitin-binding protein 51 Protein domain Chitin