TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO Aujeszky’s disease virus (ADV) gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế đồi với ngành chăn nuôi...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*************

Bài tiểu luận

CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

Môn học: Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm GVHD: TS Nguyễn Ngọc Hải

SVTH: Vũ Thị Phương Thảo

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009

Mục lục

I Đặt vấn đề 3

II Tổng quan 3

II.1 Virus Aujeszky 3

II.1.a Tình hình 3

II.1.b Đặc tính, phân loại 4

II.1.c Hình thái và cấu trúc ADV 5

II.1.d Sức đề kháng của ADV 6

II.1.e Dịch tễ học 7

Các loài vật mẫn cảm với ADV 7

Đường lây nhiễm 7

II.1.f Triêu chứng lâm sàng 9

II.1.g Bệnh tích 11

II.2 Phân lập ADV trên môi trường tế bào 11

II.2.a Chuẩn bị mẫu 12

II.2.b Chuẩn bị môi trường tế bào 14

II.2.c Chẩn đoán ADV bằng Shell Vial Assay 15

II.2.d Chẩn đoán ADV bằng 24-Well Plate Cell Culture Assay 15

II.2.e Thí nghiệm của Rafique A Tahir, Sagar M Goyal .17

III Kết luận 18

IV Tài liệu tham khảo 18

I Đặt vấn đề

D Aujeszky’s disease virus (ADV) gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế đồi với ngành chăn nuôi heo vì nó làm tăng tỉ lệ chết và gây

ra những rối loạn sinh sản ở heo (Pensaert and Kluge, 1989) Vì thế cần có một phương pháp chẩn đoán nhanh sự vấy nhiễm của ADV trong các bầy đàn để kiểm soát một cách hiệu quả sự lây nhiễm của bênh bằng cách cách ly và loại bỏ các đàn gia súc nhiễm nhằm làm giảm những thiệt hại về kinh tế mà ADV đã gây ra

D Nhiều phương pháp đã được sử dụng để chẩn đoán sự vấy nhiễm của ADV, bao gồm sự phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy

tế bào, phương pháp miễn dịch peroxidase, phương pháp miễn dịch huỳnh quang, dot-blot, PCR Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng được so sánh về các mặt độ nhậy, độ đặc hiệu, dễ phát hiện, chi phí và tốc độ

D Trong những năm gần đây, sự phân lập virus bằng shell vial assay (SVA) kết hợp với kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang hay miễn dịch peroxidase được sử dụng để phát hiện cytomegaloviruses, herpes simplex virus, respiratory virus Kĩ thuật SVA nhanh, nhậy và là phương pháp đặc biệt đối với sự chẩn đoán các loại virus này (b)

II Tổng quan

1) Virus Ạujeszky

a) Tình hình

D A Aujeszky đã phát hiện ra bệnh này vào năm 1902 ở Hungary trên bò và chó, đặt tên là bệnh “giả dại” vì ở phần lớn các loài động vật mắc bệnh đều có triệu chứng ngứa ngáy và tự cắn xé mình Lợn mắc bệnh không có những triệu chứng này mặc dù chỉ riêng lợn là

kí chủ tự nhiên của virus Các động vật mắc bệnh đều có độ mẫn cảm cao, tỉ lệ chết có thể lên tới 100%

D Ở nước ta, bệnh có từ bao giờ chưa rõ, nhưng từ năm 1975 đến nay bệnh có ở khắp các tỉnh phía Nam và nhiều tỉnh phía Bắc (a)

D Phân bố

• AJD xuất hiện ở hầu hết các quốc gia Châu Âu, Mỹ, Mexico, Cuba, Brazil, Venezuela, Nhật Bản, Đài Loan, Đông Nam Á

• Trong những năm gần đây bệnh đã gia tăng tỷ lệ nhiễm bệnh và trở nên nghiêm trọng tại các vùng có những nông trai chăn nuôi heo tập trung

• Ở Thái Bình Dương, AJD xảy ra ở New Caledonia tới năm

1984, ở Newzealand và ở Polynesia thuộc Pháp (bằng chứng huyết thanh học) tới năm 1999, nó được biết là đã xảy ra ở Samoa, Tonga, Vanuatu, Wallis, Futuna và ở những đàn lợn hoang dã ở Papua New Guinea Chưa bao giờ có báo cáo từ Úc

TM)

b) Đặc tính, phân loại

D Herpesvirus là một loại virus có một lượng DNA lớn và chu kì sinh sản xảy ra trong nhân tế bào Họ Herpesviridae được chia làm 3 họ phụ:

• Alphaherpesvirinae

• Betaherpesvirinae

• Gammaherpesvirinae (i)

D Aujeszky’s disease (AJD), còn được gọi là bệnh giả dại (pseudorabies), là một căn bệnh do porcine herpesvirus-1 [Aujeszky’s disease virus (ADV), pseudorabies virus (PRV)] gây

ra Virus này thuộc bộ Herpesviridae, giống Alphaherpesvirinae

D ADV nhiễm vào hệ thống thần kinh trung ương và những cơ quan khác, ví dụ như cơ quan hô hấp, nhiễm vào nhiều loại động vật có

vú ngoại trừ người và các loài khỉ không đuôi

D Kí chủ tự nhiên của ADV là heo, là một nguồn lây nhiễm tiềm tàng (ngoại trừ heo con dưới 2 tuần tuổi bị chết do viêm não) (g)

c) Hình thái và cấu trúc ADV

Cấu trúc tổng quát của ADV được cho thấy ở hình 1

• Phần lõi bao gồm một sợi đôi DNA dài khoảng 150 kbp được bao bọc bởi một capsid, vỏ (tegument) và vỏ bọc (envelope)

• Bộ gen của ADV bao gồm 2 vùng đơn vị (two unique regions), một đơn vị dài (unique long UL), và một đơn vị ngắn (unique shot US), được cặp sườn bởi 2 trình tự lặp lại, một cái bên trong (an internal one-IRS), một cái ở phía cuối (a terminal one-TRS) Cả

bộ gen đã được Klupp và ctv giải trình tự

• Những gen khác nhau trong bộ gen của alphaherpesvirus được chỉ định bởi 2 kí tự là US hay UL phụ thuộc vào vị trí của nó trong đơn vị dài UL hay đơn vị ngắn US theo sau đó là một con

số, con số chỉ ra vị trí của mỗi gen trong mỗi vùng đặc biệt

• Vỏ capsid của ADV đóng gói và bảo vệ bộ gen Nó bao gồm

162 capsomers, 150 hexon (1 hexon có 6 phân tử VP5 là protein được biểu hiện bởi UL19 (pUL19) và 6 phân tử VP26 (pUL35)

và 12 penton (11 penton bao gồm 5 phân tử VP5, 1 penton 12

phân tử pUL6 và hình thành lỗ xâm nhập hình trụ cho DNA mới sản xuất (newly produced dsDNA), cả hai được liên kết bởi 3 cấu trúc (1 phân tử của VP19C (pUL38) và hai phân tử của VP23 (pUL18) tất cả được xắp xếp trong một hàng rào 20 mặt

• Khoảng trống giữa vỏ capsid và vỏ envelope được lắp đầy với protein tegument Protein tegument quan trọng trong quá trình xâm nhập và nhân lên của virus, xâm nhập màng bao bọc chính của màng nhân và màng của thể golgi

• Vỏ envelope của virus là một màng phospholipids 2 lớp bao gồm 10 glycoprotein (gB, gC, gD, gE, gH, gI, gK, gL, gM, gN)

Vỏ envelope đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết, xâm nhập, đóng gói, thoát ra ngoài Lan truyền giữa các tế bào, sự đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ (f)

d) Sức đề kháng của ADV

D Khả năng sống trong môi trường của ADV rất thấp ADV có thể sống một thời gian ngắn trong môi trường lạnh, ẩm với pH từ 6 đến

8 Môi trường có ánh nắng và khô sẽ giết virus ngay lập tức (c)

D Phần lớn các chất sát trùng, tiêu độc đều có thể tiêu diệt được virus như dung dịch NaOH 1%, trong 6 giờ, formal 3% trong 3 giờ, ở nhiệt độ 60oC virus bị diệt sau 1 giờ

D Virus trong xác chết thối rữa bị diệt sau 10 ngày, trong thịt ướp sau

20 ngày

D Trong nước tiểu lợn bệnh, virus sống 3 tuần, trong chất độn chuồng virus bị bất hoạt trong vòng 8-15 ngày

D Các chất hóa học có hợp chất Clo là thuốc sát trùng có hiệu quả nhất như nước vôi đặc, các chế phẩm Clorua vôi hòa tan trong nước (a)

e) Dịch tễ học

D Các loài vật mẫn cảm với ADV

• Heo là kí chủ chính của ADV, là nguồn lây nhiễm chính cho một phổ rộng kí chủ thứ hai như bò, cừu, chó, mèo, chuột và loài gặm nhấm

• Ngựa, chim, và người có khả năng kháng ADV (c)

D Đường lây nhiễm

• ADV vẫn tồn tại ở dạng tiềm tàng trong suốt thời gian sống của heo bị nhiễm bệnh đã khỏi Sự lây lan bệnh có thể do trực tiếp tiếp xúc giữa heo khỏe

và heo bệnh hoặc mang trùng, có thể qua không khí, cũng có thể lây lan gián tiếp qua chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, người chăm sóc…

• Dây thần kinh sinh 3 (trigeminal ganglia), bầu khứu giác (olfactory bulbs), hành tủy (medulla), cuống não (brain stem),

phổi (lungs), hạch bạch huyết (lymph nodes), tủy sống (spinal cord) là những loại mô chứa virus

• Vào những thời điểm stress như sinh đẻ, virus có thể hoạt động trở lại và lây lan Những con heo này có biểu hiện bệnh tích nhẹ

• Khi ADV hiện diện trong đàn, sự tiềm tàng và sự hoạt động trở lại cuả virus rất quan trọng khi nghiên cứu sự lan truyền của virus giữa các nông trại hoặc giữa nhóm heo với nhau

• Sự lan truyền của ADV xảy ra bằng nhiều con đường khác nhau, bao gồm:

6 AJD rất dễ lây, chủ yếu lây lan qua con đường

hô hấp Sự lây nhiễm trong đàn thì nhanh nhưng

có thể chậm giữa các đàn

6 Chất tiết từ đường miệng và đường mũi, nước tiểu là một nguồn bệnh tiềm tàng của virus và sự tiếp xúc trực tiếp giữa đàn lợn nhiễm và không bị nhiễm là một con đường truyền bệnh quan trọng

6 Qua chất tiết từ tinh dịch hay âm đạo khi giao hợp

6 Qua sữa hay sữa non của thú mẹ truyền qua thú con, ngoài ra virus có thể xâm nhập qua nhau thai, truyền dọc từ thế hệ này sang thế hệ khác

6 Qua những vật dụng dùng trong thú y đã bị nhiễm (ví dụ như kim tiêm, ống tiêm)

6 Virus có thể tồn tại trong thịt heo đến 5 tuần Những con chó

ăn thịt heo nhiễm cũng bị nhiễm và chết Tỷ lệ nhiễm bằng con đường ăn thịt heo bị nhiễm cao hơn là bằng đường hô hấp

6 Lan truyền nhờ gió từ nông trại này đến nông trại khác có thể xảy

ra dưới điều kiện thích hợp (báo cáo ở Anh có thể tới 2 km)

6 Virus có thể tồn tại nhiều tuần trong một vũng nước đọng, trên

cỏ, ổ rơm Vì thế, môi trường truyền nhiễm từ bầy đàn này sang bầy đàn khác cần phải được quản lý, đặc biệt là những nơi rác thải không được thu gom và xử lý

Vai trò của côn trùng đang được điều tra, loài gặm nhấm cũng đóng một vai trò là một nguồn nhiễm Vai trò của lợn hoang dã trong khu vực Thái Bình Dương như là nguồn nhiễm đã thật sự bùng nổ (a,

f) Triêu chứng lâm sàng

D Ở heo, ADV thường lan nhanh trong các bầy đàn mới nhiễm Triệu chứng lâm sàng ở lợn thường biểu hiện khác nhau tùy theo lưa tuổi

• Heo con nhỏ hơn 2 tuần tuổi: diễn biến lâm sàng tiến triển nhanh, tỷ lệ chết cao có khi tới 100% Sốt cao trên 41oC, ủ rũ,

lông dựng đứng, da tím tái, lợn gầy sút nhanh, có triệu chứng thần kinh, run rẩy, đi lảo đảo, đi vòng quanh, sau đó xuất hiện những cơn co giật, đạp chân trong không khí là động tác đặc trưng của bệnh, kiệt sức, tử vong trong vài giờ Có thể thấy heo nôn mữa, chảy nhiều dãi, đôi khi có con đi lỏng

• Những con heo lớn hơn có biểu hiện: sốt, suy nhược, trầm cảm, nôn, khó thở, xuất hiện bệnh tích từ hệ thần kinh trung ương, dáng đi theo kiểu ngỗng, thờ thẫn, co cơ, mắt giật , tê liệt Tỉ lệ chết 20-100%

• Heo con cai sữa có những biểu hiện giống trên với những triệu chứng về đường hô hấp (ho, ắt xì, thở nặng nhọc, viêm kết mạc)

dễ thấy hơn Tỷ lệ tử vong 5-10%

• Những heo nái và heo đực giống: thường không quan sát thấy triệu chứng thần kinh, con vật ủ rũ, sốt cao, ho, thở khó kéo dài 5-10 ngày, lợn bị gầy sút nhanh chóng, tỷ lệ chết thấp

6 Ở những nái mang thai có biểu hiện về rối loạn sinh sản như sẩy thai, thai yếu, thai chết lưu trong bụng phần lớn những thai chết, thai sẩy có bệnh tích điển hình là hiện tượng hoại

tử gan, lách, tuyến thượng thận, hạch lâm ba ruột

Neurological disorders in piglets

(Photos Copyright FAO 1997)

D Ở bò chủ yếu biểu hiện ở 2 thể:

• Thể kích thích: đặc trưng nhất là ngứa nhiều ở một vùng hay nhiều vùng ở các vùng da đầu, ngực, đùi

• Thể bại liệt: con vật suy nhược, chướng bụng, táo bón, bại liệt, chảy nhiều dãi, có trường hợp bị liệt bụng

D Ở chó và mèo:

• Ở mèo, triệu chứng đầu tiên là rối loạn vận động, con vật bồn chồn, kêu nhiều, tiếng kêu khan khan, sau đó run rẩy, liệt toàn thân và chết nhanh

• Ở chó biểu hiện ngứa nhiều ở mõm, liệt cơ họng

• Ở những loài khác thường thì chỉ những vùng bị thương bị

g) Bệnh tích

White to yellow necrotic foci on spleen (pig)

(Photos Copyright FAO 1997)

D Bệnh giả dại ít có bệnh tích đặc trưng

• Có những điểm hoại tử trắng ở gan, lách

• Phổi xung huyết, phù

• Thùy tim và thùy đỉnh có các vết viêm màu đỏ sẫm

• Hiện tượng phù nề vách ngăn giữa các thùy là rất phổ biến (a,

http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE.HT

M)

2) Phân lập virus trên môi trường tế bào

D Cách xác định sự vấy nhiễm của PRV thường dựa trên sự phân lập virus trên các môi trường tế bào cùng với sự xác định bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Quy trình này được thực hiện trong vòng

từ 2-5 ngày, dựa trên thời gian xuất hiện cytopathic effects (bệnh tích tế bào-CPE)

D PRV có thể được nuôi cấy trên một phổ rộng các loại tế bào như tế bào phổi thỏ (rabbit lung-ZP), tế bào thận thỏ (rabbit kidney-RK13), tế bào thận chuột Hamster (Hamster kidney-BHK21), tế bào thận heo (porcine kidney-PK15), tế bào thận khỉ xanh (green monkey kidney-GMK), tế bào phổi chồn Vizon (mink lung-MK),

tế bào thận chồn furo (ferret kidney-FK), tế bào phôi bào thai cừu (ovine fetal lung-OFL), (bovine turbinate-BT), tế bào thận phổi gà tây (turkey embryo kidney-TEK7,13,17,21) Tuy nhiên các dòng tế bào

BT, PK15 được sử dụng rộng rãi để phân lập và chẩn đoán PRV (b)

a) Chuẩn bị mẫu

D Những mẫu vật có thể được sử dụng để chẩn đoán ADV bao gồm tủy sống, phổi, lá lách, gan, thận, hạch bạch huyết, niêm mạc họng, amidam được lấy từ những con

heo nghi ngờ nhiễm ADV.

D Lấy mẫu thí nghiệm ở heo

• Mẫu máu: lấy ở tĩnh mạch cổ hay ở tĩnh mạch tai bằng xylanh

tự động

• Dịch mũi: khi con vật có biểu hiện rối loạn hô hấp (khó thở, khò khè…) lấy tăm bông ngoáy vào hốc mũi

D Thời gian lấy mẫu

• Khi con vật biểu hiện những triệu chứng lâm sàng, lấy mẫu ở các lỗ tự nhiên

• Khi con vật đã chết (mới chết trong vòng 6 giờ) mổ ra, biều hiện bệnh tích ở đâu thì lấy mẫu tại đó (đường hô hấp, tiêu hóa, thần kinh)

D Những điều cần lưu ý khi lấy mẫu:

• Lấy máu ở tĩnh mạch cổ khi cần lượng máu nhiều

• Lấy máu ở tĩnh mạch tai khi không cần nhiều máu

• Đối với nái mang thai nên lấy ở giai đoạn heo mới sinh 2-3 ngày

• Khi lấy mẫu cần có dụng cụ cố định con vật, đeo găng tay

• Khi lấy mẫu bằng tăm bông để tăm bông trong ống nghiệm vô trùng cho vào lọ chứa dung dịch chuyên chở và bẻ đoạn que nơi tay cầm

• Khi lấy mẫu máu thì ta nên cho chất kháng đông vào Có 3 loại chất kháng đông: EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate), Heparin, Sodium Citrate, trong đó EDTA thường được sử dụng nhất vì ít gây ảnh hưởng đến các tế bào máu

• Cách lấy mẫu mô: lấy một nửa phần

mô có bệnh tích, một nửa phần giáp bệnh tích

D Cách bảo quản mẫu:

• Mẫu để trong bình, túi sạch

• Dùng bình đá nếu mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm ở khoảng cách gần

• Dùng đá khô bảo quản tối đa trong 7 ngày do đá khô ít chảy nước và ít ảnh hưởng đến bệnh phẩm Mẫu được giữ ở -70oC trong glycerol 50%

D Cách xử lý mẫu: lấy mẫu sao cho tạo được huyễn dịch 10-20%

• Lấy tỷ lệ mẫu và HBSS (Hanks’ balanced salt solution) là 1 phần mẫu, 9 phần HBSS, mẫu được đồng nhất trong HBSS thành huyễn dịch 10% bằng máy Laboratory Tissue Pulverizer Sau đó ly tâm 1000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút để loại bỏ mãnh vỡ của mô Dịch nổi bên trên được gạn ra và dự trữ ở

-70oC Hoặc ta có thể nghiền bằng tay

• Mẫu mô được để ngay góc cối gần chỗ miệng lấy ra Nếu mẫu mềm thì nghiền trực tiếp Nếu mẫu cứng thì nghền bằng thủy tinh nhuyễn để tách được các tế bào đơn

• Lấy 9 phần HBSS cho vào nghiền tiếp, nghiền xong cho vào ống nghiệm

• Sau đó cho mẫu vào tủ lạnh rồi đem ra thực hiện 1-2 lần để tế bào vỡ ra và ta thu hoạch virus

• Sau đó lọc lấy nước trong (ly tâm) cho vào lọ khác có nắp, cho kháng sinh vào (penicillin, streptomicine) để trong 30’-1h, sau

đó lọc qua màng lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế bào

• Mẫu huyết thanh cho qua lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế bào

b) Chuẩn bị môi trường tế bào

D Cả hai loại tế bào PK-15 và BT được phát triển trong môi trường tối thiểu của Eagle với muối, 8% huyết thanh thai bò, penicillin (100 đơn vị/ml), streptomicine sulfate (100 ug/ml), fungizone (1 ml), gentmicine (50 ug/ml)

D Mỗi giếng của đĩa 24 giếng được cho vào 1 ml dịch huyền phù tế bào chứa 1.5x105 tế bào

D 1 tấm phủ đường kính 12 mm được đặt vào mỗi shell vials (1-dram

ca 3.7 ml shell vials) sau đó cho vào đó 1ml dịch huyền phù tế bào chứa 1.0x105 tế bào Để dễ thao tác, shell vials được đặt vào trong các giếng của một đĩa 24 giếng rỗng và sau đó được phủ lên bằng một đĩa 24 giếng khác Đem đi ủ ở 37oC có 5% CO2 thường trong 3 ngày (b)

c) Chẩn đoán ADV bằng Shell Vial Assay (SVA)

D Các shell vial chứa các tế bào BT hay PK15 được cho vào 0.2 ml mẫu đã được chuẩn bị Sau đó nó được đem đi ly tâm với tốc độ

700 vòng/ phút trong 60 phút ở nhiệt độ 30oC

D Sau đó các shell vial được rửa với HBSS và thêm vào 0.5 ml MEM chứa 4% huyết thanh thai ngựa (fetal horse serum-FHS) Thêm vào