LUẬN VĂN CÁC PHẢN ỨNG CỦA MÀNG TẾ BÀO ĐỐI VỚI TÁC DỤNG CỦA CÁC XUNG ĐIỆN

LUẬN VĂN CÁC PHẢN ỨNG CỦA MÀNG TẾ BÀO ĐỐI VỚI TÁC DỤNG CỦA CÁC XUNG ĐIỆN Màng tế bào là ranh giới ngăn cách tế bào sống với môi trường chung quanh nó. Màng tế bào kiểm...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THÙY NHUNG

CÁC PHẢN ỨNG CỦA MÀNG TẾ BÀO

ĐỐI VỚI TÁC DỤNG CỦA CÁC XUNG ĐIỆN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THÙY NHUNG

CÁC PHẢN ỨNG CỦA MÀNG TẾ BÀO

ĐỐI VỚI TÁC DỤNG CỦA CÁC XUNG ĐIỆN

Ngành : Vât lý Chuyên ngành : Vật lý lý thuyết và vật lý toán

Mã số : 60 44 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

GS TSKH Nguyễn Ái Việt

Mục lục

1.1 Khái niệm màng tế bào 9

1.2 Thành phần cấu tạo của màng tế bào 10

1.3 Sự vận chuyển chất hoà tan qua màng 12

2 Thuyết electroporation 18 2.1 Trạng thái không thuận nghịch của hiện tượng electroporation 21 2.2 Trạng thái khả nghịch của hiện tượng electroporation 22

2.3 Những ảnh hưởng của điện thế chuyển màng 23

3 Phương pháp kết hợp 26 3.1 Mô hình Kotnik 26

3.2 Mô hình xấp xỉ Wanda 34

3.3 Các bước tiến hành và kết quả 38

3.3.1 Các xung dài và xung cực ngắn 38

3.3.2 Tế bào thường và tế bào ung thư 42

3.3.3 Mitochondria_ mô hình tế bào ba lớp màng 46

Danh sách hình vẽ

1 Màng tế bào plasma 5

1.1 Cấu trúc hai lớp của màng sinh học 10

1.2 Thí nghiệm phát hiện vai trò của các kênh ion 17

1.3 Sơ đồ dòng ion đi qua một kênh theo thời gian 17

3.1 Mô hình màng tế bào 29

3.2 màng trong (gián đoạn) và màng ngoài (liên tục) V m đối với trường hợp xung dài 38

3.3 màng trong (gián đoạn) và màng ngoài (liên tục) V m đối với trường hợp xung ngắn 38

3.4 Điện thế màng đối với các xung dài 39

3.5 Điện thế màng đối với các xung ngắn hơn 39

3.6 Điện thế cảm ứng biến đổi theo thời gian do kích thích của trường điện một chiều Đường gạch: kết quả của Kotnik [1], đường liền: những tính toán của chúng tôi 40

3.7 Điện thế cảm ứng biến đổi theo thời gian do kích thích của trường điện một chiều Đường gạch: kết quả của Kotnik [1], đường liền: những tính toán của chúng tôi 40

3.8 Điện thế cảm ứng thay đổi theo thời gian khi chịu kích thích của xung điện hình thang Đường gạch: kết quả của Kotnik [1], đường liền: những tính toán của chúng tôi 40

3.9 Điện thế cảm ứng thay đổi theo thời gian khi chịu kích thích của xung điện hình thang Đường gạch: kết quả của Kotnik [1], đường liền: những tính toán của chúng tôi 40

3.10 Mật độ dòng qua lỗ (Đường gạch) và qua tụ (Đường liền)

trong trường hợp xung dài 413.11 Mật độ lỗ theo thời gian đối với tác dụng của các xung dài 413.12 Mật độ dòng qua lỗ (Đường gạch) và qua tụ (Đường liền)

trong trường hợp xung ngắn 413.13 Mật độ lỗ theo thời gian đối với tác dụng của các xung ngắn 413.14 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan

(Đường gạch) của TB B thường 433.15 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan

(Đường gạch) của TB B ung thư 433.16 Điện thế của màng TB (Đường liền) và của màng bào quan

(Đường gạch) của TB B thường, sử dụng các thông số mới 443.17 Điện thế của màng tế bào (Đường liền) và của màng bào

quan (Đường gạch) của TB B ung thư, sử dụng các thông

số mới 443.18 Sự phân bố năng lượng của TB B thường theo tần số,

(Đường đậm: màng trong, đường liền nhạt: màng ngoài,

đường gạch: môi trường ngoài) 453.19 Sự phân bố năng lượng của TB B ung thư theo tần số,

(Đường đậm: màng trong, đường liền nhạt: màng ngoài,

đường gạch: môi trường ngoài) 453.20 Năng lượng tiêu thụ đối với trường hợp xung, (Đường liền:

TB B ung thư, đường gạch: TB B thường) 463.21 Sự phụ thuộc của các điện thế vào tần số Đường đậm: TB,

đường gạch: mito trong, đường chấm: mito ngoài, đường

liền: màng trong kết hợp 48

3.22 Tỉ lệ điện thế đường liền: |∆Ψ outermito |/|∆Ψ cell |, đường gạch:

|∆Ψ innermito |/|∆Ψ cell | 48

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS TSKH.Nguyễn Ái Việt, Viện vật lý Hà nội đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôitrong suốt quá trình tôi làm luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa vật lý, Đạihọc khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã động viên, giúp đỡ

và chỉ dạy cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tậpcủa tôi tại trường

Cảm ơn bạn Lê Thanh Tùng, người đã giúp tôi rất nhiều trong học tập

và trong quá trình tính toán các kết quả của luận văn

Sau cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bạn bè và gia đình đã độngviên, ủng hộ tôi trong quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2009

Hình 1: Màng tế bào plasma

Các quá trình vận động của màng tế bào được nghiên cứu và tìm hiểusâu hơn cùng với sự phát triển của kỹ thuật thực nghiệm

Tế bào là thành phần không thể thiếu được trong mỗi cơ thể sống Mỗi

tế bào được bảo vệ bởi màng tế bào Lớp màng đôi lipid là một trong những

viên gạch cấu trúc quan trọng bậc nhất trong tế bào Một lớp màng baogồm một rào thế linh động ngăn cách phần bên trong và bên ngoài của

tế bào, bảo vệ các bào quan (nhân và các vật liệu di truyền), có vai trònhư là một trung tâm chức năng hoá cho việc sản sinh các protein Màngsinh học có nhiều hình dạng khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc, chức năng,như hình phẳng (màng plasma), hình cầu, hình trụ hoặc có dạng phức tạphơn (Endoplasmic Recticulum, ER và bộ máy Golgi) Bề mặt của mànglipid có hệ các điện tích linh động bao quanh, tính chất tương tự như các

hệ điện tử trên bề mặt hêli lỏng Bề mặt của màng tế bào trong các môitrường dung dịch có thể tích điện âm Các lớp điện tích khuyếch tán từdung dịch rất linh động Chúng sẽ chắn mặt màng và hình thành các lớpđiện tích dương hai chiều tích tụ ở sát mặt trong và mặt ngoài của màng

tế bào Thêm vào đó, do các ion khác loại của các kênh ion trên màng cókhả năng thẩm thấu khác nhau nên phần trong của màng luôn được duytrì ở mức điện thế âm hơn so với phía bên ngoài môi trường Các cơ chếcổng của các kênh ion trên màng tế bào được cho là có thể mở ra việc sửdụng các cổng cảm nhận điện thế và đang là một vấn đề mở trong lý sinhhọc

Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới về các phản ứng của màng tếbào chống lại tác dụng của các xung điện là có xem xét đến hiện tượngelectroporation Electroporation, hay electropermeabilization, là sự tăngđáng kể về độ dẫn điện và độ từ thẩm của màng plasma tế bào Điều nàyxuất hiện là do tác dụng của một trường điện ngoài Electroporation được

sử dụng trong sinh học phân tử để đưa một số chất vào trong tế bào.Những chất kích thích này có thể làm thay đổi chức năng của tế bào, hoặcmột đoạn mã DNA

Electroporation là một hiện tượng động lực phụ thuộc vào điện thế củanội màng Thực nghiệm chứng tỏ rằng, đối với mỗi xung có hình dạng

và độ dài xác định, sẽ tồn tại một ngưỡng thế đặc trưng cho hiện tượngelectroporation (từ 0.5V đến 1V) Điều này dẫn đễn sự định rõ cường

độ ngưỡng cho hiện tượng Electroporation E Chỉ khi các tế bào ở

trong khoảng E < E ngng thì mới xuất hiện hiện tượng mở lỗ trên màng

tế bào Nếu cường độ điện trường bằng hoặc vượt qua ngưỡng, hiện tượngelectroporation sẽ gây tổn hại đến sự tồn tại của tế bào

Trong sinh học phân tử, quá trình electroporation thường được sử dụngcho sự chuyển hoá của vi khuẩn, nấm và các tế bào trần Ngoài các mànglipid, vi khuẩn cũng có các thành tế bào Các thành này khác với các mànglipid, được tạo thành bởi peptidoglycan và các dẫn xuất của nó Các thành

có lỗ hoạt động như các vỏ cứng đơn bảo vệ vi khuẩn khỏi một vài tác độngcủa môi trường Nếu các vi khuẩn và plasmid được trộn với nhau, plasmid

có thể được đưa vào tế bào sau quá trình electroporation Các tế bào phảiđược bảo vệ vô cùng cẩn thận cho đến khi chúng có cơ hội để phân chiathành các tế bào mới có chứa các plasmid tái sinh Quá trình này có hiệuquả gấp khoảng 10 lần so với quá trình chuyển hoá hoá học

Trong luận văn này, chúng tôi xét mô hình màng tế bào được kích thíchbởi các xung điện cực mạnh Khi chịu tác dụng này, trên màng tế bào sẽxuất hiện điện thế cảm ứng, dẫn đến hiện tượng electroporation Kotnik(2006) [?] đã nghiên cứu về điện thế chuyển màng nhưng không tính đếnhiện tượng electroporation Ở đây, chúng tôi đã đưa ra một phương phápmới, phương pháp K-Wand để tính điện thế cảm ứng trên màng tế bào vàchứng minh sự tồn tại của hiện tượng electroporation Phương pháp củachúng tôi không chỉ áp dụng cho màng lipid kép mà còn có thể dùng cho

tế bào 3 lớp màng, mitochodria và xác định các tế bào ung thư qua việcxác định năng lượng làm nóng chúng

Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn được chia thành 3 chương:Chương I, chúng tôi trình bày tổng quan về màng tế bào Sơ lược về lýthuyết electroporation được trình bày trong chương II Cuối cùng, chươngIII là phương pháp và các kết quả đạt được của chúng tôi khi nghiên cứu

về các phản ứng của màng tế bào đối với kích thích của các xung điệnmạnh cực ngắn

Chương 1

Tổng quan về màng tế bào

Cuối thế kỉ 19, các nhà sinh học bắt đầu nghi ngờ rằng lớp vỏ bao quanh tế bào có chứa thành phần lipid từ công trình nghiên cứu của Ernst Overton (1899) Ông đã chỉ ra rằng một vài loại phân tử nhuộm không tích điện, về mặt hoá học gần giống với lipid, có thể xâm nhập vào trong tế bào

dễ dàng hơn các phân tử cấu tạo không giống lipid Nhờ có công trình của Chevural đầu thế kỷ XVIII, tính chất vật lý và hoá học của axit béo đã được hiểu một cách đầy đủ Sử dụng bazơ và triglixerit mạnh là chất thử, ông

đã tìm ra các tính chất của các phân tử có liên quan đến việc dự trữ năng lượng và sản xuất màng tế bào này.

Sau đó, vào năm 1925, một thí nghiệm đánh dấu một bước ngoặt lớntrong ngành tế bào học được thực hiện bởi E Gorter và F Grendel, liênquan đến việc lấy các tế bào máu hoà tan các màng tế bào trong các dungmôi hữu cơ Về mặt hoá học, vì các lipid giống các dung môi hữu cơ hơn

là nước nên chúng có thể được sàng lọc khỏi phần còn lại của tế bào theocách này Khi có các thành phần lipid tinh khiết của màng tế bào, họ đặtchúng lên mặt nước Như đã được tiên đoán, đầu cực của các phần lipidtương đối nhỏ liên kết đặc biệt với bề mặt nước trong khi các thành phầnkhông cực dài hơn được gắn lên trên mặt phẳng trong không khí Gorterand Grendel đã có thể khiến bề mặt của màng lipid tự nhân đôi và hìnhthành màng hai lớp giống như những gì chúng ta đã biết về bản chất thực

sự của các màng tế bào Đây là thí nghiệm đầu tiên khẳng định sự tồn tại

của lớp lipid kép trong màng tế bào.

Tế bào có cấu tạo phức tạp Màng tế bào hay màng sinh chất là một bộphận của tế bào bao quanh lớp sinh chất Các màng tế bào vạch rõ ranhgiới giữa tế bào và môi trường bên ngoài, đồng thời điều khiển dòng phân

tử đi qua ranh giới đó Màng chia không gian trong tế bào thành các bộphận riêng biệt, các thành phần riêng rẽ Chúng tổ chức phản ứng liên tục

và là trung tâm của việc dự trữ năng lượng, thông tin qua lại từ tế bàonày sang tế bào khác Mọi hoạt động sinh học của màng bắt nguồn từ tínhchất vật lý đặc biệt của chúng

Các màng bền vững nhưng linh hoạt, tự khép kín, thẩm thấu có chọnlọc đối với các chất tan có cực Tính linh hoạt làm cho nó thay đổi có địnhhướng, đồng thời làm cho nó vừa lớn lên, vừa di chuyển Tính khép kíngiúp nó vừa tự liền các chỗ vỡ tạm thời của hai màng lúc đưa chất thải rangoài tế bào hay trong quá trình phân chia tế bào vừa không gây ra các lỗlớn trên mặt màng Tính thẩm thấu có chọn lọc của màng giúp tế bào giữlại các chất và các ion nhất định đặc trưng, đồng thời ngăn chặn nhữngvật chất có thể gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động của tế bào đi vào trong

tế bào

Màng tế bào không phải là tấm chắn thụ động Chúng bao gồm các loạiprotein đặc biệt kích thích hay xúc tác khác nhau Các bơm vận chuyểncác chất tan hữu cơ đặc biệt và các ion vô cơ qua màng ngược với gradientnồng độ, biến đổi năng lượng từ dạng này sang dạng khác

Màng được chia thành ba miền: miền ngoài, miền trong và miền giữa.Phân tích hoá học cho thấy màng chủ yếu được cấu tạo từ các lớp képphotpho-lipid được bao phủ bởi các ion tự do, lớp này thường tích điện

âm với nồng độ rất cao tức là ở trạng thái plasma Vì vậy, màng sinh chấtcòn được gọi là màng kiểu plasma Plasma tế bào đóng vai trò quan trọngtrong việc trao đổi chất và trao đổi thông tin qua lại giữa tế bào và môi

Để hiểu được chức năng của màng tế bào, ta phải xác định rõ các thànhphần cấu tạo của chúng Cấu tử chính của màng sinh chất là các protein

và lipid có cực Tỷ lệ giữa protein và lipid khác nhau ở các loại màng khácnhau Các lipid trong màng tế bào chủ yếu là photpho-lipid, ngoài ra còn

có các lipid khác như galactolipit, triaxylixerol

Hình 1.1: Cấu trúc hai lớp của màng sinh học

Tất cả các màng sinh chất đều có tính chất cơ bản: Chúng không cókhả năng thẩm thấu đối với nhiều chất tan có cực hay tích điện nhưng cókhả năng thẩm thấu đối với các hợp chất không cực Khi quan sát lớp cắtngang nhờ kính hiển vi điện tử, màng dày từ 5-8 nm Màng có cấu trúckhảm lỏng Độ lỏng của lớp kép photpho-lipid phụ thuộc vào nhiệt độ Cụthể, nhiệt độ có thể làm cho chúng chuyển từ dạng tinh thể đặc tới lỏnghơn

Thành phần và kết cấu của lipid

Hợp chất phospholipids trong tế bào tự động tạo nên các lớp màng đôiphospholipids dạng tấm mỏng, với độ dày khoảng hai lần kích thước phân

tử Các chuỗi hydrocarbon trong mỗi lớp tạo nên nhân kỵ nước dày khoảng3-4 nm trong hầu hết mọi màng sinh học.

Tiết diện cắt ngang của tất cả các màng đôi trông giống như một "đườngray": Hai đường tối, mỏng là các nhóm đầu và khoảng sáng dày 2 nm làphần đuôi kỵ nước.[6]

Các loại màng trong tự nhiên có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theochức năng của tế bào Bề mặt trơn nhẵn của màng plasma của tế bào hồngcầu cho phép loại tế bào này có thể luồn lách qua các mao mạch rất hẹp.Một vài loại màng tế bào khác lại có các phần mở rộng mỏng dài dạnglông mao Chuyển động của các lông mao này gây ra dòng chất lỏng chảydọc trên bề mặt của các biểu mô hay giúp cho một vài loại tế bào (nhưtinh trùng ) bơi được trong môi trường Thân của các tế bào thần kinhlại được bọc bởi nhiều lớp màng plasma tạo thành màng bọc myelin Mặc

dù có nhiều hình dạng và chức năng khác nhau, tất cả các màng sinh họcđều có cấu trúc hai lớp phổ biến

Mỗi màng có thành phần lipid đặc trưng Từng loại mô và từng cơ quangắn với tế bào lại có thành phần lipid khác nhau Các tế bào có cơ chếkiểm soát các loại và tổng số lipid đã tổng hợp của màng

Một màng sinh học điển hình được cấu tạo từ ba loại lipids: glycerides, sphingolipids và steroids Cả ba loại lipid này đều có tính chấtvừa ưa nước, vừa kỵ nước (amphipathic) vì có một nhóm đầu cực ưa nước

phospho-và đuôi kỵ nước Hiệu ứng kỵ nước là tương tác Val-der- Waals làm chocác nhóm tự kết hợp vào một lớp màng đôi với các nhóm đầu cực đượcđịnh hướng về phía môi trường ngoài Mặc dù các loại lipid trên màng phổ

biến đều có tính chất amphipathic nhưng chúng khác nhau trong cấu trúc

hoá học và chức năng sinh học

Các lipid màng vận động liên tục, chuyển động tự do trên mặt màng.Mặc dù màng có cấu trúc hai lớp lipid rất ổn định, những phân tử photpho-lipid và sterol riêng của chúng tự do chuyển động trên mặt màng Các phân

tử khuyếch tán ra các bên với tốc độ rất nhanh

Màng sinh chất khác nhau có protein khác nhau Nhiều loại protein đóngvai trò như chất vận chuyển, mỗi loại phụ trách vận chuyển một chất hoàtan riêng đi qua màng Một số protein có liên kết cộng hoá trị với một hoặcnhiều lipid Protein sắp xếp không đối xứng do khác nhau về chức năng

Ta có thể chia protein màng thành hai loại: Protein xuyên màng và proteinrìa màng Protein xuyên màng liên kết chặt chẽ với màng còn protein rìamàng thì liên kết yếu hơn Protein xuyên màng không tan trong nước Sựkhông tan của chúng là do sự có mặt của phần lớn các axit amin giàu nhóm

kỵ nước Còn các protein rìa màng dễ dàng hoà tan trong nước [6]

Protein rìa màng liên kết thuận nghịch với màng Rất nhiều proteinrìa màng được gắn chắc với màng nhờ tương tác tĩnh điện và liên kết hy-dro với vùng ưa nước của protein xuyên màng và các nhóm đầu phân cựccủa các lipid màng Protein rìa màng đóng vai trò như các chất điều hoàcác enzym liên kết màng hay giới hạn sự chuyển động của một số proteinmàng Khi nghiên cứu cấu trúc màng sinh chất, người ta đặc biệt chú ýđến các protein xuyên màng Protein xuyên màng có tác dụng nối buộc lớpkép lipid, điều khiển chất tan hoặc các tín hiệu đi qua màng Chúng bắcqua bề dày của lớp kép và kéo lồi ra cả bên trong và bên ngoài bề mặt màng

Mọi tế bào sống lấy ở xung quanh các nguyên liệu thô để tổng hợp sảnxuất năng lượng và thải ra môi trường những chất không cần thiết Màngsinh chất chứa các protein đặc biệt giúp mang vào tế bào các chất cầnthiết như đường, các axit amin, các ion vô cơ Trong nhiều trường hợp,các thành phần này chuyển vào trong tế bào ngược với gradien nồng độ.Một số loại khác được bơm ra để duy trì nồng độ thấp hơn ở môi trườngxung quanh Sự di chuyển của các phân tử nhỏ đi qua màng sinh chất nhờ

các quá trình trung gian của protein, thông qua các kênh vận chuyển mànghoặc qua chất mang hay còn gọi là bơm.

Vận chuyển bị động

Khi màng tế bào được đặt trong trường chất nguyên sinh và môi trườngngoài có chứa nồng độ chất tan hoặc ion không cân bằng nhau, chất tanchuyển động từ vùng có nồng độ cao, qua màng, tới vùng có nồng độ thấphơn, đến khi hai bên có nồng độ chất tan bằng nhau Tuy nhiên, sự thẩmthấu đơn giản này hạn chế bởi tính thẩm thấu chọn lọc Để vượt qua lớpkép, chất tan có cực hay tích điện phải từ bỏ mối quan hệ của chúng vớiphân tử nước của vỏ hydrad của chúng Sự đi qua màng của các chất tan

có cực hoặc ion có thể thực hiện được nhờ protein màng hạ thấp nănglượng hoạt hoá cho sự vận chuyển bằng cách cung cấp con đường xen kẽđối với các chất tan đặc biệt thông qua lớp kép lipid Protein màng làmtăng tốc độ chuyển động của dung dịch qua màng nhờ sự thẩm thấu đượcgọi là chất vận chuyển hay enzym thấm lọc

Vận chuyển chủ động

Sự vận chuyển chủ động gây ra sự chuyển động chất tan ngược với gradiennồng độ do đó không xảy ra sự tích tụ chúng Vận chuyển này dẫn tới tíchluỹ chất tan ở trong một phía của màng Người ta chia thành hai loại vậnchuyển chủ động: sơ cấp và thứ cấp Trong vận chuyển chủ động sơ cấp, sựtích luỹ chất tan gắn liền trực tiếp với phản ứng toả nhiệt Sự vận chuyểnchủ động thứ cấp diễn ra khi vận chuyển thu nhiệt của một chất tan đượcgắn liền với dòng toả nhiệt của chất tan khác đã được bơm lên nguyên vẹnnhờ sự vận chuyển chủ động sơ cấp Loại vận chuyển này được tăng cường

và điều khiển nhờ enzym ATP Thông thường, vận chuyển chủ động tiêu

tốn nhiều năng lượng Nhiều tế bào động vật duy trì nồng độ Na+ thấp

Loại ion Trong tế bào (mM) Ngoài tế bào (mM)

và nồng độ K+ cao hơn so với môi trường xung quanh

Sự không cân bằng này được duy trì nhờ hệ thống vận chuyển tích cực

trong màng sinh chất gồm có enzym Na+K+ − AT P − aza Cứ ba Na+

vận chuyển ra ngoài đổi lại thường là hai K+ vận chuyển vào trong Quátrình này tích điện làm cho màng có hiệu điện thế âm so với bên ngoài Ởthực vật bậc cao, hiệu điện thế giữa trong và ngoài màng cỡ 250mV.Vận chuyển thông qua các kênh ion

Các kích thích khác nhau trên màng sinh chất làm biến đổi nhanh chónghiệu điện thế qua màng dẫn tới sự mở và đóng nhanh các kênh ion

Nhờ chất axetylcholin, kênh ion mở cho các cation Na+ và K+ đi qua,làm giảm nhanh gradient nồng độ và không cho các cation khác cũng nhưtất cả các anion đi qua Tốc độ vận chuyển đi qua kênh rất nhanh Kênh

ion cảm nhận axetylcholin là tiêu biểu của nhiều kênh ion trong tế bào và

sản sinh hoặc trả lời tín hiệu điện: Nó có cửa mở trả lời cho sự kích thích

và một cơ chế giới hạn thời gian đóng cửa Thế tín hiệu axetylcholin là

nhất thời-một tín hiệu quan trọng cho sự dẫn có dấu hiệu điện Để hiểutại sao sự vận chuyển có chọn lọc của ion sinh ra một hiệu điện thế màng

tế bào, ta xét thí nghiệm hình 1.2 dưới đây:

Một màng ngăn cách hai ngăn chứa hai dung dịch muối có nồng độkhác nhau Ngăn phải là dung dịch KCl 15 mM, ngăn trái là dung dịch

KCl 150 mM Một volt kế được nối với hai ngăn để đo hiệu điện thế giữahai ngăn Nếu màng tế bào không có các kênh ion, không có dòng ion nàođược khuếch tán qua màng và giữa hai ngăn không có sự chênh lệch điệnthế Trên thực tế, màng tế bào có nhiều protein xuyên màng đóng vai trò

các kênh vận chuyển ion như kênh Na+, K+, Kênh K+ cho phép ion K+

đi qua nhưng ngăn chặn các loại ion khác như Cl −, sự vận chuyển này là

do cơ chế khuyếch tán gây ra bởi gradient nồng độ Dòng ion dương khuếchtán có xu hướng tập trung ở ngăn phải hình 1.2c gây ra một sự tích điệndương ở ngăn phải và âm ở ngăn trái Sự dư thừa các ion này chỉ xuất hiện

ở khu vực gần màng bởi các điện tích trái dấu hút nhau Kết quả là, mộtđiện trường trên màng được sinh ra kèm theo sự chênh lệch điện thế giữangăn phải và ngăn trái, ngăn trái có điện thế âm so với ngăn phải Trạngthái cân bằng được thiết lập nhanh chóng ứng với độ chênh thế xác địnhkhi các yếu tố gây ra dòng khuếch tán cân bằng nhau: đó là gradient nồng

độ và điện thế trên màng Đây là loại màng bán thấm, về chức năng thìgiống với một tụ điện gồm phần điện môi (lõi ưa nước) và phần bản tụ(các nhóm đầu cực phospholipid và các ion trong dung dịch) Ở trạng tháicân bằng, hiệu điện thế cân bằng liên hệ với nồng độ khối cation của hai

ngăn bởi phương trình Nernst [6]: V K = RT ZF ln [K] l

[K] r

với R là hằng số khí, F là hằng số Faraday, T là nhiệt độ tuyệt đối, Z là

số điện tích ion (Z K = +1) và [I] là nồng độ mol của ion trong dung dịch

Với các nồng độ như ở bảng 1.1, điện thế xuyên màng cỡ −30 → −70mV

Điện thế trên bề mặt của đa số các tế bào động vật là không thay đổi theothời gian Chỉ riêng với các tế bào thần kinh và tế bào cơ là các loại tế bào

sử dụng xung điện lan truyền đi trong việc điều khiển hoạt động dựa trên

sự thay đổi đột ngột của điện thế xuyên màng

Quá trình đóng, mở của các kênh ion là quá trình bột phát xảy ra trongthời gian ngắn cỡ ms Bằng kỹ thuật kẹp mẩu (patch clamping), người ta

có thể nghiên cứu hoạt động của từng kênh ion đơn lẻ Kỹ thuật này chophép ta xác định lượng ion ra vào một kênh mở và thời gian đóng mở củakênh

Ví dụ như đối với kênh Na, kênh này dưới tác dụng của xung điện có

thể mở ra trong vài ms và trong mỗi ms, khoảng 9900 ion Na+ tràn quakênh này (hình 1.3 là sơ đồ mô tả dòng ion qua các kênh Chỗ hõm sâuứng với sự mở kênh Những sự dao động nhỏ khác là do nhiễu nền.)

Hình 1.2: Thí nghiệm phát hiện vai trò của các kênh ion

Hình 1.3: Sơ đồ dòng ion đi qua một kênh theo thời gian

và của các màng của tế bào và (3) Một vài đặc trưng của sự vận chuyểnphân tử.

Hiện tượng điện từ thầm hoá (electropermeabilization hay tion) của tế bào đã được biết đến từ vài thập kỷ và gần đây đã nhận được

electropora-sự quan tâm của những nghiên cứu về tế bào và các mô Rất nhiều quansát ban đầu đã đề xuất rằng một vài loại "phá vỡ do điện " có thể xuất hiệntrong các màng được kích thích điện Gần mười năm sau đó, các báo cáo

đã đưa về sự việc các xung điện có thể giết chết các vi sinh vật và không

sinh nhiệt Và không lâu, với việc tìm ra nhờ các túi sinh học, giới khoahọc đã đánh dấu một một mốc quan trọng về hiện tượng electroporation.Những nghiên cứu thực nghiệm sau đó đã được thúc đẩy nhanh hơn, nhưviệc khám phá ra hệ thống vận chuyển các phân tử trong tế bào máu và

sự tăng độ dẫn của một màng cụ thể lên khoảng 1 Scm − 2 trong 1 µs khi

cho một xung điện mạnh tác dụng lên màng Khi nghiên cứu vấn đề này,người ta đã chỉ ra rằng trường điện tác dụng lên phần lipid của màng tếbào Sự mô hình hoá các hệ lipid trở thành vấn đề rất được quan tâm bởi

vì nó cho phép tìm hiểu về cơ chế phân tử của hiện tượng electroporation.Như vậy, cách hiểu của ta là hiện tượng học, vì nó dựa trên sự đo đạcdòng điện chạy qua các màng kép và dựa trên sự vận chuyển phân tử vàotrong hoặc ra ngoài các tế bào, phụ thuộc vào các xung điện Rất nhiều thínghiệm đã quan sát được có thể gọi là hiện tượng "electropermeabilization"của màng, ví dụ như sự tăng đáng kể độ từ thẩm (permeability) hoặc độdẫn (conductivity) và trong một vài trường hợp là sự gián đoạn cơ học.Bằng chứng trực tiếp cho điều này không tồn tại ở mức màng Tuy nhiên,

có những bằng chứng gián tiếp về chúng Những kết quả quan sát bằng kínhhiển vi electron chỉ ra rằng sự thay đổi cấu trúc nội màng phải từng xảy

ra, nhưng không phản ảnh các điểm khuyết sơ cấp (the primary defects)hay còn gọi là các lỗ được gây ra bởi hiệu điện thế màng tăng cao Tóm lại,những bằng chứng gần đây chỉ ra hiện tượng electroporation không nhữnggây nên sự tăng đột ngột độ dẫn điện (hoặc độ từ thẩm) mà còn giải thíchcho sự đứt gãy ngẫu nhiên của màng phẳng

Những tài liệu về hiện tượng electroporation chủ yếu bắt nguồn từ nhữngthí nghiệm được tiến hành trên ba hệ thống: (1) Sự treo tế bào, (2) Các tếbào riêng rẽ, và (3) các màng lipid kép phẳng Mỗi một trong ba hệ thốngnày có những ưu điểm và những hạn chế riêng Một đặc trưng chung nhất

và cũng là quan trong nhất là màng tế bào đóng vai trò rất lớn trong việckhuếch đại điện trường đặt vào Ví dụ, khi tế bào hình cầu có màng không

dẫn được đặt trong điện trường ngoài, E e thì sự phân bố điện thế trongmiền xung quanh tế bào được mô tả bằng phương trình Laplace với những

điều kiện biên thích hợp Nó có nghiệm:

trong đó U là thế màng chuyển, r cell là bán kính và θ là góc giữa mặt trên

màng tế bào nơi U được đo và hướng của − → E e Ở các cực (θ = 0, π), 75%

điện thế tập trung ở vùng gần tế bào, dọc theo các màng của chúng Cường

độ điện trường của màng chuyển, E m , lớn hơn so với E e Độ khuếch đại

tương ứng với sự tập trung trường này là E m /E e = 1.5r cell /h = 2 × 103

đối với r cell = 10µm và độ dày của màng là h ≈ 5 × 10 −7 cm Điều này là

hệ quả của việc vùng nội bào là cân bằng điện thế Vì vậy, nếu điện thế

màng chuyển đạt được 0.5V đối với một bán kính tế bào khoảng 10µm thì

ta cần một trường khoảng 300 V cm −1

Để làm sáng tỏ cơ chế của hiện tượng electroporation, một vài thuộctính của các màng kép phẳng nhân tạo đã được khai thác Thứ nhất, sựkhuyếch đại là lớn hơn rất nhiều bởi vì tất cả sự chênh lệch điện thế giữa

các điện cực xuất hiện ngang qua màng Thời gian tác dụng thích hợp, τ chg,

là một vài microgiây Vì vậy, đối với sự nghiên cứu các xung điện ngắn,

khoảng xung tác dụng cùng độ lớn với τ chg, sự chênh lệch điện thế toànphần qua các điện cực không xuất hiện ngang qua màng và điều này cũngbao gồm cả điện trở của đường dẫn điện Đối với các xung điện dài hơn,toàn bộ sự chênh lệch điện thế về cơ bản là xuất hiện giữa các điện cực

ngang qua màng Ở đây, sự khuếch đại là (L electrode /h) trong đó L electrode

là khoảng cách giữa các điện cực và h là độ dày của màng Điều này có

nghĩa là để nhận được hiệu điện thể màng chuyển là 0.5V, phải có nửa voltđược đặt vào các điện cực Tuy nhiên, khi hiện tượng electroporation bắtđầu, sự phân chia điện thế sẽ xuất hiện bởi vì sự giảm nhanh của điện trởmàng và điện trở cố định của môi trường ngoài, các điện cực và điện trởlối ra của máy phát xung Điều này dẫn tới sự giảm điện thế qua màng

2.1 Trạng thái không thuận nghịch của hiện tượng

electroporation

Một đặc trưng quan trọng trong cấu hình thực nghiệm của lớp màng képphẳng là sau sự tích điện của màng, điện thế của các điện cực và điện thếchuyển màng trở nên cân bằng nhau, nếu điện trở của màng lớn ở thờiđiểm trước khi các lỗ được tạo thành trên màng

Các đo đạc thực nghiệm về dòng qua màng chuyển, I(t) chỉ ra rằng tiếp theo sự chuyển trong điện thế được đặt vào các điện cực, U0 sau quá trình

tích điện ở màng, một dòng ổn định sẽ xuất hiện, phụ thuộc vào U Sau

đó, dòng sẽ dao động δI do sự tăng một chiều I tới giá trị bão hoà Trong

miền bão hoà của I, trên màng bị thủng (rupture) Điều này được khẳng

định bằng việc hiệu điện thế U giảm và dòng I qua các lỗ màng có giá trị

giống như không có màng Nếu một màng mới được tạo ra và ta lặp lại thínghiệm này thì dòng I được sản ra vẫn có giá trị cũ, tuy nhiên, thời gian

sống của màng, τ m (được định nghĩa là thời gian từ khi điện thế ở mức

0 đến khi lên mức 1 của sự tăng dòng mạnh) thường sẽ khác Đặc trưngcủa các thăng giáng, và khoảng thời gian hiện tượng thăng giáng diễn ra,cũng khác nhau Tóm lại, độ dẫn và thời gian sống của màng đều thể hiệnnhững thuộc tính biến thiên ngẫu nhiên Đó là kết luận chính để có thểnói rằng hiện tượng tạo lỗ trên màng không có cơ chế hoàn toàn tất định

Thêm vào đó, khi U tăng thời gian sống trung bình của màng được nhận

thấy là giảm đi rất nhanh Trong một nghiên cứu điển hình, màng lipid của

não được sử dụng với điện thế bước V0 = 0.4V [8] Thời gian sống trung

bình quan sát thấy là ¯τ ≈ 1s Dòng trong trạng thái cân bằng trước khi

cấu trúc màng bị phá vỡ là I ss = 5 × 10 −9 A và dòng sau khi màng thủng

là I sat = 5 × 10 −5A (bị giới hạn bởi điện trở của các lỗ (chamber)) Trongsuốt thời gian sống, một màng sẽ trải qua hai trạng thái: (1) Trạng tháidòng cân bằng và (2) Trạng thái dòng thăng giáng Đôi khi, màng chuyển

từ trạng thái thăng giáng trước khi bị thủng về trạng thái ban đầu của nó,

và (nếu độ rộng xung không quá dài) màng vẫn nguyên vẹn Nếu có một

điện thế lớn được đặt vào màng trong một thời gian ngắn, thì màng banđầu thường chuyển sang trạng thái bị kích thích dài riêng biệt (khoảng 10phút), được đặc trưng bởi độ dẫn và thăng giáng dòng lớn thậm chí ở thế

U thấp hơn Trạng thái đặc biệt này được gọi bằng thuật ngữ "Trạng thái

ứng suất" Hiện tượng phá vỡ cấu trúc không thuận nghịch (thủng) cũngđược nghiên cứu bằng các dùng kỹ thuật xung điện [9] Trong nghiên cứu

xung điện đầu tiên, màng được tích điện có U = 0.1V (độ rộng xung 400

ns) Sự phóng điện rất thấp Trong thí nghiệm khác, một xung có cùng

độ rộng nhưng màng được tích hiệu điện thế 0.4V, sau 300 đến 400 µs U

giảm đến 0 theo hình sigma do hiện tượng thủng

Để xác định cơ chế thủng trên màng, cần làm rõ sự phụ thuộc của ¯τ vào

rất nhiều các thông số, đặc biệt là điện thế màng chuyển U(t) Một số kết quả điển hình: Điện thế tăng từ 300 đến 600 mV, phụ thuộc vào log10τ U¯gần như tuyến tính Do đó, khi tăng U đến 100 mV thì ¯τ giảm đi 10 lần.

Với hiệu điện thế U lớn hơn, sự giảm ¯ τ tương ứng với sự tăng U trở nên

kém rõ ràng hơn Ví dụ, khi U tăng từ 200 mV đến 1.4 V, ¯ τ m giảm hơn

sáu lần độ lớn, đạt tới khoảng 10µs Trạng thái này phù hợp với lý thuyết

về lỗ sẽ được trình bày trong phần 2.2

electropo-ration

Phương pháp phục hồi điện tích cũng đã được dùng để chỉ ra rằng khi

màng cholesterol bị oxy hoá được tích điện nhanh (400ns) đạt khoảng 1V,

độ lớn của điện trở của màng giảm thuận nghịch xuống gần chín bậc [9]

Điểm đáng chú ý là điện thế không thể vượt quá U ≈ 1.2V dù cường độ

xung tiếp tục tăng mạnh Thêm vào đó, sau khi phóng điện, màng vẫn cânbằng về mặt cơ học, và có thể lặp lại như quá trình đã diễn ra Do đó, ta có

thể quan sát được hiện tượng electroporation khả nghịch (gọi tắt là REP)

trên màng phẳng trong thời gian đầu Bốn loại biểu hiện có thể được phân

Trạng thái điện tích đặc trưng Cường độ xung

"Sự đánh thủng thuận nghịch"; Lớn nhất

màng phóng điện đến khi U=0

Sự đánh thủng không hoàn toàn Nhỏ hơn

màng phóng điện đến khi U=0

Sự thủng (về cơ học); Nhỏ hơn nữa

Sự phóng điện chậm theo hình xich-ma

Màng tích điện không có U Nhỏ nhất

Bảng 2.1: Bốn trạng thái khác nhau của hiện tượng electroporation trên màng kép phẳng

Hiện tượng electroporation khả nghịch tiếp đó được nghiên cứu dựa trên

kỹ thuật kẹp (clamp) điện thế Trạng thái điển hình của I(t) đối với các

ứng dụng thành công trong 20 µs của các xung có điện thế điều chỉnh ở các

độ lớn khác nhau đối với màng cholecterol bị oxy hoá liên quan đến mộtvài đặc trưng hồi dòng của I(t) Ban đầu dòng điện nạp trội hơn nhưng

nó nhanh chóng phân rã Cùng lúc đó, một dòng dẫn của màng chuyển

xuất hiện, và chỉ sau khoảng 5 µs nó trở thành dòng chủ đạo Cuối cùng,

ở điện thế U = 0.7V dòng dẫn đạt khoảng 5 × 10 −5 A, tương ứng với độ

dẫn G = 10 −5 đến 10−6 S Vì vậy, G(t) tăng vượt mức độ dẫn ban đầu,

sự tăng G(t) là khả nghịch, và dòng I(t) đạt giá trị tương tự khi áp dụnglại xung giống như lần đầu Tuy nhiên, một xung dài có thể biến hiệntượng khả nghịch của G(t) trở thành không thuận nghịch Sự tăng cường

độ xung, V0 dẫn tới sự tăng nhanh của dòng I(t) Đáng chú ý, hiện tượngelectroporation của tế bào cũng liên quan đến trạng thái khả nghịch giốngtrạng thái khả nghịch của màng cholesterol bị oxy hoá

Các lỗ thấm nước (sau đây sẽ gọi là lỗ) về mặt điện tích có thể được coinhư là có năng lượng tương ứng với sự thay đổi của điện dung riêng của

nó, C LW, như lipid được thay bằng nước [14] Người ta thấy rằng, việc các

ion đi qua các lỗ nhỏ trên màng dung môi là không khả dĩ, vì vậy, lỗ cóthể dưới dạng một tụ điện đầy nước hơn là đầy chất điện phân Tuy nhiên,với các lỗ thấm nước nhỏ, thậm chí nếu khối chất điện phân tồn tại trong

các lỗ, độ từ thẩm có thể là ² ≈ 70²0, chỉ khác 10% so với nước tinh khiết

Thêm vào đó, điện trở của lỗ, R p = ρ e h/πr2, có thể vẫn lớn so với điện

trở truyền, vì vậy, điện thế dọc lỗ có thể rất gần với U Vì điều này, năng

lượng tự do của sự tạo lỗ trong trường điện của màng chuyển là:

∆W p (r) = 2γπr − Γπr2 − 0.5C LW U2πr2 (2.2)

U là điện thế trung bình của màng trong không gian, trong khi sự giảm

điện thế màng cũng bao gồm cả điện thế ở lỗ dẫn là U p Do đó, sự thayđổi của điện trở riêng của lỗ do nước đẩy lipid để hình thành một lỗ là:

Với, ² w = K w ²0 là hằng số điện môi của nước tương, và ² m = K m ²0 là hằng

số điện môi của lipid trong màng tế bào Hằng số C0 là điện trở trên một

đơn vị diện tích màng có lỗ trống, ví dụ C0 = ² m /h, h là độ dày của màng

mang điện Điển hình là khi K m ≈ 2, K w ≈ 80, thì ∆W p (r, U ) giảm vì U

tăng

Như đã nói ở trên, hàm ∆W p (r, U ) tạo ra một hàng rào chắn, nhưng chiều cao của hàng rào chắn, tương ứng với bán kính lỗ, r c, cả hai cùng

giảm đi khi U tăng vì điện môi trong lỗ có hằng số điện môi lớn hơn hằng

số điện môi của lipid trong màng tế bào Điều này giải thích hợp lý cho

sự thủng màng tế bào: đối với các U lớn hơn, chiều cao của hàng rào chắn giảm và khả năng để màng tạo lỗ với r > r c tăng Sự xuất hiện của lỗ đơngần tới hạn đủ để gây ra sự thủng màng vì lỗ đó có thể mở rộng đến khi

nó đạt tới độ mở vĩ mô xác định màng tế bào

Bán kính tới hạn của lỗ, r c, tương ứng với hàng rào chắn lớn nhất,

∆W p.c = ∆W p (r c , U ) xác định dưới dạng:

Γ + 0.5C LW U2∆W p.c ∆W p.c = πγ2

Γ + 0.5C LW U2 (2.4)

Bán kính lỗ tới hạn sẽ nhỏ hơn nếu U tăng Đáng chú ý hơn, năng lượng

lỗ tương ứng, ∆W p,max cũng giảm Thông thường, sự vượt qua rào chắn

năng lượng có sự phụ thuộc phi tuyến vào các thông số của hệ như là U,

vì sự phụ thuộc vào một hoặc nhiều hệ số Boltzmann Vì thế, sự độc lập

phi tuyến vào U của nó là khả dĩ Cụ thể là, sự tăng vừa đủ của U có thể

thay đổi sự ổn định và tăng khả năng thủng của màng Mật độ lỗ trongkhoảng bán kính lỗ được cho bởi:

∂r

¶

(2.5)Những ảnh hưởng của điện thế chuyển màng đóng vai trò rất quan trọngtrong sự thay đổi của màng cũng như toàn bộ tế bào sinh học