PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DOFertilizers - Determination of free amino acids content

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN ...-2:2018Phân bón – Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do Fertilizers - Determination of free amino acids content 1 Phạm vi áp dụng Phươn

TCVN T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A

TCVN -2 :2018

Xuất bản lần 1

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO

Fertilizers - Determination of free amino acids content

HÀ NỘI - 2018

Lời nói đầu

TCVN …….-2:2018 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn,

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn

Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN -2:2018

Phân bón – Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do

Fertilizers - Determination of free amino acids content

1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này quy định phương pháp xác định tổng hàm lượng axit amin tự do và từng loại axit amin tự do;

Đối với phương pháp xác định tổng axit amin sử dụng phương pháp định l ượng nito formol và hiệu chỉnh với nitơ ammoniac;

Đối với phương pháp xác định từng loại axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) dùng phương pháp với việc sử dụng thiết bị phân tích axit amin hoặc thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có cột trao đổi ion Phương pháp áp dụng cho các axit amin sau:

- tổng của cystin và cystein; methionin; lysin; threonin; alanin; arginin; axit aspartic; axit glutamic; glycin; histidin; iso leucin; leucin; phenylalanin; prolin; serin; tyrosin; valin

Phương pháp này không phân biệt giữa các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng đồng phân D và L của axit amin Phương pháp không cho phép xác định tryptophan hoặc các chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl

2 Nguyên tắc

Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc Dung dịch lọc dùng để xác định hàm lượng axit amin tự do

2.1 Tổng axit amin tự do trong nước có môi trường trung tính, do 2 nhóm chức axit (-HCOOH) và

Khi mẫu thử kết hợp với formol, nhóm amin kết hợp với formol tạo thành nhóm methylenic, muối amoni trung tính kết hợp với formol tạo thành hexamethylen tetraamin và HCl Do đó làm mất tính kiềm của dung dịch, chuẩn độ lượng HCl và nhóm COOH được giải phóng ra trong phản ứng bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N cho đến khi pH dung dịch đạt 9,2 Dựa vào l ượng kiềm tiêu tốn khi chuẩn độ để tính tổng hàm lượng nitơ amin và nitơ amoniac (gọi chung nitơ formol) Hàm

lượng nitơ axit amin được tính bằng cách hiệu chỉnh hàm lượng nitơ formol với hàm lượng nitơ amoniac

- Muối amoni có trong mẫu thử sau khi hòa tan trong n ước được kiềm hóa dung dịch bằng magie oxit Hàm lượng nitơ amoniac được định lượng bằng phương pháp kjeldahl

2.2 Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20 Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm

3 Hóa chất và thuốc thử

Hóa chất và thuốc thử chất lượng PA dùng cho sắc ký

3.1 Nước, sử dụng nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương tự (độ dẫn điện <10 μS).S) 3.2 Magie oxit (MgO) tinh thể không chứa cacbonat.

3.3 Dung dịch axit clohydric (HCl) chuẩn 0,1N; 0,5N hoặc dung dịch axit sunfuric chuẩn (H2SO4) 0,1N; 0,5N; 1N: pha từ ống chuẩn

3.4 Dung dịch natri hydroxit (NaOH) chuẩn 0,1N: pha từ ống chuẩn.

3.5 Thymolphtalein (C28H30O4) tinh thể

3.6 Dung dịch thymolphtalein (C28H30O4) 1%: Hòa tan 1g tinh thể (3.5) với 99mL ethanol 60% Lắc đều

3.7 Fomaldehyt (HCHO) đậm đặc

3.8 Dung dịch Fomaldehyt (formol) trung tính: Hút 50 thể tích dung dịch Fomaldehyt đậm đặc

(3.7) hòa tan với 1 thể tích dung dịch thymolphtalein 1% (3.6), thêm từ từ dung dịch natri hydroxit 0,1N (3.4) cho đến khi dung dịch có màu xanh nhạt

3.9 Kali clorua (KCl) tinh thể

3.10 Dung dịch kali clorua (KCl) 1M: Hòa tan 74,5g kali clorua tinh thể (3.9) với khoảng 500mL

nước trong bình định mức dung tích 1000mL Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều

3.11 Nhôm clorua (AlCl3.6H2O) tinh thể

3.12 Dung dịch nhôm clorua (AlCl3) 1M: Hòa tan 240g nhôm clorua tinh thể (3.11) với khoảng 500mL nước trong bình định mức dung tích 1000mL Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều

3.13 Kali hydroxit (KOH) tinh thể

3.14 Dung dịch kali hydroxit 170g/L: Hòa tan 170g kali hydroxit tinh thể (3.13) với khoảng

500mL nước trong bình định mức dung tích 1000mL Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều

3.15 Axit clohydric (HCl) đậm đặc d= 1,184.

3.16 Dung dịch axit clohydric (HCl) tỷ lệ 1:200: Pha loãng axit clohydric đậm đặc (3.15) với

nước theo tỉ lệ 1: 200 về thể tích

3.17 Amoni sunfat [(NH4)2SO4] tinh thể

3.18 Dung dịch amoni sulfat [(NH4)2SO4] 0,5gN/L: Hòa tan 2,3571g amoni sulfat tinh thể (3.17)

3.19 Metyl đỏ (C15H15N3O2) tinh thể

3.20 Dung dịch chỉ thị methyl đỏ (C15H15N3O2) 0,1g/100mL: Hòa tan 0,1g metyl đỏ tinh thể (3.19) với khoảng 50mL ethanol 95% trong bình định mức dung tích 100mL Thêm ethanol 95% đến vạch định mức và lắc đều

3.21 Thymol blue (C27H30O5S) tinh thể

3.22 Dung dịch chỉ thị Thymol blue (C27H30O5S) 1g/100mL : Hòa tan 1g thymol blue tinh thể (3.21) với khoảng 20mL ethanol 95%, trong bình định mức dung tích 100mL Thêm ethanol 95% đến vạch định mức và lắc đều

3.23 Natri hydroxit (NaOH) tinh thể.

3.24 Dung dịch natri hydroxit (NaOH) 400g/L: Hòa tan 400g natri hydroxit tinh thể (3.23) trong

nước và định mức đến 1000mL Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín

3.25 Dung dịch natrihydroxit 7,5 M: Hòa tan 300g natrihydroxit tinh thể (3.23) trong nước và

định mức đến 1000mL Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín

3.26 Dung dịch natrihydroxit 1M: Hòa tan 40g natrihydroxit tinh thể (3.23) trong nước và định

mức đến 1000mL Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín

3.27 Axit boric (HBO3) tinh thể

3.28 Dung dịch axit boric (HBO3), 5%: Hòa tan 50g axit boric (3.27) với 950mL nước nóng Lắc đều, để nguội Khi sử dụng cứ 50mL axit boric 5% cần cho thêm 10 giọt hỗn hợp chỉ thị màu, sau

đó nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu đỏ tía nhạt (pH khoảng 5)

3.29 Metyl xanh (C37H27N3Na2O9S3) tinh thể

3.30 Dung dịch chỉ thị màu hỗn hợp: Hòa tan 0,1g metyl đỏ tinh thể (3.19) với khoảng 50mL

rượu etylic 95% và thêm vào 0,05g metyl xanh tinh thể (3.29) trong bình định mức dung tích

100mL, lắc cho tan hết Thêm rượu etylic đến vạch định mức và lắc đều Bảo quản ở 20oC trong lọ màu nâu

3.31 Thiodiglycol (C4H10O2S) độ tinh khiết >99%

3.32 Axit 5-sulfosalicylic (C7H6O6S) tinh thể

3.33 Natri citrat (Na3C6H5O7) tinh thể

3.34 Natri clorua (NaCl) tinh thể.

3.35 Dầu nhẹ, nhiệt độ sôi từ 400C đến 600C

3.36 NorLeucin, hay bất kỳ chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn.

3.37 Khí nitơ 5.0

3.38 Các axit amin

3.38.1 Các chất chuẩn axit amin chỉ ra trong Điều 1.

3.38.2 Axit cysteic

3.38.3 Methionin sulfon.

GHI CHÚ 1: Sử dụng các hợp chất tinh khiết không chứa nước kết tinh Làm khô trong chân không có chứa P 2 O 5 hoặc

H 2 SO 4 trong 1 tuần trước khi sử dụng.

3.39 Hỗn hợp chiết (axit clohydric 0,1M chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2mL axit clohydric đậm đặc

(3.4) pha loãng với khoảng 900mL nước Thêm 20mL thiodiglycol (3.7) và định mức tới 1000mL bằng nước (3.1)

GHI CHÚ 2: Không trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (3.4) và thiodiglycol (3.7)

3.40 Dung dịch axit sulfosalicylic 6 %: Hòa tan 60g axit sulfosalicylic (3.8) trong nước (3.1) và

định mức đến 1000mL bằng nước (3.1)

3.41 Đệm citrat (Na+: 0,2M) , pH = 2,20

Hòa tan 19,61g natri citrat (3.9), 5mL thiodiglycol (3.7), 1g phenol (3.6) và 16,50mL axit clohydric đậm đặc (3.4) trong khoảng 800mL nước (3.1) Điều chỉnh pH tới 2,20 Định mức đến 1000mL bằng nước (3.1)

3.42 Đệm rửa giải, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

3.43 Thuốc thử ninhydrin, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng 3.44 Dung dịch chuẩn của các axit amin

3.45.1 Dung dịch chuẩn gốc axit amin (theo điều 1) có nồng độ là 2,5 μS).mol/mL trong axit HCl.

Các dung dịch này thường có sẵn trên thị trường

3.46.2 Dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon, 1,25 μS).mol/mL.

Hòa tan 0,2115 g axit cysteic (3.16.2) và 0,2265g methionin sulfon (3.16.3) trong đệm citrat (3.24) vào bình định mức 1000mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat

GHI CHÚ 4: Các dung dịch chuẩn được bảo quản dưới 5 O C không quá 12 tháng Dung dịch này không nên dùng nếu dung dịch chuẩn gốc (3.26.1) có chứa axit cysteic và methionin sulfon.

3.46.3 Dung dịch chuẩn gốc và chất nội chuẩn, ví dụ như norleucin 20 μS).mol/mL.

Hòa tan 0,6560g norleucin (3.14) trong đệm citrat (3.24) vào bình định mức 250mL và định mức

3.46.4 Dung dịch chuẩn làm việc của các chất chuẩn axit amin, sử dụng cho các dịch thủy

phân, axit cysteic và methionin sulfon có nồng độ 0,1μS).mol/mL và các axit amin khác là 0,2μS).mol/mL

Hòa tan 2,2 g natri clorua (3.10) trong cốc 100mL với 30mL đệm citrat (3.24) Thêm 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit amin (3.27.1), 4,00 ml dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon (3.27.2), và 0,50mL chuẩn gốc của dung dịch nội chuẩn (3.27.3) nếu cần sử dụng Điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1M (3.18) Chuyển định lượng vào bình định mức 50mL và

3.46.5 Dung dịch hiệu chuẩn của các chất chuẩn axit amin

Đối với đường chuẩn của các axit amin (điều 1) sử dụng các dịch thủy phân được chuẩn bị theo 5.3.3.2 và sử dụng với các dịch chiết (5.2)

Đối với đường chuẩn axit cysteic và methionin sulfon chuẩn bị dung dịch tương tự 3.27.4 nhưng

4 Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và

4.1 Bình cầu đáy tròn, dung tích 100mL hoặc 250mL có sinh hàn hồi lưu.

4.2 Bình thủy tinh bosilicat, dung tích 100mL với nắp bằng cao su/teflon (ví dụ: Duran, Schott)

chịu nhiệt

4.3 Tủ sấy, có điều khiển nhiệt độ.

4.4 Máy đo pH, đọc được đến ba số thập phân.

4.5 Màng lọc, 0,2 μS).m.

4.6 Máy ly tâm

4.7 Máy lắc và mấy khuấy từ.

4.8 Rây 0,25mm.

4.9 Bể điều nhiệt.

4.10 Thiết bị chưng cất Kjeldahl, có dung tích 250mL bao gồm.

4.10.1 Ống sinh hàn

4.10.2 Bình cất Kjeldahl, dung tích 250mL (Nếu đun trực tiếp sử dụng bình đáy cầu dung tích 1000mL)

4.10.3 Đầu tránh bắn, có đầu vào đầu ra và nối với phễu nhỏ giọt

4.10.4 Phễu nhỏ giọt có khóa

4.10.5 Bình hứng, dung tích 250mL (hoặc 500mL)

4.11 Máy phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC có cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột

cho ninhydrin và detector quang

Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin Tốc độ dòng của dung dịch đệm và ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổn định ± 0,5% trong suốt quá trình chạy đường chuẩn và phân tích mẫu

Đối với một số máy phân tích axit amin, quá trình thủy phân có thể được sử dụng mà trong đó dịch thủy phân có nồng độ natri 0,8M và chứa tất cả lượng axit formic dư từ bước oxy hóa Một số máy khác sẽ không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa nồng độ axit formic quá dư và/hoặc nồng độ ion natri cao Trong trường hợp này, giảm thể tích axit bằng cách làm bay hơi tới xấp xỉ 5mL sau khi thủy phân và trước khi điều chỉnh pH Quá trình bay hơi nên

5 Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu:

5.1.1 Phân bón dạng rắn: Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015

5.1.2 Phân bón dạng lỏng

- Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử,

mẫu phải được lắc đều

- Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử,

mẫu phải được trộn đều

GHI CHÚ 3: Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 o C hoặc đông khô trước khi nghiền Các mẫu có hàm lượng chất béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (3.13) trước khi nghiền.

5.2 Xác định tổng axit amin tự do

Cân khoảng 5 gam mẫu chính xác đến 0,0001g đã được chuẩn bị theo (5.1) vào bình nón và thêm 100,0mL của hỗn hợp dịch chiết (3.39) Lắc đều trong 60 min sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy

từ Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10,0mL dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ 100mL Đối với mẫu dạng lỏng (5.1.2), dùng pipet hút khoảng 5mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến 0,0001g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng dạng sền sệt;

Thêm 5,0mL dung dịch axit sulfosalicylic 6% (3.22), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa Dung dịch (A) thu được dùng để xác định tổng axit amin tự do

5.2.1 Xác định hàm lượng nitơ ammoniac

5.2.1.1 Lắp đặt, kiểm tra thiết bị chưng cất Kjeldahl:

Tùy theo thực tế của mỗi thiết bị mà cách lắp đặt có thể khác nhau, nhưng phải tuyệt đối kín trong suốt quá trình hoạt động, có khả năng điều chỉnh được tốc độ cất và tốc độ ngưng;

Trước khi chưng cất mẫu phải kiểm tra thiết bị Kjeldahl bằng cách chưng cất 50mL dung dịch amoni sulfat 0,5gN/L (4.23) với kiềm Chuẩn độ lượng nitơ trong bình hứng hết 17,85mL ± 0,1mL dung dịch chuẩn độ tiêu chuẩn acid chlohydric 0,1N (4.2) là đạt yêu cầu, nếu ít hơn là do thiết bị cất bị hở, nếu lớn hơn có thể là do bị bắn kiềm từ bình cất hoặc do thiết bị không sạch, cần khắc phục và kiểm tra lại

5.2.1.2 Chưng cất mẫu

Hút 50mL dung dịch A thêm ≥ 2g magie oxit không chứa carbonate (4.1);

Dùng phễu nhỏ giọt, rót từ từ vào bình chưng cất 100ml dung dịch natri hidroxyt 400g/L (4.23) hoặc 20ml nếu là mẫu không qua thủy phân hoặc phân hủy, giữ lại khoảng 2ml trong phễu;

Dùng buret cho vào bình hứng chứa 50ml dung dịch axit boric 5% (4.25) có chứa sẵn hỗn hợp chỉ thị (4.27) và 35mL axit sunfuric tiêu chuẩn 0,1N (4.2);

Lắp bình vào bộ chưng cất sao cho đầu ra của ống sinh hàn thấp hơn bề mặt dung dịch axit, nếu cần cho thêm nước;

Tiến hành chưng cất cho đến khi thu được khoảng 200mL dung dịch ở bình hứng Ngừng đun, tháo ống sinh hàn, dùng bình tia tráng rửa ống sinh hàn, nước rửa thu vào bình hứng

5.2.1.3 Chuẩn độ mẫu

Chuẩn độ lượng axit dư trong bình hứng bằng dung dịch tiêu chuẩn natri hidroxit 0,1N (4.3) đến khi màu dung dịch chuyển từ xanh tím sang xanh lá cây;

Tiến hành phép thử trắng trong cùng một điều kiện với cùng lượng các loại thuốc thử nhưng không có mẫu phân tích

5.2.1.4 Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ - amoniac, được tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức (1):

001401 ,

0 ) (

m

V V k

N amoniac

(1)

Trong đó:

tích, tính bằng mililít (mL);

tính bằng mililít (mL);

0,001401 là khối lượng nitơ tương ứng với 1mL dung dịch axit sunfuric 0,1N

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của hai phép thử được tiến hành song song, sai lệch cho phép giữa chúng không được vượt quá 0,30% giá trị tuyệt đối

5.2.2 Xác định hàm lượng nito amin – amoniac (nito formol)

5.2.2.1 Cách tiến hành

Hút 50mL dung dịch A thêm khoảng 400mL dung dịch kali clorua 1M (4.9), lắc đều trong khoảng

30 phút với với tốc độ lắc 30-40 vòng/phút;

dịch mẫu) và một vài giọt chỉ thị methyl đỏ 0,1g/100mL (4.19);

Thêm ngay lập tức (vừa lắc vừa thêm) dung dịch kali hydroxit 170g/L (4.13) cho đến khi dung dịch chuyển thành màu vàng nhạt;

Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều và lọc;

Dùng pipet lấy chính xác 20mL dịch sau lọc cho vào cốc dung tích 250mL, thêm nước đến thể tích khoảng 50mL, trung hòa dịch lọc bằng dung dịch axit clohydric 1: 200 về thể tích (4.15) cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt;

Dùng buret cho thêm 20mL dung dịch formol trung tính (4.7) vào rồi khuấy đều, để yên 5 phút; Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N cho đến khi pH của dung dịch bằng 9,2 (sử dụng máy đo pH hoặc dùng chỉ thị thymol xanh (4.21) màu của dung dịch sẽ chuyển từ màu xanh lá sang màu xanh da trời;