TỔNG QUAN KỸ THUẬT NHUỘM HOÁ MÔ MIỄN DỊCH DẤN ẤN MSI TRÊN MÁY VENTANA BENCHMARK XT

AEC 3 – amino – 9 – ethylcarbazoneCC1 Cell Conditioning Solution CIMP Kiểu hình methyl hoá đảo CpG CpG island methylator phenotypeCIN Mất ổn định NST chromosomal instability CRC Ung thư

ĐỖ THU UYÊN

TỔNG QUAN KỸ THUẬT NHUỘM

HOÁ MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN MSI TRÊN MÁY

VENTANA BENCHMARK XT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHOÁ 2017 - 2021

HÀ NỘI – 2021

ĐỖ THU UYÊN

TỔNG QUAN KỸ THUẬT NHUỘM

HOÁ MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN MSI TRÊN MÁY

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, em đãnhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, anh, chị và cácbạn Với tấm lòng của người học trò, em xin trân thành cảm ơn Ban Giámhiệu, Phòng Đào tạo đại học, khoa Kỹ thuật Y học, bộ môn Giải phẫu bệnhlâm sàng trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ emtrong quá trình học tập và hoàn thành bài luận văn này

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn trân thành tới:

ThS Tạ Hồng Hải Đăng – giảng viên trường Đại học Y Hà Nội, người

thầy đã tận tình chỉ bảo động viên, hướng dẫn, giúp đỡ em trong kiến thứcchuyên môn và rèn luyện kỹ năng thực hành, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Em xin trân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ, nhân viên khoa Giải phẫubệnh, bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em trongsuốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng chấm khoá luận đãcho em những đóng góp quý báu để hoàn thành luận văn này

Lời cuối cùng con xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cha, mẹ, những ngườithân trong gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, chăm sóc, cổ vũ, động viêncon trong suốt quá trình học tập, phấn đấu và trưởng thành

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2021

Đỗ Thu Uyên

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em Các nộidung được nêu trong tổng quan là trung thực và chưa từng công bố trong bất

cứ công trình khoa học nào

Đỗ Thu Uyên

AEC 3 – amino – 9 – ethylcarbazone

CC1 Cell Conditioning Solution

CIMP Kiểu hình methyl hoá đảo CpG (CpG island methylator phenotype)CIN Mất ổn định NST (chromosomal instability)

CRC Ung thư đại trực tràng (Colorectal Cancer)

DAB 3,3 – diaminobenzidentetrahydrochlorid

DNA Deoxyribonucleic acid

EMAST Thay đổi vi vệ tinh cao ở sự lặp lại bốn nucleotide được chọn

HNPCC Hội chứng Lynch (ung thư đại trực tràng không polyp di truyền)HRP Enzyme peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa (Horseradish

Peroxidase)

IDL Vòng lặp không bắt cặp bổ sung

LOH Sự mất dị hợp tử (loss of heterozygosity)

MACS Ổn định vi vệ tinh và nhiễm sắc thể

(microsatellite and chromosomally stable)

MSI Sự mất ổn định vi vệ tinh (Microsatellite instability)

MSI-H MSI mức độ cao

MSI-L MSI mức độ thấp

MSS Sự ổn định vi vệ tinh (Microsatellite Stability)

PCR Phản ứng trùng hợp chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)PMS1 postmeiotic segregation increased 1

PMS2 postmeiotic segregation increased 2

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Microsatellite instability (MSI) hay còn gọi là sự mất ổn định vi vệ tinh

là hình thái mất ổn định của gen, khi đó các đột biến gen sẽ dễ dàng xuất hiện.MSI có thể gặp trong nhiều ung thư như ung thư kết tràng, ung thư nội mạc tửcung, ung thư dạ dày và một số bệnh ung thư khác như: ung thư buồng trứng,ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đường gan mật, … Trong đó ung thư gặp phổbiến nhất là ung thư đại trực tràng Phần lớn các ung thư đại trực tràng pháttriển thông qua con đường bất ổn định nhiễm sắc thể trong khi đó 12 - 15%phát sinh từ MSI, là hậu quả của sự suy giảm chức năng của một trong cácgen sửa chữa bắt cặp sau DNA (Mismatch repair - MMR) bao gồm genMLH1, MSH2, MSH6, PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bấthoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sau DNA dẫn đến tích lũy các đột biến ở vùng

vệ tinh, gây ra ung thư đại trực tràng có tính chất di truyền Đặc biệt ung thưđại trực tràng không polyp có tính chất di truyền (HNPCC), hay còn gọi là hộichứng Lynch phát sinh từ con đường MSI [1]

Việc xác định MSI có ý nghĩa rất quan trọng, không chỉ để sàng lọc hộichứng Lynch mà còn giúp phân biệt giữa ung thư đại trực tràng khiếm khuyết

hệ thống sửa chữa bắt cặp sai với ung thư đại trực tràng MSS, nó sẽ cung cấpcác thông tin có giá trị cho tiên lượng và việc cá thể hóa trong điều trị [2].Xác định MSI bằng phương pháp hoá mô miễn dịch ít tốn kém hơn PCRvới tính chính xác cao, độ nhạy cao và độ đặc hiệu tuyệt đối Hiện nay, cácphương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch khác nhau đã được thương mại hoábởi nhiều hãng như Dako, Leica, Thermo, Cell Marque, … Nhiều thế hệ máynhuộm hoá mô miễn dịch tự động và bán tự động được phát triển và sử dụngrộng rãi như: Leica BOND – III, Leica Bond Max, Ventana BenchMarkULTRA, … Máy nhuộm hoá mô miễn dịch Ventana BenchMark XT là hệ

thống máy với sự linh hoạt cao, đáp ứng được nhu cầu nhuộm hoá mô miễndịch nhiều dấu ấn khác nhau, có thể cài tay các quy trình nhuộm, dễ dàng xâydựng quy trình nhuộm tối ưu cho từng phòng xét nghiệm Nhằm tổng hợp cáckiến thức xung quanh MSI và quy trình nhuộm dấu ấn MSI trên máy Ventana

BenchMark XT, chúng tôi thực hiện tổng quan tài liệu: “Tổng quan kỹ thuật

nhuộm hoá mô miễn dịch dấu ấn MSI trên máy Ventana BenchMark XT”, gồm các nội dung chính sau:

1.Sơ lược về MSI và ung thư đại trực tràng có MSI.

2.Nhuộm hoá mô miễn dịch dấu ấn MSI trên máy Ventana BenchMark XT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ MSI

1.1 Lịch sử phát hiện dấu ấn MSI:

MSI được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn vào những năm 1970 – 1980 vàđược mô tả một cách rõ ràng vào đầu những năm 1990 [3] MSI được gây rabởi sự bất hoạt đột biến của các gen liên quan đến quá trình sửa chữa DNA.Căn bệnh đầu tiên ở người có liên quan rõ ràng với các khiếm khuyết trongquá trình sửa chữa DNA là bệnh khô da sắc tố, một bệnh lặn hiếm gặp do độtbiến bất hoạt cả hai allen trong các gen liên quan đến sửa chữa cắt bỏnucleotide

Năm 1992, Manuel Perucho đã sử dụng phản ứng trùng hợp chuỗipolymerase (PCR), chiết xuất DNA từ các mô đại tràng và khuếch đại hàngnghìn trình tự bằng cách sử dụng một số lượng nhỏ mồi PCR được chọn ngẫunhiên [4] Khi phân tích các kết quả thu được, các tác giả đã nhận thấy rằng12% khối u có các băng điện di có chiều dài ngắn hơn do DNA di chuyển xahơn một chút Họ đã phân tích các trình tự DNA trong các băng này và pháthiện ra rằng chúng chứa các trình tự lặp lại đơn giản, chủ yếu ở các vùngpolyadenine liên kết với trình tự Alu Các khối u này có các đặc điểm lâmsàng và bệnh lý độc đáo Đầu tiên, các khối u với các đột biến xóa này cónhiều khả năng phát sinh hơn ở đại tràng gần, ít có khả năng bị xâm lấn hơn,

ít có khả năng có đột biến ở KRAS hoặc p53 , kém biệt hóa hơn và đến từnhững bệnh nhân trẻ tuổi Dựa trên những phát hiện này, các tác giả kết luậnrằng những đột biến này đại diện cho một con đường duy nhất dẫn đến sựphát triển của khối u và dự đoán rằng sự sai lệch trong cơ chế sao chép củacác tế bào bình thường gây ra chúng có thể là di truyền, mặc dù họ không cóbằng chứng cho điều này [5]

Đồng thời, phòng thí nghiệm của Stephen Thibodeau đang nghiên cứutrình tự lặp lại dinucleotide để lập bản đồ di truyền và phân tích tính di truyềncủa sự mất dị hợp tử (LOH – loss of heterozygosity), đồng thời tìm kiếm cácgen ức chế khối u mới trên nhiễm sắc thể 5q, 15q, 17p và 18q trong các khối

u đại trực tràng Họ quan sát thấy các đột biến mất đoạn trong trình tự lặp lại

CA ở những vùng này và đặt ra thuật ngữ không ổn định của tế bào vi mô (mà

họ gọi là MIN) Họ đã phát hiện ra MSI ở 28% các khối u đại trực tràng vàlưu ý rằng những đột biến này không đồng nhất ở các khối u khác nhau [6].Quan trọng hơn, họ phát hiện ra rằng 89% khối u có MSI là ở đại tràng gần vànhững bệnh nhân ung thư đại trực tràng có MSI có tiên lượng tốt hơn Giốngnhư Perucho, Thibodeau và cộng sự đã công nhận rằng điều này đại diện chomột con đường duy nhất để phát triển khối u mà "không liên quan đến mất dịhợp tử" [7]

Các nghiên cứu từ một tổ chức quốc tế do Bert Vogelstein đứng đầu ởHoa Kỳ và Albert de la Chapelle ở Phần Lan đã giúp làm sáng tỏ ý nghĩa lâmsàng của MSI Aaltonen và cộng sự đã tìm thấy mối liên kết đáng kể ở nhiễmsắc thể 2p bằng cách sử dụng dấu ấn D2S123 ở hai dòng họ lớn mắc hộichứng Lynch (khi đó được gọi là ung thư đại trực tràng không polyp di truyền

- HNPCC) [8] Trong quá trình này họ đã tìm thấy MSI trong 13% trường hợpung thư đại trực tràng đơn lẻ và lý giải chính xác rằng các khối u trong ungthư đại trực tràng di truyền và một tập hợp con các khối u trong ung thư đạitrực tràng đơn lẻ có chung một con đường phát triển khối u chung nhưng duynhất [9]

Một loạt các cuộc điều tra đã dẫn đến nhận ra rằng MSI phát sinh từ cáckhiếm khuyết trong hệ thống sửa chữa không phù hợp DNA (MMR) và việcxác định 4 gen gây ra hội chứng Lynch Khung thời gian của những khám phánày được minh họa trong hình dưới đây [10]

Hình 1.1: Nghiên cứu MSI liên quan đến ung thư đại trực tràng từ năm

1990 đến năm 2010 1.2 Vùng vi vệ tinh:

Vùng vi vệ tinh là đoạn DNA gồm các chuỗi từ một đến sáu cặpnucleotide (thường là hai nucleotide) lặp lại nhiều lần, phổ biến nhất là lặpđoạn CA Các trình tự vi vệ tinh thay đổi giữa từng cá thể, tuy nhiên, đượcxác định giống nhau giữa các tế bào của cùng một cơ thể và là một dấu ấn đặctrưng cho mỗi người

Microsatellite instability (MSI) hay còn gọi là sự mất ổn định vi vệ tinh

là một hình thái mất ổn định của gen, khi đó các đột biến gen sẽ dễ xuất hiện

Sự mất ổn định vi vệ tinh được biểu hiện bởi sự tăng hoặc giảm chiều dài do

sự suy giảm chức năng của hệ thống sửa chữa lỗi ghép cặp sai DNA Khinhững sai sót trong quá trình tái bản DNA không được phát hiện và sửa chữa,các sai sót này dần tích lũy, bên cạnh nguy cơ hình thành nên các đột biến, cácsai sót không được sửa chữa ở chuỗi lặp vùng vi vệ tinh cũng dần tích lũy,dẫn đến kéo dài hoặc rút ngắn đoạn vi vệ tinh

1.3 Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai DNA:

Khi DNA nhân đôi, chuỗi DNA được tổng hợp mới sao chép nguyên bảnchuỗi DNA gốc (thành phần, trình tự các nucleotide) nhờ cơ chế ghép cặptương ứng các nucleotide theo quy tắc bổ sung (A-T và G-X) Khi xuất hiệnghép cặp sai hay vi phạm quy tắc bổ sung, tế bào có một số các cơ chế giúpphát hiện và sửa chữa kịp thời các lỗi này, đảm bảo vật liệu di truyền đượcchuyển giao nguyên vẹn đến thế hệ tế bào sau Khâu đầu tiên trong quá trìnhsửa chữa lỗi ghép cặp sai DNA được đảm nhiệm bởi chính enzyme DNApolymerase, đây là enzyme chủ chốt trong quá trình tổng hợp DNA

1.3.1 Cơ chế sửa bắt cặp sai DNA của DNA polymerase:

DNA polymerase là enzyme xúc tác quá trình tổng hợp chuỗipolynucleotide theo nguyên tắc bổ sung (A liên kết với T bằng 2 liên kếtHidro và G liên kết với X bằng 3 liên kết Hidro) Sự bắt cặp cẩn thận củaDNA polymerase đảm bảo cho sự chính xác của tái bản Trước khi thực hiệnphản ứng polymer hóa nối các nucleotide, nucleotide triphosphate tự do phảibắt cặp với base bổ sung trên sợi khuôn mẫu Nếu sự bắt cặp sai xảy ra, DNApolymerase sẽ loại bỏ nucleotide bắt cặp sai trước khi hình thành liên kếtphosphodieste giữa nucleotide này với mạch DNA đang được tổng hợp

Quá trình xúc tác tổng hợp mạch mới trong nhân đôi DNA của DNApolymerase xảy ra theo chiều 5’ – 3’ Ngoài hoạt tính polymerase 5’ – 3’,enzyme này còn có hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ Đây là hoạt tính enzyme cắtmạch DNA từ tận cùng đầu mút theo chiều 3' - 5' Khi bắt gặp một cặp basebắt cặp không theo nguyên tắc bổ sung, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều

đi của nó và cắt bỏ base không ăn khớp Sau khi cắt đi base, polymerase cóthể lắp lại chính xác base cần thiết và tiếp tục tái bản DNA

Ở vi khuẩn, cả ba loại enzyme DNA polymerase (I, II và III) đều có khảnăng đọc sửa, sử dụng hoạt tính exonuclease 3' - 5' Ở sinh vật nhân thực, chỉ

những enzyme polymerase đảm nhận chức năng kéo dài mạch mới có khảnăng đọc sửa [11]

Mức độ đọc sửa trong quá trình nhân đôi DNA xác định tần số đột biến

và là khác nhau giữa những loài khác nhau [12] Ví dụ, sự mất đi khả năngđọc sửa do các đột biến trong gen mã hóa DNA polymerase epsilon dẫn đến

hệ quả là tạo ra một kiểu gen siêu đột biến với hơn 100 đột biến trên mỗimegabase (1.000.000 cặp base) của DNA trong tiến trình ung thư đại trựctràng ở người [13]

Hoạt động bắt cặp và sửa lỗi của DNA polymerase được thực hiện vôcùng nghiêm ngặt Chính vì thế sự hoạt động của DNA polymerase có độchính xác cao, với tỷ lệ lỗi nội tại là ít hơn một lỗi cho mỗi 107 nucleotide[14] Một tỷ lệ nhỏ các nucleotide bắt cặp sai mà không được sửa chữa bởiDNA polymerase có thể sẽ được sửa chữa bằng các cơ chế sửa sai khác của tếbào Trong đó sửa sai bằng hệ thống MMR là một khâu quan trọng trong quátrình sửa chữa lỗi ghép cặp sai trong nhân đôi DNA Cơ chế sửa chữa bắt cặpsai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E coli được gọi là con đườngMutHLS

1.3.2 Cơ chế sửa chữa lỗi ghép cặp sai ở vi khuẩn E.coli – con đường MutHLS:

Con đường sửa chữa sự không phù hợp của E coli MutHLS là một conđường sửa chữa DNA chung giúp nhận biết và sửa chữa tất cả các cặp sai một

DNA helicase II (sản phẩm của gen uvrD) đảm bảo sự tháo xoắn và tách haimạch đơn ở những vị trí cần thiết trên DNA

1.3.3 Các gen liên quan đến hoạt động của MMR ở người:

Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở động vật có vú cũng hoạt động tương tựnhư cơ chế hoạt động ở vi khuẩn (E coli) Ở người đã xác định được các gen

có liên quan đến hoạt động của sửa chữa bắt cặp sai gồm có các gen humanmutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutShomolog 2 (hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutShomolog 6 (hMSH6), human postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2),human postmeiotic segregation increased 1 (hPMS1) [15]

1.3.3.1 Các protein liên quan đến hoạt động của MMR ở người:

Ở sinh vật nhân chuẩn, có hai phức hợp chính có chức năng tương tựMutS ở E.coli là MSH2/MSH6 (MutSα) và MSH2/MSH3 (MutSβ) Con đườngMutSα chủ yếu tham gia vào quá trình sữa chữa thay thế base và các đột biếndịch khung vòng nhỏ MutSβ cũng tham gia vào quá trình sửa chữa đột biếndịch khung vòng nhỏ, đặc biệt tham gia vào sửa chữa vòng lặp lớn (khoảng 10vòng nucleotide) Tuy nhiên, MutSβ không sửa chữa các đột biến thay thế base

Sự tiến hóa của các dạng tương đồng đa dạng của MutS đã làm tăng khả năngcủa tế bào trong việc nhận ra và sửa chữa các lỗi tổng hợp trong DNA và tăngtính chính xác của quá trình sao chép ở các sinh vật bậc cao

Sinh vật nhân chuẩn có năm MutL homolog được ký hiệu là MLH1,MLH3, PMS1 và PMS2 Ở người, sự tổ hợp của các phân tử trên tạo nên ba

tổ hợp khác nhau có chức năng tương tự như MutL ở nhân sơ là MutLα,MutLβ và MutLγ Phức hợp MutLα được tạo ra từ các tiểu đơn vị MLH1 vàPMS2, dị tử MutLβ được tạo ra từ MLH1 và PMS1, trong khi MutLγ đượctạo ra từ MLH1 và MLH3 MutLα hoạt động như một endonuclease liên kết

với các protein cần thiết khác, MutSα và PCNA tham gia vào quá trình cắt bỏđoạn DNA sai sót Các vai trò do MutLβ và MutLγ đảm nhận trong việc sửachữa lỗi ghép cặp sai DNA vẫn chưa được tìm hiểu rõ ràng ở người Vì phân

tử MLH1 là thành phần không thể thiếu để tạo nên các phân tử giống MutL ởE.coli nên mất MLH1 dẫn đến mất toàn bộ hoạt động của MMR, nhưng mấtPMS2 có thể được bù đắp một phần bằng MLH3

Ở sinh vật nhân thực không có phân tử tương đồng về chức năng vớiMutH ở E.coli Chức năng endonuclease của MutH được đảm nhận bởi cácphân tử có chức năng tương tự với MutL ở sinh vật nhân thực

1.3.3.2 Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người:

- MSH2 – MSH6 (MutSα) nhận ra các cặp base đơn không khớp Bước này yêu

cầu năng lượng từ một phân tử adenosine triphoshpate (ATP) bởi MSH2

- Phức hợp MutSα khuếch tán ra khỏi vị trí bắt cặp sai, sau đó liên kết với phứchợp MLH1-PMS2 (MutLα) tạo thành phức hợp protein sửa chữa ghép cặp saiMMR

- Phức hợp này di chuyển dọc theo chuỗi DNA mới cho đến khi nó gặp phứchợp DNA polymerase

- Phức hợp protein sửa chữa ghép cặp sai MMR tương tác với exonuclease-1,kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) và DNA polymerase

- Phức hợp này đưa DNA polymerase quay trở lại vị trí của sự không phùhợp Cuối cùng, phức hợp rời khỏi DNA và quá trình tái tổng hợp xảy ra

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của hệ thống MMR ở người

Sự sao chép trượt trong quá trình tái bản DNA trong một trình tự lặp lạitạo ra một vòng lặp không bắt cặp bổ sung (IDL) hoặc các đột biến thay thế

có thể được hệ thống MMR nhận ra và sửa chữa Nếu những vị trí này khôngđược sửa chữa, trong lần nhân đôi thứ hai, sợi bố mẹ ban đầu được sao chépchính xác, nhưng sợi con được tổng hợp sai (với đột biến bắt cặp không theonguyên tắc bổ sung hoặc IDL) chứa một đột biến Các cặp base bắt cặp khôngtheo nguyên tắc bổ sung đơn lẻ dẫn đến đột biến điểm, trong khi IDL dẫn đếnđột biến dịch khung thường dẫn đến đột biến vô nghĩa xuôi dòng Điều nàydẫn đến việc tạo ra một protein bị cắt ngắn, không có chức năng Đây là cơ sởtạo thành các MSI

1.3.3.3 Các dạng mất ổn định vi vệ tinh:

- Các khối u có biểu hiện mất bộc lộ một protein MMR được gọi chung làdMMR và được coi là MSI – H Theo quy định hướng dẫn của Bethesda,trong trường hợp này, trên 30% của bộ dấu ấn MSI bị đột biến

- Những người có các protein MMR nguyên vẹn có thể được phân loại làpMMR bao gồm MSS (Microsatellite Stability – Sự ổn định vi vệ tinh) vàMSI – L Những khối u dạng MSI – L thường không có sự khác biệt về mặtlâm sàng và giải phẫu bệnh so với các khối u dạng MSS Các khối u dạngMSI – L và MSS chỉ khác nhau ở mức độ MSI

+ Khi có ít hơn 30% các dấu ấn MSI bị đột biến, khối u sẽ được xếp vàonhóm MSI – L

+ Khi không có sự mất ổn định vi vệ tinh, khối u sẽ được xếp vào nhómMSS và được coi là khối u có ổn định vi vệ tinh

- Ngoài hai dạng trên, có một loại MSI khác được gọi là “thay đổi vi vệ tinhcao ở sự lặp lại bốn nucleotide được chọn” (EMAST) EMAST được tìm thấythường xuyên nhất trong các khối u không phải đại trực tràng và gắn liền vớiđột biến gen p53 Không có bằng chứng cho thấy nó được gây ra bởi sự bấthoạt đột biến của hệ thống MMR [16]

CHƯƠNG 2 MSI TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Việc xác định tình trạng mất ổn định vi vệ tinh là hết sức cần thiết giúpcác nhà lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Trong ung thư đại trựctràng, giai đoạn bệnh theo TNM là yếu tố quan trọng trong điều trị và tiênlượng Trên các bệnh nhân giai đoạn III, hóa trị bổ trợ sau mổ đã được chứngminh có hiệu quả, tuy nhiên đối với các bệnh nhân giai đoạn II, việc sử dụnghóa chất sau mổ còn nhiều tranh cãi, nhất là với các bệnh nhân có các đặcđiểm nguy cơ cao trên mô bệnh học Xác định tình trạng mất ổn định vệ tinhtrên các bệnh nhân này giúp lựa chọn đối tượng hóa chất sau mổ Theo hướngdẫn điều trị gần đây của Hội ung thư chây Âu, MSI nên được đánh giá trêncác bệnh nhân ung thư đại tràng giai đoạn II giúp quyết định điều trị sau mổ.Trên thế giới theo các nghiên cứu gần đây của các tác giả S Popat vàcộng sự (2005), D Klingbiel và cộng sự (2015), Hisato và cộng sự (2015), cácbệnh nhân ung thư đại trực tràng ở giai đoạn II với tình trạng mất ổn định vệtinh có tiên lượng tốt và không đáp ứng với hóa chất 5 - FU sau mổ, điều này

có nghĩa các bệnh nhân trong nhóm này được khuyến cáo chỉ cần điều trị bằngphẫu thuật Những bệnh nhân ở giai đoạn III được điều trị hóa chất bổ trợ vớiliệu trình FOLFOX để thay thế cho phác đồ 5 - FU cho kết quả khả quan

2.1 Dịch tễ ung thư đại trực tràng:

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trên thế giới Theo WHO,năm 2019 mỗi năm có khoảng 8 triệu ca mắc ung thư đại trực tràng mới vàkhoảng 800.000 ca tử vong vì bệnh này Ung thư đại trực tràng phần lớn xảy

ra ở các nước phát triển, trong đó tỉ lệ mắc cao nhất ở Australia, New Zealand,các nước Châu Âu và Bắc Mỹ Ở Bắc Mỹ và Châu Âu, số người chết vì bệnhđứng thứ 2 sau ung thư vú và phổi ở nữ Tại Mỹ, bệnh ung thư đại trực tràng

đứng thứ năm sau ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bàng quang

và ung thư tuyến giáp, số người tử vong do ung thư đại trực tràng ước tínhkhoảng 50.830 người, đứng thứ hai về tỷ lệ tử vong chỉ sau ung thư phổi [17],[18] Tại châu Á, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng tăng nhanh ở các quốc gianhư Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Singapore [19],[20],[21] Ở ViệtNam, theo số liệu công bố của tổ chức ghi nhận ung thư toàn cầu, mỗi nămViệt Nam có 8.768 bệnh nhân mắc mới, 5.976 bệnh nhân chết do bệnh ungthư đại trực tràng [22] Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng mắc hàng thứ ba ởnam và thứ sáu ở nữ, đồng thời ung thư đại trực tràng cũng đứng thứ năm sauung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú và ung thư vòm [23] Biểu hiện lâmsàng của ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm không rõ ràng nên đa số bệnhnhân được phát hiện ở giai đoạn muộn Có nhiều yếu tố khác nhau tác độngđến quá trình chuyển dạng từ niêm mạc bình thường trở thành ác tính Trong

đó, môi trường và di truyền là các yếu tố đóng vai trò quan trọng [24]

2.2 Chẩn đoán ung thư đại trực tràng:

2.2.1 Chẩn đoán ung thư đại trực tràng:

2.2.1.1 Chẩn đoán lâm sàng:

- Triệu chứng cơ năng: bao gồm rối loạn lưu thông ruột, táo bón hoặc ỉa

chảy Trong đó, triệu chứng hay gặp nhất là đi ngoài ra nhầy máu Bệnh nhân

sẽ cảm thấy đau bụng, mỗi kiểu đau khác nhau sẽ định hướng chẩn đoán cácbệnh khác nhau: u đại tràng phải đau kiểu Koernig, u đại tràng trái đau kiểutắc ruột, u đại tràng sigma đau hạ vị kèm đi ngoài nhiều lần Ngoài ra còn cócác biến chứng của u như bán tắc, tắc ruột, thủng u gây viêm phúc mạc Bệnhnhân có thể gặp một số triệu chứng do di căn xa như tự sờ thấy hạch thượngđòn, chướng bụng

- Triệu chứng thực thể: Khi khám bụng, có thể sờ thấy u qua thành bụnghoặc qua thăm khám trực tràng nếu u ở trực tràng, ống hậu môn Bệnh nhân

có thể tự sờ thấy u Khi khám trực tràng, có thể phát hiện khối u ở trực tràngthấp và trực tràng giữa Khám toàn thân để phát hiện di căn gan, hạch ngoại

vi, dịch cổ trướng, di căn buồng trứng ở phụ nữ, giúp đánh giá mức độ tiếntriển bệnh

- Triệu chứng toàn thân: nổi hạch thượng đòn (thường gặp bên trái),thiếu máu, gầy sút (người bệnh có thể gầy sút 5-10kg trong vòng 2-4 tháng),suy nhược do bệnh tiến triển lâu làm hao mòn sức sống của bệnh nhân

2.2.1.2 Chẩn đoán cận lâm sàng:

- Nội soi: Soi đại trực tràng ống mềm là phương pháp quan trọng để chẩnđoán ung thư đại trực tràng, cho biết vị trí, đặc điểm khối u một cách trựctiếp

- Chẩn đoán hình ảnh: Chụp X-quang, chụp bụng không chuẩn bị, chụpcắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, siêu âm

- Y học hạt nhân:

+ Chụp hình phóng xạ khối u đặc hiệu (chụp hình miễn dịch phóng Radioimmunoscintigraphy: RIS) Sử dụng các kháng thể đơn dòng đánh dấuphóng xạ chụp SPECT giúp phát hiện u nguyên phát và tổn thương di căn.+ Chụp hình khối u theo nguyên tắc chuyển hóa (PET, PET/CT,PET/MRI) với F18-FDG phát hiện u nguyên phát, di căn hạch, di căn xa, giúpđánh giá chính xác giai đoạn bệnh, mô phỏng lập kế hoạch xạ trị (với ung thưtrực tràng)

xạ-+ Chụp xạ hình, SPECT xương với Tc99m-MDP giúp phát hiện tổnthương di căn xương

+ Chụp xạ hình, SPECT gan với Tc99m-SC giúp phát hiện tổn thương dicăn gan

- Xét nghiệm sinh hóa - huyết học

+ Xét nghiệm CEA, CA 19-9, phối hợp với các phương pháp khác đểtheo dõi và chẩn đoán ung thư tái phát, di căn sau điều trị.

+ Xét nghiệm huyết học và hóa sinh máu: đánh giá toàn trạng người bệnh

- Mô bệnh học: Đây là phương pháp quan trọng nhất để khẳng định bệnh ungthư Ung thư đại tràng được phẫu thuật triệt căn, đánh giá giai đoạn mô bệnhhọc bao gồm: độ mô học, giai đoạn T, số lượng hạch vét được và số hạchdương tính, diện cắt trên, diện cắt dưới và diện cắt xung quanh u, sự xâm lấnthần kinh mạch máu, sự xâm lấn mạch bạch huyết, nhân ung thư mạc treongoài hạch, đánh giá di căn hạch, sinh thiết hạch cửa nhằm phát hiện di cănhạch chính xác hơn nhờ kĩ thuật hóa mô miễn dịch được cân nhắc, xác địnhMSI bằng kỹ thuật sinh học phân tử - PCR hoặc bằng phương pháp hóa mômiễn dịch

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy MSI trong ung thư đại trựctràng có nhiều ý nghĩa lâm sàng rõ rệt Việc xác định MSI có ý nghĩa rất quantrọng, không chỉ để sàng lọc hội chứng Lynch mà còn giúp phân biệt giữa ungthư đại trực tràng khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai với ung thư đạitrực tràng MSS, nó sẽ cung cấp các thông tin có giá trị cho tiên lượng và việc

cả thể hóa trong điều trị Việc chẩn đoán MSI ở mảnh sinh thiết có thể cungcấp các thông tin quan trọng trong việc ra quyết định xử lý phẫu thuật ung thưđại trực tràng (cắt đoạn với cắt đại trực tràng gần toàn bộ) So với các u có sự

ổn định hệ thống sửa chữa bắt cặp sai, các u có thiếu hụt có tỉ lệ tái phát và dicăn giảm, tỉ lệ sống sót cao hơn

2.2.2 Xét nghiệm xác định MSI trong ung thư đại trực tràng:

NCCN khuyến cáo kiểm tra MSI cho những bệnh nhân dưới 70 tuổi, đặcbiệt với nhóm ung thư biểu mô đại tràng phải, độ ác tính cao, thể mô học chếnhầy, thâm nhiễm bạch cầu lympho trong mô u hay có các cấu trúc nang bạch

huyết quanh khối u dạng giống với bệnh Crohn (trên vi thể), những yếu tố kểtrên là những bệnh cảnh đặc trưng của khối u có MSI-H.

Dấu ấn MSI, với sự đồng thuận trong các hướng dẫn thực hành lâm sànggần đây, đã được xem là một dữ kiện quan trọng và tối cần thiết cho bác sĩlâm sàng trong quản lý và điều trị ung thư đại-trực tràng

Hiện nay có hai kỹ thuật được sử dụng để chẩn đoán MSI là chẩn đoánbằng kỹ thuật sinh học phân tử hay sử dụng phản ứng PCR và bằng phươngpháp hoá mô miễn dịch

2.2.2.1 Xác định MSI bằng phản ứng PCR:

PCR hay phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain Reaction) dùng

để chỉ một kỹ thuật được sử dụng để "khuếch đại" phân tử DNA hoặc đoạnphân tử DNA ngoài cơ thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên lượngtuỳ ý muốn [28],[29],[30]

Tình trạng MSI-H được xác định bằng xét nghiệm khuếch đại chuỗiDNA polymerase (PCR) với đoạn mồi tương ứng với chuỗi vi vệ tinh DNA,cho kết quả chiều dài của đoạn vi vệ tinh khác nhau ở tế bào u so với tế bàobiểu mô bình thường

Từ năm 1998, BAT25 và BAT26 (đoạn mồi gồm hai mononucleotide) vàD2S123, D5S346, D16S250 (đoạn mồi dài hơn gồm ba dinucleotide) được việnung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI) khuyến cáo sử dụng trên thực hành lâm sàng.Với xét nghiệm này, các khối u MSI-H được xác định khi kết quả phântích cho thấy có sự khuếch đại với ít nhất 2 trong số 5 đoạn mồi chỉ điểm(tương ứng với tăng số lần lặp của các đoạn mồi này hay nói cách khác, tăngchiều dài của đoạn vi vệ tinh) Nếu xét nghiệm chỉ cho thấy sự khuếch đại với

1 chỉ điểm, khối u được xếp loại MSI mức độ thấp (MSI-L) Nếu phân tích

không phát hiện sự khuếch đại đối với bất kỳ chỉ điểm nào, khối u thuộcnhóm có vi vệ tinh ổn định - MSS.

2.2.2.2 Xác định MSI bằng phương pháp hoá mô miễn dịch:

Xét nghiệm xác định MSI có thể sử dụng nhiều kỹ thuật như: PCR, các

kỹ thuật sinh học phân tử,… nhưng xác định MSI bằng hoá mô miễn dịchđược sử dụng rộng rãi hơn cả Hoá mô miễn dịch là kỹ thuật Hoá – Miễn dịchđược ứng dụng vào mô bệnh học hay nói cách khác nó là sự kết hợp giữa bangành Hoá học, Mô học và Miễn dịch học Kỹ thuật này giúp xác định có haykhông có kháng nguyên riêng biệt của một mô, xác định tình trạng khángnguyên của các tế bào đặc hiệu trong mô và vị trí của kháng nguyên trong tếbào dựa vào tính chất đặc hiệu cao của kháng thể Xét nghiệm MSI bằngphương pháp hóa mô miễn dịch là phương pháp xác định tình trạng suy giảmhoạt động của các gen chi phối quá trình sửa lỗi ghép cặp DNA qua việc giảmbộc lộ các protein tương ứng của các gen này (gồm MLH1, MSH2, MSH6 vàPMS2) Nếu mất 1 hoặc nhiều hơn các dấu ấn này, khối u được xem là cóthiếu hụt sửa chữa ghép cặp sai:

- Sự mất bộc lộ protein MLH1 một mình trong ung thư đại trực tràng đơn lẻ.Trong các ung thư với sự mất đi biểu hiện protein MLH1, việc kiểm tra độtbiến ở gen ung thư BRAF là cách tiếp cận hiệu quả nhất để xác nhận mộttrường hợp lẻ tẻ và thường không bao gồm hội chứng Lynch [32]

- Các protein MLH1 và PMS2 thường bị mất đi cùng nhau vì chỉ khi có cả haiđơn phân này thì phân tử MutLα mới được hình thành và có hoạt tính hoànchỉnh Biểu hiện mất chức năng MLH1 thường do sự im lặng của gen hoặcđột biến dòng tế bào Sự mất bộc lộ protein PMS2 riêng biệt thường chỉ ramột đột biến PMS2 ở dòng mầm tiềm tàng

- Protein MSH2 và MSH6 thường bị mất đồng thời vì chỉ khi có cả hai đơnphân này thì phân tử MutSα mới được hình thành và có hoạt tính sinh học Sựmất riêng biệt của MSH2 hoặc MSH6 bằng xét nghiệm hoá mô miễn dịch cótính đặc hiệu cao đối với đột biến gen của những gen này giúp chẩn đoán hộichứng Lynch Ngoài ra, sự mất bộc lộ protein MSH2 có thể là do sự biến đổidòng tế bào mầm ở gen EPCAM chứ không phải là gen MSH2.

Trong thực tế, tất cả các khối u có các đột biến ở gen MSH2 hoặc MLH1đều được xem là MSI-H Tuy nhiên, đột biến gen MSH6 có thể gặp ở cả cáckhối u MSI-H, MSI-L hoặc MSS [31]

Một ứng dụng quan trọng trong việc chẩn đoán MSI bằng phương pháphoá mô miễn dịch giúp xác định bệnh nhân có hội chứng Lynch – một dạngung thư đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 2 - 5% tổng số ung thư đại trựctràng và chiếm 1/3 tất cả các ung thư đại trực tràng liên quan đến MSI.Khoảng 90% nam giới và 70% phụ nữ mắc hội chứng Lynch sẽ phát triển ungthư đại trực tràng trước tuổi 70 Những bệnh nhân có nghi ngờ về ung thư đạitrực tràng di truyền cần được tư vấn về di truyền học, từ đó có thể xác địnhđược các đột biến về dòng họ và đánh giá hoặc sàng lọc các thành viên tronggia đình

2.3 Con đường mất ổn định vi vệ tinh trong ung thư đại trực tràng:

2.3.1 Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng:

2.3.1.1 Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng:

Ung thư đại trực tràng có thể khởi phát do nhiều con đường Khoảng 80%các ung thư đại trực tràng do mất ổn định vi vệ tinh hoặc mất ổn định NSThoặc cả hai Một phần nhỏ còn lại (chiếm 20%) các ca ung thư đại trực tràng là

ổn định vi vệ tinh và nhiễm sắc thể (microsatellite and chromosomally stable MACS) [32]

-Phần lớn ung thư đại trực tràng là do mất ổn định NST (chromosomalinstability - CIN) Sự mất ổn định NST xảy ra do ảnh hưởng của các gen ứcchế ung thư hoặc gen ung thư như K-ras, p53, …

Khoảng 12 - 15% các ca bệnh ung thư đại trực tràng xảy ra do mất ổnđịnh vi vệ tinh

- Trong đó, bất thường methyl hóa làm bất hoạt gen MLH1 sửa chữa ghép cặpsai DNA Điều này chủ yếu ở ung thư đại trực tràng đơn lẻ, hoặc không ditruyền và chiếm 2/3 trong tổng số các ca ung thư đại trực tràng có MSI Cácung thư đại trực tràng MSI-H đơn lẻ biểu hiện mất MLH1 thường đi kèm vớikiểu hình methyl hoá đảo CpG (CpG island methylator phenotype - CIMP).CIMP là trạng thái promoter bị methyl hóa quá mức mật độ cao của các gentrong ung thư Đây là một kiểu biểu hiện riêng biệt của ung thư đại trực tràng[33] Bệnh nhân có ung thư đại trực tràng MSI-H đơn lẻ có hầu hết các đặcđiểm lâm sàng như hội chứng Lynch, tuy nhiên có các đặc điểm dịch tễ khácnhau bao gồm tuổi chẩn đoán cao hơn, ưu thế ở nữ và tỷ lệ hút thuốc lá caohơn

- Các ca ung thư đại trực tràng có MSI còn lại do đột biến dòng mầm di truyềngây bất hoạt xảy ra ở 1 trong số 4 gen sửa chữa ghép cặp sai (MLH1, MSH2,MSH6 hoặc PMS2) tạo ra hội chứng Lynch

Hình 2.1 Cơ sở phân tử ung thư đại trực tràng

2.3.1.2 Hội chứng Lynch:

Hội chứng Lynch còn gọi là ung thư đại tràng di truyền không phát sinhpolyp (Hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC), là một hộichứng ung thư di truyền thường có khuynh hướng di truyền cùng những loại

ung thư khác Điều này có nghĩa là những người mắc hội chứng Lynch tăngnguy cơ mắc nhiều loại ung thư Hội chứng Lynch được đặc trưng bởi sự giatăng nguy cơ ung thư đại trực tràng (CRC) và ung thư nội mạc tử cung, ungthư buồng trứng, ung thư dạ dày, ruột non, đường tiết niệu, đường mật, não(thường là u nguyên bào thần kinh đệm), da (u tuyến bã nhờn, ung thư biểu

mô tuyến bã và u sừng) , tuyến tụy và ung thư tuyến tiền liệt Nguy cơ mắcung thư và độ tuổi khởi phát ung thư khác nhau tùy thuộc vào gen liên quan[34] Đây là dạng phổ biến nhất của ung thư đại trực tràng di truyền

Hội chứng Lynch chiếm khoảng 3 - 4% tổng số ung thư đại trực tràng vàchiếm 1/3 tất cả các ung thư đại trực tràng liên quan đến MSI Hội chứngLynch là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, do nhữngđột biến gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai(MMR) gồm có: MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là genMLH1 và MSH2 [35]

Phân tích sự di truyền các gen MMR ở người cho thu được trên 90%

bệnh nhân mắc hội chứng Lynch là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2 Riêng gen MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và gen MSH2 là 1/500 ở nhiều quần

thể [36] Trong số tất cả các đột biến gen được báo cáo trong hội chứng

Lynch, gen MLH1 có ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng

số trường hợp, sau đó là đến MSH2 (40%), MSH6 (10%) và PMS2 (<5%) Như vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư đại trực

tràng không polyp di truyền (HNPCC)

Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E.

coli Gen này có 19 exon, có kích thước khoảng 57,36 kb, mARN dài 2524 bp

và protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin.

2.3.2 Giá trị tiên lượng của xét nghiệm MSI trong ung thư đại trực tràng: