BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN xx : BỆNH DO KÍ SINH TRÙNG BONAMIAOSTREAE VÀ BONAMIA EXITIOSA Ở HÀU

Bệnh thủy sản– Quy trình chẩn đoán –Phần XX: Bệnh do Bonamiaostreae và Bonamiaexitiosa ở hàu Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part xx: Infection with Bonamia ostreae/ exi

HÀ NỘI – 2020

Lời nói đầu

TCVN8710-XX:2020do Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị,Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lườngChất lượng thẩm định,Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản- Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8710-7: 2019, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép

- TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

- TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

- TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm

- TCVN8710-19:2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm

- TCVN8710-20:2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm

- TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn streptococcus agalactiae ở cá

Bệnh thủy sản– Quy trình chẩn đoán –

Phần XX: Bệnh do Bonamiaostreae và Bonamiaexitiosa ở hàu

Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure –

Part xx: Infection with Bonamia ostreae/ exitiosa in oysters

CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn

Là bệnh truyền nhiễm ở hàu do kí sinh trùng Bonamia sp gây ra Bonamiaký sinh trong tế bào máu,

gây rối loạn chức năng tế bào và gây chết hàu Bonamia ostreae và Bonamia exitiosalà hai loài phổ

biến gây bệnh ở hàu

2.2

Bonamia ostreae/ Bonamia exitiosa là kí sinh trùng đơn bào nguyên sinh bắt buộcthuộc nhóm

Halosporidia Bonamia sp là những tế bào có thành mỏng, kích thước dao động từ 2 µm - 5µm, phát

triển nhân lên trong tế bào máu theo cơ chế trực phân Trong giai đoạncảm nhiễm, có thể quan sát các

tế bào này trong tế bào máu hoặc tế bào biểu mô liên kếtnhư mang, màng áo, ruột

2.3 Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic.

- Ct(Threshold cycle): chu kỳ ngưỡng;

- HE(Haematoxylin-Eosin): Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng Haematoxylin-Eosin;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

-Realtime PCR (Realtime Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực;

3.2.4 Kít nhân gen cho phản ứng PCR

3.2.5 Kít nhân gen cho phản ứng realtime PCR

3.2.6 Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate – EDTA)hoặc TBE (Tris-acetate – EDTA).

3.2.7 Chất nhuộm màu.Ví dụ như Gel red hoặc SYBR safe 1

3.2.8 Chất đệm tải mẫu

3.2.9 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10 Thang chuẩn ADN (Ladder), phân vạch 100 bp

3.2.11 Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.12 Agarose

3.2.13 Mẫu chuẩn dương,được chứng nhận là dương tính hoặc ADN chuẩn dương tách chiết từ mẫu

chuẩn dương có giá trị Ct (Chu kỳ ngưỡng đã biết trước)

3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

3.3.1 Dung dịch Formalin, 10 %(xem A.1, Phụ lục A)

3.3.2 Xylen

3.3.3 Dung dịch Davidson (xem A.2, Phụ lục A).

3.3.4 Thuốc nhuộm Haematoxylin(xem A.3, Phụ lục A)

3.3.5 Thuốc nhuộm Eosin (xem A.4, Phụ lục A).

3.3.6 Parafin, có nhiện độ tan chảy từ 56 oC đến 60 oC

3.3.7 Keo dán lamen

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ chung

4.1.1 Nồi hấp vô trùng, có thể duy trì ở nhiệt độ 121°C.

4.1.2 Tủ sấy, có thể duy trì ở nhiệt độ 180 °C.

4.1.3 Tủ hút khí độc

1 Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này Khi sử dụng sản phẩm khác nên tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.4 Buồng cấy an toàn sinh học, cấp I, II

4.1.5 Máy đồng nhất mẫu

4.1.6Tủ mát, có thể duy trì ở nhiệt độ 2 °C - 8 °C

4.1.7Tủ lạnh đông, có thể duy trì ở nhiệt độ âm 20 °Ctới âm 80 °C

4.1.8 Bể điều nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C

4.1.9Dao mổ, panh và kéo,vô trùng.

4.1.10 Ống nghiệm vô trùng, dung tích 15 ml, 45 ml.

4.1.11 Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml.

4.1.12 Túi lynon, vô trùng

4.2Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, realtime PCR 4.2.1 Máy nhân gen PCR

4.2.2 Máy realtime PCR

4.2.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 15.000 rpm

4.2.4 Máy lắc trộn vortex,có thể hoạt động với tốc độ từ 200 rpm đến 2.500 rpm 4.2.5 Máy ly tâm nhanh spindown

4.2.6 Hệ thống điện di, gồm bộ nguồn, lược tạo giếng và bể chạy điện di

4.2.7 Máy đọc gel

4.2.8 Ống PCR, 0.2 ml,không có RNase/DNase

4.2.9 Ống eppendorf,không có RNase/DNase.

4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp nhuộm tiêu bản HE

4.3.1 Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể

4.3.2 Hệ thống xử lý mẫu mô tự động

4.3.3 Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 oC đến 65 oC

4.3.4 Khay sắt (loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể).

4.3.5 Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 oC đến 4 oC.

4.3.6 Máy cắt tiêu bản, có thể cắt tiêu bản với độ dày từ 2 µm đến 5 µm.

4.3.7 Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 oC đến 65 oC

4.3.8 Phiến kính, vô trùng

4.3.9 Lamen

4.3.10 Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X.

4.3.11 Máy sấy mẫu

4.3.12 Keo Canada Balsam

4.3.13 Lọ thủy tinh tối màu, 200 ml, nút mài

Bonamia ostreae là nguyên nhân gây chết hàu hàng loạt tại các nước Châu Âu:Pháp, Ireland,

Ý, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kì, Tây Ban Nha, Anh, Canada Mỹ, Úc và Newzeland.

Bonamia exitiosađã được phát hiện trên hàu ở New Zealand, South Island, Úc, Tây Ban Nha, Ý,

Pháp và Anh

- Loài mắc bệnh:

Loài hàuOstrea edulis là loài duy nhất bị bệnh do nhiễmtự nhiên với Bonamia ostreae Sao biển (Ophiothrix fragilis), hàu thái bình dương (Crassostrea gigas) được xác định là vật chủ trung

gian làm lây lan mầm bệnh

Các loài cảm nhiễm với Bonamia exitiosa bao gồm Ostrea chilensis, O angasi, O edulis, O stentina Có nghiên cứu cho rằngC gigascó thể đóng vai trò là kí chủ trung gian mang mầm bệnh B exitiosa.

- Giai đoạn cảm nhiễm:

Hàu ở mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm với Bonamia, ấu trùng của hàu cũng có thể bị nhiễm BonamiaostreaevàBonamiaexitiosa Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ở hàu 6 tháng tuổi thường cao

hơn so với hàu ở giai đoạn khác

Hàu có chiều dài ≥ 58 mm thường bị nhiễm với Bonamiaexitiosa,ấu trùng của hàu cũng có thể bị

- Đại thực bào bởi các tế bào máu là đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại tác nhân gây bệnh ở

nhuyễn thể Tuy nhiên, B ostreae có thể sống sót và nhân lên trong tế bào đại thực bào, sản sinh độc

tố và hủy hoại tế bào máu Bonamia phát triển ra ngoài tế bào, gây rối loạn sinh lý tế bào, gây chết hàu.

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh thường không thể hiện dấu hiệu lâm sàng Hàu có biểu hiệnsinh trưởng phát triển chậm.Khi cường độ nhiễm kí sinh trùng ở mức cao,hàu mở vỏ và chết

5.3 Bệnh tích

- Hàu gầy rạc, thịt mỏng nhiều nước, tim to, co màng áo;

- Tuyến tiêu hóa nhợt màu,đôi khi có tổn thương tạo thành áp xe;

- Trong một số trường hợp, hàu bị nhiễm Bonamiaxuất hiện màu sắc nhợt ngả vàngtrên mang và

màng áo

- Quan sát mô học dưới kính hiển vi quang học cho thấy sự xâm nhập các tế bào máu tại các mô liênkết bị tổn thương như mang, màng áo, dạ dày, tuyến ruột Có thể quan sát thấy kí sinh trùng trongcác tế bào máu, hoặc tại các mô liên kết có kích thước rất nhỏ 2 µm - 5 µm hình cầu hoặc hình ovan

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu, bảo quản mẫu

6.1.1 Lấy mẫu

Số lượng hàu trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của hàu:

– Hàu giống: lấy từ 10 – 15 con/ mẫu cho vào túi lynon (4.1.12)

– Hàu trưởng thành: lấy từ 5 conđến 10 con/mẫu cho vào túi lynon (4.1.12)

Đối với mẫu dùng cho xét nghiệm vi thể:dùng panh, kéo vô trùng (4.1.9) cắt mẫu bệnh phẩm của mômang, màng áo, tuyến tiêu hóa với kích thước khoảng 3 mm và cố định mẫu tại hiện trường trong dungdịch formalin 10 % (3.3.1) hoặc dung dịch Davidson (3.3.3)

CHÚ Ý: Lấy hàu còn sống, sắp chết hoặc mới chết

6.1.2 Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 oC và vận chuyển tới phòng thí nghiệm trong vòng24 h

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 oC(4.1.7), hoặc trong cồn Ethanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1)

Đối với hàu còn sống hoặc chưa tách vỏ:

- Dùng dao mổ (4.1.9) cắt cơ mở vỏ và tách làm hai.Dùng pank, kéo vô trùng cắt lấy khoảng 1 g mẫubệnh phẩm từ mang, màng áo, ruột và các vị trí mô thương tổn khác

Mẫu được đồng nhất với dung dịch PBS (3.1.2) để tạo thành huyễn dịch 10 % Mẫu được chia thànhhai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ ở tủ âm 20 °C (4.1.7)

CHÚ Ý: dùng panh, kéo vô trùng tại các mô khác nhau, tránh lây nhiễm.

Trình tự cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho Bonamia sp, B ostreae và B exitiosa (xem Bảng C.1, Phụ

lục C) Cách chuẩn bị mồi và mẫu dò như sau:

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh 8.000 rpm (4.2.3) trong 30 s để mồilắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE(3.2.9) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò gốc ở nồng độ 100 µM

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease(3.2.11) (20 µl mồi gốc và 80 µl dung dịch TE (3.2.9) hoặc nước tinh khiết không có nuclease)

6.2.4 Thực hiện phản ứng realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã chuẩn bị (6.2.3) và pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướngdẫn của bộ kit (xem Bảng C.2, Phụ lụcC)

- Hỗn hợp nhân gen: cho 20 l vào mỗi ống PCR 0,2 ml (4.2.8);

- Mẫu đối chứng dương: cho 5 l ADNchuẩn dương (3.2.13)vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhângen;

- Mẫu đối chứng âm: cho 5 l nước cất vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: cho 5 l ADN vừa tách chiết (6.2.2) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm nhanh (4.2.5), đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.2.2);

- Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt (xem BảngC.3, Phụ lục C)

CHÚ THÍCH:

1)Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

2) Để tiết kiệm chi phí xét nghiệm, sử dụng cặp mồi, mẫu dò phát hiện Bonamia sptrước, nếu âm tính thì kết luận âm tính.

Trường hợp dương tính, tiến hành xác định loài bằng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu tương ứng.

3) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm chạy cùng với mẫu kiểm tra.

6.2.5 Đánh giá kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct  30(± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có giá trị Ct

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị Ct  35 được coi là dương tính;

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

3) Mẫu có giá trị 35<Ct40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại, hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác đểkhẳng định Nếu vẫn còn nghi ngờ, cần lấy mẫu lại để xét nghiệm kết hợp với điều tra dịch tễ học đểđưa ra kết luận cuối cùng

6.3 Phát hiện Bonamia bằng phương pháp PCR

6.3.1 Tách chiết ADN

Thực hiện theo điều6.2.2

6.3.2 Thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng PCR phát hiện gen SSU-rDNA đặc hiệu cho Bonamia sp và xác định các loàiB ostreae và

B exitiosa, các bước được thực hiện như sau:

Chuẩn bị mồi ở nồng độ 15 μM với nước không có Dnase/Rnase:thực hiện theo điều6.2.3 M với nước không có Dnase/Rnase:thực hiện theo điều6.2.3

Trình tự mồi phát hiện Bonamia sp, B ostreae và B exitiosa(xem BảngD.1,Phụ lụcD).Pha hỗn hợp

phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (xem Bảng D.2, Phục lục D)

- Hỗn hợp nhân gen: cho 17,5l vào mỗi ống PCR 0,2 ml (4.2.8);

- Mẫu đối chứng dương: cho 2,5l ADN chuẩn dương (3.2.13) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhângen;

- Mẫu đối chứng âm: cho 2,5 l nước cất vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: cho 2,5 l ADN vừa tách chiết (6.3.1) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm nhanh (4.2.5), đặt ống PCR vào máynhân gen (4.2.1);

- Chạy phản ứng RT-PCR theo chu trình nhiệt cài đặt (xem BảngD.3, Phụ lục D) Sản phẩm thu đượcsau phản ứng PCR đem điện di (4.2.6) để đọc kết quả

CHÚ THÍCH:

1) Mẫu đối chứng dương và đối chứng âm phải được tiến hành cùng với mẫu xét nghiệm.

2) Nhiệt độ và thời gian của phản ứng PCR có thể thay đổi tùy theo kít nhân gen Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.3Chạy điện di

6.3.3.1 Chuẩn bị thạch điện di

Pha 1,5 g bột agarose (3.2.12) với 100 ml dung dịchTBE1X hoặc TAE 1X (3.2.6), rồi đun nóng trong lò

vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn Khi hỗn hợp nguội khoảng 50 °C, cho chất nhuộm màu ADN (xem3.2.7) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau đó đổ thạch vào khay và cắm lược (4.2.6),độ dày bản gelkhoảng 3 mm - 4 mm, để thạch đông lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.Cho dung dịch đệm TBE 1Xhoặc TAE 1X loài cùng với dung dịch pha thạch (3.2.6) vào bể điện di cho đến khi bản gel được ngậphoàn toàn trong dung dịch

6.3.3.2 Điện di

- Mẫu sau khi khuếch đại (6.3.2) được nhuộm với đệm tải mẫu (3.2.8) rồi trộn đều

- Cho 2 µl ladder (3.2.10) vào giếng đầu tiên

- Cho 5 µl -10 µl mẫu đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu xét nghiệmvào các giếng tiếp theo

- Tiến hành điện di trong khoảng 45 min ở hiệu điện thế 90 V -100 V.

Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV (4.2.7) có bước sóng 590 nm để đọc kếtquả

Điều kiện của phản ứng:

Phản ứng PCR chỉ có giá trị khi đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đối chứng dương: dương tính với sản phẩm điện di có kích thước đã biết

- Đối chứng âm: âm tính và không có sản phẩm điện di

6.4 Phát hiện Bonamia bằng phương pháp nhuộm HE

6.4.1 Chuẩn bị mẫu

Đối với hàu còn sống hoặc chưa tách vỏ

- Dùng dao mổ vô trùng (4.1.6) cắt cơ mở vỏ và tách làm hai

- Dùng panh, kéo vô trùng cắt mẫu bệnh phẩm của mô mang, màng áo, tuyến tiêu hóa với kích thướckhoảng 3 mm và cho vào dung dịch formalin 10 % (3.3.1) hoặc dung dịch Davidson (3.3.3) theo tỉ lệ1:10trong khoảng từ 24 h đến 72 h.Mẫu được chuyển sang cồn ethanol 70%

CHÚ THÍCH: dùng panh, kéo vô trùng tại các mô khác nhau, tránh lây nhiễm.

6.4.2Xử lý mẫu

Lấy bệnh phẩm đã cố định trong formalin 10 % hoặc Davidson (6.4.1; 6.1.1) cho vào khuôn nhựa(4.3.1)

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm ethanol 70 %(3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min

Ngâm sang ethanol95 %(3.1.1) trong thời gian 30 đến 60 min

Ngâm sang ethanol100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ30 đến 60 min

Ngâm sang ethanol100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ30 đến 60 min

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ60 đến 90 min

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ60 đến 90 min

Ngâm tẩm parafin(3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian 90 min

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ hai, thời gian từ 120 min

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.3.2) Nếu làm thủ công, cần thực hiện các bước xử lý mẫu trong tủ hút khí độc (4.1.3).