Tài liệu Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm ppt

Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm Chẩn đoán huyết thanh học •Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gàHI Chẩn đoán virus học •Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng •Giám định

Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm

gia cầm

Chẩn đoán huyết thanh học

•Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) Chẩn đoán virus học

•Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng

•Giám định virus bằng kỹ thuật PCR

Chẩn đoán virus học

Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm

tăm bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào

trong ống nhựa đã khử trùng chứa 1-2 ml dung dịch bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế

sự phát triển của vi khuẩn

• Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu ,

nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì

phải giữ ở nhiệt độ -700 C

Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm

thành huyễn dịch 10%

• Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi

• Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm

Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ

1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong

tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng sinh tác dụng Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm.μm hoặc 0,22μm.m hoặc 0,22μm hoặc 0,22μm.m

Phân lập virus trên phôi gà

• Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm

vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi

• Tiêm truyền trên phôi gà

• Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên

• Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi

• Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ

đã đục vào túi niệu lượng 0,1-0,2 ml huyễn dịch/ trứng Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng

• Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin

Phân lập virus trên phôi gà

• Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày

• Thu hoạch nước trứng

• Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ

ấm -200 C trong 30 phút

• Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía buồng hơi

• Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm

10ml.

• Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm

-700 C

• Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA Nếu

âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần

Phản ứng RT-PCR

Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL

• Cho 75μm hoặc 0,22μm.0 μm hoặc 0,22μm.l bệnh phẩm vào ống 1,5μm hoặc 0,22μm ml

• Thêm 25μm hoặc 0,22μm.0 μm hoặc 0,22μm.l TRIZOL.

Phản ứng RT-PCR

Bước1: chiết tách RNA từ bệnh phẩm bằng TRIZOL

• Hút 45μm hoặc 0,22μm.0-5μm hoặc 0,22μm.00 μm hoặc 0,22μm.l sang một ống mới

• Thêm 5μm hoặc 0,22μm.00 μm hoặc 0,22μm.l iso propanol, trộn bằng pipet rồi

giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút

• Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời gian 5μm hoặc 0,22μm phút

• Thêm 1ml ethanol 75μm hoặc 0,22μm.% rồi ly tâm với tốc độ

10000 vòng/ phút trong thời gian 5μm hoặc 0,22μm phút

• Để khô ở nhiệt độ phòng

• Cho thêm 20 -60 μm hoặc 0,22μm.l nước

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc )

Nguyên liệu :

• Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog

#210212) gồm:

• Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT-PCR (chứa Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT

và HotstarTaq TM DNA polymerase)

• Dung d ịch QIAGen Onestep RT-PCR, 5μm hoặc 0,22μm.X.

• Dung d ịch Q-solution- 5μm hoặc 0,22μm.X.

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc )

• Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại

• Nước RNAse- Free.

• Chất ức chế RNAse( 40U/ μm hoặc 0,22μm.l).

• Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5μm hoặc 0,22μm.ml.

• Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μm hoặc 0,22μm.l.

• Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút

Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc )

• Máy lắc vortex.

• Máy nhân gen

• RNA của virus kiểm tra

• RNA đối chứng dương tính

• Primer forward và primer reverse

• Primer đặc hiệu H5μm hoặc 0,22μm.N1: H5μm hoặc 0,22μm.N1F và H5μm hoặc 0,22μm.N1R.

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1 bước )

Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )

nhân gen

– 42o C trong 0,5μm hoặc 0,22μm phút

– 5μm hoặc 0,22μm.00 C trong 30 phút

– 95μm hoặc 0,22μm 0 C trong 15μm hoặc 0,22μm phút

Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR

• Ethidium bromide ( 10μm hoặc 0,22μm.g/ μm hoặc 0,22μm.l.)

XC)

Các bước tiến hành

• Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp thạch

• Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5μm hoặc 0,22μm ml a, b, c

• Lấy 5μm hoặc 0,22μm μm hoặc 0,22μm.l các sản phẩm PCR từ các ống phản ứng vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với 2μm hoặc 0,22μm.l dung dịch nạp(GLB)

• Cho 5μm hoặc 0,22μm.μm hoặc 0,22μm.l marker trọng lượng phân tử vào giếng thứ nhất của miếng thạch 1,5μm hoặc 0,22μm.%

Các bước tiến hành

• Cho 7μm hoặc 0,22μm.l sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch theo thứ tự từ a đến c

• Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút

PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực tím có bước sóng 302nm

• Ghi lại hình bằng máy ảnh

Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân tử

• Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong 100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan

• Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc 10μm hoặc 0,22μm.g/μm hoặc 0,22μm.l đổ vào thạch agarose để có hàm lượng cuối cùng là 0,5μm hoặc 0,22μm.μm hoặc 0,22μm.g/ml

của dung dịch nạp (GLB), BPB được sử dụng

rộng rãi như một chất thuốc nhuộm điện di cho axit